CN113943701A - 一种可扩增间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法 - Google Patents

一种可扩增间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于检测领域，具体涉及一种可扩增间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法。主要含有姜黄素、千金藤碱、小檗碱、白藜芦醇、花青素、骨形态蛋白4，β‑甘油磷酸、胆固醇、异丁甲基黄嘌呤、EGF、生物素、aFGF、肝素钠、还原型谷胱甘肽、转铁蛋白、胰岛素、抗坏血酸、地塞米松、白介素2、维生素B12、白介素6、干细胞因子、烟酰胺、TGF‑β3、血小板生成素、牛磺酸、罗格列酮、FMS样酪氨酸激酶3配体、IGF2、丙酮酸钠、GM‑CSF和TPO等组分，该无血清培养基不仅具备体外扩增来源于脂肪、胎盘、骨髓、脐带间充质干细胞的能力，还可保持干细胞自我更新、防止其分化，抑制其癌变。

Description

一种可扩增间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于检测方法领域，具体涉及一种可扩增间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymaLstemceLLs，MSCs)是一种成体干细胞，具有高度的自我更新、多向分化潜能、低免疫原性、来源丰富等诸多优点，因此得到组织工程和再生医学的高度重视与青睐，是目前再生医学中常用的细胞。
MSCs来源于骨髓、外周血、脐带血、胎盘等组织，是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。在不同的诱导条件下，其可分化为多种组织细胞，并具有造血支持、免疫调节、组织修复等作用，它可分泌多种细胞因子及生长因子，促进造血干细胞的增殖与分化。MSCs还具有免疫调节、抗炎、组织修复作用，可减轻移植物抗宿主病及其他移植相关并发症。
干细胞治疗目前在全球开展了多项临床试验，覆盖140多种疾病，其中包括不同种干细胞类型及多种疾病类型，主要包括心脑血管疾病、骨科疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病、肝病、风湿免疫病、免疫排斥等，是治疗多种疾病的种子细胞。2015年7月31日，国家卫生计生委办公厅、国家食品药品监管总局办公厅发布的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》中指出，MSCs制剂作为一种新型生物治疗产品，其在细胞质量、安全性和生物学效应方面都应进行全面的研究及质量控制。
间充质干细胞的扩增有赖细胞因子、小分子化合物等组合，通过研究往无血清培养基添加细胞因子、小分子化合物保持其增殖能力的同时阻止其分化，解决扩增间充质干细胞的难题。目前间充质干细胞的体外扩增主要有向培养基中加入一定量的动物来源成分，如胎牛血清。但是，动物来源成分往往含有一定量的免疫原成分或者病原微生物，这些外源物会引起病人严重的免疫反应，危害病人的健康，影响干细胞移植效果，最终可能造成干细胞移植的失败。
中国专利申请CN112662624 A公布了一种用于骨髓间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基，其特征在于，为一种水溶液，其组分及其含量如下：基础培养基20-40g/L，生长因子5-15ng/mL，红茶菌发酵液8-22mg/mL，血清蛋白质3-20mg/mL，硒代蛋氨酸1-10ng/mL，阿魏酸钠0.1-0.4mg/mL，二甲双胍3-8ng/mL，3'-脱氧烟酰胺腺嘌呤二核苷酸5-12ng/mL，L-谷氨酰胺150mg/L-550mg/L，复合维生素30-110μM，胰岛素12mU/L-24mU/L。然此发明中所含的二甲双胍会干扰维生素的吸收，造成营养不均。
因此急需研制一种无动物来源成分的可扩增间充质干细胞的无血清培养基，在促进间充质干细胞扩增、阻止其分化，使脂肪、骨髓、胎盘、脐带血造血干细胞在体外扩增的同时依然保持细胞多向分化的能力以外，确保无外源物会引起病人严重的免疫反应，从而影响干细胞移植效果。
