CN105462913A - 一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用转基因法诱导分化人脐带间充质干细胞获得胰岛β细胞的方法，使用包含PDX1、MAFA、NGN3、FOXA2、NEUROD1和FGF21胰岛细胞特异基因并连接穿膜信号的腺病毒表达载体，结合多种重组蛋白和小分子，诱导人脐带间充质干细胞定向分化为有功能的胰岛β细胞。本发明的诱导方法简便、易操作、分化效果好。

Description

一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种诱导形成胰岛β细胞的方法，尤其是涉及一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法。

背景技术

糖尿病是由于胰岛β细胞破坏或胰岛素抵抗所致的胰岛素绝对或相对缺乏。糖尿病治疗目前仍然是治标不治本，药物治疗虽然能有效降低血糖，但不能有效修复胰岛功能。补充胰岛素是1型和部分2型糖尿病的传统治疗方法。但是胰岛素治疗虽能控制症状、延缓和减少并发症的发生，却不能使糖尿病彻底治愈，且长期使用胰岛素会产生诸如失明、肾衰、肥胖等严重的并发症以及产生胰岛素抵抗，另外每天注射胰岛素本身也给患者带来极大的痛苦，给患者、家庭和社会带来沉重的经济负担。胰岛细胞移植虽然是一个有效的治疗策略，然而面临的问题依然是供体缺乏及免疫排斥等医学与伦理学问题。

再生医学在器官修复与替代方面起重要的作用，也为糖尿病的治疗提供了新思路。

间充质干细胞（MesenchymalStemCells，MSCs）起源于中胚层，在骨髓、脐带、脐血、脂肪等多种组织和器官中均可分离获得，具备干细胞的自我扩增和多向分化性，在发育的不同阶段和特定环境条件下，能分化为多种间质起源的组织细胞，如成骨、软骨和脂肪细胞，也能横向分化为肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、肝胰细胞等多种其他组织细胞。MSCs兼具再生、修复和免疫调节等多方面的作用。

而人脐带来源的间充质干细胞（Umbilical-DerivedMesenchymalStemCells，UMSCs）是存在于脐带沃顿胶和血管周围组织中的间充质干细胞。与来源于骨髓的间充质干细胞相比，具有更加显著的优势，包括：采集方便为无创性操作；来源于胎儿脐带的间充质干细胞比成人骨髓间充质干细胞更幼稚，增殖和分化潜能更大；脐带来源丰富，可以进行规模化生产，使其在临床应用尤其是治疗糖尿病方面展现出更广阔的前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方法简便、易操作、效果好的体外诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法。

本发明解决其技术问题的解决方案是：一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，包括以下步骤：

1）将人脐带间充质干细胞在DMEM高糖培养基中培养，得到贴壁生长的人脐带间充质干细胞；

2）用PBS清洗步骤1）中得到的人脐带间充质干细胞，然后用胰酶消化收集；

3）将收集到的人脐带间充质干细胞用无血清的DMEM/F12培养基培养，同时添加六种腺病毒进行腺病毒感染，感染24小时后，用PBS清洗细胞，然后添加含有胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，培养三天后，PBS清洗，再次进行腺病毒感染，如此循环，共进行三次腺病毒感染，完成人脐带间充质干细胞向胰岛β细胞的诱导分化；所述六种腺病毒的转染基因分别为PDX1、MAFA、NGN3、FOXA2、NEUROD1和FGF21。

所述DMEM高糖培养基添加有胎牛血清FBS，碱性成纤维生长因子bFGF。优选地，所述胎牛血清FBS的添加比例为10~20wt%，所述碱性成纤维生长因子bFGF的添加浓度为10~100ng/mL。

所述人脐带间充质干细胞在DMEM高糖培养基中培养3天。

所述人脐带间充质干细胞在DMEM高糖培养基中的培养密度为5×10³个细胞/cm²

用PBS清洗得到的人脐带间充质干细胞3次，然后用0.25%质量体积比的胰酶消化收集。

所述六种腺病毒，每种腺病毒加入的MOI（感染复数）为30，六种腺病毒的总MOI为180。

所述六种腺病毒的滴度分别为PDX1：2.96×10⁸pfu/mL，MAFA：8.52×10⁹pfu/mL，NGN3:5.24×10⁹pfu/mL，FOXA2：4.35×10⁹pfu/mL，NEUROD1：3.62×10⁸pfu/mL和FGF21：4.15×10⁸pfu/mL。

