CN104342402B - 一种骨髓去分化间充质干细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种骨髓去分化间充质干细胞的培养方法。其中包括：从人骨髓中经Ficcol分离培养获得间充质干细胞，待细胞处于生长对数期，直至细胞密度达到70%‑80%时，弃去间充质干细胞培养基，更换成骨诱导培养基进行培养3‑7天后，弃去诱导培养基，并以PBS清洗3次将诱导培养基残夜清除干净，将细胞重新置于间充质干细胞培养基，其中每隔2‑3天更新新鲜培养基，待细胞铺满培养皿后，进行正常消化传代处理，以胰酶消化，消化时间不超过1分钟，细胞传代后继续培养直到第12‑14天结束。通过更换培养基的方法获得的去分化间充质干细胞与传统的人骨髓源间充质干细胞相比，增殖效率提高，成骨分化能力增强。

Description

一种骨髓去分化间充质干细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种人骨髓去分化间充质干细胞的培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)

来源于发育早期的中胚层和外胚层，最初在骨髓中被Friendenstein等发现为非造血组织干细胞，由于其具有可分化为间充质组织细胞的能力，故称之为间充质干细胞。以后陆续在许多组织中分离到，包括脂肪、滑膜、软骨、骨膜、胎盘和脐血。间充质干细胞在合适的条件下可以分化成为内胚层、中胚层和外胚层细胞等,并且易于分离培养。以其独特的低免疫原性和多向分化和自我更新功能得到了普遍的认可，间充质干细胞并广泛的应用于组织工程和再生医学中。

1.间充质干细胞生物学特性

间充质干细胞具备以下共同属性：(1)，间充质干细胞是具有自我维持和自我更新的细胞群体，其细胞数目是相对恒定的，即间充质干细胞具有自稳定性。(2)，在生物体总的细胞构成比上，间充质干细胞只占有其中很小的一部分。(3)，间充质干细胞可在适宜环境中向不同方向分化，即其为相对未分化类细胞。

1.1MSCs具有强大的自我更新和多向分化能力。

MSCs可以分化为软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为造血细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、基质细胞等多种细胞的能力。间充质干细胞可以经诱导向成骨细胞方向分化，也可以经诱导后向脂肪细胞方向分化，其双向分化特性在骨质疏松发生时的骨量减少和骨髓中的脂肪组织增多相伴行的现象中发挥重要作用。研究发现，间充质干细胞在经定向诱导成骨分化成熟后，通过改变诱导培养基的方法，将成骨诱导培养基转换成脂肪诱导培养基后，可见明显脂肪细胞形成。从已分化成熟的细胞形态转换成另一种细胞形态，是间充质干细胞转分化的特点。MSCs在适宜的外界刺激作用下可以分化成非中胚层细胞，包括功能性神经元，星形胶质细胞，内皮细胞等。将MSCs注射到囊胚层后，一部分细胞分化为多种组织和器官的体细胞，如大脑，肝脏，肾脏，肺，脾，血液和皮肤等。间充质干细胞在被诱导后仍然维持其多向分化潜能。

1.2MSCs具有独特的免疫原性。

MSCs通过与细胞的直接接触、旁分泌细胞因子抑制T细胞的增殖、自身免疫反应的微环境等多种途径负性调控免疫应答，发挥其免疫重建功能。一些文献报道MSCs可以分泌多种细胞因子，如肝细胞生长因子和转化生长因子，前列腺素，NO，以及通过细胞之间的直接接触作用参与了PD-1信号通路。Krampera等证明MSCs在与IFN—γ共培养的时候可以抑制B细胞的增殖。Zhang等研究发现在移植前或者移植后多次注射MSCs可下调免疫排斥反应。Schatton等证实MSCs可以延长移植物在体内存活时间。目前大量的文献报道显示MSCs可以在注射到动物体内后，发挥其低免疫原性作用而大大降低移植物引起的免疫排斥作用。

1.3MSCs来源广泛，易于体外分离，扩增和培养，多次培养传代后仍具有干细胞特性，在体外可较长时间保持相对未分化状态。

1.4MSCs间充质干细胞体外转染率高，并且异体移植排异较轻，配型要求不严格，能高效稳定表达多种治疗性外源目的基因。因此，间充质干细胞不仅是组织工程中的具有前景的种子细胞，还是理想的细胞增殖分化模型，被认为是在治疗学和生物技术方面有优质潜能的种子细胞，为器官、组织损伤后的再生修复和自身免疫性疾病治疗带来新的曙光。

2.间充质干细胞的成骨分化

理想的成骨种子细胞应该具备以下特点：(1)容易取材，对机体的伤害小。(2)在体外的定向培养中可以分化为成骨细胞，具有较强的增殖传代能力。(3)细胞移植入体内后能够适应机体的生理、病理和应力等环境的影响并能保持成骨的活性。而间充质干细胞作为组织工程中重要的种子细胞具备了上述成骨种子细胞的特点，成为骨组织工程研究中的具有潜力的优势种子细胞。

在体外分化培养过程中，间充质干细胞需要在特定的成骨诱导环境中培养，才能分化成骨，形成钙化骨样组织。成骨诱导培养的过程分为四个时期：(1)细胞转化期。(2)细胞增殖期。(3)细胞聚集分泌期。(4)细胞外基质矿化期。间充质干细胞在体外成骨诱导培养过程中，细胞形态由贴壁的间充质干细胞向成骨细胞转化，体积变大。转化后发生增殖现象，细胞呈现出集落、融合、复层生长，形成肉眼可见的团块状。其中是以DNA的复制和组蛋白的合成为主要特征。而细胞聚集分泌期则是以碱性磷酸酶(ALP)的活性增高，I型胶原分泌增多为主要特点。最后的矿化期有骨钙素(BGP)分泌和钙离子增多，一些与细胞外基质相关的基因也在这一时期的表达达到高峰，如骨桥蛋白(OPN)，骨钙素(BGP)，骨唾液蛋白(BSP)等。间充质干细胞在向成骨细胞分化的过程中，一些特异性的骨特征标志陆续表达，这些基质蛋白相互之间的协同作用保证了细胞外基质的正常与成熟。细胞外基质的正常成熟后可将成骨细胞包埋其中，使其形成正常的骨组织。

间充质干细胞在成骨分化过程，是一些细胞因子和调节蛋白，还有信号调节通路的共同参与和相互作用的结果，这些调节因子在骨形成，骨修复和骨再生过程中发挥重要的直接或间接的调控作用，从而保证骨形成过程正常和顺利的进行。

2.1骨形成蛋白(BMP)

BMP是一组在诱导成骨和成软骨过程中分泌的重要信号分子。目前已经发现的BMP分子有20多种。BMP与细胞表面的受体结合从而激活BMP相关的信号通路，这些信号通路参与了心肌，中枢神经系统和软骨等的形成和发展过程。在间充质干细胞的成骨分化过程中，BMP诱导未分化的间充质干细胞增殖速度减慢，移植干细胞生长转而向成骨细胞分化。是调节间充质干细胞向成骨细胞分化的重要的初始信号分子，具有跨种属诱导成骨的特点与能力。

