CN103173407B - 利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法，包括以下步骤： 1）、宫内膜干细胞的分离培养和扩增；2）、体外诱导分化：A、将上述步骤1）所得的第2~4代生长状况良好的细胞以胰酶消化，当显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含体积浓度9~11%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心，所得的细胞沉淀用PBS清洗；B、将上述步骤A所得的经PBS清洗后的细胞沉淀接种于6孔板中进行诱导培养； C、选择采用诱导培养基I的体系1或者采用诱导培养基Ⅱ的体系2进行诱导培养；D、2-3天半量换液一次，每日在倒置显微镜下观察细胞状态；诱导时间为20~22天，得具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法。
背景技术
原位肝移植是终末期肝病治疗的金标准。然而，肝源的短缺成为了肝细胞移植在临床应用上最大的瓶颈。所以，找到合适的、丰富的肝细胞来源是现在生物学领域研究的热点。1981年Evans等人建立了第一个小鼠ES细胞系，以其为模型，研究已证实小鼠ES细胞在体外不仅可以诱导分化为肝祖细胞，而且可以进一步分化为有功能的肝细胞。有动物实验表明，将体外分化得到的肝细胞移植入肝损伤模型体内，移植细胞能够融合到肝脏组织，并缓解小鼠的肝损伤状况，且移植3个月内未发现畸胎瘤和肿瘤的形成。人ES细胞的成功建立打开了体外产生可供移植治疗的所有类型的人体细胞、组织乃至器官的大门。多数研究者利用各种成体干细胞在体外诱导分化为肝脏细胞，并研究其作用于急性肝损伤的动物模型，如腹腔注射四氯化碳、烯丙胺及倒千里光碱等造成的肝持续性纤维化，以及构建肝部分切除动物模型。这些研究中，均对诱导分化后的细胞进行功能特性等研究，如形态学观察，细胞表面抗原，成熟肝脏细胞所具有的糖原合成储备、尿素产生、分泌白蛋白功能，肝脏细胞特异性蛋白（Alb, AFP等）的表达进行了研究。至今已有经由骨髓间充质肝细胞、胚胎干细胞、脐带及脐带血干细胞、胎盘间充质干细胞等向肝细胞方向分化的报道。然而，由于骨髓的有创来源、胚胎干细胞等的致畸胎瘤性，使其面临伦理学的争议。
2007年，Masuda等研究证实宫内膜细胞符合干细胞的标准。宫内膜细胞具有与人成体干细胞相同的多向分化潜能、表达细胞表面标志物的能力以及贴壁生长的特点。宫内膜干细胞能表达干细胞表面标志物，如CD9, CD29, CD41a, CD44, CD59, CD73,CD90和CD105等。但一些造血干细胞表面标志物（如CD34和CD45等）则为阴性。经血干细胞体外能长期培养而保持染色体组型的稳定性不变，且其增殖分化潜能明显高于脐带血间充质干细胞。Borlongan 等利用经血干细胞与外周血淋巴细胞共培养发现其并不能刺激淋巴细胞增殖，也就是说其免疫原性低，这为细胞移植的安全性提供了一定的保证。经血干细胞能通过非侵入性手段轻易获得，能利用标准的实验室条件达到很好的扩增和定向分化结果。
目前，已有报道经血干细胞具有可成脂肪细胞、骨与软骨、神经细胞及心肌细胞肺上皮，胰岛细胞等三个胚层的许多细胞分化的能力。有文献报道，经血干细胞成功定向分化为心肌细胞，并研究了该干细胞在心肌梗死动物模型中发挥的作用，发现其可一定程度缓解梗死灶、恢复心肌收缩功能。Toyoda等报道月经血干细胞具有肌源性分化，从而在杜氏肌营养不良的恢复中发挥重要作用。Murphy 则发现这种细胞在肢段缺血动物中能够产生一些生长因子，抑制炎症反应并且能够在宿主体内得到增殖。台湾国立大学的Li将宫内膜干细胞在体外诱导成能产生胰岛素的细胞，并将其用于治疗Ⅰ型糖尿病，取得了很好的效果，发现细胞移植后能有效的控制血糖水平，且移植的干细胞在小鼠胰岛内发生分化也被观察。还有研究称月经血干细胞不仅仅能表达干细胞特定表型标志，而且在实验动物模型中能发挥一定的神经保护作用，这一发现具体体现在耶鲁大学和南佛罗里达大学的两个研究组将其用于帕金森和中风的动物模型。经血干细胞不仅能够向神经元方向分化而且在修复脑血管损伤上起重要作用。另外，有研究称，脐带间充质干细胞可以定向分化为低免疫原性的肝细胞样细胞。理论上，经血干细胞仅低表达人类白细胞抗原Ⅰ型，不表达人类白细胞抗原Ⅱ型。这为解决异体细胞移植后所必然发生的排异反应提供了很大突破点。目前，尚无关于经血干细胞定向分化为肝脏细胞的研究报道。
经血干细胞是最近发现的成体干细胞的一种，属于间充质干细胞（MSC）。子宫内膜组织内发现存在丰富的间充质干细胞，在月经期间随经血排出体外，是一种无创、安全的干细胞来源方式。在细胞标记分子表达和细胞增殖、分化能力上，经血干细胞与胚胎干细胞更相似。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法，包括以下步骤：
1）、宫内膜干细胞的分离培养和扩增：
将经血经含抗生素的杀菌液的杀菌处理后，离心，去上清液；然后加入Chang氏通用培养基置于4~6%CO2、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱中培养；
培养5~7天后换液去除未贴壁细胞；一旦细胞生长至75~85%汇合度时，即采用胰酶消化传代；
2）、体外诱导分化：
