CN109082401B

CN109082401B - 一种羊膜上皮干细胞诱导分化为功能性肝细胞的方法及其应用

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Publication number: CN109082401B
Application number: CN201810857098.0A
Authority: CN
Inventors: 辛洪波; 柳全文; 李婧嫄; 刘倩玉; 任康康
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2018-07-31
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2038-07-31
Also published as: CN109082401A

Abstract

本发明公布了一种利用人羊膜上皮干细胞诱导分化为具有生物功能的肝脏细胞的方法，包括以下步骤：1)羊膜上皮干细胞的分离、培养、扩增、鉴定及GFP(Green Fluorescent Protein)标志；2)体外诱导分化：实验用带有GFP标志的第3～7代羊膜上皮细胞干细胞，选择用含诱导培养基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的体系1或者采用含诱导培养基Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的体系2进行诱导分化。经体系1(诱导时间为14‑15天)或体系2(诱导时间为22‑23天)诱导分化得到能够表达肝脏细胞特异性标志物及具有正常肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞；3)体内移植：将诱导产生的肝脏样细胞移植到急性肝损伤模型小鼠体内，可明显缓解急性肝损伤、恢复小鼠肝脏功能及提高小鼠存活率。

Description

一种羊膜上皮干细胞诱导分化为功能性肝细胞的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种利用羊膜上皮干细胞诱导分化肝脏细胞的方法。

背景技术

原位肝移植是终末期肝病治疗的金标准。然而，肝源的短缺是临床上进行肝细胞移植的最大瓶颈。所以，找到合适的、丰富的肝细胞来源是现在生物学领域研究的热点。1981年Evans等人建立了第一个小鼠ES细胞系，以其为模型，证实小鼠ES细胞在体外不仅可以诱导分化为肝祖细胞，而且可以进一步分化为有生物功能的肝细胞。有动物实验表明，将体外分化得到的肝细胞移植入肝损伤模型小鼠体内，移植细胞能够融合到肝脏组织，并缓解小鼠的肝损伤状况，且移植3个月内未发现畸胎瘤和肿瘤的形成。人ES细胞的成功建立打开了体外产生可供移植治疗的所有类型的人体细胞、组织乃至器官的大门。多数研究者利用各种成体干细胞在体外诱导分化为肝脏细胞，并研究其作用于急性肝损伤的动物模型，如腹腔注射四氯化碳、烯丙胺及倒千里光碱等造成的肝持续性纤维化，以及构建肝部分切除动物模型。这些研究中，均对诱导分化后的细胞进行功能特性研究，如形态学观察，细胞表面抗原，成熟肝脏细胞所具有的糖原合成储备、尿素产生、分泌白蛋白(ALB)功能，肝脏细胞特异性蛋白(ALB)和AFP (alpha-fetoprotein，甲胎蛋白)的表达进行了研究。至今已经有经由骨髓间充质干细胞、脐血间充质干细胞、胚胎干细胞和诱导多能性干细胞等向肝细胞方向分化的报道。然而骨髓和脐血来源有限、胚胎干细胞存在伦理问题及致瘤性、诱导多能性干细胞存在致瘤性，使得这些细胞很难真正用于临床。

2005年，Toshio等研究证实人羊膜上皮细胞符合干细胞的标准。表达胚胎干细胞标志物如SSEA-3、SSEA-4、TRA 1-60、TRA 1-81、SOX2、Oct-4、Nanog 等，表达间充质干细胞标志物如CD29、CD73、CD105等，同时表达上皮干细胞标志物CK7、E-cadherin等；但部分间充质干细胞标志物(CD90)和造血干细胞表面标志物(如CD34和CD45)则为阴性。羊膜上皮干细胞体外可长期培养且保持染色体组型稳定，其增殖分化潜能明显高于脐血、骨髓和脂肪等来源的间充质干细胞。羊膜上皮干细胞不表达HLA-DR(human leukecyte antigen-antigen D related)，低表达HLA-ABC(human leukocyte antigen class I)，NOD-SCI(nonobese diabetic severe combined immunodeficient)小鼠体内移植不产生畸胎瘤，说明其免疫原性低、无致瘤性，这为细胞移植的安全性提供了一定的保证。羊膜上皮干细胞能通过非入侵性手段轻易获得，能利用标准的实验室条件达到很好的扩增和定向分化结果。

目前，已有研究报道羊膜上皮干细胞具有向神经细胞(外胚层来源)、心肌细胞(中胚层来源)和胰岛细胞(内胚层来源)等三个胚层的许多细胞分化的能力。有文献报道，羊膜上皮干细胞可成功定向分化为胰岛样细胞，并研究了该细胞可响应葡萄糖刺激分泌胰岛素，移植进入1型和2型糖尿病动物模型后可在一定程度上缓解胰高血糖症；Gao等研究发现羊膜上皮干细胞体外可定向分化为具有生物功能的神经细胞，将这些细胞移植进入脊髓损伤模型中可修复损伤。TAN 等发现羊膜上皮干细胞可分泌多种因子，具有强大的免疫调节性能，可影响巨噬细胞的极性及活性，其分泌的LXA4在极性肺损伤中发挥重要作用；Mary等发现羊膜上皮干细胞可直接调节大脑的小胶质细胞，释放营养因子，修复脑损伤； Miki等发现羊膜上皮干细胞可分化为胆管上皮细胞，体内移植后可治疗慢性胆汁阻塞。羊膜上皮干细胞不表达HLA-DR，低表达HLA-ABC，说明其免疫原性低、这为降低或解决异体细胞移植后所产生的排斥反应提供了重要的细胞来源。

羊膜上皮干细胞是新近发现的成体干细胞的一种，属于上皮干细胞。羊膜组织中发现存在丰富的上皮干细胞，可从胎儿分娩后废弃的羊膜上快速的分离，是一种无创、安全的干细胞来源方式。在细胞标志分子表达和分化能力上，羊膜上皮干细胞与胚胎干细胞最为相似。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用羊膜上皮干细胞诱导分化为功能性肝脏细胞的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用羊膜上皮干细胞诱导分化为肝脏细胞的方法，包括以下步骤：

1)人羊膜上皮干细胞的分离、培养、扩增及标志：

人羊膜经含抗生素的杀菌液处理后，用胰酶将上皮干细胞从羊膜上消化下来，离心去上清；然后加入羊膜上皮干细胞培养基置于5％CO₂、95％湿度37℃ 培养箱中培养；

培养2-3天后换液去除未贴壁细胞，一旦细胞生长至75％-80％汇合度时，即采用胰酶消化传代；

取P3代羊膜上皮干细胞，通过慢病毒进行GFP转染：

2)体外诱导分化：

A、在50ml离心管中加入1ml Matrigel，并加入29ml PBS，充分混匀，以此作为6孔板孵育液。每个6孔中加入1ml稀释后的Matrigel，室温孵育1小时， PBS清洗3遍待用。

B、将上述步骤1)所得的3～7代生长状态良好的细胞以胰酶消化，当显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含体积浓度10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心，所得细胞沉淀用PBS清洗；

C、将上述步骤B中所得的经PBS清洗后的细胞沉淀接种于Matrigel预处理过的6孔板中进行诱导培养，接种细胞密度为3～4×10⁵/孔，每孔中加入2ml羊膜上皮干细胞培养基；在5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养；

D、选择以下任意1个体系进行：

体系1：待细胞生长密度达到80-90％时，吸弃孔内培养基，更换成2ml的诱导培养基I，然后置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养；2天后吸弃诱导培养基I，更换为2ml的诱导培养基Ⅱ，每2天换液，共5天；5天后吸弃诱导培养基Ⅱ，更换为2ml的诱导培养基Ⅲ，每2天换液，共7天。每天在倒置显微镜下观察细胞状态，诱导时间为14-15天，得到具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞。

诱导培养基I的制备方法为：在34.76ml IMDM中加入4ml胎牛血清、0.4ml 浓度为100mM的非必需氨基酸、0.4ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺、0.04μl 浓度为55mM的2-巯基乙醇、0.4ml双抗(含10,000U/ml苄青霉素纳和10,000 μg/ml链霉素)、400ng人表皮生长因子、400ng人碱性成纤维生长因子；