发明内容
本发明旨在提供一种无动物来源成分的可扩增间充质干细胞的无血清培养基，促进其扩增、阻止其分化，使脂肪、骨髓、胎盘、脐带血造血干细胞在体外扩增的同时依然保持细胞多向分化的能力。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种扩增间充质干细胞的无血清培养基，包括以下组分及其浓度：
Figure BDA0003338326710000021
Figure BDA0003338326710000031
进一步地，以DMEM/F12培养基为溶剂，所述扩增间充质干细胞的无血清培养基包括以下组分及其浓度：
Figure BDA0003338326710000032
Figure BDA0003338326710000041
进一步地，以DMEM/F12培养基为溶剂，所述扩增造血干细胞的无血清培养基包括以下组分及其浓度：
Figure BDA0003338326710000051
Figure BDA0003338326710000061
进一步地，以DMEM/F12培养基为溶剂，所述扩增造血干细胞的无血清培养基包括以下组分及其浓度：
Figure BDA0003338326710000062
Figure BDA0003338326710000071
进一步地，所述的可扩增间充质干细胞的无血清培养基，还包括以下组分及其浓度：姜黄素0.2-2μg/mL、千金藤碱0.1-1.5μg/mL，小檗碱0.05-0.15μg/mL，白藜芦醇0.5-4μg/mL，花青素1-4μg/mL。
进一步地，所述姜黄素浓度为0.5-1.5μg/mL，千金藤碱浓度为0.1-1.0μg/mL，小檗碱浓度为0.05-0.1μg/mL，白藜芦醇1-3μg/mL，花青素2-3μg/mL。
更进一步地，所述姜黄素浓度为1.2μg/mL，千金藤碱浓度为0.5μg/mL，小檗碱浓度为0.05μg/mL，白藜芦醇2μg/mL，花青素2.5μg/mL。
此外，本发明还提供一种可扩增间充质干细胞的无血清培养基的应用，所述的可扩增间充质干细胞的无血清培养基用于扩增脂肪、脐带血、胎盘和骨髓所含有的间充质干细胞。
更进一步地，所述的应用为扩增脂肪、脐带血、胎盘和骨髓所含有的间充质干细胞。
本发明还提供了一种可扩增间充质干细胞无血清培养基的制备方法，具体步骤如下：
将姜黄素、千金藤碱、小檗碱、白藜芦醇、花青素、骨形态蛋白4、β-甘油磷酸、胆固醇、异丁甲基黄嘌呤、EGF、生物素、aFGF、肝素钠、还原型谷胱甘肽、转铁蛋白、胰岛素、抗坏血酸、地塞米松、白介素2、维生素B12、白介素6、干细胞因子、烟酰胺、TGF-β3、血小板生成素、牛磺酸、罗格列酮、FMS样酪氨酸激酶3配体、IGF2、丙酮酸钠、GM-CSF、TPO加入DMEM/F12培养基中，溶解均匀，调节pH值为7.2～7.4，常温下过0.22μm滤膜，即得。
本发明提供的扩增间充质干细胞的无血清培养基中，姜黄素、千金藤碱、小檗碱、干细胞因子具有保持造血干细胞体外多向分化能力；丙酮酸钠、罗格列酮、胰岛素、血小板生成素调节造血干细胞体外增殖，具有明显促进其体外增殖的效果；FMS样酪氨酸激酶3配体、骨形态蛋白4、白介素2和白介素6能够激活间充质干细胞的增殖活性；GM-CSF、aFGF和EGF能够促进间充质干细胞自我更新能力；β-甘油磷酸、异丁甲基黄嘌呤、抗坏血酸、FMS样酪氨酸激酶3配体、TGF-β3促进增殖与贴壁。
千金藤碱属于双苄基异喹啉累生物碱，具有多种生物功能活性，如抗炎、增强免疫功能，发明人将其用于造血干细胞培养基，发现其可改善干细胞因子、血小板生成素、FMS样酪氨酸激酶3配体刺激间充质干细胞的体外增殖使干细胞多向分化能力扩增导致的多向分化性能丢失现象，保证离体干细胞的多分化稳定性。
姜黄素属于黄酮类化合物，科学研究表明具有抗炎、抗氧化、调脂、抗病毒、抗感染、抗肿瘤、抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化等广泛的药理活性，且毒性低、不良反应小。姜黄素具有抑制间充质干细胞癌变，通过诱导恶性肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡及对肿瘤生长各期的抑制效应来发挥其抗癌作用。另外，姜黄素的抗炎活性可比拟甾体药物和非甾体类的药物，如吲哚美辛和保泰松，且在大多数情况下是安全的。