A、将上述步骤1）所得的第2~4代生长状况良好的细胞以胰酶消化，当显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含体积浓度9~11%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心，所得的细胞沉淀用PBS（例如为：无钙镁离子的PBS洗涤液）清洗；
B、将上述步骤A所得的经PBS清洗后的细胞沉淀接种于6孔板中进行诱导培养，接种细胞密度为4.8×105~5.2×105/孔，每孔加1ml的 Chang氏通用培养基；在36~38℃、4~6%CO2、94~96%饱和湿度的培养箱中培养；
C、选择以下任意1个体系进行：
体系1：待细胞生长密度到达80-90%时，向各孔中加入5-氮胞苷混匀，使5-氮胞苷达到终浓度为9~11μM； 5-氮胞苷处理细胞22~26小时后，吸弃孔内培养基，用PBS（例如为：无钙镁离子的PBS洗涤液）清洗细胞2次；更换成1ml的诱导培养基I（即，每孔加1ml的诱导培养基I）；然后置于36~38℃、4~6%CO2、94~96%饱和湿度的培养箱中培养；随后进行下述步骤D；
诱导培养基I的制备方法为：在1ml的Chang氏通用培养基中加入0.018~0.022ml的FBS（胎牛血清）、39~41ng的 HGF（人肝细胞生长因子）、 19~21ng的EGF（人表皮生长因子）, 加入DEX（地塞米松）使浓度为49~51nM，加入0.008~0.012ml的ITS premix（胰岛素-转铁蛋白-硒复合物，该ITS premix为：10mg/L 胰岛素, 5.5mg/L 转铁蛋白, 5ug/L亚硒酸）；
体系2：待细胞完全贴壁后，吸弃孔内培养基，更换成1ml的诱导培养基II（即，每孔加1ml的诱导培养基II）；然后置于5%CO2，95%饱和湿度的37℃培养箱中进行培养；随后进行下述步骤D；
诱导培养基Ⅱ的制备方法为：在1ml的Chang氏通用培养基中加入0.018~0.022ml的FBS、19~21ng的 HGF（人肝细胞生长因子）、9~11ng的FGF-4（人成纤维细胞生长因子-4）、9~11ng的OSM（重组人致瘤素M）、39~41ng的 DEX（地塞米松），加入0.008~0.012ml的ITS premix（胰岛素-转铁蛋白-硒复合物，该ITS premix为：10mg/L 胰岛素, 5.5mg/L 转铁蛋白, 5ug/L亚硒酸）；
D、2-3天半量换液一次（即，用相应的诱导培养基I或者诱导培养基Ⅱ进行半量换液），每日在倒置显微镜下观察细胞状态；诱导时间为20~22天，得较成熟具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞。
作为本发明的利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法的改进，步骤1）依次为：
①、经血收集：
在采集管内设置20ml的Hank's平衡盐溶液，并添加以下成分至以下浓度：万古霉素60~100 μg/mL、头孢氨苄150~350 μg/mL、卡那霉素50~150 μg/mL、庆大霉素80~160 μg/mL、两性霉素B 2~3μg/mL及300~500单位肝素钠； 以此作为含抗生素的杀菌液；
将15~20ml的经血放入上述采集管内，于4℃的低温下保存24~48小时；然后离心，去上清液；
②、原代培养：
A）、取6~10ml的Chang氏通用培养基加入到步骤①所得物中；
B）、将步骤A）的所得物放入培养瓶中置于4~6%CO2、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱内培养；培养5~7天后全量换液；再将上述培养瓶直立3~8分钟，从而使未贴壁的细胞滑落至培养瓶底部，用移液管去除培养瓶中的培养基；
C）、在步骤B）所得的培养瓶中加入2~4 mL的Chang氏通用培养基进行润洗，然后用移液管去除培养瓶中的培养基；
D）、在步骤C）所得的培养瓶中加入6~10 mL的Chang氏通用培养基，置于4~6%CO2、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱内培养；
所述Chang氏通用培养基的配制方法如下：在无菌条件下，在无菌容器中加入650mL MEM-alpha 培养基、160~200mL的 Chang B基液、10~30mL的 Chang C基液、5~15 mL 青霉素/链霉素双抗 (10,000U/mL苄青霉素钠，10,000 μg/mL链霉素)，5~15 mL的浓度为 200 mM的L-谷氨酰胺、130~170 mL的胎牛血清；充分混匀，高压蒸汽灭菌后放入4℃冰箱保存待用；
③、细胞传代培养：
一旦步骤②原代培养的细胞生长至75~85%汇合度时，即采用胰酶消化传代；具体如下：
A）、一旦步骤②原代培养的细胞生长至75~85%汇合度时，去除培养液，然后用无钙镁离子的PBS进行洗涤；
B）、加入1~2ml胰酶，置于4~6%CO2、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱中孵育4~6分钟；
C）、加入4~6ml的Chang氏通用培养基使胰酶失活；
D）、轻柔吹打，使贴壁细胞脱落并成单细胞状态；
E）、按1：4的比率传代；
F）、在每1ml的细胞悬液中加入2~4ml的Chang氏通用培养基；然后置于4~6%CO2、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱中培养。