诱导培养基Ⅱ的制备方法为：在34.36ml IMDM中加入4ml胎牛血清、0.4ml 浓度为100mM的非必需氨基酸、0.4ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺、0.04μl 浓度为55mM的2-巯基乙醇、0.4ml双抗、400ng人表皮生长因子、400ng人碱性成纤维生长因子、800ng的肝细胞生长因子、加入地塞米松使浓度为1μM、加入0.4ml的ITS Premix；

诱导培养基Ⅲ的制备方法为：在34.36ml IMDM中加入4ml胎牛血清、0.4ml 浓度为100mM的非必需氨基酸、0.4ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺、0.04μl 浓度为55mM的2-巯基乙醇、0.4ml双抗、400ng人表皮生长因子、800ng的人重组致瘤素M、800ng的肝细胞生长因子、加入地塞米松使浓度为1μM、加入0.4ml的ITS Premix；

该ITS premix为：10mg/L胰岛素、5.5mg/L转铁蛋白、5μg/L亚硒酸；

体系2：待细胞生长密度达到80-90％时，吸弃孔内培养基，更换成2ml的诱导培养基Ⅳ，然后置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养；2天后吸弃诱导培养基Ⅳ，更换为2ml的诱导培养基Ⅴ，每2天换液，共7天；7天后吸弃诱导培养基Ⅴ，更换为2ml的诱导培养基Ⅵ，每2天换液，共14天。每天在倒置显微镜下观察细胞状态，诱导时间为23-24天，得到具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞。

诱导培养基Ⅳ的制备方法为：在39.6ml IMDM中加入800ng人表皮生长因子、400ng人碱性成纤维生长因子、0.4ml双抗(含10,000U/ml苄青霉素纳和 10,000μg/ml链霉素，下同)；

诱导培养基Ⅴ的制备方法：在39.54ml IMDM中加入800ng人肝细胞生长因子、400ng人碱性成纤维生长因子、0.04ml的DMSO、0.4ml双抗；

诱导培养基Ⅵ的制备方法：在39.2ml IMDM中加入800ng的人重组致瘤素 M、加入地塞米松使浓度为1μM、加入0.4ml的ITS Premix、0.4ml双抗；

该ITS premix为：10mg/L胰岛素、5.5mg/L转铁蛋白、5μg/L亚硒酸；

作为本发明的利用羊膜干细胞诱导分化为功能性肝脏细胞的方法的改进，步骤1)依次为：

A、羊膜收集：

将羊膜从胎盘上剥离，放入上述装有含抗生素的杀菌液的烧杯中，室温下处理1-2小时；用PBS洗羊膜3次，每次将羊膜转移到含有新鲜PBS的烧杯中；

B、原代培养

1)将步骤A中所得的羊膜转移到50ml离心管中，加入30ml新鲜预热的胰酶/EDTA，37℃水浴锅中孵育，每隔10分钟振荡器上震荡1次；40分钟后加入2倍体积的含体积浓度10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化；

2)将步骤1)中所得的细胞悬液离心去上清，加入7-8ml羊膜上皮干细胞培养基，接种于10cm细胞培养皿中，置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养。

所述羊膜上皮干细胞通用培养基的配置方法如下：在无菌容器中加入430mlDMEM-high glucose(ThermoFisher，10564011)、5ml浓度为100mM的苯酮酸钠(ThermoFisher，11360070)、50ml胎牛血清、5ml浓度为100mM的非必需氨基酸、5ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺、500μl浓度为55mM的2-巯基乙醇、5ml双抗(含10,000U/ml苄青霉素纳和10,000μg/ml链霉素)、5μg人表皮生长因子；充分混匀，4℃保存待用。

C、细胞传代培养：

一旦步骤B)原代培养的细胞生长至70％-80％汇合度时，即采用胰酶消化传代；具体步骤如下：

1)一旦步骤B)原代培养的细胞生长至75％-85％汇合度时，去除培养基，然后用无钙镁离子的PBS进行洗涤；

2)加入1-2ml胰酶，置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中孵育2-3分钟；

3)加入2-4ml含体积浓度为10％胎牛血清的DMEM-高糖培养基使胰酶失活；

4)轻柔吹打，使贴壁细胞脱落成单细胞状态，离心去上清；

5)加入3ml羊膜上皮干细胞通用培养基，按1:3的比例传代；

6)在每1ml的细胞悬液中加入7-8ml的羊膜上皮干细胞通用培养基，接种于10cm细胞培养皿中，置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养。

D、细胞GFP标志

1)将293T细胞培养在六孔板中，细胞密度达到80％时，开始准备转染，转染前3小时换成新鲜不含双抗的培养基；

2)准备2个无菌的1.5mL EP管，各加入250μL的OPTI-MEM，3.3μg的 pCL-Eco质粒和3.3μg的GFP质粒混合均匀；

3)向另外2个离心管中加入10μL

3000和240μL OPTI-MEM，温和混匀，室温孵育5min；

4)将B和C中的液体一起温和混匀，室温孵育20min；

5)将转染混合物加入2个六孔板的孔中，每个孔做好标记，加完后十字形混匀(此时记转染时间0h)；

6)转染后8h换上新鲜293T培养液(DMEM-high glucose+10％FBS)，48h 后收集上清，用0.45μm滤膜过滤后然后加入polybrene(聚凝胺)使终浓度为 8μg/ml；

7)用6)中得到的感染液感染羊膜上皮干细胞，感染12h后羊干细胞换上新鲜的羊膜干细胞培养液；

8)免疫荧光观察转染效率，在培养基中加入3mg/ml嘌呤霉素(Puromycin， Sigma，A1113803)筛选带有GFP的羊膜上皮干细胞。

本发明具有以下优点：

1、细胞来源丰富，分离培养技术已掌握，提供了一种新型的成体干细胞来源；

2、通过体外定向诱导将羊膜上皮干细胞分化为功能性肝样细胞，提供了一种大量获得功能性肝脏细胞的方法；

3、通过体内移植，发现由羊膜上皮干细胞诱导产生的功能性肝脏细胞可以迁移至受损肝脏，且在一定程度上抑制转氨酶活性、恢复肝脏白蛋白水平，提高急性肝损伤小鼠存活率，为临床肝衰竭、肝硬化和肝癌的治疗提供了一种新的选择。

综上所述，本发明采用分离培养的人羊膜上皮干细胞，利用体外干细胞诱导技术，研究羊膜上皮干细胞的多能性及其定性分化功能性肝脏细胞的潜能，并通过尾静脉将肝脏细胞移植进入急性肝损伤模型小鼠体内，证实其应用于急性肝损伤治疗的可行性，为肝脏疾病的干细胞治疗提供了一种新的途径。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是羊膜上皮干细胞分离和鉴定的结果图：

(A)i为原代细胞在不含EGF的培养基中培养至第7天形成的集落，ii为在含有EGF的培养基中得到的细胞，呈卵圆形，典型的上皮样细胞，单层生长；

(B)RT-PCR检测表明羊膜上皮干细胞表达胚胎干细胞标志基因Nanog和 Oct4；表达上皮干细胞标志基因E-cadherin和CK7；表达间充质干细胞标志基因CD73和CD105，不表达间充质干细胞标志基因CD90；

(C)流式细胞术检测表明羊膜上皮干细胞表达间充质干细胞标志蛋白 CD29、CD73、CD105及低表达主要组织相容性Ⅰ类抗原HLA-ABC；不表达间充质干细胞标志蛋白CD90、造血干细胞标志标志蛋白CD34、CD45及主要组织相容性Ⅱ类抗原HLA-DR；

(D)RT-PCR检测表明羊膜上皮干细胞不表达主要组织相容性Ⅱ类抗原 HLA-DR、低表达主要组织相容性Ⅰ类抗原HLA-ABC，并且不同代数羊膜上皮干细胞HLA-DR及HLA-ABC的表达了无明显差异；

