CN115044540A - 一种羊膜上皮细胞的分离、纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羊膜上皮细胞的分离、纯化方法，解决现有方法获得P0代羊膜上皮细胞数量少、纯度低的问题，方法主要包括以下步骤：一、胎盘采集运输；二、羊膜上皮细胞分离；三、羊膜上皮细胞纯化，获得大量高纯度P0代羊膜上皮细胞冻存，即完成。本发明在短时间消化这种现有方法基础上增加消化次数，既保证了细胞活率、贴壁率，又能获得更多的细胞；将分离的细胞在铺有基质的培养器材上以合适密度接种进行贴壁纯化，于细胞贴壁完成且未进行扩增前消化收获，获得了SSEA‑4、CD105稳定表达的高纯度P0代羊膜上皮细胞。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分离、纯化方法，尤其是一种羊膜上皮细胞的分离、纯化方法。
背景技术
人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)与来源于囊胚期内细胞群的胚胎干细胞在原始祖性上仅低一代，是目前除了胚胎干细胞以外能够明确表达Otc-4、Nanog、Sox-2、FGF-1、Rex-1等胚胎干细胞标志的“干”性细胞，比脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞等围产期干细胞在原始祖性上高二代，即具有向三个胚层分化的多能干性，能够自主分化为外胚层来源的神经元、星形胶质细胞、神经胶质细胞；中胚层来源的骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肌细胞；以及内胚层来源的肝细胞、胰腺细胞等，是真正意义上的类亚全能干细胞。
hAECs从羊膜上分离获得。人羊膜是一层很薄的无血管膜，形成一个充满液体的囊包着胎儿。人羊膜的上皮层是由胚胎发育第8天的囊胚期内细胞群第一次分化的上胚层发育而来，由扁平、立方和柱状上皮细胞组成，与羊水接触，分离的hAECs即为此层细胞。有研究表明，每克羊膜可分离获得(12.9±0.7)×106个hAECs。在组织学上，上皮细胞表面分为游离面、侧面和基底面，基底面由基膜、质膜内褶和半桥粒组成。基膜是上皮细胞基底面与深部结缔组织之间共同形成的薄膜，靠近上皮部分为基板，与结缔组织相邻部分为网板，基板是由上皮细胞分泌产生，构成基板的主要成分有层粘连蛋白、IV型胶原蛋白和硫酸肝素蛋白多糖等。
目前国内常用流式标志SSEA-4作为hAECs阳性指标，国外细胞库在鉴定该细胞时阳性指标主要以上皮细胞标志作为纯度指标，如上皮黏附分子EpCAM(CD326)、整合素亚基β1(CD29)和α6(CD49f)、钙粘蛋白E-Cadherin(CD324)等。国内阴性指标常选择CD34、CD45、HLA-DR，国外常在此基础上加入CD105，用于排除胎盘间充质干细胞的污染。
hAECs在体外培养过程中易发生上皮间充质转化，细胞表现出形态和表型上的变化，这增加了hAECs的异质性，不利于临床应用。解决这个问题的其中一种方式是尽量将hAECs从羊膜上完全分离下来并减少体外培养时长。此外，在将hAECs从羊膜上分离下来的过程中，不可避免地会将羊膜上的其他细胞分离下来，所以hAECs分离后需要进行纯化。若要达到以上两方面的目的，则需要满足以下要求：一是所使用的分离方法既要保证分离细胞的活性，又要达到尽量分离羊膜上hAECs的目的；二是分离后尽量减少体外培养时长，尽量在hAECs贴壁完成但未扩增前进行收获。
目前已有诸多关于羊膜上皮细胞分离、纯化的报道，但都存在一些不足，例如：