BMP是在1971年被Urist等在骨基质中首先发现的，由于其存在骨基质中能使未分化的间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞，并且形成骨组织的活性蛋白质，故被定义为骨形成蛋白。BMP是不含胶原的低分子量蛋白，在血清中含量很低，促进MSCs成骨分化，以及ALP活性增高，钙盐沉积形成新骨，还可刺激血管内皮生长因子合成，增加新生血管形成，促进骨行成和修复。

2.2成骨特异性转录因子(Runx2)

Runx2是转录因子Runx家族中的一员，是成骨细胞特异性转录因子，对骨形成和修复重建起着重要作用，可以调控多种基因的转录。Runx2能激活和启动间充质干细胞向成骨细胞分化的信号分子通路。调查表明Runx2亚型I主要在成骨细胞早期增殖过程中起作用，Runx2亚型II主要在成骨阶段后期对成骨细胞的成熟过程发挥作用，并且Runx2基因与成骨细胞异性顺式作用元件结合后，可激活骨钙素，骨桥素和胶原蛋白的转录和表达，说明Runx2在成骨分化后期仍能控制其功能。Runx2决定着多能干细胞向成骨细胞的分化，促进软骨形成和软骨血管化，而且与细胞外基质的形成有关。

2.3Osterix

Osterix是继Runx2之后发现的成骨细胞分化的关键转录因子，属于新指结构DNA蛋白，处于Runx2下游，与Runx2相互作用于成骨分化过程。

体外分离培养的间充质干细胞具有多向分化潜能，其成骨分化过程受到多种因素的共同影响和调控。鉴于间充质干细胞的成骨分化潜能，以及自体的MSCs移植没有免疫反应等优点，将间充质干细胞应用于骨组织工程具有广阔的临床应用前景和潜能。对于满足骨组织工程的种子细胞质和量的要求，对于满足临床细胞治疗的需求具有重要而深远的意义。

去分化细胞

转分化（Transdifferentiation）是指一种已分化的形态转变成另一种细胞形态，是间充质干细胞的多向分化潜能特点之一。在细胞发生转分化，从一种细胞形态到另一种细胞形态的过程中，细胞不是直接发生转换的，研究表明其中有过渡阶段。在改变间充质干细胞诱导培养条件后，细胞从已分化的形态首先回复到较为原始的细胞形态，即未分化的间充质干细胞形态，后接受外界已改变的诱导因素刺激，定向分化为另一种细胞形态，这个过渡阶段也称之为去分化过程。去分化(Dedifferentiation)又称脱分化，是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有原始未分化细胞特性的过程。去分化往往随之又发生再分化(Redifferentiation)。

两栖类动物在其一生中通过去分化保证复杂机体结构的功能性再生；在哺乳动物中分化是细胞正常逆转，提高内源性再生能力的一种方式。最近的研究表明终末分化的哺乳细胞在损伤或一定培养条件下均可发生去分化。肾脏疾病中肾小管上皮细胞的修复首先需要近曲小管上皮细胞的去分化，然后去分化的细胞移行到损伤部位，进而再分化恢复肾小管的结构和功能。人软骨细胞、上皮细胞、胰岛细胞、脂肪基质细胞均可在一定条件下去分化，具备了某些原始干细胞特性，在再分化中的分化速度和效率均有提高。Li等在头皮移植手术患者中证实移植的上皮细胞去分化后可成为干细胞或类干细胞细胞。人关节软骨细胞在体外单层细胞培养2周后成为去分化，细胞表型与骨髓MSCs接近，甚至表达某些人胚胎干细胞表型SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60和TRA1-81等，同时具有分化为软骨、骨、脂肪、心肌和神经元细胞的潜能；体外单层培养6次传代后的去分化软骨细胞在增殖动力学和细胞周期都与MSCs相似，高表达成软骨相关基因。人胰岛β细胞用基因细胞谱系示踪(genetic6cell-lineage tracing)的方法去分化后表达MSCs的表面标志，虽然未能诱导出明显的中胚层系细胞，但在体外可扩增至16倍以上，并可再分化为胰岛细胞。Zhang等分离大鼠心肌细胞经体外培养4-5天后去分化，此时去分化的心肌细胞增殖有利增殖，表现一定程度的干细胞特性，包括c-kit的表达和具备多项分化潜能。

目前最为典型的去分化细胞是多能诱导干细胞(induced pluripotent stemcells,iPS)，通过向皮肤成纤维细胞的培养基中转入Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4等转录因子基因，诱导成纤维细胞转化为类多能胚胎干细胞。iPS解决了再生医学中自体种子细胞数量不足和免疫学问题，Chan等的研究结果表明MSCs源的神经元细胞撤除神经元诱导因子继续培养2周后去分化间充质干细胞(De-MSCs)可重新回到MSCs样的状态，表达MSCs的某些标志；与未分化的MSCs相比，抗凋亡相关基因和神经元细胞相关基因表达增多，生存期延长，再次分化为神经元细胞的速度更快、效率更高，并可转分化为上皮细胞。人骨髓MSCs源血管平滑肌细胞去分化后仍保留血管平滑肌细胞特有的L型CaV1.2钙离子通道，有利于血管平滑肌的再次分化。并且De-MSCs既保留了间充质干细胞的自我更新和多向分化能力，而且在再次进行定向分化的分化效率是高于未分化MSCs，克服了间充质干细胞在移植体内后的存活率低和分化率低的缺点，可以成为更具有优势的种子细胞。目前已开始用间充质干细胞治疗临床上一些难治性疾病，如脊髓损伤、脑瘫、肌萎缩侧索硬化症、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、克隆氏病、中风、糖尿病、糖尿病足、肝硬化等，根据初步的临床报告，间充质干细胞对这些疾病的治疗都取得可观的疗效。

但是，近来有研究发现，尽管间充质干细胞显示出了良好的治疗效果，但大多数的研究发现表明MSCs在体内的生存期和分化效率都处于较低水平；特别是当间充质干细胞直接注射到损伤部位时，可观察到移植细胞大量死亡，有效细胞数目不多，且容易向周围多种组织分化，而并不是分化为目的细胞。这种间充质干细胞在移植体内后存在着定向分化效率差和存活率低的问题极大的限制了其在组织工程研究以及临床上的应用前景。并且，间充质干细胞具有强大的免疫抑制功能，但是越来越多的研究表明MSCs在分化过程中免疫原性上调，导致机体的免疫应答和移植失败。因此寻找生存期更长、分化效率更高的种子细胞仍然是组织工程学中亟待解决的问题。