(E)免疫荧光检测表明羊膜上皮干细胞表达胚胎干细胞标志蛋白Oct-4、 Nanog、SSEA-4和上皮干细胞标志蛋白E-cadherin。

图2是羊膜上皮干细胞(hAESCs)体外及体内致瘤性的检测结果图；

(A)hAESCs不能在软琼脂上增殖、生长，未形成集落，而对照组肝癌细胞HEPG2能无限繁殖，形成肉眼可见的较大集落群。说明hAESCs体外无致瘤性；

(B)hAESCs移植进入NOD-SCID小鼠体内，至第6个月未见肿瘤出现。而注射胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)的对照组在第2个月就出现肿瘤。结果表明羊膜上皮干细胞体内无致瘤性。

图3是羊膜上皮干细胞(hAESCs)诱导为功能性肝脏细胞(Hepatocyte-likecells，HLCs)分化检测结果图；

(A)hAESCs体外诱导分化为功能性HLCs路线图；

(B)羊膜上皮干细胞在诱导培养基作用下细胞形态逐渐发生改变，由原来的卵圆形上皮样细胞形态(D0)逐渐发展为多角的“铺路石”样形态(D14)，类似于正常人肝细胞(Primary Hepatocytes，PHH)的生长形态；

(C)免疫荧光检测表明，hAESCs体外诱导分化2天后，表达内胚层标志蛋白FOXA2和SOX17；诱导分化7天之后表达早期肝祖细胞标志蛋白AFP；

(D)RT-PCR检测羊膜上皮干细胞成肝分化7天和14天后肝脏细胞特异性基因的表达情况。结果表明羊膜上皮干细胞诱导分化后表达肝脏细胞特异性标志基因ALB、AAT、CYP3A4、CK19等。

未分化HAESCs和PHH作为阴性和阳性对照；

图4是羊膜上皮干细胞(hAESCs)诱导产生的肝细胞样细胞(HLCs)功能检测图；

(A)免疫荧光检测hAESCs成肝诱导14天后表达功能性肝细胞特异性蛋白ALB和AAT，绿色为阳性；

(B)QRT-PCR检测表明肝样细胞表达CYP酶活性相关基因CYP3A4、 CYP1A2、CYP7A1及CYP2B6；

(C)ALB分泌检测：hAESCs体外诱导分化14天之后，ELISA检测表明其可分泌ALB；

(D)尿素合成实验：hAESCs成肝分化第7和14天均可检测到尿素产生，且尿素浓度呈逐渐升高趋势；

(E)PAS染色和ICG吸收实验：PAS(periodic acid-Schiff，北京雷根，DG0006) 染色中，hAESCs成肝诱导14天细胞被染色成为紫红色；ICG(Indocyanine green， Sigma，1340009)吸收实验中，羊膜上皮干细胞成肝诱导14天细胞可吸收ICG 变为绿色。

未分化的羊膜上皮细胞(HAESCs)和正常人原代肝细胞(PHH)分别作为阴性和阳性对照。

图5是体内实验、肝功能检测及免疫组化结果图

(A)体内实验路线图。NOD-SCID小鼠腹腔注射CCl₄造急性肝损伤模型， 4h后通过尾静脉注射PBS或诱导的肝细胞(Hepatocyte-Like Cells，HLCs)，移植3天和7天后，处死小鼠，收集血清及心脏，做后续检测。

(B)移植3天和7天后，细胞移植组小鼠(n＝8)相对于PBS移植组小鼠(n＝8)血清TBIL(总胆红素)、ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶) 和ALP(碱性磷酸酶)显著下降，ALB(白蛋白)上升。表明移植HLCs可以在一定程度上恢复小鼠白蛋白水平，抑制转氨酶活性；

(C)HLCs移植7天后，取不同组小鼠肝脏组织进行HE染色。结果表明， CCl₄注射7天后，CCl₄+PBS移植组小鼠肝脏细胞大量坏死、肝实质区域中出现大量空泡及炎症细胞浸润。而HLCs移植可减少小鼠坏死肝细胞数目、空泡面积及炎症细胞浸润，有效缓解急性肝损伤；

(D)对C图中肝细胞死亡面积进行统计，结果表明CCl₄+HLCs移植组小鼠肝脏中肝细胞死亡面积显著小于CCl₄+PBS组小鼠。

图6是HLCs移植后在急性肝损伤小鼠体内后的分布及治疗效果检测图；

(A)带有GFP标志的HLCs的形态图；

(B)将带有GFP标志的HLCs移植进入急性肝损伤模型小鼠体内，细胞移植3天后，处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、胰腺和大脑，小动物活体成像检测表明，部分HLCs移植后可特异性迁移至受损肝脏组织；

(C)细胞移植7天后，免疫组化及免疫荧光检测表明急性肝损伤模型小鼠肝脏组织中存在GFP阳性细胞；

(D)将每只小鼠CCl₄注射量提高至3mL/kg，4小时后通过尾静脉注射2×10⁶ HLCs或PBS(n＝8)。CCl₄+PBS组小鼠在5天内全部死亡(0/8)，而HLCs移植组中有6只小鼠长期存活(6/8)，表明HLCs移植可显著提高急性肝损伤小鼠存活率(75％)。

具体实施方式

实施例1、羊膜上皮干细胞(HAESCs)的分离、培养、扩增及GFP标志：

在获得新生儿家属同意的前提下，分离得到新鲜羊膜。经抗生素处理2h后，进行微生物检测及传染病病原体安全检测。羊膜经胰酶/EDTA(0.25％)37℃水浴锅中消化1h后，加入终止液。经离心，去上清，用羊膜上皮干细胞培养基置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养。2-3天后换液去除未贴壁细胞，随后每2天换液。当细胞汇合度达到80％时，采用胰酶/EDTA消化传代。取第3代羊膜上皮干细胞，利用慢病毒进行GFP转染。再利用免疫荧光和流式细胞技术对羊膜上皮干细胞进行OCT4、Nanog、SSEA-4、E-cadherin、CD29、CD73、CD90、 CD105、HLA-ABC、HLA-DR、CD34、CD45等分子表型鉴定。

具体操作规程如下：

一、羊膜上皮干细胞的分离、培养和扩增：

招募不同年龄段的怀孕妇女，在完全自愿的前提下捐献羊膜。

具体操作规程如下:

1、羊膜样品收集(细胞分离)

将500ml蓝盖瓶送至产房。蓝盖瓶预先装有200ml HBSS(Hank’s平衡盐溶液，Hanks'Balanced Salt Solution)的采集液，其中含有万古霉素60-100μg/ml、头孢氨苄150-300μg/ml、卡那霉素50-150μg/ml、庆大毒素80-160μg/ml、两性霉素B 2-3μg/m及300-500单位肝素钠；以此作为含抗生素的杀菌液

上述HBSS(Hank’s平衡盐溶液)采集液的制备方法如下：

在200ml的Hank’s平衡盐溶液中添加以下成分至下述浓度：万古霉素60-100 μg/ml、头孢氨苄150-300μg/ml、卡那霉素50-150μg/ml、庆大毒素80-160μg/ml、两性霉素B 2-3μg/m及300-500单位肝素钠；然后再按照常规程序于高温下进行灭菌。

孕妇分娩之后，将胎盘放入上述采集瓶中。在得到羊膜捐赠者知会同意的情况下对细胞进行培养。样品在送往实验室之前必须在低温(0-4℃)条件下进行保存(保存期一般为24-48h)。

1)将羊膜从胎盘上剥离，入上述装有含抗生素的杀菌液的烧杯中，室温下处理1-2小时；用PBS洗羊膜3次，每次将羊膜转移到含有新鲜PBS的烧杯中；

2)将上述羊膜转移到含有30ml预热胰酶/EDTA(0.25％)的50ml离心管中，37℃水浴锅中孵育，每隔10分钟振荡器上震荡1次；40分钟后加入2倍体积的含体积浓度10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化；

3)在1000rpm的转速下离心样品5分钟，去除上清液。

上述上清液可按照常规方式进行微生物检测及传染病病原体安全检测，一般对常见病毒如艾滋病病毒(HIV，human immunodeficiency virus)、乙肝病毒(HBV，hepatitis B virus)、丙肝病毒(HCV，hepatitis C virus)和梅毒病原体(Syphilispathogen)进行检测。若为阳性结果，则结束整个羊膜上皮干细胞的分离培养和扩增。检测目的是为了保证所得的羊膜上皮干细胞(此处指未做诱导处理的用于移植治疗的羊膜上皮干细胞)的使用安全性。