经血干细胞是一种新研究发现的干细胞群，具有取材方便等特点，本发明通过体内、体外实验，运用免疫组化染色、RT-PCR、ELISA等技术验证经血干细胞治疗急性肝损伤以及在终末期肝病干细胞移植的可行性，从而为干细胞治疗提供新的种子资源。
本发明具有如下优点：
1、细胞来源丰富，分离培养技术已掌握，提供了一种新型的成体干细胞来源；
2、通过体外定向诱导分化为肝脏样功能细胞，提供了一种大量获得肝脏细胞的方法；
3、通过体内移植，发现该细胞不仅能融入受损伤肝脏，而且可以一定程度恢复肝脏白蛋白水平和抑制转氨酶的活性，为临床终末期肝病的治疗提供了一种新的选择。
综上所述，本发明采用分离培养的宫内膜（经血）干细胞，利用体外干细胞诱导技术，研究宫内膜干细胞的多能性和肝细胞定向分化，并通过体内移植用于小鼠肝脏部分切除的急性肝损伤模型进行研究，证实其用于急性肝损伤治疗的可行性，为肝脏疾病的干细胞治疗提供一种新的途径。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是宫内膜干细胞分离获得的结果图；
（A）i为原代培养细胞第7天的集形成落，ii为传代培养第一代细胞，呈长梭形，典型的成纤维样细胞，单层生长；
（B）宫内膜干细胞表型鉴定。利用流式细胞术对传代培养的第3代细胞进行表面标志的检测分析，宫内膜干细胞表达间充质干细胞表型，但不表达造血干细胞表型（CD34，CD45等）。
（C）宫内膜干细胞体外生长曲线，其在体外培养大约24小时发生倍增。
图2是宫内膜干细胞成肝分化检测结果图；
（A）宫内膜干细胞在条件培养基作用下细胞形态逐渐发生改变，由原来的长梭形（i）逐渐发展为多角或者圆形的上皮样细胞形态，至第21天呈现“铺路石”样形态（ii），大体上类似于人肝细胞癌细胞株HepG2的生长状态（iii）（50倍）；
（B）成肝分化细胞在第10和20天肝脏细胞特异性基因表达的RT-PCR检测，未分化细胞（control）和HepG2细胞分别作为阴性和阳性对照；
（C）免疫细胞化学检测肝细胞特异性蛋白ALB（ii）和AFP（iii）的表达，棕色为阳性。未分化的宫内膜干细胞作为阴性对照（i），蓝色的核为经苏木素复染；
（D）PAS染色。阳性结果为细胞被染色称为紫红色，对照组未见染色（图片未展示）；
（E）ICG吸收实验；
（F）尿素合成实验；分化第3,6,9,12,15,18,21,24天均可检测到尿素水平，且呈逐渐升高趋势，未分化的宫内膜干细胞则无。（C、D、E均为100倍）。
图3是免疫组化检测结果图；
对第一种诱导体系（即体系1）得到的细胞进行免疫细胞化学检测，肝细胞特异性蛋白酶染色为阳性，分别为PCK26（ii），CYP1A1（iii），CYP3A4（iv），阴性对照未见阳性染色结果（i）。（200倍）。
图4是体内试验图；
（A）体内试验路线图；
（B）细胞移植小鼠（n=10）血清相对于假实验组小鼠（n=10）血清ALB（p=0.04，i），ALT（p=0.035，ii）和AST（p=0.049，iii）水平的变化。*：p<0.05，表示移植干细胞可以一部分恢复白蛋白水平，也可部分抑制转氨酶的活性；
（C）免疫荧光化学检测。用抗人特异性线粒体抗体检测移植后2个月的小鼠肝脏组织切片中抑制细胞的存在。绿色荧光信号为阳性，表示该处组织中存在人细胞（ii，iii），即可说明移植细胞经脾脏迁移到受损伤肝脏中。假实验组中未见荧光信号（i），*代表血管腔，说明部分细胞附着在血管内皮表面。（100倍）
图5是免疫组化检测图；
在移植细胞后60天，处死小鼠，取肝脏组织，固定，石蜡切片，免疫组化检测。分为宫内膜干细胞和诱导后肝细胞移植组（P.T.&MenSCs组合P.T.&HLCs组），i,,ii,v,vi,ix,和x为检测人特异性线粒体（hMIT）的存在；iii,iv,vii,viii，和xi为检测人肝细胞白蛋白（hALB）。i,iii为正常人肝脏组织切片，作为阳性对照；ii,iv为未行细胞移植组小鼠肝脏切片，作为阴性对照。v,vii,ix,xi显示细胞存在于肝脏门静脉血管周围；vi,viii,x,xi显示细胞整合入受体小鼠实质内部。棕褐色为阳性结果。（100倍）
具体实施方式
实施例1、经血间充质干细胞的分离培养和扩增：
招募10位不同年龄段的经期妇女，在完全自愿的前提下捐献月经血样品。经抗生素处理24小时后，进行微生物检测及传染病病原体安全检测。经离心、去上清液，随后接种，采用Chang氏通用培养基置于5%CO2，95%饱和湿度的36~38℃（例如为37℃）培养箱中培养。5-7天后换液去除未贴壁细胞，随后每2~4天（例如为3天）换液一次。一旦细胞生长至80%汇合度，即采用胰酶/EDTA消化传代。再利用流式细胞技术对经血间充质干细胞进行CD117，CD34，CD44，CD45，CD73，CD90，CD105，CD29， HLA-DR等分子表型鉴定。
具体操作规程如下：
一、宫内膜干细胞的分离培养和扩增：
招募10位不同年龄段的经期妇女，在完全自愿的前提下捐献月经血样品。
具体操作规程如下：
1、经血样品收集（细胞分离）：
将经血采集管，月事杯放入经血采集盒，送至经血供者。采集管事先装有20ml HBSS（Hank's平衡盐溶液）采集液，其中含有Vancomycin（万古霉素） 80 μg/mL、Claforan（头孢氨苄） 250 μg/mL、Amikacin（卡那霉素） 100 μg/mL、Gentamycin（庆大霉素）120μg/mL、Amphotericin B（两性霉素B） 2.7 μg/mL及400单位肝素钠。以此作为含抗生素的杀菌液。
