CN105567649A - 一种修饰的增强型dc-cik靶向免疫细胞群的制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种修饰的增强型DC-CIK靶向免疫细胞群的制备方法和用途，其中制备DC？细胞的方法包括？：单核细胞进行分离培养，以便获得未成熟的DC细胞？；将未成熟DC细胞进行肿瘤抗原负载并进行诱导分化培养，以便获得成熟的DC细胞，其中，所述单核细胞是从样本的外周血单个核细胞中分离获得的。制备CIK的方法包括：CIK细胞体外分化培养，获得未成熟的CIK细胞；制备修饰用重组慢病毒对CIK细胞进行体外修饰；修饰后CIK细胞与DC细胞共培养，以便获得成熟的修饰后CIK细胞（Platinum-DC-CIK），进而用于获得更好的肿瘤免疫治疗效果。

Description

一种修饰的增强型DC-CIK靶向免疫细胞群的制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及修饰的DC-CIK细胞靶向性免疫细胞群及其制备方法和用途，属于细胞生物学、免疫学、肿瘤治疗领域。

背景技术

恶性肿瘤是人类主要的致死性疾病类型，成为威胁人类健康的头号杀手。卫生部最新统计数据，据2012年癌症有关报告显示，我国每年新发癌症病例约337万，死亡约211万。癌症已成为我国死亡第一大原因，死亡人数占全球癌症死亡人数四分之一。2012年世界癌症报告显示，每年癌症新发病例约1400万，死亡约800万，这与2008年的统计结果1270万人相比，人数大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也有所增加，从过去的760万人增加到820万人。报告称，到2030年，新增癌症病例将增加50%，达到每年2160万人。我国新发病例占全球新发病例22%，死亡人数占26%，超过全球癌症死亡人数的四分之一。男性当中肺癌发病率最高，女性是乳腺癌。

目前的肿瘤临床治疗策略中，主要以手术和放疗等局部治疗对局限性肿瘤进行治疗，而对于全身性、转移性或局部治疗后的微小残留病灶则主要依靠化疗法进行系统性治疗。但治疗效果多半不理想，并常伴有严重的副作用。肿瘤的发生是多步骤、多基因突变作用的结果，表现出生长、分化与凋亡的失控。临床上病人的诊断具有多样性和个体遗传异质性，同时经常办随肿瘤远处转移病灶的出现和复发，使肿瘤治疗必须以全身性疾病的观点，采取全身治疗方案，不仅要消除局部病灶的肿瘤，还要控制肿瘤的复发、转移生长及肿瘤对重要脏器的侵袭，才能真正有效地提高肿瘤病人的治愈率和生存期。

近年来，随着分子医药技术的发展，肿瘤免疫疗法治疗肿瘤成为肿瘤临床治疗的焦点，为肿瘤患者带来了希望。2013年《科学》杂志将肿瘤免疫治疗列为十大科学突破的首位，细胞免疫治疗方法在理论上有巨大优势：（1）它不损伤降低免疫系统功能，反而增强免疫系统。对活跃繁殖和静止隐藏的癌细胞都有杀伤效果。（2）可以广谱治疗多种癌症，对普遍人群均有效果。（3）可以通过治疗后的免疫监视抑制癌细胞进化，降低复发率。由于肿瘤细胞免疫治疗应用范围广(可用于多种实体肿瘤及白血病)，特别对肿瘤微小病灶(包括转移、复发灶、血液中的癌细胞)更为有效，无毒副作用，而且适用于肿瘤各阶段(如晚期放、化疗不易使用)，因此具有巨大的应用前景和广阔的市场空间。

细胞免疫治疗主要包括CIK和DC细胞：

树突状细胞（Dendriticcell，DC）是近年来所发现的最为重要的免疫调控和辅助细胞，它是最主要的抗原提呈细胞，具有捕获、加工处理抗原并向T淋巴细胞提呈抗原分子的功能，并表达共刺激分子和粘附分子；且能分泌在机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用的Th1型细胞因子IL-12，诱导机体产生抗原特异性T淋巴细胞，认别和杀伤肿瘤细胞。

多种细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-inducedkillercell，CIK）是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子,故又被称为NK细胞样T淋巴细胞,兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。因此,应用CIK细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。CIK细胞中的效应细胞CD3+和CD56+细胞在正常人外周血中较少，仅1%-5%。