本发明的有益效果是：本发明利用转基因法诱导人脐带间充质干细胞分化，获得胰岛β细胞；具体地，使用包含PDX1、MAFA、NGN3、FOXA2、NEUROD1和FGF21胰岛细胞特异基因并连接穿膜信号的腺病毒表达载体，结合多种重组蛋白和小分子，诱导人脐带间充质干细胞定向分化为有功能的胰岛β细胞。本发明的方法简便、易操作、分化效果好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单说明。

图1是本发明的人脐带间充质干细胞形貌图；

图2~图7人脐带间充质干细胞在向胰岛β细胞分化的过程中形态变化；

图8本发明的实施例1诱导得到的胰岛β细胞双硫腙DTZ染色法鉴定结果；

图9本发明的实施例1诱导得到的胰岛β细胞胰岛功能检测结果。

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。本发明创造中的各个技术特征，在不互相矛盾冲突的前提下可以交互组合。

本发明的一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，具体地步骤是：

1、人脐带间充质干细胞的提取。

使用经产妇同意授权的新生儿脐带作为间充质干细胞的来源。

新鲜获取的脐带，75%乙醇中表面消毒，在超净工作台中操作，生理盐水清洗后分离剥除脐带血管，获得华通氏胶部分。将获得的华通氏胶冲洗后剪碎，稀释后种瓶，在二氧化碳培养箱中培养。通过全量换液逐渐去除未贴壁细胞，待细胞融合度达到70-80%后传代培养，收获的人脐带间充质干细胞冷冻存储待用。

人脐带间充质干细胞的提取并不限于上述方法，还可以通过其他的本领域技术人员熟悉的方法。

显微镜下观察细胞生长情况，可以看到细胞贴壁生长，呈长梭形，包浆透亮，胞体较小，有立体感。如图1所示。

2、六种含转染基因分别为PDX1、MAFA、NGN3、FOXA2、NEUROD1和FGF21的腺病毒准备。

腺病毒为外包制备，-80℃保存，优选地，腺病毒滴度分别为：PDX1：2.96×10⁸pfu/mL，MAFA：8.52×10⁹pfu/mL，NGN3：5.24×10⁹pfu/mL，FOXA2：4.35×10⁹pfu/mL，NEUROD1：3.62×10⁸pfu/mL和FGF21：4.15×10⁸pfu/mL。

3、人脐带间充质干细胞的诱导分化。

3.1将冷冻存储的人脐带间充质干细胞复苏，洗涤一次后以适宜密度于细胞培养皿中培养，培养基成分为DMEM高糖培养基，得到贴壁生长的人脐带间充质干细胞；优选地，所述高糖培养基中按一定比例添加胎牛血清FBS，碱性成纤维生长因子bFGF，进一步地，所述胎牛血清FBS的添加比例为10~20wt%，所述碱性成纤维生长因子bFGF的添加浓度为10~100ng/mL。优选地，所述培养时间为3天。

3.2用PBS清洗得到步骤1）中得到的人脐带间充质干细胞；优选地，清洗三次，然后用0.25%质量体积比的胰酶消化收集。

3.3将收集到的人脐带间充质干细胞用无血清的DMEM/F12培养基培养，同时添加六种腺病毒进行腺病毒感染，感染24小时后，用PBS清洗细胞，然后添加含有胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，培养三天后，PBS清洗，再次进行腺病毒感染，如此循环，共进行三次腺病毒感染，完成人脐带间充质干细胞向胰岛β细胞的诱导分化。优选地，所述六种腺病毒，每种腺病毒加入的MOI为30，六种腺病毒的总MOI为180。

人脐带间充质干细胞在向胰岛β细胞分化的过程中形态变化如图2~7所示。图2为初始贴壁生长的间充质干细胞，形态呈长梭状紧密生长；图3细胞开始聚拢生长；图4聚拢成团的细胞；图5~图7细胞聚拢生长更为明显，形成细胞球。

4、对诱导分化获得的胰岛β细胞进行鉴定。

4.1双硫腙DTZ染色法：

DTZ为螯合指示剂，可与铅、铜、锌等螯合，人和动物（豚鼠除外）的胰岛β细胞因含锌，DTZ染色呈猩红色，其它胰岛细胞不着色，故DTZ对胰岛呈特异性染色。

方法：DTZ10mg溶于3ml无水乙醇(含50μl浓NHOH)，加Hanks液12ml，制成储存液。

使用时用Hanks液（pH7.8）1:100稀释存储液，0.22μm孔径滤膜过滤，之后用于细胞染色鉴定。

吸去细胞液，将工作液加入培养皿，室温10分钟后，镜检。

4.2胰岛功能检测

胰岛素释放试验：染色后细胞经Hanks液洗涤三次，挑选40个左右细胞团分入两个培养瓶中，一瓶加低糖无血清DMEM培养基（含5.5mmol/L葡萄糖），另一瓶加高糖无血清DMEM培养基（含25mmol/L葡萄糖），置于37℃，5%CO₂培养箱中24小时培养，收集培养液用ELISA法分别检测胰岛素含量及C肽含量。