即上述HBSS（Hank's平衡盐溶液）采集液的制备方法如下：
在20ml的Hank's平衡盐溶液中添加以下成分至以下浓度：万古霉素（Vancomycin） 80 μg/mL、头孢氨苄（Claforan） 250 μg/mL、卡那霉素（Amikacin） 100 μg/mL、庆大霉素（Gentamycin）120μg/mL、两性霉素B（Amphotericin B） 2.7μg/mL及400单位肝素钠；然后再按照常规程序于高温高压下进行灭菌。
供者在月经开始的前几天（第1至3天），利用月事杯获取经血样品。将每15~20ml的经血（属于同一个供者）放入上述1个采集管内。在得到细胞捐赠者知会同意的情况下对细胞进行培养（此知会同意必需获得制定评审委员会的批准）。在获取样品后送往处理实验室之前必须将它们在低温（0~4℃）条件下进行保存（保存期一般为24到48小时）。
1)保存24小时后，观察经血收集管中的样品，如有沉淀，可将样品经由 100 micron过滤网过滤；
2)准备离心前，仔细将样品收集管的外周擦拭干净；确保离心机上离心管的平衡；
3)在 840g、4.0℃的条件下离心样品7分钟；
4)小心取出样品收集管，勿扰乱细胞分层；
5)将样品收集管外周用酒精棉擦拭消毒后，移入生物安全柜进行下一步操作；
6)去除上清液；小心吸液，不要扰乱细胞层，造成额外的细胞丢失。
上述上清液可用于进行细菌检测，即将该上清液按照常规的血培养法进行厌氧菌和需氧菌、真菌的检测，并按照常规方法进行鉴定。若为阳性结果，则结束整个宫内膜干细胞的分离培养和扩增。
将上述HBSS（Hank's平衡盐溶液）采集液中被处理了24小时后的经血，按照常规方式进行微生物检测及传染病病原体安全检测，一般对常见病毒如HIV、HBV、HCV、CMV和梅毒病原体进行检测。若为阳性结果，则结束整个宫内膜干细胞的分离培养和扩增。
上述2种检测目的是为了保证所得的宫内膜干细胞（此处指未做诱导处理的用于移植治疗的宫内膜干细胞）的使用安全性。
2、原代培养：
培养基配制——Chang氏通用培养基的成分如下：
1)650 mL MEM alpha 培养基
2)180 mL Chang 氏B 液(基础培养基) (18 % v/v)
3)20 mL Chang氏 C液(2 % v/v)
4)10 mL 青霉素/链霉素双抗 (10,000 U/mL苄青霉素钠，10,000μg/mL链霉素；即每ml青霉素/链霉素双抗溶液中含有10,000 U的苄青霉素钠和10,000 μg的链霉素)
5)10 mL 的 L-谷氨酰胺200 mM (100x)
6)150 mL 的胎牛血清 (15 % v/v)
Chang氏通用培养基的配制方法如下：在无菌条件下，在无菌容器中加入650mL MEM-alpha 培养基（MEM alpha，Invitrogen 公司）、180mL Chang B基液（Irvine Scientific公司）、20mL ChangC基液（Irvine Scientific公司）、10 mL 青霉素/链霉素双抗(10,000 U/mL苄青霉素钠，10,000 μg/mL链霉素),10 mL的浓度为200 mM的L-谷氨酰胺（L-glutamine，Invitrogen公司）、150 mL的胎牛血清（ES-FBS，Invitrogen公司）；充分混匀，按照常规方式高压蒸汽灭菌后放入0~4℃冰箱保存待用。
1)取7mLChang氏通用培养基，加入到已去除上清的经血样品（即步骤1的所得物）中，轻柔吹打混匀；得细胞悬液；
2)取一个T-25培养瓶，将步骤1）所得的全部细胞悬液移取到该培养瓶中；
3)放入5%CO2、95%饱和湿度、37℃的培养箱（例如为孵箱）中培养；
4） 培养5-7天，全量换液（即换7mLChang氏通用培养基）。在生物安全柜中，先将培养瓶直立5分钟，待未贴壁的细胞大部分随培养基滑落至培养瓶底部，用移液管将培养基去除。
5）取3 mLChang氏通用培养基，慢慢在培养瓶侧壁滴入。慢慢将培养瓶放平，轻柔地摇晃，润洗细胞层，然后将培养瓶直立5分钟，用移液管将培养基去除。
6）取7 mL Chang氏通用培养基，慢慢在培养瓶侧壁滴入。
7）镜下观察，有散落的贴壁细胞。
8）放入5%CO2、95%饱和湿度、37℃培养箱内继续培养。在培养过程中，等干细胞细胞贴壁后，去除未贴壁的细胞，一般每隔2~4天换液一次继续培养。
一周后观察，细胞生长，有成团细胞增殖（集落形成为间充质干细胞特性之一），此时细胞生长至80%汇合度。
3、细胞传代培养
1)去除上述原代培养步骤的8）所得物中的培养液；
2)用无钙镁离子的PBS洗涤液进行洗涤；
上述无钙镁离子的PBS洗涤液的配制如下：
于高压蒸汽灭菌（常规程序）后放入4℃冰箱保存待用。
3)加入1ml胰酶， 37℃孵育（5%CO2，95%饱和湿度）5分钟；
4)加入4ml的Chang氏通用培养基使胰酶失活；
5)轻柔吹打，使贴壁细胞脱落并成单细胞状态；
6)按1：4的比率传代：在4ml的细胞悬液中取1ml至一新的T-25培养瓶中，再加入3ml的Chang氏通用培养基，混匀；
7)放入37℃的CO2 孵箱（5%CO2，95%饱和湿度）内培养；
8)每3-4天传代细胞一次（即从步骤1）开始至步骤7）为止，每3-4天传代一次），过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率。