人们又发现当在CIK细胞培养时加入肿瘤患者自体的DC后，彼此能相互作用，促进双方细胞的成熟，并诱导除比同源CIK细胞更强增殖活性和更高肿瘤细胞杀伤活性的细胞群。本发明在对DC细胞和CIK细胞增殖、杀伤特性研究的基础上，对CIK细胞进行早期修饰，并把DC与CIK进行共培养，可产生明显增强的CIK细胞群，其增殖效率和抑瘤细胞活性均有显著增强。

程序性死亡受体-1（programmeddeath1，PD-1）PD-1是免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，相对分子质量为55×10³左右，由细胞外区、疏水性跨膜区、细胞质区组成。PD-1分子最显著的特征是细胞质区的尾部含有两个酪氨酸残基，分别参与组成免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotifs，ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptortyrosine-basedswithmotifs，ITSM)结构域。ITIM能使细胞质段的磷酸化得到恢复，发挥拮抗抗原受体的功能，而ITSM上的酪氨酸残基在PD-1的负性调节中是必需的。PD-1配体包括PD-L1和PD-L2，其中PD-L1广泛表达在T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、多种肿瘤细胞及一些非淋巴PD-1/PD-Ls发挥着负性免疫调节作用。当细胞表面的PD-1与PD-Ls耦联后，可导致T细胞胞质区的ITSM结构域的Tyr磷酸化，然后磷酸化的Tyr即可募集磷酸酶蛋白酪氨酸酶-2和蛋白酪氨酸酶-1，不仅可阻滞细胞外信号调节激酶的活化，还可阻断磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-hydroxykinase，PI3K)和丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine/threoninekinase，Akt)的激活，最终抑制T淋巴细胞增殖和相关细胞因子的分泌。

因此本研究通过在CIK细胞表面过量表达无胞内功能区的PD-1，使之成为肿瘤表面PD-L1的假受体，从而减少CIK细胞表面具有胞内功能区的PD-1与肿瘤细胞表面的PD-L1结合，减少肿瘤对杀伤性细胞的抑制，极大的增强肿瘤杀伤效果。

发明内容

本发明公开了一种修饰的DC-CIK细胞靶向性免疫细胞群及其制备方法和用途，其制备方法如下：

1．制备表达人源PD-1片段慢病毒

合成序列表的SEQIDNO:1所示的双链DNA分子，将其连入商业化慢病毒载体中，以pWPXL载体系统作为示范例，包括但不限于pWPXL载体，构建出重组质粒pWPXL-PD-1。通过下列常规操作完成病毒包装：

a、采用磷酸钙法将重组表达质粒连同辅助质粒共转染HEK293细胞。接种HEK293细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37oC和5%CO2的条件下培养至对数生长期，收集细胞，于10cm直径的细胞培养皿中接种5×10⁶个细胞，继续培养16～24h。待细胞长至70～80%密度时更换培养基为IMDM，孵育2～4h后进行病毒转染。

b、将重组质粒pWPXL-PD-1和包装质粒pMD2.G质粒和psPAX2质粒共转染HEK293细胞（每1×10⁶个细胞约转染30-40μg重组质粒，转染过程为将包装质粒与磷酸钙溶液过滤混合后，加到培养皿中，混匀。8-15h后，将培养基换成DMEM，48～60h后，收集上清。

所用质粒量如下表：

2.病毒纯化

采用超速离心纯化方法，步骤如下:1、将收集的培养液离心，4oC，3000rpm,20min；2、吸取上清，过滤膜（0.45um）；3、4oC离心，2000rcf，2小时；4、弃上清，加入1/1000体积的预冷的PBS，振摇溶解；5、4oC离心，1000rpm，10min；6、吸取上清，10ul/支分装，冻存在-80oC；

病毒滴度测定：ELISA法测定全病毒病毒滴度：抗原检测操作按试剂盒说明书进行。

对照病毒的制备

用pWPXL质粒代替重组质粒pWPXL-PD-1进行步骤二、三，得到的溶液命名为pWPXL病毒液。

修饰的DC-CIK（Platinum-DC-CIK）的制备

a．外周血单个核细胞PBMC的制备

取新鲜抗凝全血，EDTA（枸橼酸钠或肝素）抗凝剂均可。用等体积PBS或0.9%NaCl稀释全血。在离心管中加入一定体积的分离液，将稀释后的血样平铺到分离液液面上方，保持两液面界面清晰。分离液、抗凝未经稀释全血、PBS（或生理盐水）体积为1:1:1。，离心2000rpmí25min，分离得PBMC，再用Hanks液洗涤2次，镜下计细胞数，最后用无血清培养液VIVO-15调节细胞密度使成5í10⁶/ml细胞悬液；