实施例1

1、人脐带间充质干细胞的提取。

使用经产妇同意授权的新生儿脐带作为间充质干细胞的来源。

胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用生理盐水冲洗脐带，再用医用酒精消毒，将脐带置于脐带保存液中2-8℃恒温保存。

用0.9%氯化钠注射液冲洗获得的脐带，重复2~3次，去除血渍。75%乙醇浸没整根脐带消毒灭菌。氯化钠注射液重复洗涤去除残留乙醇。用无菌手术剪将脐带剪成约2~5cm数段，清除脐带小段血管中淤血和凝块。剔除脐带的两条动脉，一条静脉。位于羊膜与血管之间的白色结缔组织即为华通氏胶，用有齿镊将其撕下，放入无菌平皿中，加入适量0.9%氯化钠注射液，洗涤胶体。

胶体转移至离心管，称量记录。用无菌组织剪将称重后的华通氏胶体剪切成1~4mm³的组织匀浆块，加入0.9%氯化钠注射液，离心800~900g，5min。收集末次洗涤液送检无菌。

根据胶体重量，加入适量培养基，定容组织匀浆浓度约为0.4~0.7g/ml，移液器吹打组织匀浆块均匀后，将组织匀浆块接种于T75培养瓶中，加入培养基混合培养。

平置培养瓶使组织匀浆块尽量均匀分布于整个底面，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱。培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2%。

显微镜下观察细胞生长情况，可以看到细胞贴壁生长，呈长梭形，包浆透亮，胞体较小，有立体感。

通过全量换液逐渐去除未贴壁细胞，待细胞融合度达到70-80%后传代培养，收获的人脐带间充质干细胞冻存待用。

2、六种含转染基因分别为PDX1、MAFA、NGN3、FOXA2、NEUROD1和FGF21的腺病毒的准备。

腺病毒为外包制备，-80℃保存，腺病毒滴度分别为：PDX1：2.96×10⁸pfu/mL，MAFA：8.52×10⁹pfu/mL，NGN3：5.24×10⁹pfu/mL，FOXA2：4.35×10⁹pfu/mL，NEUROD1：3.62×10⁸pfu/mL和FGF21：4.15×10⁸pfu/mL。

3、人脐带间充质干细胞的诱导分化。

3.1将冻存的人脐带间充质干细胞复苏，加入离心管中，然后加入预冷0.9%氯化钠注射液，移液管吹打洗涤，定容，混匀，离心，300g，10min。

洗涤一次后以5×10³个/cm²于细胞培养皿中培养，培养基成分为DMEM高糖培养基，其中添加10wt%的胎牛血清FBS，10ng/mL碱性成纤维生长因子bFGF，培养3天。

3.2用PBS清洗得到步骤1）中得到的人脐带间充质干细胞，3次×3min，然后用0.25%质量体积比的胰酶消化收集。

3.3将收集到的人脐带间充质干细胞用无血清的DMEM/F12培养基，以5×10³/cm²的密度培养，第一次加入六种混合的腺病毒，每种腺病毒的MOI为30，总MOI为180。培养24小时后，用PBS洗细胞三次，感染24小时后，用PBS清洗细胞三次，然后添加含有胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，培养三天后，用PBS清洗细胞三次，再次进行腺病毒感染，如此循环，共进行三次腺病毒感染，诱导过程结束，获得人脐带间充质干细胞诱导分化为的胰岛β细胞。

4、对诱导分化获得的胰岛β细胞进行鉴定。

4.1双硫腙DTZ染色法鉴定。

鉴定结果如附图8所示。可见诱导获得的细胞团对DTZ特异性染色呈猩红色，为胰岛β细胞。

4.2胰岛功能检测

参照图9，在体外培养的情况下，低糖培养基和高糖培养基中加入基本等量的诱导分化所得的胰岛β细胞。经过一段时间培养后，其中的胰岛素浓度和C肽浓度都出现了明显差异，由此可见，转化所得细胞球具有胰岛β细胞的分泌功能，而且其胰岛素及C肽分泌水平在高糖条件下显著高于低糖条件。

