CN113897334A - Pd-1阻断剂增强nk细胞杀伤力的用途 - Google Patents

Pd-1阻断剂增强nk细胞杀伤力的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了PD‑1阻断剂增强NK细胞杀伤力的用途。NK细胞发挥杀伤靶细胞的过程中，NK细胞受到信号触发，先通过脱颗粒过程释放Perforin、GranzymeB到达靶细胞，Perforin作用是在靶细胞膜上穿孔通道进而介导GranzymeB进入靶细胞，GranzymeB进入靶细胞后引发靶细胞的DNA断裂使靶细胞凋亡。CD107a也是NK细胞脱颗粒过程中的重要参与因子。因此，本领域技术人员通常通过检测Perforin、GranzymeB、CD107a的表达水平评价NK细胞的杀伤力强弱。据此可以说明，本发明通过阻断NK细胞中PD‑1表达后有效提高了NK细胞的杀伤力。

Description

PD-1阻断剂增强NK细胞杀伤力的用途
技术领域
本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及PD-1阻断剂增强NK细胞杀伤力的用途。
背景技术
NK细胞又称自然杀伤细胞，是机体固有免疫的组成细胞之一，主要分布于外周血和脾脏。在正常情况下，NK细胞通过识别细胞表面的人类白细胞抗原(HLA)Ⅰ类分子区分“自我”与“非我”以杀伤或诱导凋亡来清除肿瘤细胞或病毒感染细胞。目前，NK细胞已被广泛用于肿瘤的过继免疫治疗中。由于NK细胞仅占外周血淋巴细胞的5％～15％，因而可以通过体外扩增以满足临床治疗的需求。实验研究已表明，体外扩增的NK细胞在肝癌、胶质母细胞瘤、白血病等多种肿瘤中均表现出良好的抗肿瘤效应。
PD-1是一种在激活的淋巴细胞上表达的抑制性受体，通过与肿瘤细胞表面表达的程序性细胞死亡配体1(PD-L1)结合，调节T细胞激活，介导肿瘤细胞的免疫逃逸。在对NK细胞的扩增过程中，PD-1阻断增强作用，对于患者的治疗具有积极的意义。
1,3-O-二咖啡酰奎宁酸在免疫细胞调节方面有一些研究报道，但是对NK细胞体外培养的影响以及作用机制未见研究和报道。
发明内容
本发明的目的在于提供PD-1阻断剂增强NK细胞杀伤力的用途。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
PD-1阻断剂用于NK细胞体外培养增强其杀伤力的用途。NK细胞发挥杀伤靶细胞的过程中，NK细胞受到信号触发，先通过脱颗粒过程释放Perforin、Granzyme B到达靶细胞，Perforin作用是在靶细胞膜上穿孔通道进而介导Granzyme B进入靶细胞，Granzyme B进入靶细胞后引发靶细胞的DNA断裂使靶细胞凋亡。CD107a也是NK细胞脱颗粒过程中的重要参与因子。因此，本领域技术人员通常通过检测Perforin、Granzyme B、CD107a的表达水平评价NK细胞的杀伤力强弱。据此可以说明，具体实施例通过阻断NK细胞中PD-1表达后有效提高了NK细胞的杀伤力。
优选地，所述PD-1阻断剂为1,3-O-二咖啡酰奎宁酸。具体实施例中，1,3-O-二咖啡酰奎宁酸有效阻断NK细胞中PD-1表达水平。
有益效果：
本发明发现，1,3-O-二咖啡酰奎宁酸用于NK细胞体外培养时可以有效增强其杀伤力，1,3-O-二咖啡酰奎宁酸发挥该作用的机制可能与阻断PD-1有关。
附图说明
图1是Westernblot检测PD-1含量水平。
图2是流式法检测Perforin、Granzyme B、CD107a表达水平。
具体实施方式
一、实验材料
淋巴细胞分离液购自杭州联科生物技术股份有限公司，品牌为MultiSciences。IL-2购自索莱宝，人AB血清购自上海联硕生物科技有限公司，NK细胞培养基品牌为CellGro。
1,3-O-二咖啡酰奎宁酸购自成都瑞芬思生物科技有限公司，HPLC≥98％。
二、实验方法
1、NK细胞培养和鉴定
