CN114606187A - 一种nk细胞培养基及体外扩增nk细胞的方法 - Google Patents

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韩忠朝
张磊升
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Abstract

本发明公开了一种NK细胞培养基，通过在培养基中加入1,3‑二咖啡酰奎宁酸，能够显著增强NK细胞对K562的杀伤活性,并且该促进作用随着效靶比的增高而增强。利用本发明的NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法，可扩增出活性高、杀伤性更强的NK细胞。

Description

一种NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，特别是涉及一种NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法。
背景技术
自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）是机体重要的免疫细胞，主要分布在外周血中。NK细胞作为机体防御体系的第一道防线，不仅可以在天然免疫系统发挥其主要杀瘤效应，而且在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。
NK细胞在外周血中的含量远不能满足临床需要，目前主要利用细胞因子的刺激来扩增NK细胞，但上述方法扩增的NK细胞与临床需求仍存在一定的差距。如何提供一种可扩增出大量且高活性的NK细胞的培养基，是NK细胞体外扩增领域亟待解决的问题之一。
洋蓟素(1,3-二咖啡酰奎宁酸，CAS号：30964-13-7，分子式：C25H24O12，分子量：516.45)，又称朝蓟素，洋蓟酸，英文名： 1,3-Dicaffeoylquinic acid。存在于菊科植物洋蓟(Cynara scolymus L. )、森林千里光(Senecio nemorensis L. )全草中，临床主要用于治疗由肝功能不足引起的各种疾病。发明人在先前的研究中发现，1,3-二咖啡酰奎宁酸可能对p53通路具有调节作用。p53是一个重要的抗癌基因，其野生型使癌细胞凋亡，从而防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。目前尚无1,3-二咖啡酰奎宁酸对NK细胞活性的影响的有关报道。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法，可扩增出活性高、杀伤性更强的NK细胞。
为解决上述技术问题，本发明的第一个方面，提供一种NK细胞培养基，所述培养基含有：
10-20%FBS、50μg/mL 青霉素-链霉素溶液的1640培养基；
10-200 mg/mL人血浆转铁蛋白；
100uM 1,3-二咖啡酰奎宁酸；
1000 IU/mL 人重组IL-2；
10-200 IU/mL 人重组IL-15；
10-200 IU/mL 人重组IL-18
10-200 IU/mL 人重组IL-21。
在一种优选的实施方式中，所述培养基中含有：
10%FBS、50μg/mL 青霉素-链霉素溶液的 1640 培养基；
20mg/mL人血浆转铁蛋白；
100uM 1,3-二咖啡酰奎宁酸；
1000 IU/mL 人重组IL-2；
20 IU/mL 人重组IL-15；
20 IU/mL 人重组IL-21。
本发明的第二个方面，提供一种体外扩增NK细胞的方法，所述方法包括：将NK细胞悬于上述NK细胞培养基中，并将悬有NK细胞的培养基转移至细胞培养瓶中，并将细胞培养瓶置于培养箱中培养。
在一种实施方式中，在将NK细胞转移至细胞培养瓶时，将细胞密度调整为1-5×105个/ml。
在一种实施方式中，所述培养箱参数为湿度饱和、5%CO2、37℃。
本发明的第三个方面，提供一种1,3-二咖啡酰奎宁酸在制备用于促进NK细胞杀伤活性的试剂中的应用。
在一种实施方式中，所述试剂为培养基。
本发明相对于现有技术获得了如下显著的进步：
本发明首次公开了 1,3-二咖啡酰奎宁酸对NK细胞杀伤活性的促进作用，在培养基中加入1,3-二咖啡酰奎宁酸，能够显著增强NK细胞对K562的杀伤活性, 并且该促进作用随着效靶比的增高而增强。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明实施例2中的细胞杀伤实验结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1 NK细胞培养基的制备和体外扩增方法
NK细胞培养基配制组分如下：