4、经血间充质干细胞的分子表型鉴定及活力检测：
一、流式细胞术检测细胞表面抗原
1）细胞传至第3代时收集细胞，胰蛋白酶－EDTA消化液（0.25％）消化细胞，制成细胞悬液，细胞浓度为1 ×106个/ml；
2）分别取所需数量的0.5ml EP管，分别加入小鼠抗人单克隆抗体(CD117， CD34，CD44，CD45，CD73，CD90，CD105，CD29， HLA-DR及同型对照) 20μl；
3）、管内分别加入细胞样本（上述步骤1）所得）50μl，避光4℃孵育30 min；
4）、300g离心5分钟；
5）、弃上清，加入1%（质量浓度）人血清的PBS 1ml，充分混匀，300g离心5分钟；
6）、弃上清，加入PBS调整样本量至100μl，上流式细胞仪进行分析；
所得结果为：CD44， CD73，CD90，CD105和CD29为阳性，CD117,CD34 ，CD45和HLA-DR为阴性；从而确定所获得的细胞符合间充质干细胞的一般表型标准（即，确定所得为宫内膜干细胞）。
二、培养细胞活力测定——四唑盐（MTT）比色法
1）、将宫内膜干细胞传代培养至第3代，0.25%胰蛋白酶-EDTA（即，胰蛋白酶－EDTA消化液 ，0.25％）消化细胞，用增殖培养基重悬细胞，取100μL单细胞悬液（1×103个/ml）接种于96孔板。在37oC、5％CO2、95%饱和湿度培养箱中培养10天，每天作为一个时间点并分别设置6个复孔。
所述增殖培养基为：即为上述的Chang氏通用培养基。
2）、将2mg/ml的MTT液60μL加入含有600μL增殖培养基的无菌管中，吹打混匀，取110μL所得的混合液加入待测孔中，轻轻震荡孔板使溶液混匀；继续于37℃、5％CO2、95%饱和湿度培养箱内孵育4小时；
3）、吸出孔内含MTT的培养液后，加入DMSO（100μL/孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解；
4）、酶标仪检测各孔OD值（检测波长490nm）。记录结果。根据OD值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。并可以时间为横轴，细胞增殖程度为纵轴，绘制细胞生长曲线。具体如图1（C）所示。
根据该结果，我们得知：宫内膜干细胞在体外传代培养生长曲线呈典型的“S”形，细胞在接种后24小时内可以达到倍增，随后进入对数生长期，继而进入平台期。宫内膜干细胞体外培养符合一般细胞的生长规律，未见有无限增殖的现象出现。
实施例2、体外诱导分化及检测：
具体操作规程如下：
1、体外定向诱导宫内膜干细胞分化为肝脏细胞
1）取培养第三代的生长状况良好的细胞，表现为生长旺盛、胞体大、胞核清晰、胞浆丰富、显微镜下折光性强的细胞，以胰蛋白酶－EDTA消化液（0.25％）消化，显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含10%（体积浓度）胎牛血清的DMEM培养基终止消化，轻柔吹打后离心，获得细胞沉淀，PBS（无钙镁离子的PBS洗涤液）洗2遍（目的是为了洗去胰蛋白酶、胎牛血清等物质）。
2）将上述经PBS清洗后的细胞沉淀接种于6孔板中进行诱导培养，接种细胞密度为5×105/孔，每孔加1ml的Chang氏通用培养基，在37oC、5％CO2、95%饱和湿度培养箱中培养。
3）选择以下任意1个体系进行：
体系1：待细胞生长密度到达80-90%（即，细胞达到80%-90%汇合度）时，向各孔中加入适当体积的5-氮胞苷，使5-氮胞苷达到终浓度为10μM，轻轻摇晃平板使5-氮胞苷与培养基完全混匀，24小时后，吸弃孔内培养基（包括Chang氏通用培养基和5-氮胞苷），用PBS（无钙镁离子的PBS洗涤液）清洗细胞2次；然后更换成1ml的诱导培养基I（即，每孔加入1ml的诱导培养基I）；然后置于5%CO2，95%饱和湿度的37℃培养箱中进行培养。随后按步骤4）执行操作。
诱导培养基I的制备方法为：在1ml的Chang氏通用培养基中加入0.02ml的FBS（胎牛血清）、40ng的 HGF（人肝细胞生长因子）, 20ng的EGF（人表皮生长因子）, 加入DEX（地塞米松）使浓度为50nM，加入0.01ml的ITS premix（胰岛素-转铁蛋白-硒复合物，该ITS premix为：10mg/L 胰岛素, 5.5mg/L 转铁蛋白, 5ug/L亚硒酸）。
体系2：待细胞完全贴壁后，吸弃孔内培养基（即为Chang氏通用培养基），更换成1ml的诱导培养基II（即，每孔加入1ml的诱导培养基II）；然后置于5%CO2，95%饱和湿度的37℃培养箱中进行培养。随后按步骤4）执行操作。
诱导培养基Ⅱ的制备方法为：在1ml的Chang氏通用培养基中加入0.02ml的FBS（胎牛血清）、20ng的 HGF（人肝细胞生长因子）、10ng的FGF-4（人成纤维细胞生长因子-4）、10ng的OSM（重组人致瘤素M）, 40ng的 DEX（地塞米松），加入0.01ml的ITS premix（胰岛素-转铁蛋白-硒复合物，该ITS premix为：10mg/L 胰岛素, 5.5mg/L转铁蛋白, 5ug/L亚硒酸）。
4）2-3天半量换液一次（（即，用相应的诱导培养基I或者诱导培养基Ⅱ进行半量换液）），每日在倒置显微镜下观察细胞状态。诱导时间为21天，得较成熟具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞。