本发明的实验表明，小檗碱不仅具有促进造血干细胞体外增殖效果，有效的维持造血干细胞自我更新以及多向分化能力，而且与千金藤碱、姜黄素联合作用，可令扩增造血干细胞的无血清培养基在具备高效扩增能力、增强细胞贴壁性以及细胞增殖速率的同时，保证干细胞的形态和细胞多向分化的性能，最大限度维持胎盘、骨髓间充质干细胞的性能，并有效抑制间充质干细胞后期培养癌变。
白藜芦醇是非黄酮类多酚化合物，其具有抗衰老、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、免疫调节等生理功能。花青素是广泛存在于植物中的水溶性天然色素，研究表明其具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生理功能。在本研究中发现，二者联用可使造血干细胞自我更新能力提高、有效防止分化，且造血干细胞增殖功能增强。
与现有技术相比，本发明提供的可扩增间充质干细胞的无血清培养基，具有以下优势：
(1)本发明提供的扩增间充质干细胞的无血清培养基中添加了姜黄素、千金藤碱和小檗碱，可保持干细胞自我更新、抑制多向分化能力与抑制其癌变，尤其是添加的白藜芦醇、花青素，可大幅增强造血干细胞的增殖功能，防止其分化，并通过本发明无血清培养基扩增的造血干细胞具有良好的促进患者体内造血系统重建的效果。
(2)本发明提供的扩增间充质干细胞的无血清培养基不含有动物组织来源成份，具备体外扩增来源于脂肪、胎盘、骨髓间充质干细胞的能力，使用本发明的无血清培养基可增加细胞贴壁性能，增加细胞增殖速率，维持细胞形态。
附图说明
图1为本发明实施例7所得的可扩增间充质干细胞的无血清培养基与市售普通干细胞培养基体外扩增间充质干细胞曲线图；
图2为本发明实施例7所得的可扩增间充质干细胞的无血清培养基与市售普通干细胞培养基对间充质干细胞体外扩增图；
图3为本发明实施例7所得的可扩增间充质干细胞的无血清培养基与市售普通干细胞培养基对间充质干细胞扩增后，干性因子Nanog、Oct4、Sox2基因表达水平变化图；
图4为本发明实施例7所得的可扩增间充质干细胞的无血清培养基与市售普通干细胞培养基对间充质干细胞培养扩增后，其抑癌基因P53表达水平变化图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。
本发明所使用的将骨形态蛋白4、β-甘油磷酸、胆固醇、异丁甲基黄嘌呤、EGF、生物素、aFGF、肝素钠、还原型谷胱甘肽、转铁蛋白、胰岛素、抗坏血酸、地塞米松、白介素2、维生素B12、白介素6、干细胞因子、烟酰胺、TGF-β3、血小板生成素、牛磺酸、罗格列酮、FMS样酪氨酸激酶3配体、IGF2、丙酮酸钠、GM-CSF、TPO购于Prprotech公司；丙酮酸钠、罗格列酮、姜黄素、千金藤碱、小檗碱、白藜芦醇、花青素购于Sigma公司；市售普通干细胞培养基购于赛默飞世尔科技有限公司，具体型号为11995040，其余试剂均为市售。
实施例、一种可扩增间充质干细胞的无血清培养基制备
所述可扩增间充质干细胞的无血清培养基以DMEM/F12培养基为溶剂，由以下成份及其浓度组成，参见表1：
表1实施例1～7无血清培养基之成份及其浓度组成
Figure BDA0003338326710000101
Figure BDA0003338326710000111
制备方法为：
取100克DMEM/F12培养基粉末，加入900mL去离子水，再加入3gNaHCO3，加入3g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)，搅拌1h，调pH值为7.2，加入以下成份：姜黄素、千金藤碱、小檗碱、白藜芦醇、花青素、骨形态蛋白4、β-甘油磷酸、胆固醇、异丁甲基黄嘌呤、EGF、生物素、aFGF、肝素钠、还原型谷胱甘肽、转铁蛋白、胰岛素、抗坏血酸、地塞米松、白介素2、维生素B12、白介素6、干细胞因子、烟酰胺、TGF-β3、血小板生成素、牛磺酸、罗格列酮、FMS样酪氨酸激酶3配体、IGF2、丙酮酸钠、GM-CSF、TPO，溶解均匀，去离子水定容至1L，调节pH值为7.2，常温下过0.22μm滤膜，即得。
试验例一、促进间充质干细胞体外促增殖效果