2、原代培养

培养基配置-羊膜上皮干细胞通用培养基的成分如下：

1)430ml DMEM-high glucose培养基；

2)50ml胎牛血清(10％v/v)；

3)5ml浓度为100mM的苯酮酸钠(1％v/v)；

4)5ml浓度为100mM的非必需氨基酸(1％v/v)；

5)5ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺(1％v/v)；

6)500μl浓度为55mM的2-巯基乙醇(0.1％v/v)；

7)5ml双抗(含10,000U/ml苄青霉素纳和10,000μg/ml链霉素)，(1％

v/v)；8)5μg人表皮生长因子(终浓度为10ng/ml)。

羊膜上皮干细胞通用培养基的配置方法如下：在无菌容器中加入430ml DMEM-high glucose、5ml浓度为100mM的苯酮酸钠、50ml胎牛血清、5ml 浓度为100mM的非必需氨基酸、5ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺、500μl 浓度为55mM的2-巯基乙醇、5ml双抗(含10,000U/ml苄青霉素纳和10,000μg /ml链霉素)、5μg人表皮生长因子；充分混匀，4℃保存待用。

1)取7ml羊膜上皮干细胞通用培养基，加入到已经去除上清的羊膜上皮干细胞样品(即步骤1的所得物)中，轻柔吹打混匀，得细胞悬液，

2)取一个10cm皿，将步骤1)所得的全部细胞悬液转移到该培养皿中；

3)放入到5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养；

4)培养2-3天后，全量换液(即换7ml羊膜上皮干细胞通用培养基)；

5)取5ml上皮干细胞通用培养基，慢慢在培养皿侧壁滴入，轻柔摇晃，润洗细胞层，用移液管将培养基去除；

6)取7ml羊膜上皮干细胞通用培养基，慢慢在培养皿侧壁滴入；

7)镜下观察，有较多贴壁细胞。放入到5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中继续培养。在培养过程中，每3天换液一次，继续培养。待细胞汇合度达到70-80％时，进行传代。

3、细胞传代培养

1)去除上述原代培养步骤7)所得物中的培养液；

2)用无钙镁的PBS洗涤液进行洗涤；

上述无钙镁离子的PBS洗涤液的配制如下：

于高压蒸汽灭菌(常规程序)后放入4℃冰箱保存待用。

3)加入1ml胰酶，37℃孵育(5％CO₂、95％湿度)5分钟；

4)加入2ml羊膜上皮干细胞通用培养基使胰酶失活；

5)轻柔吹打，使贴壁细胞脱落并形成单细胞状态；

6)按1:3的比例传代：从3ml的细胞悬液中取1ml至一新的10cm培养皿

中，再加入6ml的羊膜上皮干细胞通用培养基，摇匀；

7)放入到5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养；

8)每3-4天传代细胞一次(即从步骤1)至步骤7))。

4、羊膜上皮干细胞GFP标志

2)准备2个无菌的1.5mL EP管，各加入250μL的OPTI-MEM(Minimal EssentialMedium)，3.3μg的pCL-Eco质粒和3.3μg的GFP质粒混合均匀；

3)向另外2个离心管中加入10μL

3000(Gbico， L3000015)和240μL OPTIMEM(Gbico，31985062)，温和混匀，室温孵育5min；

4)将B和C中的液体一起温和混匀，室温孵育20min；

5)将转染混合物加入2个六孔板的孔中，每个孔做好标记，加完后十字形混匀(此时记转染时间0h)。

7)用6)中得到的感染液感染第3代羊膜上皮干细胞，感染12h后羊膜上皮干细胞换上新鲜的羊干培养液；

5、羊膜上皮干细胞表面分子标志鉴定：

一、RT-PCR检测细胞标志基因

1)细胞传至第3代时收集细胞，胰酶/EDTA消化液(0.25％)消化细胞，制成细胞悬液，调整细胞密度至1×10⁶个/ml；

2)RNA提取：取1ml细胞悬液，1000rpm离心5分钟，弃上清。加入1ml TRIzol，至细胞完全溶解后转移至1.5ml EP管中；加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀，室温放置5min；4℃下12,000rpm离心15min，吸取上层水相约300μL 入新的1.5ml EP管中；加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min；4℃ 下12,000rpm离心10min，弃上清；用75％的乙醇洗涤沉淀，4℃下12,000rpm 离心5min，弃上清；室温干燥2-5min后，加入适量DEPC水溶解；

3)cDNA第一链合成：总RNA样品用DNA酶消化处理清除残余的基因组 DNA污染，用紫外分光光度计测定(波长为260nm)RNA浓度。每个样品取2μg 总RNA(0.5-1μL)用于第一链合成。具体步骤如下：2μg总RNA(0.5-1μL)、 1μL oligo(dT)18引物和1μL随机引物，ddH₂O补至总体积12μL，置65℃反应5min；加入5×buffer 4μL、dNTP 2μL、ribolockTM RNaseinhibitor 1μL和 RevertAidTM M-MulV反转录酶1μL，反应总体积为20μL，25℃5min→42℃60min→70℃5min。合成的cDNA第一链用于下一步PCR反应。

4)PCR反应：将上述制备的cDNA分别用PCR进行扩增。PCR所需引物见下表：

表1羊膜上皮干细胞标志基因RT-PCR引物序列及片段扩增长度

PCR扩增体系为：

cDNA 2μL、2mM dNTP 1μL、10μM的上下游引物(GAPDH、Nanog、 OCT4、E-cadherin、CK7、CD105、CD73、CD90、HLA-ABC和HLA-DR等) 各1μL、10×buffer(含Mg²⁺)5μL和TaqDNA聚合酶1μL，加H₂O补至总体积50μL。PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃～62℃退火 30s，72℃延伸30s，35循环，72℃延伸7min，退火温度和循环数根据引物的具体情况进行选择。反应完成后取5μL扩增产物加1μL溴酚兰指示剂，用1.2％的琼脂糖进行凝胶电泳。电泳完毕后，用凝胶成像分析系统观测结果，拍照。

所得结果为：Nanog、OCT4、E-cadherin、CK7、CD105、CD73、HLA-ABC 为阳性，CD90和HLA-DR为阴性。

二、流式细胞术检测细胞表面抗原

2)分别取所需数量的1.5ml EP管，分别加入小鼠抗人单克隆抗体(CD29、 CD90、CD73、CD105、CD34、CD45、HLA-DR、HLA-ABC及同型对照)20μl；

3)管内分别加入细胞样本(上述步骤1)所得)50μl，避光4℃孵育30min；

4)1000rpm离心5分钟；

5)弃上清，加入含1％(质量浓度)人血清的PBS 1ml，充分混匀，1000rpm 离心5分钟；

6)弃上清，加入PBS调整样本量至100μl，上流式细胞仪进行分析。

所得结果为：CD29、CD105、CD73、HLA-ABC为阳性，CD90、CD34、 CD45及HLA-DR为阴性。

三、免疫荧光检测细胞标志蛋白

2)将共聚焦玻片放入12孔板中，将细胞样品接种在玻片上，贴壁24h后进行免疫荧光检测；

3)4％多聚甲醛固定细胞15分钟，预冷PBS清洗细胞两遍；

4)含0.25％Triton-X 100的PBS处理10分钟对细胞进行破膜处理，PBS清洗3遍，每遍5分钟；

5)再经含1％BSA的PBST(含0.1％Tween-20的PBS)孵育30分钟来封闭非特异性蛋白结合位点；

6)用含1％BSA的PBST稀释一抗(OCT-4、SSEA-4、Nanog及E-cadherin)， 4℃湿盒中孵育细胞过夜。

7)PBS清洗3遍，每遍5分钟；用含1％BSA的PBS稀释二抗，室温下孵育细胞1小时；

8)吸出二抗，PBS多次清洗细胞后加入DAPI复染1分钟，激光共聚焦显微镜下观察。

所得结果为：OCT-4、SSEA-4、Nanog及E-cadherin均为阳性。

上述检测确定所得细胞符合羊膜上皮干细胞的一般表型标准(即确定所得为羊膜上皮干细胞)。

实施例2、羊膜上皮干细胞体内外致瘤性检测

1、羊膜上皮干细胞体内外致瘤性检测

1)取培养第三代的生长状况良好的羊膜上皮细胞，表现为生长旺盛、胞体大、胞核清晰、胞浆丰富、显微镜下折光性强的细胞，以胰蛋白酶－EDTA消化液(0.25％)消化，显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含10％(体积浓度)胎牛血清的DMEM培养基终止消化，轻柔吹打后离心，获得细胞沉淀，PBS(无钙镁离子的PBS洗涤液)洗2遍(目的是为了洗去胰蛋白酶、胎牛血清等物质)；