而目前现有技术中常见的获得去分化细胞的技术，主要是采用对于去分化细胞的人工诱导方法，如：转基因、细胞融合、化学小分子诱导等。但这些方法存在实验操作时间周期长，实验过程也极为复杂，实验成本高等问题。此外，虽然Chan等研究了使用神经元诱导因子诱导的鼠De-MSCs具有更强的神经分化能力，但是该方法仅特异的针对神经元诱导进行研究，目前并没有文献报道利用更简便易于操作又节约的可行的培养方法，以诱导获得定向分化效率高存活率高的骨髓去分化间充质干细胞。

发明内容

为了解决上述存在的技术问题，本发明提出一种骨髓去分化间充质干细胞的培养方法。通过对间充质干细胞进行节约且短暂的诱导培养后去除诱导条件，继续初始的干细胞培养而将细胞培养成为去分化间充质干细胞，该培养方法包括以下步骤：

一种骨髓去分化间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：

第一步，从骨髓中分离获得间充质干细胞；

第二步，将间充质干细胞在间充质干细胞完全培养基中进行细胞培养；

其中，第二步所述的细胞培养的步骤中，还包括更换诱导培养基进行诱导培养的步骤。

其中，所述的诱导培养为将所述的间充质干细胞在诱导培养基中培养3-10天，优选的为5-7天。

其中，所述的间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞，从人骨髓分离获得，优选的为3-5代的人骨髓间充质干细胞。

其中，所述的人骨髓间充质干细胞具有能分化为成骨的能力。

其中，所述的诱导培养基为成骨诱导培养基。

其中，所述第二步的细胞培养为将细胞培养至处于对数生长期，优选的，培养至细胞密度达到70%-90%时，弃去所述间充质干细胞完全培养基，更换诱导培养基进行诱导培养。

其中，在所述的诱导培养的步骤之后，弃去诱导培养基，将细胞重新置于间充质干细胞完全培养基中培养并传代得到De-MSCs细胞，优选的，培养并传代12-14天。

其中，在更换诱导培养基的之前和之后还包括将培养基残液清除的步骤。

其中，所述的清除的步骤为用PBS进行清洗，优选的PBS清洗2-3次。

其中，所述的诱导培养基由以下成分配制而成：DMEM-L培养基、10%胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100mg/L、L-抗坏血酸50ug/ml、β-磷酸甘油钠10mmol/ml、地塞米松10^{- 8}mmol/ml。

本发明所述的从骨髓中分离获得间充质干细胞是从健康的人骨髓中分离采集获得的间充质干细胞，并且将细胞置于间充质干细胞完全培养基中进行培养，通常为使培养基给细胞提供充分的生长所需物质，每隔一段时间更换新鲜的完全培养基，优选的每2-4天更换培养基，待细胞处于生长对数期时（至细胞密度达到约70%-90%），弃去间充质干细胞完全培养基，以PBS清洗将间充质培养基清除干净，优选的，通常采用PBS清洗2-3次。更换诱导培养基进行短暂的培养，优选地，培养3-10天，更优选地，培养5-7天，诱导培养后弃去诱导培养基，以PBS清洗将诱导培养基残液清除干净，优选的PBS清洗2-3次，将清洗后的细胞重新置于间充质干细胞完全培养基，每隔一段时间更新新鲜培养基，优选的，通常每隔2-4天更换完全培养基，待细胞铺满培养皿后进行正常消化传代处理，以胰酶消化，消化时间不超过1分钟，否则消化时间过长会导致细胞死亡，细胞传代后继续培养直到第12-14天获得诱导培养的De-MSCs细胞。

本发明在以往间充质干细胞正常培养的基础上，采用更换细胞培养基的方法，获得去分化间充质干细胞，本发明所述的培养方法采用本领域常规使用的完全培养基（间充质干细胞培养基）和诱导培养基，在特定条件和特定剂量配比的培养基培养下对细胞进行短暂诱导，实验操作简易便捷，实验成本非常低，实验周期短，仅需经短暂诱导时间便可以高效的获得去分化间充质干细胞。

根据本发明所述的培养方法获得的去分化间充质干细胞具有以下优点：

1）获得的去分化间充质干细胞其形态回复到干细胞长梭形，单层，扁平贴壁的状态，表达干细胞标志。

2）保留和维持了部分干细胞特性，可发生多向分化，在一定条件下可以分化为成骨、脂肪、软骨等，具有修复与再生的功能。

3）在细胞生物学特性方面，去分化间充质干细胞体外增殖速率提高，移植体内之后，抗凋亡能力增强，使存活力增强。

4）在定向分化能力方面，去分化间充质干细胞在体内、外成骨分化效率提高。

上述优点使本发明的方法培养的去分化间充质细胞能够在组织工程中以及临床上被广泛应用。

附图说明

图1.A光镜下观察未分化间充质干细胞MSCs形态图;

图1.B光镜下观察去分化间充质干细胞De-MSCs形态图;

图2未分化和去分化间充质干细胞流式细胞检测图;

图3光镜下观察未分化MSCs和去分化间充质干细胞De-MSCs成脂肪诱导;

图4 CCK8检测未分化和去分化间充质干细胞体外增殖实验(n=5,p<0.01);

图5.A间充质干细胞成骨再分化7天形态图;

图5.B去分化间充质干细胞成骨分化7天形态图;

图6.qPCR检测未分化和去分化间充质干细胞体外成骨诱导7天成骨相关基因检测(n=3;**,P<0.01);

图7未分化和去分化间充质干细胞体外成骨诱导14天碱性磷酸酶ALP活性检测(n=4;**,P<0.01);

图8未分化和去分化间充质干细胞体外成骨诱导28天茜素红染色图；

图9未分化和去分化间充质干细胞体内成骨诱导7天碱性磷酸酶ALP活性检测体内活性检测(n=6,P<0.01)；

图10.qPCR分析未分化和去分化间充质干细胞体内成骨诱导7天成骨相关基(n=3,P<0.05)；

图11未分化MSCs和去分化间充质干细胞De-MSCs体内成骨诱导30天H&E染色图；

图12未分化MSCs和去分化间充质干细胞De-MSCs体内成骨诱导30天collagen I型胶原图。

具体实施方式

实施例1：诱导培养的成骨去分化间充质干细胞及其生物学特性分析实验

1.材料

1.1试剂

1640完全培养基：Hyclone公司（美国）；胎牛血清、胰酶、青链霉素：Gibco公司（美国）；PBS：solarbio公司（美国）；DMSO、胰蛋白酶、地塞米松、β—磷酸甘油、2-磷酸－左旋VitC、均购自Sigma公司（美国)，试验涉及流式抗体均购自eBioscience公司（美国)，细胞培养皿及48、96孔板：Corning（美国），cck8试剂盒(Dojindo日本)。其余试剂均为国产分析纯。