2、设置对照组：
相对于上文中的“体外定向诱导经血干细胞分化为肝脏细胞”作如下改动，其余同“体外定向诱导经血干细胞分化为肝脏细胞”的步骤1）~步骤4）。
取消体系1的“诱导培养基I”中的“40ng的 HGF（人肝细胞生长因子）和 20ng的EGF（人表皮生长因子）”的使用；作为体系1的对照组；
取消体系2的“诱导培养基Ⅱ”中的“20ng的 HGF（人肝细胞生长因子）、10ng的 FGF-4（人成纤维细胞生长因子-4）、10ng的OSM（重组人致瘤素M）”的使用；作为体系2的对照组；
结果为：2个对照组的细胞形态均未发生变化。
3、体外分化的肝脏细胞鉴定
下面以按照体系1所得的较成熟具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞以及体系1的对照组为例，进行下述鉴定：
1）、经血间充质干细胞的形态学观察
细胞在诱导后定期镜下观察其形态、胞浆颗粒及细微结构。结果如图所示。
2）、免疫组化鉴定
收集对照组（上述步骤2所得的体系1的对照组）和诱导组（上述步骤1所得的体系1）诱导后第21天的细胞爬片,4%多聚甲醛室温固定,加入3%H2O2 阻断内源性过氧化物酶,分别加入待测的一抗(AFP，ALB) ,4℃过夜,加入生物素标记的二抗(羊抗兔IgG) ,37oC孵育45 min,DAB 显色(镜下控制显色时间) ,苏木素复染,梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。实验中用0.1M PBS代替一抗作阴性对照。细胞在免疫组化染色后镜下随机数取非重叠10个视野计算阳性细胞的比例,根据染色强度进行分级。阳性标准为镜下胞浆内出现棕黄色颗粒。
结果如图2（A）所示；根据该结果我们能得出以下结论：宫内膜干细胞在条件培养基作用下细胞形态逐渐发生改变，由原来的长梭形逐渐发展为多角或者圆形的上皮样细胞形态，至第21天呈现“铺路石”样形态。
3）、RT-PCR检测肝脏细胞特异性蛋白mRNA (AFP、ALB等)的表达
取未经诱导的第2代细胞和诱导后第10天和20天的细胞,计数约1 ×106 个, Trizol法提取总RNA。逆转录并进行体外扩增。PCR所需引物见下表：
表1、RT-PCR引物序列及片段扩增长度
扩增体系为：
| 反应物 | 体积 |
| 10X PCR buffer （Mg2+ free） | 5 μl |
| MgCl2（25mM） | 3 μl |
| dNTP mix（2.5mM，each） | 4 μl |
| 10μM Primer 上游 | 1 μl |
| 10μM Primer下游 | 1 μl |
| Template DNA | 1 μl |
| Taq或EXTaqDNA Polymerase | 0.25 μl |
| Sterile deionized water | Up to 50μl |
| Total | 50 μl /Sample |
扩增条件：94℃ 45s，适当的退火温度 60s，72℃ 45s，30个循环，最后72℃延伸4min。取5ul扩增产物，2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果用凝胶成像系统照相并作吸光度扫描分析。结果如图2（B）所示；根据该结果我们能得出以下结论：RT-PCR检测成肝分化细胞在第10和20天能表达肝脏细胞特异性基因，未分化的宫内膜干细胞则不能表达大部分肝脏细胞的基因。
4）、糖原合成（PAS）
①、选取诱导分化21天的细胞，用丙酮/甲醇（vol/vol：1:1）-20℃固定细胞20分钟；
②、蒸馏水洗2次；
③、1%（wt/vol）过碘酸孵育10分钟；
④、蒸馏水洗2次；
⑤、Schiff反应物（可购自德国merck公司，货号：HX074593）孵育15分钟；
⑥、微温（37℃）蒸馏水洗2次；
⑦、蒸馏水洗2次；
⑧、计数，标准光学显微镜下分析。
结果如图2（D）所示；根据该结果我们能得出以下结论：在条件培养基中，宫内膜干细胞分化的细胞具有与肝脏细胞类似的糖原合成与储备功能。
5）、尿素合成（urea synthesis）
①、选取诱导过程中不同时间节点（0,3,6,9,12,15,18,21和24天）的细胞，PBS清洗3次；
②、在欲进行测试的孔中加入含6mM/L NH4Cl无血清Hank’s 缓冲盐溶液（要求浸没细胞，例如为2 ml），复置入5%CO2，95%饱和湿度的37℃培养箱中培养24hr；
③、Quantichrom urea assay kit 检测尿素浓度。
结果如图2（F）所示；根据该结果我们能得出以下结论：在条件培养基中，宫内膜干细胞分化的细胞具有与肝脏细胞类似的尿素合成能力，且随着诱导时间的延长，细胞合成尿素能力越强。
6）、ICG吸收排泌实验
①、选取诱导分化第21天细胞，撤去诱导培养基（用移液器吸弃），PBS清洗3遍；
②、加入1mg/mlICG 染液（要求浸没细胞）于37oC孵育15分钟；
③、弃ICG染液，PBS洗3次。
普通光学显微镜下观察细胞颜色变化。结果如图2（E）所示；根据该结果我们能得出以下结论：在条件培养基中，宫内膜干细胞分化的细胞具有与肝脏细胞类似的吲哚氰绿吸收能力。
上述鉴定结果能证明按照本发明体系1所得的细胞是具有肝脏细胞功能的较成熟的肝脏样细胞。
备注说明：