2)将步骤1)中羊膜上皮干细胞接种在软琼脂上，培养30天之后，观察集落形成情况；

3)用PBS稀释步骤1)中的羊膜上皮干细胞，调整密度至2.5×10⁷个/ml。取200μl(细胞数目为5×10⁶个)，分别在NOD-SCID小鼠背部皮下及大腿肌肉注射；小鼠放入SPF级动物房继续饲养，2个月后检测小鼠肿瘤形成情况；

根据该结果，我们得知羊膜上皮干细胞体外不能在软琼脂上增殖、生长，未形成集落(箭头所指为单个悬浮细胞)；体内移植不产生畸胎瘤。表明羊膜干细胞安全、无致瘤性。

2、设置对照组

相对于上文中的“羊膜上皮干细胞体内外致瘤性检测”做如下改动，其余同 “羊膜上皮干细胞体内外致瘤性检测”的步骤1)～步骤3)

将步骤2)中的羊膜上皮干细胞更换为肝癌细胞HEPG2，作为体外致瘤性检测的阳性对照组；

将步骤3)中的羊膜上皮干细胞更换为胚胎干细胞，作为体内致瘤性检测的阳性对照组；

结果为，肝癌细胞HEPG2体外能无限繁殖，形成肉眼可见的较大集落群；胚胎干细胞在NOD-SCID小鼠体内可产生肿瘤。

实施例3、羊膜上皮干细胞诱导分化为肝细胞及其功能检测

具体操作规程如下：

1、体外定向诱导羊膜上皮干细胞分化为肝细胞

1)取培养第三代的生长状况良好的细胞，以胰蛋白酶－EDTA消化液(0.25％)消化，显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含10％(体积浓度)胎牛血清的DMEM培养基终止消化，轻柔吹打后离心，获得细胞沉淀，PBS(无钙镁离子的PBS洗涤液)洗2遍(目的是为了洗去胰蛋白酶、胎牛血清等物质)；

2)将上述经PBS清洗后的细胞沉淀接种于Matrigel预先处理过的6孔板中进行诱导培养，接种细胞密度为3×10⁵个/孔，每孔加2ml的羊膜上皮干细胞通用培养基，在37℃、5％CO₂、95％饱和湿度培养箱中培养；

3)选择以下任意1个体系进行：

体系1：待细胞生长密度达到80-90％时，吸弃孔内培养基，用无钙镁离子的 PBS清洗细胞两次。然后更换成2ml的诱导培养基I，置于5％CO₂、95％湿度、 37℃培养箱中培养；2天后吸弃诱导培养基I，更换为2ml的诱导培养基Ⅱ，每 2天换液，共5天；5天后吸弃诱导培养基Ⅱ，更换为2ml的诱导培养基Ⅲ，每 2天换液，共7天。随后按步骤4)执行操作。

诱导培养基I的制备方法为：在34.76ml IMDM(Iscove's Modified Dulbecco'sMedium，Thermo Fisher，12440053)中加入4ml胎牛血清、0.4ml浓度为100mM 的非必需氨基酸、0.4ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺、0.04μl浓度为55mM 的2-巯基乙醇、0.4ml双抗(含10,000U/ml苄青霉素纳和10,000μg/ml链霉素)、 400ng人表皮生长因子、400ng人碱性成纤维生长因子；

该ITS premix为：10mg/L胰岛素、5.5mg/L转铁蛋白、5μg/L亚硒酸；

体系2：待细胞生长密度达到80-90％时，吸弃孔内培养基，更换成2ml的诱导培养基Ⅳ，然后置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养；2天后吸弃诱导培养基Ⅳ，更换为2ml的诱导培养基Ⅴ，每2天换液，共7天；7天后吸弃诱导培养基Ⅴ，更换为2ml的诱导培养基Ⅵ，每2天换液，共14天。

诱导培养基Ⅳ的制备方法为：在39.6ml IMDM中加入800ng人表皮生长因子、400ng人碱性成纤维生长因子、0.4ml双抗；

该ITS premix为：10mg/L胰岛素、5.5mg/L转铁蛋白、5μg/L亚硒酸；

4)每天在倒置显微镜下观察细胞状态，体系1诱导时间为14-15天，体系2 诱导时间为23-24天，得到具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞。

2、设置对照组：

相对于“体外定向诱导羊膜上皮干细胞分化为肝细胞”做如下改动，其余同 “体外定向诱导羊膜上皮干细胞分化为肝细胞”步骤1)～步骤4)。

取消体系1的“诱导培养基I”中的400ng人表皮生长因子(EGF)、400ng 人碱性成纤维生长因子(bFGF)；“诱导培养基Ⅱ”中的400ng人表皮生长因子 (EGF)、400ng人碱性成纤维生长因子(bFGF)、1μM的地塞米松使浓度、0.4 ml的ITS Premix；“诱导培养基Ⅲ”中的400ng人表皮生长因子(EGF)、800ng 的人重组致瘤素M、800ng的肝细胞生长因子、1μM的地塞米松使浓度、0.4ml 的ITS Premix；作为体系1的对照组；

取消体系2的“诱导培养基Ⅳ”中的800ng人表皮生长因子(EGF)、400ng 人碱性成纤维生长因子(bFGF)；“诱导培养基Ⅴ”中的800ng人肝细胞生长因子(EGF)、400ng人碱性成纤维生长因子(bFGF)；0.04ml的DMSO；“诱导培养基Ⅵ”中的800ng的人重组致瘤素M、1μM的地塞米松使浓度、0.4ml的ITS Premix；作为体系2的对照组；

结果为：2个对照组的细胞形态均未发生改变。

3、体外分化的肝脏细胞鉴定：

下面以按照体系1所得的较成熟具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞以及体系1的对照组为例，进行下述鉴定：

1)羊膜上皮干细胞的形态学观察

细胞在诱导后定期镜下观察其形态、胞浆颗粒及细微结构。

结果如图3(B)所示，根据该结果我们能得出以下结论：羊膜上皮干细胞在诱导培养基作用下细胞形态逐渐发生改变，由原来的卵圆形逐渐发展为多边形的肝脏细胞形态，至第14天呈现“铺路石”样形态，与正常人原代肝细胞(PHH) 形态相似。

2)免疫荧光检测内胚层标志蛋白FOXA2、SOX17及肝祖细胞标志蛋白AFP 的表达

A)羊膜上皮干细胞接种在玻片上，体外诱导分化2天和7天后；将共聚焦玻片放入12孔板中进行免疫荧光检测；

B)4％多聚甲醛固定细胞15分钟，预冷PBS清洗细胞两遍；

C)含0.25％Triton-X 100的PBS处理10分钟对细胞进行破膜处理，PBS清洗3遍，每遍5分钟；

D)经含1％BSA的PBST(含0.1％Tween-20的PBS)孵育30分钟来封闭非特异性蛋白结合位点；

E)用含1％BSA的PBST稀释一抗(OCT-4、SSEA-4、Nanog及E-cadherin)， 4℃湿盒中孵育细胞过夜。

F)PBS清洗3遍，每遍5分钟；用含1％BSA的PBS稀释二抗，室温下孵育细胞1小时；

G)吸出二抗，PBS多次清洗细胞后加入DAPI复染1分钟，激光共聚焦显微镜下观察。

所得结果如图3(C)所示：羊膜上皮干细胞体外诱导分化2天后，SOX17 和FOXA2为阳性，体外诱导分化7天后，AFP为阳性。

上述检测确定羊膜上皮干细胞体外诱导2天后分化为内胚层细胞，诱导7 天后分化为肝祖细胞。

3)RT-PCR检测肝脏细胞特异性蛋白mRNA(ALB、AAT等)的表达

取未经诱导的第2代羊膜上皮干细胞(hAESCs)和诱导后第7天和14天及人原代肝细胞(PHH)，计数约1×10⁶个，Trizol法提取总RNA。逆转录并进行体外扩增。PCR所需引物见下表：