b．非粘附与粘附细胞分离

将细胞悬液移入6孔板，37℃，5%CO₂，培养2h，然后用移液管轻轻冲洗细胞，将非粘附细胞悬液收集在离心管中作诱导CIK细胞备用，粘附细胞留在6孔板上，加入DC培养液3ml/孔待用。

c．粘附DC细胞的诱导和扩增

在留有粘附细胞的6孔板上，每孔添加DC培养液3ml内含有GM-CSF800U/ml和IL-4500U/ml，于37℃，5%CO₂培养，培养4-5天，每隔2-3天等量补液一次，在培养的第5d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC细胞成熟于第6-7天收集细胞备用；

d．非粘附CIK细胞的诱导和扩增

把离心管中的非粘附细胞悬液接种到含有IFN-γ1000U/mlVIVO-15培养液的25cm²培养瓶，10-15ml/瓶，置于37℃，5%CO₂培养箱中24-36h后，把用Hanks液配制的抗CD3单抗5μg/ml包被25cm²培养瓶，同时加入终浓度IL-1a100U/mlVIVO-15，IL-2000U/mlVIVO-15继续培养48-72h，镜下计数，用CIK培养液调细胞密度为4í10⁵/ml，每隔48h按上述相同条件扩增1次，以及加入2％～10％体积的自体血清，其中，所述血清来源于所述血液样本。由此，培养效果好。根据本发明的实施例，所述无血清培养基为VIVO-15的无血清培养基。根据本发明的另一些实施例，所述无血清培养基中添加有0.5体积％～5体积％的抗生素，优选庆大霉素。由此，能够高效地制备获得靶向性免疫细胞群。培养至5-7天收集CIK细胞备用；

抗CD3单抗包被方法：在VIVO-15培养液中加入CD3单抗，使成为抗CD3单抗浓度为5-10ug/ml的包被液，在25cm²培养瓶中加入5ml包被液，4C过夜或者37℃温育2h后，弃去全部包被液即可；

e．肿瘤抗原的制备及负载

手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净，再用无菌生理盐水洗3次；用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI1640培养基，充分研磨，200目无菌网过滤后收集单细胞悬液。用RPMI1640培养基重悬细胞至1-2x10⁷/ml，装入5ml无菌冻存管中，浸入液氮中速冻，10min后取出，再迅速放入37℃水浴中解冻10min，反复3-5次；（或以-80℃/37℃反复冻融3-5次）。将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min，收取上清，0.22μm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体，-80℃保存备用。

调整细胞密度，将裂解肿瘤细胞与培养7天的DC细胞与肿瘤抗原孵育、共培养，使之成为成熟的DC细胞。

CIK细胞的修饰及Platinum-DC-CIK细胞的制备

将培养7天的CIK细胞加入5í10⁸病毒，共培养12小时。

将负载肿瘤抗原的DC和培养至5-7天的修饰后CIK细胞，计数，离心，分别收集DC和CIK细胞，用VIVO-15无血清培养液调两细胞的密度分别为2í10⁵和1í10⁶，按DC：CIK=1:5等体积混合后移入25cm²培养瓶10ml/瓶，于37℃，5%CO₂培养，每隔培养4-5天，每隔2-3天等量补液一次；分瓶扩大培养1次，经5次扩大培养后即可获得5í10⁹~1í10¹⁰的Platinum-DC-CIK细胞。

Platinum-DC-CIK细胞制剂的制备

离心收集1~5í10⁹细胞，用0.9%氯化钠注射液洗涤2次，离心，弃上清，将细胞移至250ml输液瓶中，加2g人血清白蛋白和250ml0.9%氯化钠注射液，制成细胞悬液制剂。

附图说明

图1PD-1片段PCR扩增目的条带电泳检测结果；

图2修饰后免疫细胞群PD-1的real-timePCR检测结果；

图3修饰后免疫细胞群对人HepG2细胞增殖的抑制作用；

图4修饰后免疫细胞群对人U251细胞增殖的抑制作用；

图5修饰后免疫细胞群对人宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用；

图6修饰后免疫细胞群对人肺癌A549细胞增殖的抑制作用；

图7修饰后免疫细胞群对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用；

图8修饰后免疫细胞群对人结肠癌HT29细胞增殖的抑制作用；

图9修饰后免疫细胞群对人胃癌SGC-7901细胞增殖的抑制作用；

具体实施方式：

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》（Sambrook,J.,Russell,DavidW.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001,NY,ColdSpringHarbor）。

