CN107460158A - 一种诱导脐带间充质干细胞分化为形成胰岛素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导脐带间充质干细胞分化为形成胰岛素的方法，包括以下步骤：脐带间充质干细胞的体外分离培养；细胞因子诱导脐带间充质干细胞分化为胰岛素细胞：将第3代脐带间充质干细胞接种在T25cm培养瓶中，细胞融合80％‑90％时，加入诱导液，对细胞进行诱导，得到胰岛素细胞。脐血分离培养后的脐带间充质干细胞扩增能力较强，具有多向分化潜能、造血支持及免疫抑制效应。此与捐献骨髓或采集动员外周血相比，供者无痛苦，感染机会少，扩增能力强。

Description

一种诱导脐带间充质干细胞分化为形成胰岛素的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种诱导脐带间充质干细胞分化为形成胰岛素的方法。
背景技术
脐带间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。
脐带间充质干细胞具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出间充质干细胞，且细胞含量、增殖能力优于骨髓间充质干细胞，免疫原性比骨髓间充质干细胞低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。
糖尿病是一种由于多因素导致胰岛B细胞分泌胰岛素相对不足或绝对不足或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性综合征。患者持续性的高血糖与长期的代谢紊乱等可导致全身各个系统出现并发症。糖尿病目前的常规治疗方法仅仅是对症治疗，最佳状态就是使血糖控制平稳，药量在渐渐增加，胰岛功能在逐渐衰竭，目前的治疗效果大多数并不理想，伴随着干细胞及临床转化研究的深入，利用干细胞诱导分化的胰岛细胞治疗糖尿病成为了新的希望。
人脐带间充质干细胞可在体外诱导分化为胰岛样细胞，通过研究发现，这种分化来源的胰岛样细胞不仅对葡萄糖刺激敏感，能够分泌胰岛素，而且还可以表达多种胰岛细胞的基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导脐带间充质干细胞分化为形成胰岛素的方法，以实现通过脐带间充质干细胞制备得到胰岛素。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种诱导脐带间充质干细胞分化为形成胰岛素的方法，包括以下步骤：
(1)脐带间充质干细胞的体外分离培养：取脐血，以等量的PBS缓冲液混匀，缓慢滴入到等量的淋巴细胞分离液，离心；抽取白膜层细胞，以等量的PBS缓冲液洗涤离心，基础培养液重悬，接种至100mm培养皿，置于37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱内培养；第5天首次全量换液，之后每周2次换液，2周后达60％～80％融合时，0.25％胰酶常规消化传代；
(2)细胞因子诱导脐带间充质干细胞分化为胰岛素细胞：将第3代脐带间充质干细胞接种在T25cm培养瓶中，细胞融合80％-90％时，加入诱导液，对细胞进行诱导，得到胰岛素细胞。
所述步骤(1)中，基础培养液的组成为：DMEM/F12，10％胎牛血清、100U/mL青霉素和链霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺。
所述步骤(1)中，离心的条件为：650g离心15min
所述步骤(2)中，对细胞进行诱导方法为：按照两阶段诱导方案对细胞进行诱导：第1阶段：在UltraCULTURE培养基中加入4nmol/L活化素A，25μg/L表皮生长因子，100μg/Lβ-神经生长因子，10mmol/L尼克酰胺，诱导培养至14d；第2阶段：在UltraCULTURE培养基中加入1％胰岛素-转铁蛋白-硒，10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，继续诱导培养14d。
有益效果：脐血分离培养后的脐带间充质干细胞扩增能力较强，具有多向分化潜能、造血支持及免疫抑制效应。此与捐献骨髓或采集动员外周血相比，供者无痛苦，感染机会少，扩增能力强。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
一种诱导脐带间充质干细胞分化为形成胰岛素的方法，包括以下步骤：
(1)脐带间充质干细胞的体外分离培养：取脐血，以等量的PBS缓冲液混匀，缓慢滴入到等量的淋巴细胞分离液，650g离心15min；抽取白膜层细胞，以等量的PBS缓冲液洗涤离心，基础培养液重悬，接种至100mm培养皿，置于37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱内培养；第5天首次全量换液，之后每周2次换液，2周后达60％～80％融合时，0.25％胰酶常规消化传代；其中，基础培养液的组成为：DMEM/F12，10％胎牛血清、100U/mL青霉素和链霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺。
(2)细胞因子诱导脐带间充质干细胞分化为胰岛素细胞：将第3代脐带间充质干细胞接种在T25cm培养瓶中，细胞融合80％-90％时，加入诱导液，按照两阶段诱导方案对细胞进行诱导：第1阶段：在UltraCULTURE培养基中加入4nmol/L活化素A，25μg/L表皮生长因子，100μg/Lβ-神经生长因子，10mmol/L尼克酰胺，诱导培养至14d；第2阶段：在UltraCULTURE培养基中加入1％胰岛素-转铁蛋白-硒，10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，继续诱导培养14d。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种诱导脐带间充质干细胞分化为形成胰岛素的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)脐带间充质干细胞的体外分离培养：取脐血，以等量的PBS缓冲液混匀，缓慢滴入到等量的淋巴细胞分离液，离心；抽取白膜层细胞，以等量的PBS缓冲液洗涤离心，基础培养液重悬，接种至100mm培养皿，置于37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱内培养；第5天首次全量换液，之后每周2次换液，2周后达60％～80％融合时，0.25％胰酶常规消化传代；
(2)细胞因子诱导脐带间充质干细胞分化为胰岛素细胞：将第3代脐带间充质干细胞接种在T25cm培养瓶中，细胞融合80％-90％时，加入诱导液，对细胞进行诱导，得到胰岛素细胞。
2.根据权利要求1所述的诱导脐带间充质干细胞分化为形成胰岛素的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，基础培养液的组成为：DMEM/F12，10％胎牛血清、100U/mL青霉素和链霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺。
3.根据权利要求1所述的诱导脐带间充质干细胞分化为形成胰岛素的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，离心的条件为：650g离心15min。
4.根据权利要求1所述的诱导脐带间充质干细胞分化为形成胰岛素的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，对细胞进行诱导方法为：按照两阶段诱导方案对细胞进行诱导：第1阶段：在UltraCULTURE培养基中加入4nmol/L活化素A，25μg/L表皮生长因子，100μg/Lβ-神经生长因子，10mmol/L尼克酰胺，诱导培养至14d；第2阶段：在UltraCULTURE培养基中加入1％胰岛素-转铁蛋白-硒，10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，继续诱导培养14d。
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