表2肝细胞特异性标志基因RT-PCR引物序列及片段扩增长度

扩增体系为：

扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃～62℃退火30s，72℃ 延伸30s，35循环，72℃延伸7min，退火温度和循环数根据引物的具体情况进行选择。反应完成后取5μL扩增产物加1μL溴酚兰指示剂，用1.2％的琼脂糖进行凝胶电泳。电泳完毕后，用凝胶成像分析系统观测结果，拍照。

结果如图3(D)所示，根据该结果我们能得出以下结论：RT-PCR检测成肝分化细胞在第7天和第14天能表达肝脏细胞特异性基因ALB、AAT、CYP3A4、 CK19等，与正常人原代肝细胞类似，未分化的羊膜上皮干细胞则不能表达大部分肝脏细胞的基因。

4)免疫荧光检测成熟肝脏细胞标志蛋白AAT及ALB的表达

收集对照组HAESCs及其诱导分化14天产生的HLCs，4％多聚甲醛固定细胞15分钟，预冷PBS清洗细胞两遍；含0.25％Triton-X 100的PBS处理10分钟对细胞进行破膜处理，PBS清洗3遍，每遍5分钟；再经含1％BSA的PBST(含 0.1％Tween-20的PBS)孵育30分钟来封闭非特异性蛋白结合位点；用含1％ BSA的PBST稀释的一抗(AAT、ALB)，4℃湿盒中孵育细胞过夜。PBS清洗3 遍，每遍5分钟；用含1％BSA的PBS稀释二抗，室温下孵育细胞1小时；吸出二抗，PBS多次清洗细胞后加入DAPI复染1分钟，激光共聚焦显微镜下观察。

如图4(A)所示，根据该结果我们能得出以下结论：羊膜上皮干细胞在诱导培养基作用下至第14天，表达功能性肝细胞特异性标志蛋白AAT和ALB。而未分化的HAESCs不表达肝细胞特异性标志蛋白AAT和ALB。

5)RT-qPCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction)检测CYP450(Cytochrome P450)相关酶基因表达水平

CYP450相关酶是肝脏中药物代谢最重要的酶。

收集羊膜上皮干细胞(HAESCs)、羊膜上皮干细胞诱导产生的肝脏细胞 (HLCs)及原代人肝脏细胞(PHH)，提取RNA；用试剂盒将RNA反转成cDNA；用得到的cDNA进行下一步RT-qPCR，所需引物见表2。

表3CYP450酶相关基因RT-qPCR引物序列

RT-qPCR扩增体系：

所得结果为：HLCs表达CYP3A4、CYP1A2、CYP7A1和CYP2B6，且其表达量显著高于羊膜上皮干细胞(HAESCs)，低于人原代肝脏细胞(PHH)。

6)ALB分泌

选取诱导过程中不同时间节点(0、7和14天)细胞的培养基，ELISA(ALB enzyme-linked immunosorbent assay)Kit(Cloud Clone，CEB028Hu)检测ALB 浓度。

实验结果如图4(C)所示，羊膜上皮细胞体外诱导分化14天之后可分泌白蛋白，分泌水平显著高于未分化的羊膜上皮干细胞，低于PHH。

7)尿素合成检测

选取诱导过程中不同时间节点(0、7和14天)的细胞，暴露于1mmol/L NH₄Cl 中，24小时后收集培养液。Quantichrom urea assay kit(BioAssay Systems， DIUR-048)检测尿素浓度

实验结果如图4(D)所示，根据该结果我们能得出以下结论：羊膜上皮干细胞分化的细胞具有与肝脏细胞类似的尿素合成能力，且随着诱导时间的延长，细胞合成尿素能力越强。

8)糖原合成(PAS)检测

收集羊膜上皮干细胞(HAESCs)、肝细胞样细胞(HLCs)及人原代肝脏细胞(PHH)的细胞爬片，用丙酮/甲醇(vol/vol＝1:1)-20℃固定细胞20分钟；PBS 洗2次，1％(wt/vol)过碘酸孵育10分钟，PBS洗2次；Schiff反应物(periodic acid-Schiff，北京雷根，DG0006)孵育15分钟；37℃预热PBS洗2次；计数，标准光学显微镜下分析、拍照。

结果如图4E(I-III)所示，根据该结果我们能得出以下结论：在诱导培养基中，羊膜上皮干细胞分化诱导分化14天的细胞具有与肝脏细胞类似的糖原合成与储存能力。而未分化的羊膜上皮干细胞无糖原合成与储存能力。

9)ICG(Indocyanine green)吸收实验

①选取人原代肝脏细胞(PHH)、HAESCs及其体外诱导分化14天后细胞 (HLCs)，吸弃培养基，PBS洗细胞3次；

②加入浓度为1mg/ml的ICG染液(完全浸没细胞)，37℃孵育1小时；

③吸弃ICG染液，PBS洗细胞3次，普通光学显微镜下观察细胞颜色变化并拍照。

结果如图4E(IV-VI)所示，根据该结果我们能得出以下结论：羊膜上皮干细胞诱导产生的细胞具有与肝脏细胞类似的吲哚菁绿(ICG)吸收能力。而未分化的羊膜上皮干细胞无吲哚菁绿吸收能力。

上述鉴定结果能证明按照本发明体系1所得的细胞是具有肝脏细胞功能的较成熟的肝脏细胞样细胞。

备注说明：

以“体系2所得的较成熟具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞以及体系2 的对照组”替代上述“体系1所得的较成熟具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞以及体系1的对照组”重复上述整个“3、体外分化的肝脏细胞鉴定”；结果相同。该鉴定结果能证明按照本发明体系2所得的细胞是具有肝脏细胞功能的较成熟的肝脏样细胞。

实施例4、羊膜上皮干细胞诱导产生的功能性肝细胞样细胞体内移植及其治疗急性肝损伤潜能检测

下面以按照体系1所得的较成熟具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞为例，进行下述实验

1)选取8周龄雄性NOD-SCID小鼠(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)24只，分为正常对照组和急性肝损伤模型组。正产对照组小鼠腹腔注射橄榄油(olive oil)，急性肝损伤模型组小鼠腹腔注射CCl₄(CCl₄以10％的比例溶解于olive oil中，以1mLCCl₄/kg小鼠体重注射)。

设置以下组别：

A、Olive oil对照组(n＝8)：腹腔注射橄榄油；

B、CCl₄+PBS组(n＝8)：小鼠腹腔注射CCl₄四小时后，通过尾静脉移植 500μl PBS进入急性肝损伤模型小鼠体内；

C、CCl₄+HLCs移植组(n＝8)：小鼠腹腔注射CCl₄四小时后，通过尾静脉移植羊膜上皮干细胞诱导产生的肝细胞样细胞(HLCs)进入急性肝损伤模型小鼠体内，注射量为：2×10⁶细胞/500μl PBS；

2)细胞体内移植：带有GFP标志的羊膜上皮干细胞在条件培养基中诱导14 天之后，吸弃培养基，PBS洗3遍；胰蛋白酶－EDTA消化液(0.25％)消化，显微镜下见细胞变为单个圆形时即以含10％(体积浓度)胎牛血清的DMEM培养基终止消化；1000rpm离心5分钟，去上清；加入PBS调整细胞密度至4× 10⁶个/ml；NOD-SCID小鼠注射CCl₄四小时后，通过尾静脉注射2×10⁶个HLCs 或500μl PBS。