取适量抗凝外周血，加入淋巴细胞分离液，2000rpm离心20min，吸取白膜层，生理盐水洗涤3次，去上清，加入添加有200U/mL IL-2和50mL/L人AB血清的NK细胞培养基(完全培养基)，调整细胞密度为1×106/mL，接种于6孔培养板中，于5％CO2、37℃培养箱中培养，根据生长情况及时添加培养基。用PerCP-Cy5.5标记的CD3、FITC标记的CD56与未诱导培养(0d)和培养12d的NK细胞孵育进行流式细胞术检测细胞表型。
2、分组和体外干预
取培养12d的NK细胞，接种于24孔板中，接种数量为1×105个，接种体积为1mL。分为对照组和干预组，每组3个复孔。适应性培养12h后，干预组更换为含有5μM 1,3-O-二咖啡酰奎宁酸的完全培养基继续培养，对照组更换为新鲜的完全培养基继续培养。继续培养48h后，收集细胞进行后续试验。
3、PD-1含量水平检测(Western blot法)
收集继续培养48h的NK细胞，洗涤，RIPA裂解液裂解，BCA法测蛋白浓度。各组取等量总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，转膜、封闭后，加入PD-1、GAPDH一抗，于4℃孵育过夜，次日加入相应的二抗，室温避光孵育120min，PBST洗去未结合的二抗，用化学发光显色后进行图像分析，采用Image J软件对显影的条带进行灰度分析。
4、NK细胞杀伤活性检测(流式法)
收集继续培养48h的NK细胞，PBS洗涤并重悬调整细胞密度为1×107/mL，接种于流式管中，每管0.1mL，用PE标记的穿孔素(Perforin)、PE标记的颗粒酶B(Granzyme B)、APC标记的CD107a孵育进行流式细胞术检测。
5、统计学分析
使用GraphPad Prism 5软件进行数据统计学分析。数据采用均数±标准差表示，两组数据间比较采用配对t检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
三、实验结果
1、NK细胞培养和鉴定
流式细胞术检测结果显示，0d细胞CD3－CD56+阳性率为(10.8±3.7)％，培养12d的NK细胞CD3－CD56+阳性率高达(75.2±6.5)％，差异有统计学意义，NK细胞培养成功。
2、Western blot检测PD-1含量水平
结果如图1所示，与对照组相比，干预组PD-1含量水平显著下调，差异有统计学意义，说明1,3-O-二咖啡酰奎宁酸阻断了PD-1的表达，1,3-O-二咖啡酰奎宁酸为NK细胞中PD-1表达阻断剂。
3、流式法检测Perforin、Granzyme B、CD107a表达水平
结果如表1和图2所示，与对照组相比，干预组Perforin、Granzyme B、CD107a的表达水平均显著上调，差异有统计学意义。
表1 Perforin、Granzyme B、CD107a表达水平
对照组 干预组
Perforin 38.5％ 70.8％
Granzyme B 34.6％ 62.5％
CD107a 72.1％ 88.7％
NK细胞发挥杀伤靶细胞的过程中，NK细胞受到信号触发，先通过脱颗粒过程释放Perforin、Granzyme B到达靶细胞，Perforin作用是在靶细胞膜上穿孔通道进而介导Granzyme B进入靶细胞，Granzyme B进入靶细胞后引发靶细胞的DNA断裂使靶细胞凋亡。CD107a也是NK细胞脱颗粒过程中的重要参与因子。因此，本领域技术人员通常通过检测Perforin、Granzyme B、CD107a的表达水平评价NK细胞的杀伤力强弱。据此可以说明，本发明通过1,3-O-二咖啡酰奎宁酸阻断NK细胞中PD-1表达后有效提高了NK细胞的杀伤力。

Claims (2)

1.PD-1阻断剂用于NK细胞体外培养增强其杀伤力的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，所述PD-1阻断剂为1,3-O-二咖啡酰奎宁酸。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114606187A (zh) * 2022-05-13 2022-06-10 北京汉氏联合生物技术股份有限公司 一种nk细胞培养基及体外扩增nk细胞的方法

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