1.2.仪器

CO₂孵育箱，Thermo（美国）；超净工作台（苏州净化设备厂）；生物安全柜（北京五洲科技发展有限公司）；高压蒸汽灭菌锅、恒温烤箱（八八金实验器材有限公司）；酶联免疫检测仪（Bio Tek公司（美国））；流式细胞仪（BD公司(美国)）；倒置显微镜（Axiovert（德国））；正置显微镜及照相系统（CarlZeiss（德国））；超纯水过滤机（Millipore（美国））；温控离心机（ThermoFisher Scientific（美国））；离心机（Thermo Fisher Scientific（美国））；4℃冰箱（Panasonic公司（日本））；水浴锅（江苏荣华仪器制造有限公司）；微量移液枪（Gilson(法国)）；超低温冰箱（Revco）。

2.实验方法

2.1骨髓MSCs的分离、培养和鉴定

无菌条件下采集健康成人骨髓3ml(按医院规定，并经家属同意)，经生理盐水稀释后，在华氏管中加入Ficoll分离液(1.077g/L)4ml，以2000rpm,20℃,30min离心，收集单个核细胞，用PBS液洗涤3遍，弃上清，重悬于完全培养基(含L-DMEM，10%FBS)，按1×10⁵/ml的密度接种于六孔板中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱培养，原代细胞接种48小时后进行首次全量换液，此后每2-4天进行换液，待细胞生长铺满至瓶底70%-90%时，传代，以后按常规方法传代、冻存。培养三代以后的细胞进行流式鉴定和分化能力的鉴定，包括成脂肪诱导和成软骨诱导，鉴定结果符合MSCs特点后用于实验，记为MSCs。

2.2De-MSCs(De-MSCs)诱导和细胞培养

将前述传代3-5代的MSCs细胞常规细胞培养，约长满75㎝²培养皿约80%，PBS洗3次后加入成骨培养基(低糖DMEM、10%FBS、L-抗坏血酸50ug/ml、β-磷酸甘油钠10mmol/ml、地塞米松10^-8mmol/ml、青霉素100U/mL、链霉素100mg/L)进行成骨诱导培养，7天后PBS冲洗3次，加入MSCs完全培养基继续培养，每2-4天换液，正常情况传代，2周成为去分化干细胞，记为De-MSCs。

2.3MSCs和De-MSCs的细胞表型分析比较

细胞培养皿中培养细胞，去除培养基，PBS漂洗2次，胰酶消化，待细胞将要从培养瓶壁脱落时，加入培养基终止消化，将细胞从培养瓶上吹落并分散成单细胞悬液。将获得的MSCs和De-MSCs调整细胞浓度为1×10⁶/孔，分别加入CD29、CD34、CD45、CD90、CD105和HLA-DR抗体，1ug/孔，置4℃孵育30min，PBS洗2遍，直至单抗可直接上流式细胞仪检测，间标则再加相应二抗，再置4℃孵育30min，PBS洗2遍后，进行流式细胞仪分析。

2.4MSCs和De-MSCs的细胞增殖实验

细胞培养皿中培养细胞，取对数生长期的细胞用于实验。倒去培养基，PBS漂洗2次，胰酶消化，待细胞将要从培养瓶壁脱落时，加入培养基终止消化，将细胞从培养瓶上吹落并分散成单细胞悬液。进行细胞计数，并进一步稀释成1×10⁴/mL。将细胞分种于96板（MSCs组和De-MSCs组），每孔加200μl细胞悬液。将培养板置于5%CO₂、37℃培养箱中，培养24小时（h）细胞完全贴壁后，分别培养1d，3d，5d和7d。每组每个时间段均设6个复孔。于培养终止前3h每孔加入20μlCCK8试剂。实验结束时于酶标仪上450nm波长处检测吸光度A值。实验重复3次。以时间为横轴、OD值为纵轴绘制不同组的细胞生长曲线，进行比较。

2.5MSCs和De-MSCs的脂肪诱导实验

将获得的MSCs和De-MSCs以相同浓度接种于六孔板中，待生长至50%满时，细胞培养液更换为成脂诱导培养液(DMEM+10%FBS+IBMX50mmol/L+胰岛素1mg/L+地塞米松0.1μmol/L+吲哚美辛200μmol/L)进行成脂诱导分化，约15天后出现脂肪细胞形态，油红染色鉴定

2.6统计学分析

所有数据采用均值±标准差表示，SPSS17.0进行方差分析，*表示P<0.05，**表示P<0.01，为差异有显著意义。

3.结果

3.1.MSCs和De-MSCs形态观察

光镜下见MSCs呈长梭形，经7天成骨诱导后MSCs形成明显结节状结构，撤除诱导继续培养2周后的De-MSCs结节状结构消失，回复到长梭样状态，形态近似MSCs（见图1A和图1B）。从细胞形态方面说明了已分化的MSCs在撤除诱导因素后可以回复到较为初始的状态，De-MSCs形态类似MSCs。

3.2.细胞表型分析

目前尚无MSCs的特异性标志，大家公认的是不表达造血细胞表面抗原，泛白细胞表面抗原。如CD45、CD34阴性，CD90、CD105阳性表达等。我们实验中所分离的MSCs的表型鉴定结果符合这一标准，而De-MSCs流式表型鉴定结果显示CD29,CD90，CD105表达阳性，CD34,CD45,HLA-DR表达阴性，与MSCs的结果保持一致。提示De-MSCs仍保留MSCs细胞表型，具有MSCs部分特性。（见图2）。

3.3.MSCs和De-MSCs成脂肪诱导

将MSCs与De-MSCs以相同细胞浓度种于细胞培养皿中，培养14d后进行油红染色，两组细胞镜下均可见脂滴形成，提示两组细胞成脂肪诱导成功（见图3）。

3.4.MSCs和De-MSCs的细胞增殖实验

MSCs与De-MSCs组在成骨培养基中培养，观察1d,3d,5d,7d四个时间点两组细胞增殖能力的差别情况，结果显示De-MSCs在1d,3d,5d,7d的增殖力均高于同一时间点的MSCs。提示De-MSCs在对其进行成骨诱导时，细胞增殖速度快于MSCs，增殖能力更强（p<0.01,见图4）。

4.结果分析

本领域已知的MSCs具有的多向分化潜能和独特的低免疫原性使其成为理想的异基因移植首选，和再生医学的种子细胞，也是组织工程的研究重点。本发明在实验中采用操作简便，周期较短的更换培养基的方法来诱导去分化细胞（将MSCs定向诱导一定时间后重新置于MSC培养基继续培养诱导De-MSCs）。以上实验结果显示了去分化间充质干细胞表达间充质干细胞的表面标志，说明De-MSCs仍具有间充质干细胞的分化潜能的可能性。在去分化培养过程中，撤除成骨诱导培养条件继续间充质干细胞培养后，培养皿中聚集的细胞团块消散，细胞又恢复到单层结构生长，说明De-MSCs具有自我更新的能力。细胞增殖效率的检测发现在体外培养中，De-MSCs的增殖效率较MSCs更强，说明De-MSCs的生长能力更好。从细胞生长能力的角度可得出本发明的细胞培养出来的De-MSCs更优于MSCs，是更理想的种子细胞。并且本发明方法培养获得的De-MSCs表达与MSCs一致的表面标志，也具有自我更新的能力，但是却不完全相同与MSCs的生物学特性，具有更强的细胞增殖能力。