3)肝功能指标检测：分别于细胞移植后第3天和第7天，对Olive oil对照组、CCl₄+PBS组和CCl₄+HLCs小鼠进行眼球取血，血清进行TBIL、ALT、AST、 ALB及ALP等生化指标检测。

结果如图5(B)所示，根据该结果我们能得出以下结论：细胞移植3天和7天后，与CCl₄+PBS组小鼠相比，CCl₄+HLCs移植组小鼠TBIL、ALT、AST 及ALP显著降低、ALB显著上升，第7天时，CCl₄+HLCs移植组小鼠肝功能水平与正常小鼠相当。说明HLCs移植可恢复急性肝损伤小鼠白蛋白水平、抑制转氨酶活性。

3)小鼠肝脏形态及组织切片HE染色：

A)HLCs移植7天后，腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，取Olive oil对照组、 CCl₄+PBS组和CCl₄+HLCs组小鼠肝脏，固定、石蜡切片；

B)脱蜡：用二甲苯浸泡切片3次，每次5分钟；依次在梯度酒精中(100％ 2次，每次2min-95％一次，2min-75％一次，3min-50％酒精一次，2min-50％3 min)进行脱蜡处理，ddH₂O洗5分钟；

C)苏木素染色20秒，流水冲洗干净；在梯度酒精(50％一次，1min-75％一次，1min-90％一次，1min-95％3min)；伊红染色5-7秒；

D)95％酒精1次，1min；100％酒精2次，1min；二甲苯三次，每次五分钟，中性树脂封片，镜下观察；

结果如图5(C、D)所示，根据该结果我们能得出以下结论：CCl₄及细胞移植7天后，与Olive oil正常对照组小鼠相比，CCl₄+PBS组和CCl₄+HLCs组小鼠肝脏细胞大量坏死、肝实质区域中出现大量空泡及炎症细胞浸润。而与 CCl₄+PBS组小鼠对比，CCl₄+HLCs组小鼠坏死肝细胞数目、空泡面积及炎症细胞浸润显著减少，急性肝损伤得到有效缓解。

5)小动物活体成像检测HLCs体内迁移：带有GFP标志的HLCs移植3天后，腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，分别取小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、胰腺和大脑组织，在小动物活体成像仪下检测HLCs在不同组织中的分布。

结果如图6(B)所示，根据该结果我们能得出以下结论：在急性肝损伤模型组小鼠中，部分HLCs可特异性迁移至受损肝脏组织。

6)免疫组化及免疫荧光检测HLCs在急性肝损伤模型小鼠肝脏中分布：

A)HLCs移植后7天，分别取Olive oil对照组、CCl₄+PBS组和CCl₄+HLCs 组小鼠肝脏进行石蜡切片；

B)脱蜡：用二甲苯浸泡切片2次，每次十分钟；依次在梯度酒精中(100％ 3min-95％3min-80％3min-70％3min-50％3min)进行脱蜡处理，ddH₂O洗2 分钟；

C)抗原修复：切片放入已预热的0.01mmol/L柠檬酸缓冲液中(PH＝6.0)，将其煮沸20分钟后取出，让切片自然冷却；

D)阻断内源性过氧化氢酶：加入3％的H₂O₂约10分钟后，用蒸馏水洗涤切片3次，每次3分钟，然后用PBS洗切片3次，每次5分钟；

E)一抗、二抗孵育及清洗：滴加GFP一抗，然后将切片放入4℃冰箱中孵育过夜；PBS洗切片3次，每次5分钟；加入HRP共轭的IgG二抗，室温处理 30分钟；PBS洗切片3次，每次5分钟；

F)加入DAB显色液孵育15分钟、显微镜下观察；蒸馏水冲洗，终止显色；苏木素复染20秒，蒸馏水清洗切片10分钟；依次在梯度酒精中(50％3min-70％ 3min-80％3min-95％3min-100％3min)；加二甲苯透明5分钟，中性树脂封片，拍照。

结果如图6(C)所示，根据该结果我们能得出以下结论：部分HLCs可特异性迁移至急性肝损伤模型组小鼠肝脏。

7)小鼠存活率实验：

将CCl₄注射量提高至3mL/kg，设置以下组别：

A、Olive oil对照组(n＝8)：腹腔注射橄榄油；

结果如图6(D)所示，根据该结果我们能得出以下结论：Olive oil对照组小鼠正常存活；CCl₄+PBS组小鼠在5天内全部死亡；CCl₄+HLCs组小鼠有6只存活。表明HLCs体内移植可显著提高急性肝损伤小鼠存活率。

备注说明：

以“体系2所得的较成熟具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞”替代上述“体系1所得的较成熟具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞”重复上述整个“体内移植实验”，结果相同。

前期有两篇报道表明羊膜上皮干细胞体外可诱导分化为肝脏细胞。TEE等研究表明羊膜上皮干细胞在含有10％FBS、10ng/ml EGF、insulin和0.1μmol Dexamethasone的诱导培养基中分化21天，可得到表达ALB的肝样细胞。Fabio 等的诱导方案分两个阶段，先将羊膜上皮干细胞在含DMEM Std、100ng/ml Activin A的诱导培养基中诱导2天，然后诱导培养基中加入0.2％FBS继续诱导 2天；最后在含有IMDM Std、5％FBS、10ng/ml EGF、10ng/mlbGFG、10ng/ml HGF和10^-6M Dexamethasone诱导培养基中诱导28天，得到表达ALB、CYP450相关代谢酶的肝细胞样细胞。但是前期的这两项研究中都没有检测肝样细胞是否具有成熟肝脏细胞类似的功能，如分泌白蛋白、合成尿素、积累糖原及吸收心脏绿等，更没有进行体内移植证明其是否具有治疗肝脏相关疾病的潜能。我们在综合前人诱导方案的基础上，将整个诱导分为3个阶段。首先，将羊膜上皮干细胞在含有IMDM、10％FBS、10ng/ml EGF、10ng/ml bGFG诱导2天，得到表达 SOX17和FOXA2的内胚层细胞；然后将细胞继续在含有IMDM、10％FBS、10 ng/ml EGF、10ng/ml bGFG、20ng/ml HGF、1μM dexamethasone、1％(v/v)ITS Premix中继续诱导5天，得到了表达AFP的肝祖细胞；最后将细胞在含IMDM、 10％FBS、10ng/ml EGF、20ng/ml oncostatin M、20ng/ml HGF、1μM dexamethasone和1％(v/v)ITSPremix的培养基中继续诱导7天，得到表达ALB、 CYP3A4及AAT的肝样细胞。并且我们首次验证了由本诱导方案得到的肝样细胞可分泌白蛋白、合成尿素、积累糖原及吸收心脏绿，表明其具有成熟肝脏细胞类似的功能。此外，我们还将诱导产生的肝脏细胞移植进入急性肝损伤小鼠体内，证明其可改善小鼠肝功能、保护肝脏结构、提高小鼠存活率。与前人的诱导方案相比，我们的诱导方案显著减少了诱导时间(分别有21天和28天减少到14天)、提高了诱导效率(超过90％的羊膜上皮细胞诱导分化为肝样细胞)、并首次在体内及体外证明了肝样细胞具有功能。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变通，如诱导的和没有诱导的羊膜上皮干细胞可用于包括肝硬化在内的肝损伤的治疗。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变通，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.利用人羊膜上皮干细胞诱导分化功能性肝脏细胞的方法，其特征是包括以下实验步骤：

A.在50ml离心管中加入1ml Matrigel和29ml PBS，充分混匀，以此作为6孔板孵育液；然后，将1ml上述Matrigel稀释液加入6孔板的每个孔中，室温孵育1小时，PBS清洗3遍待用；

B.将第3～7代生长状态良好的羊膜上皮干细胞用胰酶消化，当显微镜下见细胞为单个圆形时即以含体积浓度10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心，所得细胞沉淀用PBS清洗3次；

C.将上述步骤B中所得的细胞沉淀接种于Matrigel预处理过的6孔板中进行诱导培养，接种细胞密度为3～4×10⁵/孔，每孔中加入2ml羊膜上皮干细胞培养基；在5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养；