1.实验对象：市售普通干细胞培养基、本发明实施例7制得的可扩增间充质干细胞的无血清培养基。
2.实验方法：
2.1收集脂肪组织、脐带血、骨髓血与胎盘组织，通过单个核细胞分离试剂盒，获取间充质干细胞；
2.2将2.1中获得的间充质干细胞分别用市售普通干细胞培养基和本发明实施例1制得的可扩增造血干细胞的无血清培养基进行培养；接种于96孔板中，设3个复孔，放于培养箱孵育，置于37℃，5％CO2条件下培养，21天后，收集全部细胞，加入CCK-8溶液，继续培养1-4h，酶标仪测定各孔450nm处的OD值(光密度值)，测得吸光度A值。
生长抑制率的计算公式为：增殖率(％)＝OD实验组/OD对照组×100％。
3.实验结果：
图1数据曲线显示，在1-25天内，本发明培养基培养对间充质干细胞增殖效果优于市售培养基，本发明的可扩增间充质干细胞的无血清培养基培养的干细胞增殖快速。
试验例二、克隆形成情况
1.实验对象：市售普通干细胞培养基、本发明实施例7制得的可扩增造血干细胞的无血清培养基。
2.实验方法：
2.1去离子水配制1.0％与0.5％的低熔点琼脂糖，高温高压灭菌，置于40℃水浴保温使之不凝固；分别用本发明实施例1制得的可扩增间充质干细胞的无血清培养基和市售普通干细胞培养基把试验例一分离获取的间充质干细胞调整至密度300个/mL的混合细胞液A和B；
2.2取0.5％的低熔点琼脂糖，分别加入等体积的2.1项所配好的混合细胞液A和B中，混合配成0.25％的上层琼脂糖液A和B；
2.3另分别用市售普通干细胞培养基和本发明实施例1制得的可扩增间充质干细胞的无血清培养基把1.0％的低熔点琼脂糖液稀释成0.5％的底层琼脂糖，均匀铺于6孔板上；
2.4把上述2.2中混匀后含间充质干细胞的0.25％的上层琼脂糖液A和B对应加入2.3中含间充质干细胞6孔板底层琼脂上，使其形成双琼脂层；将6孔板继续培养21天；6孔板加入0.25mL/孔的0.05％结晶紫溶液，37℃孵育30min后观察细胞克隆数，并计算克隆形成率。
3.实验结果：
由图2可知，本发明培养基与市售普通干细胞培养基培养间充质干细胞21天后，经本发明制备的培养基培养的细胞增长率是市售普通干细胞培养基培养增长率的2倍，说明本发明制备的可扩增间充质干细胞的无血清培养基对间充质干细胞的增长促进作用较之市售普通干细胞培养基更为优异。
试验例三、间充质干细胞干性基因Nanog、Oct4、Sox2基因表达水平变化
1.实验对象：市售普通干细胞培养基、本发明实施例7制得的可扩增造血干细胞的无血清培养基。
2.实验方法：
2.1总RNA获取
(1)使用市售普通干细胞培养基和本发明试验例1制得的可扩增间充质干细胞的无血清培养基培养试验例一分离获取的地2代间充质干细胞，在37℃，5％CO2条件下培养7天，1000r/min离心收集药物作用后的细胞，弃去废液，加1mL的Trizol裂解细胞，室温下静置5min；
(2)加入0.2mL的氯仿，涡旋震荡使得细胞充分裂解，然后12000r/min，4℃离心，离心15min，之后使用移液枪轻轻吸取上层液相400μL，避免扰动下层杂蛋白；
(3)加入400μL的异丙醇，混匀，室温放置10min，4℃条件下，转速为12000r/min，离心5min，沉淀，弃去上层液，加入1mL的75％无水乙醇洗涤总RNA沉淀；
(4)将步骤(3)中乙醇洗涤总RNA沉淀在转速12000r/min，4℃条件下，离心5min，移液枪弃去液体，留下白色沉淀RNA；
(5)室温打开EP管盖子，待乙醇挥发晾干总RNA。
2.2反转录
反转录反应条件：温度37℃，时间15min；温度85℃，时间5s；得cDNA。
2.3获取qPCR
反应条件为：95℃，5s，60℃，5s，1个循环；95℃，15s，60℃，1min，42个循环；使用2-ΔΔCt法处理qPCR数据。
3.实验结果：
由图3可知，本发明的可扩增间充质干细胞的无血清培养基培养后的造血干细胞的Nanog、Oct4、Sox2表达水平(分别为3.75、4.18、3.52)均高于市售普通干细胞培养基培养后的造血干细胞的基因表达水平(分别为1.72、2.24、1.56)(P<0.05)，说明经本发明制备的无血清培养基培养间充质干细胞后，干性因子表达水平高于市售普通干细胞培养基，细胞分化状态低于市售普通干细胞培养基培养的细胞。