实施例2：诱导培养的去分化间充质干细胞体外成骨潜能分析实验

1.材料

1.1试剂

1640培养基：Hyclone公司（美国）；胎牛血清、胰酶、青链霉素：Gibco公司（美国）；PBS：solarbio公司（美国）；DMSO、胰蛋白酶、地塞米松、β—磷酸甘油、2-磷酸－左旋VitC、茜素红均购自Sigma公司（美国)，试验涉及流式抗体均购自eBioscience公司（美国)，细胞培养皿及48、96孔板：Corning（美国），cck8试剂盒(Dojindo日本)，逆转录试剂及qPCR试剂均购自Takara公司（日本),ALP试剂盒(南京基天公司)。其余试剂均为国产分析纯。

1.2仪器

CO₂孵育箱，Thermo（美国）；超净工作台：苏州净化设备厂；生物安全柜：北京五洲科技发展有限公司；高压蒸汽灭菌锅、恒温烤箱：八八金实验器材有限公司；酶联免疫检测仪：Bio Tek公司（美国）；流式细胞仪：BD公司(美国)；倒置显微镜：Axiovert（德国）；正置显微镜及照相系统：CarlZeiss（德国）；超纯水过滤机：Millipore（美国）；温控离心机：ThermoFisherScientific（美国）；离心机：Thermo Fisher Scientific（美国）；4℃冰箱：Panasonic公司（日本）；水浴锅：江苏荣华仪器制造有限公司；微量移液枪：Gilson(法国)；超低温冰箱：Revco；普通逆转录PCR扩增（RT-PCR扩增仪）——德国Biometra公司；实时定量PCR仪：Bio-Rad CFX96(美国)。

2.实验方法

将MSCs和De-MSCs（细胞培养方法同实施例1中2.1和2.2的操作步骤）分别进行成骨诱导培养，诱导7天后分别记为间充干细胞成骨(OB)和去分化成骨(Re-OB)。

将MSCs和De-MSCs，OB和Re-OB四种细胞以相同的细胞浓度收集起来，用于实验检测。

2.1实时定量PCR检测MSCs和De-MSCs，OB和Re-OB成骨相关基因表达

①器材准备

(1)，灭菌消毒：所有塑料器具经浓盐酸浸泡过夜，充分洗涤，依次用单蒸水及双蒸水冲洗后于37℃烘干，然后辐照灭菌；所用玻璃器具经洁消精浸泡30min，依次用单蒸水及双蒸水冲洗后高温烘干，120℃高压灭菌。

(2)，去RNA酶处理：所用的EP管、枪头等塑料器材均经0.1%DEPC水浸泡过夜，烘干后120℃高压灭菌处理；试剂需未拆封或DEPC水配制。

②引物的设计和合成

所用引物由上海生工合成。见表.1

③MSCs和De-MSCs,OB和Re-OB总RNA提取

所用器材及试剂经去RNA酶处理，依据Trizol试剂盒，收集细胞加入1ml Trizol液，漩涡震荡，室温静置10-15min，使细胞完全破壁。取溶解细胞转入Eppendorf管中；加入氯仿0.2ml，上下翻转震荡15s，室温静置2-3min；4℃离心，12,000g×20min；转移上层无色水相至另一Eppendorf管中，加入与上层水相相同体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；4℃离心，12,000g×10min；弃上清，75%乙醇洗涤沉淀一次，4℃离心，7,500g×5min；放在操作台中至沉淀干燥，取适量的DEPC水溶解沉淀，并在室温静置10min，使沉淀完全溶解，分装后-80℃保存备用。

④逆转录合成cDNA

每个样本各取5μlRNA提取物加入200μl反应管中，随后加入oligo(dT)1μl，DEPC水6μl至12μl，混匀离心3秒，以上操作均在冰盒上进行，置于PCR仪反应：65℃5min；然后立刻置冰上5min，以此加入5×RT-buffer4μl，10×dNTP2μl，Ribonuclease inhibiter1μl，Reversetranscriptase1μl,DEPC水至20μl，PCR仪进行逆转录反应，反应条件：42℃60min，70℃5min。逆转录反应产物保存于-20℃备用。见表.2

⑤Real-time PCR反应—相对定量分析

操作程序按照PrimeScript　RT-PCR Kit II(TaKaRa)进行（见表.3)：取④所得的逆转录产物cDNA2μl加到96孔PCR反应管中，加入TakaraSYBR Green10μl，Primer1及Primer2各0.8μl，Rox ReferenceDye(50X)0.4ul,DEPC水6μl，上述过程均在冰盒上操作。Real-time PCR扩增仪反应，反应条件：40cycles at95℃30sec，60℃34sec，72℃30sec（见表.4）。以GAPDH作为内参。扩增产物由LightCycler软件系统进行分析。

MSCs和De-MSCs成骨相关基因BMP2,Runx2,Osterix,DLX5,Beta-c mRNA扩增倍数的影响按下列公式计算：

Amplified multiples=2^-△△Ct

△△Ct=（Ct靶基因－Ct内参）_De-MSCs－（Ct靶基因－Ct内参）_MSCs

2.2MSCs和De-MSCs的碱性磷酸酶ALP活性检测

将MSCs和De-MSCs用胰酶消化后制成密度为1×10⁵/ml细胞悬液，分别接种于六孔板中，每孔加入3ml完全培养基置于5%CO₂、37℃培养箱中，每组细胞设4个复孔。待细胞完全贴壁后，倒去完全培养基，PBS清洗3次，每孔加入成骨诱导培养基3ml，培养过程中不进行传代操作，4-5天进行半量换液。分别同时培养2周后，取每组细胞培养上清，根据碱性磷酸酶ALP试剂盒对于上清液中ALP测定步骤进行操作。

充分混匀37℃水浴15分钟

显色剂(ml)1.51.51.5

立即混匀，520nm,0.5cm或者1cm光径比色，空白管调零，测各管吸光度。

计算公式：

a)MSCs和De-MSCs的成骨分化形态学检测

将MSCs和De-MSCs用胰酶消化后制成密度为1×10⁵/ml细胞悬液，分别接种于六孔板中，每孔加入3ml完全培养基置于5%CO₂、37℃培养箱中，每组细胞设4个复孔。待细胞完全贴壁后，倒去完全培养基，PBS清洗3次，每孔加入成骨诱导培养基3ml，培养过程中不进行传代操作，培养30天后倒去培养液。去离子水小心清洗3遍，倒置显微镜观察钙结节。后加入固定液(PBS：去离子水：甲醛=1:1:1.5)37℃培养箱中孵育30min，弃固定液后加入茜素红染液1ml，室温45min，倒掉染液，去离子水小心清洗2遍至无明显染液残留。倒置显微镜观察钙结节染色情况。