D.选择以下任意一个体系进行：

体系1：待细胞生长密度达到80-90％时，吸弃孔内培养基，更换成2ml的诱导培养基I，然后置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养；2天后吸弃诱导培养基I，更换为2ml的诱导培养基Ⅱ，每2天换液，共5天；5天后吸弃诱导培养基Ⅱ，更换为2ml的诱导培养基Ⅲ，每2天换液，共7天；每天在倒置显微镜下观察细胞状态，诱导时间为14-15天，得到具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞；

所述诱导培养基I的制备方法为：在34.76ml IMDM中加入4ml FBS、0.4ml浓度为100mM的非必需氨基酸、0.4ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺、0.04μl浓度为55mM的2-巯基乙醇、0.4ml双抗、400ng人表皮生长因子、400ng人碱性成纤维生长因子；所述双抗包括10,000U/ml苄青霉素纳和10,000μg/ml链霉素；

所述诱导培养基Ⅱ的制备方法为：在34.36ml IMDM中加入4ml胎牛血清、0.4ml浓度为100mM的非必需氨基酸、0.4ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺、0.04μl浓度为55mM的2-巯基乙醇、0.4ml双抗、400ng人表皮生长因子、400ng人碱性成纤维生长因子、800ng的肝细胞生长因子、加入地塞米松使浓度为1μM、加入0.4ml的ITS Premix；

所述诱导培养基Ⅲ的制备方法为：在34.36ml IMDM中加入4ml胎牛血清、0.4ml浓度为100mM的非必需氨基酸、0.4ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺、0.04μl浓度为55mM的2-巯基乙醇、0.4ml双抗、400ng人表皮生长因子、800ng的人重组致瘤素M、800ng的肝细胞生长因子、加入地塞米松使浓度为1μM、加入0.4ml的ITS Premix；

所述ITS premix为：10mg/L胰岛素、5.5mg/L转铁蛋白、5μg/L亚硒酸；

体系2：待细胞生长密度达到80-90％时，吸弃孔内培养基，更换成2ml的诱导培养基Ⅳ，然后置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养；2天后吸弃诱导培养基Ⅳ，更换为2ml的诱导培养基Ⅴ，每2天换液，共7天；7天后吸弃诱导培养基Ⅴ，更换为2ml的诱导培养基Ⅵ，每2天换液，共14天；每天在倒置显微镜下观察细胞状态，诱导时间为23-24天，得到具有肝脏细胞功能的肝脏细胞样细胞；

所述诱导培养基Ⅳ的制备方法为：在39.6ml IMDM中加入800ng人表皮生长因子、400ng人碱性成纤维生长因子、0.4ml双抗；

所述诱导培养基Ⅴ的制备方法：在39.54ml IMDM中加入800ng人肝细胞生长因子、400ng人碱性成纤维生长因子、0.04ml的二甲基亚砜、0.4ml双抗；

所述诱导培养基Ⅵ的制备方法：在39.2ml IMDM中加入800ng的人重组致瘤素M、加入地塞米松使浓度为1μM、加入0.4ml的ITS Premix、0.4ml双抗；

所述ITS premix为：10mg/L胰岛素、5.5mg/L转铁蛋白、5μg/L亚硒酸。

2.根据权利要求1所述的利用羊膜上皮干细胞诱导分化肝脏细胞的方法，其特征是人羊膜上皮干细胞获得方法为：

A、羊膜收集：

将从胎盘上剥离的羊膜，放入含有抗生素的PBS中，室温下处理1-2小时，用PBS洗羊膜3次，每次将羊膜转移到含有新鲜PBS的烧杯中；

B、原代培养

1)将步骤A中所得的羊膜转移到50ml离心管中，加入30ml新鲜预热的0.25％的胰酶/EDTA，37℃水浴锅中孵育，每隔10分钟振荡器上震荡1次；40分钟后加入2倍体积的含有10％FBS的DMEM培养基终止消化；

2)将步骤1)中所得的细胞悬液离心去上清，加入7-8ml羊膜上皮干细胞培养基，接种于10cm细胞培养皿中，置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养；

C、细胞传代培养：

1)一旦步骤B)原代培养的细胞生长至70％-80％汇合度时，去除培养基，然后用不含钙镁离子的PBS进行洗涤；

2)加入1～2ml胰酶，置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中孵育2～3分钟；

3)加入2～4ml含体积浓度为10％胎牛血清的DMEM培养基使胰酶失活；

4)轻柔吹打，使贴壁细胞脱落成单细胞状态，离心去上清；

5)加入3ml羊膜上皮干细胞通用培养基，按1:3的比例传代；

6)在每1ml的细胞悬液中加入7-8ml的羊膜上皮干细胞通用培养基，接种于10cm细胞培养皿中，置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养；

D、细胞GFP标志：

2)准备2个无菌的1.5mL EP管，各加入250μL的OPTI-MEM，3.3μg的pCL-Eco质粒和3.3μg的GFP质粒混合均匀；

3)向另外2个离心管中加入10μL和240μLOPTI-MEM，温和混匀，室温孵育5min；4)将2)和3)中的液体一起温和混匀，室温孵育20min；

5)将转染混合物加入含有293T细胞的六孔板中，混匀；此时将转染时间标记为0h；

6)转染后8h换上新鲜293T培养液，48h后收集上清，用0.45μm滤膜过滤后然后加入聚凝胺使终浓度为8μg/ml；所述293T培养液为DMEM-high glucose+10％FBS；

8)免疫荧光观察转染效率，在培养基中加入3mg/ml嘌呤霉素筛选带有GFP的羊膜上皮干细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述含抗生素的杀菌液配置如下：20ml的Hank’s平衡盐溶液体系，含有以下成分及以下浓度：万古霉素60-100μg/ml、头孢氨苄150-300μg/ml、卡那霉素50-150μg/ml、庆大毒素80-160μg/ml、两性霉素B 2-3μg/m及300-500单位肝素钠。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述羊膜上皮干细胞培养基的配置方法如下：在无菌容器中加入430ml DMEM-highglucose、5ml浓度为100mM的苯酮酸钠、50ml胎牛血清、5ml浓度为100mM的非必需氨基酸、5ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺、500μl浓度为55mM的2-巯基乙醇、5ml双抗、5μg人表皮生长因子；充分混匀，4℃保存待用。

5.利用人羊膜上皮干细胞诱导分化功能性肝脏细胞的培养基，其特征在于具体如下：

诱导培养基I的制备方法为：在34.76ml IMDM中加入4ml胎牛血清、0.4ml浓度为100mM的非必需氨基酸、0.4ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺、0.04μl浓度为55mM的2-巯基乙醇、0.4ml双抗、400ng人表皮生长因子、400ng人碱性成纤维生长因子；

诱导培养基Ⅱ的制备方法为：在34.36ml IMDM中加入4ml胎牛血清、0.4ml浓度为100mM的非必需氨基酸、0.4ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺、0.04μl浓度为55mM的2-巯基乙醇、0.4ml双抗、400ng人表皮生长因子、400ng人碱性成纤维生长因子、800ng的肝细胞生长因子、加入地塞米松使浓度为1μM、加入0.4ml的ITS Premix；

诱导培养基Ⅲ的制备方法为：在34.36ml IMDM中加入4ml胎牛血清、0.4ml浓度为100mM的非必需氨基酸、0.4ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺、0.04μl浓度为55mM的2-巯基乙醇、0.4ml双抗、400ng人表皮生长因子、800ng的人重组致瘤素M、800ng的肝细胞生长因子、加入地塞米松使浓度为1μM、加入0.4ml的ITS Premix；

使用时，诱导培养基I、诱导培养基Ⅱ、诱导培养基Ⅲ依次使用。

6.利用人羊膜上皮干细胞诱导分化功能性肝脏细胞的培养基，其特征在于具体如下：

诱导培养基Ⅵ的制备方法：在39.2ml IMDM中加入800ng的人重组致瘤素M、加入地塞米松使浓度为1μM、加入0.4ml的ITS Premix、0.4ml双抗；

使用时，诱导培养基Ⅳ、诱导培养基Ⅴ、诱导培养基Ⅵ依次使用。