实施例2

1、人脐带间充质干细胞的提取。

同实施例1。

2、六种含转染基因分别为PDX1、MAFA、NGN3、FOXA2、NEUROD1和FGF21的腺病毒的准备。

腺病毒为外包制备，-80℃保存，腺病毒滴度分别为：PDX1：2.96×10⁸pfu/mL，MAFA：8.52×10⁹pfu/mL，NGN3：5.24×10⁹pfu/mL，FOXA2：4.35×10⁹pfu/mL，NEUROD1：3.62×10⁸pfu/mL和FGF21：4.15×10⁸pfu/mL。

3、人脐带间充质干细胞的诱导分化。

3.1将冻存的人脐带间充质干细胞复苏，加入离心管中，然后加入预冷0.9%氯化钠注射液，移液管吹打洗涤，定容，混匀，离心，300g，10min。

洗涤一次后以5×10³个/cm2于细胞培养皿中培养，培养基成分为DMEM高糖培养基，其中添加20wt%的胎牛血清FBS，100ng/mL碱性成纤维生长因子bFGF，培养3天。

3.2用PBS清洗得到步骤1）中得到的人脐带间充质干细胞，3次×5min，然后用0.25%质量体积比的胰酶消化收集。

3.3将收集到的人脐带间充质干细胞用无血清的DMEM/F12培养基，以5×10³/cm²的密度培养，第一次加入六种混合的腺病毒，每种腺病毒的MOI为30，总MOI为180。培养24小时后，用PBS洗细胞三次，感染24小时后，用PBS清洗细胞三次，然后添加含有胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，培养三天后，用PBS清洗细胞三次，再次进行腺病毒感染，如此循环，共进行三次腺病毒感染，诱导过程结束，获得人脐带间充质干细胞诱导分化为的胰岛β细胞。

4、对诱导分化获得的胰岛β细胞进行鉴定。

4.1双硫腙DTZ染色法鉴定。

鉴定结果表明诱导分化所得到的细胞团DTZ特异性染色呈猩红色。

4.2胰岛功能检测

检测结果表明转化所得细胞球具有胰岛β细胞的分泌功能，其胰岛素及C肽分泌水平在高糖条件下显著高于低糖条件。

以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (9)

1.一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将人脐带间充质干细胞在DMEM高糖培养基中培养，得到贴壁生长的人脐带间充质干细胞；

2）用PBS清洗步骤1）中得到的人脐带间充质干细胞，然后用胰酶消化收集；

3）将收集到的人脐带间充质干细胞用无血清的DMEM/F12培养基培养，同时添加六种腺病毒进行腺病毒感染，感染24小时后，用PBS清洗细胞，然后添加含有胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，培养三天后，PBS清洗，再次进行腺病毒感染，如此循环，共进行三次腺病毒感染，完成人脐带间充质干细胞向胰岛β细胞的诱导分化；所述六种腺病毒的转染基因分别为PDX1、MAFA、NGN3、FOXA2、NEUROD1和FGF21。

2.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于：所述步骤1）中，DMEM高糖培养基添加有胎牛血清FBS，碱性成纤维生长因子bFGF。

3.根据权利要求2所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于：所述胎牛血清FBS的添加比例为10~20wt%，所述碱性成纤维生长因子bFGF的添加比例为10~100ng/mL。

4.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于：所述步骤1）中，人脐带间充质干细胞在DMEM高糖培养基中培养3天。

5.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于：所述步骤1）中，人脐带间充质干细胞在DMEM高糖培养基中的培养密度为5×10³个细胞/cm²。

6.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于：所述步骤1）中，贴壁生长的人脐带间充质干细胞呈梭形。

7.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于：所述步骤2）中，用PBS清洗得到的人脐带间充质干细胞3次，然后用0.25%质量体积比的胰酶消化收集。

8.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于：所述步骤3）中所述六种腺病毒，其中每种腺病毒加入的感染复数为30，六种腺病毒的总感染复数为180。

9.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛β细胞的方法，其特征在于：所述步骤3）中，六种腺病毒的滴度分别为PDX1：2.96×10⁸pfu/mL，MAFA：8.52×10⁹pfu/mL，NGN3：5.24×10⁹pfu/mL，FOXA2：4.35×10⁹pfu/mL，NEUROD1：3.62×10⁸pfu/mL和FGF21：4.15×10⁸pfu/mL。