以“体系2所得的较成熟具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞以及体系2的对照组”替代上述“体系1所得的较成熟具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞以及体系1的对照组”重复上述整个“3、体外分化的肝脏细胞鉴定”；结果相同。该鉴定结果能证明按照本发明体系2所得的细胞是具有肝脏细胞功能的较成熟的肝脏样细胞。
4、体内移植实验
下面以按照体系1所得的较成熟具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞为例，进行下述实验：
1）．选取3-4周雄性ICR小鼠（购自浙江省医学科学院实验动物中心）25只，分3组，分别在肝脏部分切除后进行移植。
设置如下组别：
A、宫内膜干细胞组（n=10），植入宫内膜干细胞，注射量为：1.5×106细胞/150ul PBS；
B、分化后细胞组（n=10），植入分化后获得的肝细胞样细胞（诱导21天所得），注射量为：1.5×106细胞/150ul PBS；
注：该两组移植所用细胞应该是相同代数细胞；
C、对照组(n=5)，注射150ul PBS缓冲液。
2）．肝损伤小鼠模型构建及细胞移植：行肝脏部分切除前，给小鼠饮用含普萘洛尔水连续3天，达到给药浓度为30mg/kg，抑制受体小鼠肝脏再生。手术前准备好待移植细胞悬液（1.5×106/150ul×1只），置冰上。2mg/kg盐酸氯胺酮注射液腹腔注射麻醉小鼠，腹部备皮，酒精消毒，手术剪刀沿皮肤、肌肉腹白线剪一2cm切口，暴露肝脏，肝蒂结扎，切除左外叶，温热生理盐水灌洗腹腔，关闭腹腔；小鼠右侧卧位，左侧肋骨下切一1cm小切口，暴露脾脏，用事先准备好的线圈套扎脾脏，用1ml注射器吸取准备好的细胞悬液缓慢注射入脾包膜下，扎紧线圈防止注射液溢出，缝合手术切口，结束手术。注重术后护理。
3）．预期追踪60-90天，检测肝功能指标：分别于细胞移植后第7和14天对小鼠摘眼球取血，血清用于ALB、AST、ALT等生化指标的检测。
待观察至2-3个月，对小鼠进行脱颈椎处死，置酒精中消毒，取不同组织用试剂盒提取总RNA，RT-PCR检测肝脏细胞相关基因（ALB、AFP、G-6-P等）在宫内膜干细胞移植后小鼠体内的表达。同时取部分肝脏用福尔马林固定，石蜡包埋切片，苏木精-伊红(HE)染色后观察肝脏的情况，其余部分用抗人线粒体抗体（Anti-Mitochondria, surface of intact mitochondria, clone 113-1；65kD，Cat. # MAB1273）检测人体细胞的存在，并通过免疫组化染色检测植入细胞在宿主肝脏中的分化情况，指标包括人肝脏特异性表达蛋白ALB等。结果为如图4（C）所示。
通过上述实验结果我们得知：
（1）移植干细胞可以一部分恢复白蛋白水平，也可部分抑制转氨酶的活性。
（2）用抗人特异性线粒体抗体检测移植后2个月的小鼠肝脏组织切片中移植细胞的存在。说明移植细胞经脾脏迁移到受损伤肝脏中，一部分融合入肝脏实质，一部分仍附着于门静脉血管内皮。
4）、在移植细胞后90天，处死小鼠，取肝脏组织，固定，石蜡切片，免疫组化检测（如图5所示）。分为宫内膜干细胞和诱导后肝细胞移植组（P.T.&MenSCs组合P.T.&HLCs组），i,,ii,v,vi,ix,和x为检测人特异性线粒体（hMIT）的存在；iii,iv,vii,viii，和xi为检测人肝细胞白蛋白（hALB）。i,iii为正常人肝脏组织切片，作为阳性对照；ii,iv为未行细胞移植组小鼠肝脏切片，作为阴性对照。v,vii,ix,xi显示细胞存在于肝脏门静脉血管周围；vi,viii,x,xi显示细胞整合入受体小鼠实质内部。棕褐色为阳性结果（100倍）。
根据图5，我们得知：干细胞移植后在小鼠体内生存的时间可超过90天，显示干细胞移植有较长的疗效。
备注说明：
以“体系2所得的较成熟具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞”替代上述“体系1所得的较成熟具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞”重复上述整个“体内移植实验”；结果相同。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，如诱导的和没有诱导的宫内膜干细胞可用于包括肝硬化在内的肝损伤的治疗。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (2)
1.利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法，其特征是包括以下步骤：
1）、宫内膜干细胞的分离培养和扩增：
将经血经含抗生素的杀菌液的杀菌处理后，离心，去上清液；然后加入Chang氏通用培养基置于4~6%CO2、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱中培养；
培养5~7天后换液去除未贴壁细胞；一旦细胞生长至75~85%汇合度时，即采用胰酶消化传代；
在采集管内设置20ml的Hank's平衡盐溶液，并添加以下成分至以下浓度：万古霉素60~100 μg/mL、头孢氨苄150~350 μg/mL、卡那霉素50~150 μg/mL、庆大霉素80~160 μg/mL、两性霉素B 2~3μg/mL及300~500单位肝素钠； 以此作为含抗生素的杀菌液；