若无特别说明，本发明实施例采用的载体和试剂皆为市售商品，所用引物及DNA序列均由Invitrogen公司合成。

实施例1．表达人源PD-1片段慢病毒的制备

1.人源PD-1片段慢病毒的构建

合成序列表的SEQIDNO:1所示的双链DNA分子，将其连入商业化慢病毒载体中，以pWPXL载体系统作为示范例，包括但不限于pWPXL载体，构建出重组质粒pWPXL-PD-1,通过PCR进行鉴定，结果如图1所示，泳道1为DL2000Marker，泳道2、3为鉴定结果。通过下列常规操作完成病毒包装：

a、采用磷酸钙法将重组表达质粒连同辅助质粒共转染HEK293细胞。接种HEK293细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37oC和5%CO₂的条件下培养至对数生长期，收集细胞，于10cm直径的细胞培养皿中接种5×10⁶个细胞，继续培养16～24h。待细胞长至70～80%密度时更换培养基为IMDM，孵育2～4h后进行病毒转染。

b、以pWPXL系统为例将重组质粒pWPXL-PD-1和包装质粒pMD2.G质粒和psPAX2

质粒共转染HEK293细胞（每1×10⁶个细胞约转染30-40μg重组质粒，转染过程为将包装质粒与磷酸钙溶液过滤混合后，加到培养皿中，混匀。8-15h后，将培养基换成DMEM，48～60h后，收集上清。所用质粒量如下表：

2.病毒纯化

采用超速离心纯化方法，步骤如下:1、将收集的培养液离心，4oC，3000rpm,20min；2、吸取上清，过滤膜（0.45um）；3、4oC离心，2000rcf，2小时；4、弃上清，加入1/1000体积的预冷的PBS，振摇溶解；5、4oC离心，1000rpm，10min；6、吸取上清，10ul/支分装，冻存在-80oC；

病毒滴度测定：ELISA法测定全病毒病毒滴度：抗原检测操作按试剂盒说明书进行。

3.对照病毒的制备

用pWPXL质粒代替重组质粒pWPXL-PD-1进行步骤1、2，得到的溶液命名为pWPXL病毒液。

实施例2、重组病毒感染CIK细胞后PD-1检测

为充分说明本发明的有益效果，本发明还采用RT-PCR对pWPXLd–PD-1感染后的CIK细胞中的PD-1转录水平的进行real-timePCR检测，步骤如下：

对pWPXLd–PD-1感染24h、48h和72h之后的细胞分别进行总RNA的提取，同时，设置感染pWPXLd的CIK细胞作为对照，未感染的CIK细胞作为空白对照。然后反转录成cDNA模板，以设计的特异性的引物检测PD-1的mRNA是否进行转录，以GAPDH为内参。GAPDH的引物序列为：

上游引物:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’

下游引物:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’；

PD-1的引物序列为：

上游引物：5’-GCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTG-3’

下游引物：5’-AGAACACAGGCACGGCTGAGGGGTCCTCCTTC-3’。

本实施例的real-timePCR检测结果如图3所示，其中，每两组柱子中，近纵坐标的柱子为GAPDH内参，远纵坐标的柱子为PD-1的检测结果。

由图2可知，相对于空白对照，以及转染了pWPXLd的CIK细胞的对照；本实施例提供的转染了pWPXLd-PD-1慢病毒的CIK细胞组的PD-1片段的表达量有显著的上调。该结果说明本发明提供的经由质粒包装系统在包装细胞HEK293细胞中所产生的慢病毒能侵染CIK细胞，并且本发明提供的含慢病毒或慢病毒载体的细胞能用于制备pWPXLd-PD-1慢病毒。

实施例3、修饰的DC-CIK（Platinum-DC-CIK）细胞的制备

1.外周血单个核细胞PBMC的制备

取新鲜抗凝全血，EDTA（枸橼酸钠或肝素）抗凝剂均可。用等体积PBS或0.9%NaCl稀释全血。在离心管中加入一定体积的分离液，将稀释后的血样平铺到分离液液面上方，保持两液面界面清晰。分离液、抗凝未经稀释全血、PBS（或生理盐水）体积为1:1:1，离心2000rpmí25min，分离得PBMC，再用Hanks液洗涤2次，镜下计细胞数，最后用无血清培养液VIVO-15调节细胞密度使成5í10⁶/ml细胞悬液；