CN103642751A(中国专利申请号：CN201310650384.7，上海同泽和济生物科技有限公司)公开了一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其分离细胞的主要步骤包括：0.25％胰蛋白酶预消化8-12min，弃去消化液；0.25％胰蛋白酶消化10-20min。分离后计数收集的细胞，如果细胞数大于2.0×107则直接冻存；否则进行培养，培养至细胞数达到大于2.0×107的标准后进行冻存。此方法消化时间较短(10-20min)，且仅消化一次，不利于将羊膜上的羊膜上皮细胞完全消化下来；此方法分离细胞数若不大于2.0×107，则需要进行培养，而羊膜上皮细胞培养扩增后，CD105表达升高，细胞异质性会增加，不利于后续的应用。
CN104818244A(中国专利申请号：CN201510263291.8，天晴干细胞股份有限公司)公开了一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法，其分离细胞的主要步骤包括：将羊膜裁剪成50-150cm2的块状，上皮面朝上贴敷于无菌硝酸纤维膜上，再将羊膜的上皮面朝下贴置在培养皿，制成羊膜贴片；0.25％的胰酶-EDTA消化15-20min。收集细胞之后进行纯化培养：按(0.9-1.1)×105/cm2的接种量接种于培养瓶中培养，细胞融合率达到85％后，弃除非贴壁细胞，消化贴壁细胞获得P0代羊膜上皮细胞单细胞悬液。此方法的缺陷在于：一方面，消化时间较短(15-20min)，且仅消化一次，不利于将羊膜上的羊膜上皮细胞完全消化下来；另一方面，其纯化培养过程需要等到细胞融合率达到85％才消化收获细胞，此过程无法明确细胞是否已经进行了扩增，公开的数据显示纯化培养后的羊膜上皮细胞纯度并不高：在其纯化前CD105表达率55.24％，纯化后CD105表达更高(84.85％)；SSEA-4的表达率也无十分明显的提高(纯化前47.57％，纯化后55.66％)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种羊膜上皮细胞的分离、纯化方法，解决现有方法获得细胞数量低、纯度低的问题，获得SSEA-4、CD105稳定表达的高纯度P0代羊膜上皮细胞。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种羊膜上皮细胞的分离、纯化方法，包括以下步骤：
步骤一，胎盘采集运输
胎盘娩出后，机械剥离羊膜，将羊膜浸入含有运输保存液的保存瓶中，密封后2-8℃运输，4小时内运输至实验室；
步骤二，羊膜上皮细胞分离
(1)从运输保存液中取出羊膜，用生理盐水重复涮洗3-5次后放入无菌不锈钢圆盘中，剪除羊膜边缘血液污染部分，剔除羊膜非上皮面胶原，生理盐水清洗至少3次，将整张羊膜裁剪成4-6块；
(2)在离心管中放入2-3块羊膜块，加入含0.02％EDTA的0.25％的胰蛋白酶液，37℃水浴预消化10-15min，弃去消化液，所述百分比浓度为质量体积百分比浓度；
(3)将预消化后的羊膜块转入新的离心管中，加入含0.02％EDTA的0.25％的胰蛋白酶液，37℃水浴消化20-25min，结束后颠倒摇晃10-15次，取出羊膜块后，保留消化液，在消化液中加入FBS终止消化，即获得第一次消化的细胞悬液，此过程再重复2次，分别获得第二、三次消化的细胞悬液；第三次消化结束后，将取出的羊膜块用的生理盐水涮洗3次，获得细胞涮洗液，所述百分比浓度为质量体积百分比浓度；
(4)将三次消化分别获得的细胞悬液和第三次消化后获得的细胞涮洗液合并，200目无菌滤网过滤收集，500g离心10min，用完全培养基重悬，AO/PI双荧光计数；
步骤三，羊膜上皮细胞纯化
(1)在培养器材上铺上促进羊膜上皮细胞贴壁的商品化基质；
(2)将上述分离获得的细胞以(4-8)×104/cm2的接种密度接种在铺有基质的培养器材上，放入二氧化碳培养箱培养40-48h，生理盐水清洗至少2遍去除非贴壁细胞，消化收集细胞，即获得高纯度羊膜上皮细胞P0代细胞，以(1.0-1.5)×107/mL浓度冻存。