试验例四、间充质干细胞抑癌基因P53表达水平变化
1.实验对象：市售普通干细胞培养基、本发明实施例7制得的可扩增间充质干细胞的无血清培养基。
2.实验方法：使用市售普通干细胞培养基与本发明试验例1制得非培养基分别培养试验例2制备的第二代间充质干细胞，培养3天、6天、9天、12天，收集细胞，qPCR分析抑癌基因P53表达水平变化总RNA提取以及P53检测方法同试验例3。
3.实验结果：
由图4可知，由本发明制备的干细胞培养基培养的细胞，第3天、6天、9天、12天时P53表达水平分别为3.35、4.75、7.82、6.09；而使用市售普通干细胞培养基培养的细胞，其数值为0.89、2.71、5.36、4.03，两者比较具有统计学意义(P<0.05)。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种可扩增间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，以DMEM/F12培养基为溶剂，包括以下组分及其浓度：
Figure FDA0003338326700000011
Figure FDA0003338326700000021
2.根据权利要求1所述的可扩增造血干细胞的无血清培养基，其特征在于，以DMEM/F12培养基为溶剂，包括以下组分及其浓度：
Figure FDA0003338326700000022
Figure FDA0003338326700000031
3.根据权利要求1所述的可扩增造血干细胞的无血清培养基，其特征在于，以DMEM/F12培养基为溶剂，包括以下组分及其浓度：
Figure FDA0003338326700000032
Figure FDA0003338326700000041
4.根据权利要求1所述的可扩增造血干细胞的无血清培养基，其特征在于，以DMEM/F12培养基为溶剂，包括以下组分及其浓度：
Figure FDA0003338326700000042
Figure FDA0003338326700000051
5.如权利要求1所述的可扩增间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述可扩增间充质干细胞的无血清培养基还包括以下组分及其浓度：姜黄素0.2-2μg/mL、千金藤碱0.1-1.5μg/mL，小檗碱0.05-0.15μg/mL，白藜芦醇0.5-4μg/mL，花青素1-4μg/mL。
6.如权利要求5所述的可扩增间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述姜黄素浓度为0.5-1.5μg/mL，千金藤碱浓度为0.1-1.0μg/mL，小檗碱浓度为0.05-0.1μg/mL，白藜芦醇1-3μg/mL，花青素2-3μg/mL。
7.如权利要求6所述的可扩增间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述姜黄素浓度为1.2μg/mL，千金藤碱浓度为0.5μg/mL，小檗碱浓度为0.05μg/mL，白藜芦醇2μg/mL，花青素2.5μg/mL。
8.一种如权利要求1-7任一所述的可扩增间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述的可扩增间充质干细胞的无血清培养基用于扩增脂肪、脐带血、胎盘和骨髓所含有的间充质干细胞。
9.一种如权利要求1-7任一所述的可扩增间充质干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
将姜黄素、千金藤碱、小檗碱、白藜芦醇、花青素、骨形态蛋白4、β-甘油磷酸、胆固醇、异丁甲基黄嘌呤、EGF、生物素、aFGF、肝素钠、还原型谷胱甘肽、转铁蛋白、胰岛素、抗坏血酸、地塞米松、白介素2、维生素B12、白介素6、干细胞因子、烟酰胺、TGF-β3、血小板生成素、牛磺酸、罗格列酮、FMS样酪氨酸激酶3配体、IGF2、丙酮酸钠、GM-CSF、TPO加入DMEM/F12培养基中，溶解均匀，调节pH值为7.2～7.4，常温下过0.22μm滤膜，即得。
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