2.非粘附与粘附细胞分离

将细胞悬液移入6孔板，37℃，5%CO₂，培养2h，然后用移液管轻轻冲洗细胞，将非粘附细胞悬液收集在离心管中作诱导CIK细胞备用，粘附细胞留在6孔板上，加入DC培养液3ml/孔待用。

粘附DC细胞的诱导和扩增

在留有粘附细胞的6孔板上，每孔添加DC培养液3ml内含有GM-CSF（800U/ml）和IL-4（500U/ml），于37℃，5%CO₂培养，在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC细胞成熟于第5-7天收集细胞备用；

4.非粘附CIK细胞的诱导和扩增

把离心管中的非粘附细胞悬液接种到含有IFN-γ1000U/mlVIVO-15培养液的25cm²培养瓶，10-15ml/瓶，置于37℃，5%CO₂培养箱中24-36h后，把用Hanks液配制的抗CD3单抗5μg/ml包被25cm²培养瓶，同时加入终浓度IL-1a100U/mlVIVO-15，IL-2000U/mlVIVO-15继续培养48-72h，镜下计数，用CIK培养液调细胞密度为4í10⁵/ml，每隔48h按上述相同条件扩增1次，培养至5-7天收集CIK细胞备用；

抗CD3单抗包被方法：在VIVO-15培养液中加入CD3单抗，使成为抗CD3单抗浓度为5-10ug/ml的包被液，在25cm²培养瓶中加入5ml包被液，4C过夜或者37℃温育2h后，弃去全部包被液即可；

5.肿瘤抗原的制备及负载

a、手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净，再用无菌生理盐水洗3次；用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI1640培养基，充分研磨，200目无菌网过滤后收集单细胞悬液。用RPMI1640培养基重悬细胞至1-2x10⁷/ml，装入5ml无菌冻存管中，浸入液氮中速冻，10min后取出，再迅速放入37℃水浴中解冻10min，反复3-5次；（或以-80℃/37℃，反复冻融3-5次）。将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min，收取上清，0.22μm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体，-80℃保存备用。

b、调整细胞密度，将裂解肿瘤细胞与

将培养7天的DC细胞与肿瘤抗原孵育、共培养，使之成为成熟的DC细胞。

CIK细胞的修饰及Platinum-DC-CIK细胞的制备

将培养7天的CIK细胞加入5í10⁸病毒，共培养12小时。

将负载肿瘤抗原的DC和培养至5-7天的修饰后CIK细胞，计数，离心，分别收集DC和CIK细胞，用VIVO-15无血清培养液调两细胞的密度分别为2í10⁵和1í10⁶，按DC：CIK=1:5等体积混合后移入25cm²培养瓶10ml/瓶，于37℃，5%CO₂培养，每隔48-72h按以上细胞密度分瓶扩大培养1次，经5次扩大培养后即可获得5í10⁹~1í10¹⁰的Platinum-DC-CIK细胞。

Platinum-DC-CIK细胞制剂

离心收集1~5í10⁹细胞，用0.9%氯化钠注射液洗涤2次，离心，弃上清，将细胞移至250ml输液瓶中，加2g人血清白蛋白和250ml0.9%氯化钠注射液，制成细胞悬液制剂。

实施例4Platinum-DC-CIK对肿瘤细胞抑制作用的检测

待测样品为实施例3制备的Platinum-DC-CIK和CIK细胞。将处于对数生长期的人HepG2肿瘤细胞分别经胰蛋白酶消化后进行收集，制备成110⁵个/mL的细胞悬液，吹打均匀后加入96孔板，每孔加200μL癌细胞悬液，在37℃、5%CO2培养箱中继续培养待细胞长至70-80%，去掉培养基，用PBS洗一次，分为4组，第1、2组每组实验孔分别加入10²、10³的Platinum-DC-CIK细胞和DC-CIK细胞100μL，培养12h，24h，48h。培养结束后，每孔加入50μLMTT溶液（5mg/mL）孵育24h后，弃去培养液，每孔加入200μL的DMSO，震荡10min后，用酶联免疫仪于测定波长为570nm的OD值，癌细胞生长抑制率由下式计算：