Chang氏通用培养基的配制方法如下：在无菌条件下，在无菌容器中加入650mL MEM-alpha 培养基、180mL Chang B基液、20mL Chang C基液、10 mL 青霉素/链霉素双抗,10 mL的浓度为 200 mM的L-谷氨酰胺、150 mL的胎牛血清；充分混匀，按照常规方式高压蒸汽灭菌；
所述青霉素/链霉素双抗中含有10,000 U/mL苄青霉素钠和10,000 μg/mL链霉素；
2）、体外诱导分化：
A、将上述步骤1）所得的第2~4代生长状况良好的细胞以胰酶消化，当显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含体积浓度9~11%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心，所得的细胞沉淀用PBS清洗；
B、将上述步骤A所得的经PBS清洗后的细胞沉淀接种于6孔板中进行诱导培养，接种细胞密度为4.8×105~5.2×105/孔，每孔加1ml的 Chang氏通用培养基；在36~38℃、4~6%CO2、94~96%饱和湿度的培养箱中培养；
C、选择以下任意1个体系进行：
体系1：待细胞生长密度到达80-90%时，向各孔中加入5-氮胞苷混匀，使5-氮胞苷达到终浓度为9~11μM； 5-氮胞苷处理细胞22~26小时后，吸弃孔内培养基，用PBS清洗细胞2次；更换成1ml的诱导培养基I；然后置于36~38℃、4~6%CO2、94~96%饱和湿度的培养箱中培养；随后进行下述步骤D；
诱导培养基I的制备方法为：在1ml的Chang氏通用培养基中加入0.018~0.022ml的胎牛血清、39~41ng的人肝细胞生长因子、 19~21ng的人表皮生长因子，加入地塞米松使浓度为49~51nM，加入0.008~0.012ml的ITS premix；
该ITS premix为：10mg/L 胰岛素, 5.5mg/L 转铁蛋白, 5ug/L亚硒酸；
体系2：待细胞完全贴壁后，吸弃孔内培养基，更换成1ml的诱导培养基II；然后置于5%CO2，95%饱和湿度的37℃培养箱中进行培养；随后进行下述步骤D；
诱导培养基Ⅱ的制备方法为：在1ml的Chang氏通用培养基中加入0.018~0.022ml的FBS、19~21ng的人肝细胞生长因子、9~11ng的人成纤维细胞生长因子-4、9~11ng的重组人致瘤素M、39~41ng的地塞米松，加入0.008~0.012ml的ITS premix；
该ITS premix为：10mg/L 胰岛素, 5.5mg/L 转铁蛋白, 5ug/L亚硒酸；
D、2-3天半量换液一次，每日在倒置显微镜下观察细胞状态；诱导时间为20~22天，得具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞。
2.根据权利要求1所述的利用宫内膜干细胞诱导分化肝脏细胞的方法，其特征是所述步骤1）依次为：
①、经血收集：
将15~20ml的经血放入上述装有含抗生素的杀菌液的采集管内，于4℃的低温下保存24~48小时；然后离心，去上清液；
②、原代培养：
A）、取6~10ml的Chang氏通用培养基加入到步骤①所得物中；
B）、将步骤A）的所得物放入培养瓶中置于4~6%CO2、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱内培养；培养5~7天后全量换液；再将上述培养瓶直立3~8分钟，从而使未贴壁的细胞滑落至培养瓶底部，用移液管去除培养瓶中的培养基；
C）、在步骤B）所得的培养瓶中加入2~4 mL的Chang氏通用培养基进行润洗，然后用移液管去除培养瓶中的培养基；
D）、在步骤C）所得的培养瓶中加入6~10 mL的Chang氏通用培养基，置于4~6%CO2、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱内培养；
所述Chang氏通用培养基的配制方法如下：在无菌条件下，在无菌容器中加入650mL MEM-alpha 培养基、160~200mL的 Chang B基液、10~30mL的 Chang C基液、5~15 mL 青霉素/链霉素双抗，5~15 mL的浓度为 200 mM的L-谷氨酰胺、130~170 mL的胎牛血清；充分混匀，高压蒸汽灭菌后放入4℃冰箱保存待用；
所述青霉素/链霉素双抗中含有10,000 U/mL苄青霉素钠和10,000 μg/mL链霉素；
③、细胞传代培养：
一旦步骤②原代培养的细胞生长至75~85%汇合度时，即采用胰酶消化传代；具体如下：
A）、一旦步骤②原代培养的细胞生长至75~85%汇合度时，去除培养液，然后用无钙镁离子的PBS进行洗涤；
B）、加入1~2ml胰酶，置于4~6%CO2、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱中孵育4~6分钟；
C）、加入4~6ml的Chang氏通用培养基使胰酶失活；
D）、轻柔吹打，使贴壁细胞脱落并成单细胞状态；
E）、按1：4的比率传代；
F）、在每1ml的细胞悬液中加入2~4ml的Chang氏通用培养基；然后置于4~6%CO2、94~96%饱和湿度的36~38℃培养箱中培养。
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