2.3统计学分析

所有数据采用均值±标准差表示，SPSS17.0进行方差分析，P<0.05为差异有显著意义。

表.1PCR扩增所需引物的序列

表.2逆转录系统

表.3实时定量（Real-time）PCR系统

表.4实时定量（Real-time）PCR扩增体系

3.结果

3.1OB和Re-OB形态观察

对MSCs和De-MSCs进行7天成骨诱导之后，细胞由单层生长的长梭形形态在接受成骨诱导刺激后，发生聚集层叠，形成在镜下可见的结节状细胞团块。Re-OB可在细胞培养皿中形成较多的团块状结构（见图5）。

3.2实时定量PCR检测成骨相关基因表达

将MSCs与De-MSC，OB和Re-OB两组细胞同时成骨诱导7天后检测成骨相关基因，发现以MSCs为对照，De-MSCs再成骨后基因表达明显高于MSCs成骨，Runx2表达增加2.89±0.76倍，BMP2增加3.82±0.98倍，Osterix增加13.82±0.76倍以MSCs为对照，OB成骨基因表达Runx2增加0.85±0.05倍，BMP2增加0.46±0.08倍，Osterix增加0.4±0.06倍,而Re-OB基因表达Runx2增加5.99±0.69倍，BMP2增加6.48±0.19倍，Osterix增加13.69±0.41倍，(P<0.01，见图6)，表明De-MSCs有更强的成骨分化潜能，成骨分化效率更高，诱导后的成骨基因表达比未诱导状态更加明显。

3.3ALP活性检测

ALP是成骨细胞活动产物，浓度与细胞的活性成正相关，是反应成骨能力敏感指标。De-MSCs与MSCs同时成骨诱导14天，收集上清检测ALP活性值，结果示De-MSCs显著高于MSCs(msc组0.58±0.015，De-msc组0.72±0.006，P<0.01)，提示De-MSCs成骨分化能力较MSCs更强（见图7），qPCR检测成骨相关基因的表达和碱性磷酸酶活性结果提示本发明方法获得的De-MSCs不仅具有MSCs的成骨分化能力，即多向分化能力，而且De-MSCs的成骨分化能力明显高于MSCs。

3.4茜素红染色

间充质干细胞在成骨诱导培养过程中，出现钙盐分泌，细胞外基质矿化形成钙结节，茜素红染色检测钙结节形成情况是分析细胞成骨能力的一种方法。实验中MSCs与De-MSCs同时成骨诱导28天进行茜素红染色。光镜下明显可见红色的钙结节，形态学上进一步证实了De-MSCs成骨能力（见图8）。

4.结果分析

以上体外实验证明，按照本发明的培养方法获得的De-MSCs与Mscs成骨分化能力的比较实验结果证实，De-MSCs在成骨培养基中增殖较MSCs为快，成骨相关基因表达较MSCs明显增高；成骨培养14天后，培养上清液中ALP含量高于MSCs。De-MSCs再次成骨分化潜能较MSCs更为明显，分化效率显著高于MSCs。并且实验结果显示本发明的方法获得的De-MSCs具有MSCs的部分特点，表达间充质干细胞表面标志和回复长梭形形态结构，能够进行成骨分化，说明De-MSCs类似MSCs，但是增殖实验结果提示De-MSCs具有更优的细胞增殖能力和生长能力，De-MSCs在细胞生物特性方面更优于MSCs。

本发明的方法培养的De-MSCs是将已分化的细胞去除诱导因素，失去分化细胞特点而形成的较为原始的细胞形态，也称之为类间充质干细胞。形态与功能也接近未分化间充质干细胞。其具备和保留的未分化MSCs的部分特点：(1)，自我更新和多向分化潜能。对去分化间充质干细胞进行定向诱导可分化成目的细胞，说明仍保留分化能力。(2),保留表达间充质干细胞表面标志。去分化间充质干细胞表面标志CD29，CD34，CD45，CD90，CD105，HLA-DR表达结果情况与为分化间充质干细胞保持一致。该De-MSCs与未分化MSCs的不同：(1),De-MSCs不仅表达干细胞基因，而且表达部分已分化细胞基因。(2),去分化间充质干细胞增殖能力较未分化间充质干细胞更强。(3),研究表明移植体内后，去分化间充质干细胞具有更强的抗凋亡能力和定向分化能力。

进一步体外实验检测了按本发明方法获得的De-MSCs与MSCs的成骨相关基因，结果显示BMP2，Runx2，Osterix，DLX5，Beta-c等表现出明显的上调，证实了对MSCs和De-MSCs的成骨诱导分化是成功的，更重要的是，De-MSCs的成骨相关基因的表达情况是明显高于MSCs的表达，从基因表达方面说明了De-MSCs具有更强的成骨能力。碱性磷酸酶ALP和I型胶原是成骨细胞中含量最丰富的两种成分，在未诱导分化的MSCs中仅有少量的表达，开始成骨诱导后，其含量随着诱导时间的延长表达逐渐增加，在诱导的第14天达到高峰，后开始逐渐下降，在矿化形成期表达微量。Runx2和Osterix（OSX）是间充质干细胞在成骨诱导分化过程中两个非常重要的转录调控因子。其中Runx2参与成骨分化的启动，Osterix调控骨的矿化，而Osterix的作用表达是需要结合Runx2的协同作用来共同发挥。未分化的MSCs不表达Runx2和Osterix，在诱导分化过程的第3天，Runx2表达量开始增高，达到高水平后即维持较高水平相对稳定，Osterix是在开始诱导是即有少量表达，在第14天达到高峰。骨形成蛋白（BMP2）也是成骨分化过程中非常重要的调控因子。我们在De-MSCs的成骨能力时检测了分化过程中几种非常重要和典型的蛋白和因子，得到的结果均提示De-MSCs有更强的成骨分化能力。

实施例3：诱导培养的去分化间充质干细胞体内成骨潜能分析实验

1.材料

1.1试剂

1640培养基：Hyclone公司（美国）；胎牛血清、胰酶、青链霉素：Gibco公司（美国）；PBS：solarbio公司（美国）；DMSO、胰蛋白酶、地塞米松、β—磷酸甘油、2-磷酸－左旋VitC、均购自Sigma公司（美国)；细胞培养皿及48、96孔板：Corning（美国）；Trizol，逆转录试剂及qPCR试剂均购自Takara公司（日本)；ALP试剂盒(南京基天公司)；胶原模块(中国科学院戴建武教授惠赠)；BCA蛋白质定量试剂盒，RIPA裂解液，PMSF：碧云天生物技术研究所(上海)。其余试剂均为国产分析纯。