含有 10%FBS、50μg/mL 青霉素-链霉素溶液的 1640 培养基；
20mg/mL人血浆转铁蛋白；
100uM 1,3-二咖啡酰奎宁酸；
1000 IU/mL 人重组IL-2；
20 IU/mL 人重组IL-15；
20 IU/mL 人重组IL-21。
将上述培养基中100uM 1,3-二咖啡酰奎宁酸组分去除，作为对照组。
体外扩增NK细胞的方法可按照如下方法进行：
1. 人外周血单个核细胞 (PB- MC)的分离:静脉血肝素抗凝, Hank' s液等体积稀释, 用 Fi- coll进行密度梯度离心, 获取 PBMC, 充分洗涤后调整PBMC密度为 2 ×109 /L:采用免疫磁珠法纯化NK细胞, 按试剂盒说明书操作 (流式检测表明, NK细胞的纯度 >95%)。
2. 将制备的NK细胞株悬于上述NK细胞培养基及对照组NK细胞培养基中，调整NK细胞的密度为1-5×105个/ml，转移到T75细胞培养瓶中培养，培养条件为湿度饱和、5%CO2、37℃的培养箱。
实施例2 NK细胞对K562细胞的杀伤实验
调整靶细胞 K562 细胞密度为1×108 /L。将实施例1中制备的NK细胞（效应细胞）的密度调整为2×105个/ml，分别在不加 1,3-二咖啡酰奎宁酸（对照组）或加 1,3-二咖啡酰奎宁酸（Drug组）的NK细胞培养基中培养72 h。 取无菌培养板, 空白组加RPMI1640 液200μL/孔, 靶细胞对照组加靶细胞、RPMI1640液各100μL/孔, 效应细胞对照组加效应细胞、RPMI1640各100μL/孔, 实验组加效、靶细胞各100μL/孔(每组设3个平行孔)。 混匀, 离心, 于37℃、 50 mL/LCO2 培养5 h。加MTT(5 g/L)20μL/孔, 混匀后于37℃、 50 mL/LCO2培养4 h。离心, 弃上清。每孔加入二甲基亚砜 150μL, 轻轻振荡, 用酶标仪测量 A490值。
细胞杀伤率 ={[ 1 -(实验孔 A值 -效应细胞对照孔 A 值)] /(靶细胞对照孔 A值 -空白孔 A值)}×100%。
数据用x±s表示, 采用 SPSS13.0统计软件进行t检验分析, 以P<0.05为有统计学意义。
实验结果如图1所示，以K562为靶细胞, 利用MTT法检测1,3-二咖啡酰奎宁酸对NK细胞杀伤功能的影响。结果显示，在加或不加1,3-二咖啡酰奎宁酸刺激条件下, 随着效靶比的增加, NK细胞对 K562的杀伤百分率均增高，但加入1,3-二咖啡酰奎宁酸能够显著增强NK细胞对K562的杀伤活性, 并且该促进作用随着效靶比的增高而增强 (aP<0.05 或bP< 0.01)。
综上所述，利用本发明的NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法，可扩增出活性高、杀伤性更强的NK细胞。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一种NK细胞培养基，其特征在于，所述培养基含有：
10-20%FBS、50μg/mL 青霉素-链霉素溶液的1640培养基；
10-200 mg/mL人血浆转铁蛋白；
100uM 1,3-二咖啡酰奎宁酸；
1000 IU/mL 人重组IL-2；
10-200 IU/mL 人重组IL-15；
10-200 IU/mL 人重组IL-18
10-200 IU/mL 人重组IL-21。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基中含有：
10%FBS、50μg/mL 青霉素-链霉素溶液的 1640 培养基；
20mg/mL人血浆转铁蛋白；
100uM 1,3-二咖啡酰奎宁酸；
1000 IU/mL 人重组IL-2；
20 IU/mL 人重组IL-15；
20 IU/mL 人重组IL-21。
3.一种体外扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：将NK细胞悬于上述NK细胞培养基中，并将悬有NK细胞的培养基转移至细胞培养瓶中，并将细胞培养瓶置于培养箱中培养。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在将NK细胞转移至细胞培养瓶时，将细胞密度调整为1-5×105个/ml。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养箱参数为湿度饱和、5%CO2、37℃。
6.一种1,3-二咖啡酰奎宁酸在制备用于促进NK细胞杀伤活性的试剂中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂为培养基。
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