抑制率%=（对照组OD均值-给药组OD值）/对照组OD均值×100%

结果见图3。图3中，A、B图分别为HepG2细胞加入102和103治疗细胞，在12h，24h，48h的培养时间对细胞肿瘤抑制的结果，

按相同方法图4-9中，A、B图分别为U251、HeLa、A549、MCF-7、HT29、SGC-7901细胞中加入10²和10³治疗细胞，在12h，24h，48h的培养时间对细胞肿瘤抑制的结果。

本实施例充分证明Platinum-DC-CIK细胞对肿瘤的杀伤效果明显优于普通DC-CIK细胞。

由上述实施例可知修饰后的DC-CIK对多种恶性肿瘤均具有强大的杀伤能力，今后进入临床将会为肿瘤患者提供良好的预后治疗，具有巨大的社会价值和经济价值。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限。

序列表

<110>哈尔滨新联合生物科技有限公司

<120>一种修饰的增强型DC-CIK靶向免疫细胞群的制备方法和用途

<210>SEQIDNO:1

<211>573

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>SEQIDNO:1

1ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGG

61CCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCC

121CTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCG

181GAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCC

241GCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTG

301CCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACC

361TACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCA

421GAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCC

481AGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGGTTGGTGTCGTGGGCGGCCTGCTGGGCAGC

541CTGGTGCTGCTAGTCTGGGTCCTGGCCGTCATC

<210>SEQIDNO:2

<211>190

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>SEQIDNO:2

1METGlnIleProGlnAlaProTrpProValValTrpAlaValLeuGlnLeuGlyTrpArg

21ProGlyTrpPheLeuAspSerProAspArgProTrpAsnProProThrPheSerProAla

41LeuLeuValValThrGluGlyAspAsnAlaThrPheThrCysSerPheSerAsnThrSer

61GluSerPheValLeuAsnTrpTyrArgMETSerProSerAsnGlnThrAspLysLeuAla

81AlaPheProGluAspArgSerGlnProGlyGlnAspCysArgPheArgValThrGlnLeu

101ProAsnGlyArgAspPheHisMETSerValValArgAlaArgArgAsnAspSerGlyThr

121TyrLeuCysGlyAlaIleSerLeuAlaProLysAlaGlnIleLysGluSerLeuArgAla

141GluLeuArgValThrGluArgArgAlaGluValProThrAlaHisProSerProSerPro

161ArgProAlaGlyGlnPheGlnThrLeuValValGlyValValGlyGlyLeuLeuGlySer

181LeuValLeuLeuValTrpValLeuAlaValIle

Claims (8)

1.一种用于修饰DC-CIK细胞的慢病毒，其特征在于包含PD-1胞外区及跨膜区序列，核酸序列如SEQIDNO：1所示。

2.如权利要求1所述的慢病毒，其特征在于该病毒可在感染细胞后表达相应蛋白，其蛋白序列如SEQIDNO：2所示。

3.制备如权利要求1所述的慢病毒的方法，其特征在于慢病毒是通过以下步骤获得的：制备PD-1胞外区及跨膜区序列核酸序列，将所述序列连入商业化慢病毒载体。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于使用pWPXL慢病毒载体，其中包括但不限于该慢病毒系统，进行载体构建，通过磷酸钙转染的方法，进行病毒包装，收获的病毒经纯化后备用。

5.制备如权利要求1所述的修饰DC-CIK细胞慢病毒的方法，所述DC-CIK细胞是通过以下步骤获得的：一种制备DC-CIK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：从外周血中分离淋巴细胞，再通过贴壁处理对DC细胞和CIK细胞进行区分，并培养5-6天；将培养5天的DC细胞与灭活的肿瘤抗原孵育培养，同时将培养5天的CIK细胞加入5x10⁸病毒，共培养12小时；再将DC细胞与修饰的CIK细胞1:5混合共培养4-5天即可获得Platinum-DC-CIK细胞。

6.如权利要求3-5任一项所述的方法，其中处理个体中包括步骤：用包含根据权利要求1所述的一种修饰的增强型DC-CIK靶向性免疫细胞群。

7.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其中所述个体已经接受或正在接受或将要接受额外的抗癌疗法，其中额外的抗癌疗法包括手术、放疗、化疗、免疫治疗或激素治疗。

8.如权利要求1-5任一项所述的慢病毒在用于制备肿瘤治疗试剂中的制药用途，优选的，所述的肿瘤包括但不限于肝癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、神经胶质瘤和乳腺癌。