1.2仪器

CO₂细胞孵育箱，Thermo（美国）；石蜡切片机：Leica(德国)；超净工作台：苏州净化设备厂；生物安全柜：北京五洲科技发展有限公司；高压蒸汽灭菌锅、恒温烤箱：八八金实验器材有限公司；酶联免疫检测仪：Bio Tek公司（美国）；倒置显微镜：Axiovert（德国）；正置显微镜及照相系统：Carl Zeiss（德国）；超纯水过滤机：Millipore（美国）；温控离心机：Thermo Fisher Scientific（美国）；4℃冰箱：Panasonic公司（日本）；超低温冰箱：Revco；普通逆转录PCR扩增（RT-PCR扩增仪）——德国Biometra公司；实时定量PCR仪：Bio-RadCFX96(美国)；电子天平(Sartorius公司，德国)；微量移液枪：Gilson(法国)；水浴锅：江苏荣华仪器制造有限公司。

1.3细胞

MSCs和De-MSCs细胞培养方法同实施例1，收集实验所需的每组细胞。1.4SCID小鼠：上海斯莱克实验动物有限公司（许可证号码：SCXK（沪）2012-0002），饲养在苏州大学动物中心。

2.方法

样品准备

①材料：将无菌材料切成5mmX5mmX2mm大小，分成2组，每组10块。

②细胞：培养皿中培养细胞，取对数生长期的MSCs和De-MSCs细胞用于实验。倒去培养基，PBS漂洗2次，胰酶消化，待细胞将要从培养瓶壁脱落时，加入成骨诱导培养基终止消化，将细胞从培养瓶上吹落并分散成单细胞悬液。进行细胞计数，并进一步稀释成8×10⁵/20μl。

③将同样细胞数的MSCs和De-MSCs两组细胞分别种植于胶原模块内，每个模块上滴加含有8×10⁵个细胞数，20μL成骨诱导培养基，置于5%CO₂、37℃培养箱中孵育3个小时。

④动物模型：随机选择180—200g的SCID小鼠，按照每100g体重注射1.5mg戊巴比妥钠进行麻醉。在背部剃毛后，每只SCID小鼠背部皮肤切开一个独立的切口，将一块事先准备好的材料移植入SCID小鼠皮下，每组细胞种植10个模块。模块大小为5mmX5mmX2mm按无菌原则将小鼠缝合好置入其无菌生长环境，用于实验。

2.1碱性磷酸酶活性检测

待植入细胞模块的SCID小鼠生长7天后，将小鼠处死取出植入细胞模块。所有操作均在冰上进行。

①取出的模块置入高压灭菌后的碾磨皿内，将其剪成细小碎片。

②融解RIPA裂解液，混匀，取适当量裂解液，在使用前数分钟加入PMSF，使PMSF得最终浓度为1mM。

③按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分，可以适当的增加裂解液的量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量)。

④用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。

⑤充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清。

根据BCA蛋白定量计算碱性磷酸酶蛋白含量

①将试剂盒中标准品按照说明书方法稀释成所需BSA标准液。

②配制BCA工作液：将试剂盒中的试剂A和试剂B按体积比50:1配制适量BCA工作液，并充分混匀。

③分别取25μl新鲜配制的BSA标准液和蛋白样品，加入96孔板中。

④每孔中加入200μlBCA工作液，并充分混匀。

⑥加盖，37℃孵育30分钟后冷却至室温，室温放置2小时。

⑦用紫外分光光度计于562nm处检测其吸光度。

⑧根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

根据碱性磷酸酶试剂盒对于组织匀浆中ALP的检测方法步骤来操作

充分混匀37℃水浴15分钟

显色剂(ml)

1.5

1.5

1.5

立即混匀，520nm,0.5cm或者1cm光径比色，空白管调零，测各管吸光度。

计算公式：

2.2成骨相关基因表达情况

①待植入细胞模块的SCID小鼠生长7天后，将小鼠处死取出植入细胞模块。在培养皿中将模块剪成细小碎末，加入适量0.5%浓度的I型胶原酶37℃孵育4小时后，加入2ml完全培养基终止消化。离心管收集悬液，1200g离心6分钟，弃上清。

②所用器材及试剂经去RNA酶处理，依据Trizol试剂盒，real-time PCR反应过程同第二部分。

2.3体内成骨形态学检测

待植入细胞模块的SCID小鼠生长30天后，将小鼠处死取出植入细胞模块，置入10%福尔马林液中固定，待切片HE染色。

HE染色步骤：

1）制作石蜡切片：

①取材与固定：将大鼠断颈处死，于无菌条件下迅速取出腓肠肌标本，修剪整齐后置入4%多聚甲醛中固定，使细胞和组织的蛋白质变性凝固，防止细胞死后自溶，从而保持细胞本来的形态、结构和理化特性。

②脱水：由低浓度到高浓度酒精作为脱水剂，依次在60%、70%、80%、90%酒精中分别浸泡2小时，100%酒精Ⅰ、Ⅱ中各浸泡1小时，逐渐脱去组织块中的水分，再将组织块置于二甲苯中以替换出组织块中的酒精。

③包埋：将上述处理好的组织块置于熔化的的石蜡中，放入45℃石蜡箱保温1小时，再放入65℃石蜡箱保温2小时，待石蜡完全浸入组织块后进行包埋。

④切片与贴片：将石蜡块固定于切片机上，切成厚度为5-10μm的薄片。

2）进行HE染色：

①在电热恒温箱中60℃烤片至溶蜡，切片常规用二甲苯脱蜡两次，第一次5分钟，第二次10分钟。

②按以下顺序依次浸泡切片：100%酒精（Ⅰ）5分钟→100%酒精（Ⅱ）5分钟→95%酒精3分钟→80%酒精1分钟→75%酒精1分钟→蒸馏水洗2分钟。

③Harris苏木素5-8分钟，自来水冲洗。

④1%盐酸水溶液分化5-10秒（切片由蓝变红）。

⑤自来水浸泡返蓝15-30分钟。

⑥饱和碳酸锂水溶液浸泡3-5秒，自来水冲洗。

⑦置于0.5%伊红中染色30-60秒。

⑧常规脱水：95%酒精（Ⅰ）5分钟→95%酒精（Ⅱ）5分钟→100%酒精（Ⅰ）5分钟→100%酒精（Ⅱ）2分钟。

3）脱水透明：染色后的切片经100%酒精脱水，再经二甲苯处理，从而使切片透明。

4）封固：将已透明处理过的切片滴上封片用树脂一滴，盖上盖玻片封片。

免疫组织化学染色步骤

免疫组织化学染色严格按照试剂公司的说明书进行，对切片先进行高温高压处理代替胰酶消化，促进抗原暴露。阴性对照以PBS替代一抗；同时用已知阳性标本作阳性对照。主要工作流程如下：

1.石蜡切片厚4μm，贴附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，56℃烤片2h。

2.二甲苯脱蜡，递减梯度酒精至水。

3.PBS冲洗3次，每次3min。

4.抗原修复，于压力锅中放入适量柠檬酸钠缓冲液，放入切片，加热至放气2min。取出切片冷却，PBS冲洗3次，每次3min。

5.加50μl过氧化酶阻断溶液（试剂A），室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3次，每次3min。

6.除去PBS液，滴加50μl正常非免疫动物血清（试剂B），室温下孵育10min。

7.除去血清，滴加50μl的第一抗体，室温下孵育10min。PBS冲洗3次，每次3分钟。

8.除去PBS液，滴加50μl生物素标记的第二抗体（试剂C），室温下孵育10min，PBS冲洗3次，每次3分钟。

9.除去PBS液，滴加50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液（试剂D），室温下孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次3min。

10.除去PBS液，滴加100μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3-10min。

11.自来水冲洗，苏木素复染，PBS冲洗。

12.梯度酒精脱水干燥，中型树胶封固。

2.4统计学分析

所有数据采用均值±标准差表示，SPSS17.0进行方差分析，P<0.05为差异有显著意义。

3.结果

3.1.碱性磷酸酶检测

碱性磷酸酶的活性是检测间充质干细胞成骨能力的灵敏指标，且因胶原模块有易于降解和良好的生物相容性的特点，实验选取模块在小鼠体内生长7天后取出检测。结果可见本发明方法培养的De-MSCs组碱性磷酸酶活性明显高于MSCs组，提示本发明方法获得的De-MSCs在体内成骨能力较强（见图9）。

3.2.成骨相关基因表达情况

体内成骨基因表达结果显示De-MSCs组高于MSCs组，与体外培养qPCR结果保持一致。De-MSCs成骨相关基因Runx2增加1.35±0.23倍，Osterix增加10.62±0.31倍，DLX5增加3.06±0.86倍（见图10），这些成骨基因表达的上调是其再次成骨效率提高的基础，与MSCs经短暂成骨诱导后可获得表达一定量的成骨相关基因是有关的。

3.3.体内成骨形态学观察

两组细胞负载胶原模块在小鼠皮下生长30天后，取出组织行HE（见图11）和col II免疫组化染色（见图12），组织形态学观察可见明显骨形成，表明MSCs和De-MSCs两组细胞在成骨诱导条件下，负载胶原模块上在体内能较好的诱导异味新骨形成，与前面的ALP活性检测和成骨基因表达情况具有一致性。

4.结果分析

实施例2的体外培养已证实了本发明方法获得的De-MSCs具有较强的分化潜能，实施例3的实验结果证实了该De-MSCs在体内也能发挥其较高的成骨分化潜能。实验将De-MSCs和MSCs同时植入胶原材料中移植入SCID小鼠体内，在体内生长一段时间后检测，发现De-MSCs的碱性磷酸酶ALP和成骨相关基因的表达同样高于MSCs，并且形态学HE染色结果也可见明显的骨形成，与体外培养实验结果保持一致。以上实验数据可以得出本发明方法获得的De-MSCs既保留了MSCs的多向分化和自我更新的能力，又增强了移植体内后细胞存活能力和定向分化能力的结论。

本发明实验证实了按照本发明方法获得的De-MSCs具有更优质种子细胞的潜质，为干细胞和组织工程的研究提供了新的思路，也为骨组织工程和临床治疗开拓了新的视野，在再生医学中具有良好的临床应用前景和研究价值。

应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明而非限制，本发明也并不仅限于上述举例，一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

中英文对照缩略词表

英文缩写	英文全称	中文全称
			MSCs	Mesenchyal stem cells	间充质干细胞
De-MSCs	Dedifferentiate Mesenchyal stem cells	去分化间充质干细胞
			BMP2	Bone morphogenetic protein-2	骨形成发生蛋白
ALP	Alkaline phophatase	碱性磷酸酶
			HE	Haematoxylin–eosin	苏木精-伊红
CCK-8	Cell counting kit-8	细胞计数试剂盒
			OB	Osteoblast cells	成骨细胞
DMSO	Dimethyl sulfoxide	二甲基亚砜
			DMEM	Dulbecco's modified Eagle Media	基础培养基
L-DMEM	LowGlucose Dulbecco's modified EagleMedia	低糖培养基
			FBS	fetal bovine serum	胎牛血清
PMSF	Phenylmethanesulfonyl fluoride	苯甲基磺酰氟
			PBS	Phosphate-buffered solution	磷酸盐缓冲溶液
BCA	Bicinchoninic acid	二喹啉甲酸
			RIPA	Radio-Immunoprecipitation Assay	蛋白质裂解液
OC	osteocalcin	骨钙素
			SCID	Ectopic bone formation	重症联合免疫小鼠
iPS	Induced pluripotent stem cells	多能干细胞
			Re-OB	Redifferentiated Osteoblast cells	再次成骨分化细胞
Col II	Collagen II	II型胶原

Claims (14)

1.一种骨髓去分化间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：

第一步，从骨髓中分离获得间充质干细胞；

第二步，将间充质干细胞在间充质干细胞完全培养基中进行细胞培养；

其特征在于，第二步所述的细胞培养的步骤中，还包括更换诱导培养基进行诱导培养的步骤，并且在所述的诱导培养的步骤之后，弃去诱导培养基，将细胞重新置于间充质干细胞完全培养基中培养并传代得到De-MSCs细胞。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的诱导培养为将所述的间充质干细胞在诱导培养基中培养3-10天。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的诱导培养为将所述的间充质干细胞在诱导培养基中培养5-7天。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述的间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述的间充质干细胞为3-5代的人骨髓间充质干细胞。

6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述的人骨髓间充质干细胞具有能分化为成骨的能力。

7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的诱导培养基为成骨诱导培养基。

8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述第二步的细胞培养为将细胞培养至处于对数生长期，弃去所述间充质干细胞完全培养基，更换诱导培养基进行诱导培养。

9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述第二步的细胞培养为将细胞培养至培养至细胞密度达到70％-90％时，弃去所述间充质干细胞完全培养基，更换诱导培养基进行诱导培养。

10.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，将细胞重新置于间充质干细胞完全培养基中培养并传代12-14天得到De-MSCs细胞。

11.根据权利要求1-9任一项所述的培养方法，其特征在于，在更换诱导培养基的之前和之后还包括将培养基残液清除的步骤。

12.根据权利要求1-9任一项所述的培养方法，其特征在于，所述的清除的步骤为用PBS进行清洗。

13.根据权利要求1-9任一项所述的培养方法，其特征在于，所述的清除的步骤为用PBS进行清洗2-3次。

14.根据权利要求1-9任一项所述的培养方法，其特征在于，所述的诱导培养基由以下成分配制而成：DMEM-L培养基、10％胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100mg/L、L-抗坏血酸50ug/ml、β-磷酸甘油钠10mmol/ml、地塞米松10^-8mmol/ml。