所述基质为Matrigel、Laminin-521或Collagen IV可促进羊膜上皮细胞贴壁的商品化基质产品。
所述培养器材为组织处理过的培养瓶、培养板或培养皿。
本发明的有益效果是：
1、短时间消化保证细胞活性的同时，增加消化次数，获得了更多的细胞。
2、将分离获得的细胞以(4-8)×104/cm2的接种密度接种在铺有基质的培养器材上培养40-48h进行纯化，保证羊膜上皮细胞贴壁完成且未进行扩增，维持了SSEA-4和CD105的稳定表达，可获得SSEA-4、CD105稳定表达的高纯度P0代羊膜上皮细胞。
附图说明
图1为羊膜组织SSEA-4和DAPI免疫荧光表达整合图(×200)；
图2为实施例1新鲜分离的细胞AO/PI染色计数图；
图3为实施例1新鲜分离的细胞接种在铺有基质的培养瓶上培养40h但未清洗非贴壁细胞的细胞形态显微镜图；
图4为实施例1新鲜分离的细胞接种在铺有基质的培养瓶上培养40h且清洗非贴壁细胞的细胞形态显微镜图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明的保护范围。
本发明的羊膜上皮细胞的分离、纯化方法，包括以下步骤：
步骤一，胎盘采集运输
胎盘娩出后，机械剥离羊膜，将羊膜浸入含有运输保存液的保存瓶中，密封后2-8℃运输，4小时内运输至实验室；
步骤二，羊膜上皮细胞分离
(1)从运输保存液中取出羊膜，用生理盐水重复涮洗3-5次后放入无菌不锈钢圆盘中，剪除羊膜边缘血液污染部分，剔除羊膜非上皮面胶原，生理盐水清洗至少3次，将整张羊膜裁剪成4-6块；
(2)在离心管中放入2-3块羊膜块，加入含0.02％EDTA的0.25％的胰蛋白酶液，37℃水浴预消化10-15min，弃去消化液，所述百分比浓度为质量体积百分比浓度；
(3)将预消化后的羊膜块转入新的离心管中，加入含0.02％EDTA的0.25％的胰蛋白酶液，37℃水浴消化20-25min，结束后颠倒摇晃10-15次，取出羊膜块后，保留消化液，在消化液中加入FBS终止消化，即获得第一次消化的细胞悬液，此过程再重复2次，分别获得第二、三次消化的细胞悬液；第三次消化结束后，将取出的羊膜块用的生理盐水涮洗3次，获得细胞涮洗液，所述百分比浓度为质量体积百分比浓度；
(4)将三次消化分别获得的细胞悬液和第三次消化后获得的细胞涮洗液合并，200目无菌滤网过滤收集，500g离心10min，用完全培养基重悬，AO/PI双荧光计数；
步骤三，羊膜上皮细胞纯化
(1)在培养器材上铺上促进羊膜上皮细胞贴壁的商品化基质；
(2)将上述分离获得的细胞以(4-8)×104/cm2的接种密度接种在铺有基质的培养器材上，放入二氧化碳培养箱培养40-48h，生理盐水清洗至少2遍去除非贴壁细胞，消化收集细胞，即获得高纯度羊膜上皮细胞P0代细胞，以(1.0-1.5)×107/mL浓度冻存。
所述基质为Matrigel、Laminin-521或Collagen IV可促进羊膜上皮细胞贴壁的商品化基质产品。
所述培养器材为组织处理过的培养瓶、培养板或培养皿。
下面结合附图、具体实施例和对比例对本发明作进一步详细说明：实施例1
1、胎盘采集运输：胎盘娩出后，机械剥离羊膜，将羊膜浸入含有运输保存液的保存瓶中，密封后2-8℃运输，4小时内运输至实验室。
2、羊膜上皮细胞分离：
(1)从运输保存液中取出羊膜，用生理盐水重复涮洗3次后放入无菌不锈钢圆盘中，剪除羊膜边缘血液污染部分，剔除羊膜非上皮面(即羊膜近胎盘侧，粗糙面)胶原，生理盐水清洗3次，将整张羊膜裁剪成4块。切取25mm2大小的羊膜块，进行免疫荧光染色，染色结果见图1，SSEA-4(红色荧光所示)在羊膜组织上大量表达。
(2)在50mL离心管中放入2块羊膜块，加入30mL 0.25％的胰蛋白酶液(含0.02％EDTA)，37℃水浴预消化15min，弃去消化液；所述百分比浓度为质量体积百分比浓度，下同。
(3)将预消化后的羊膜块转入新的50mL离心管中，加入30mL 0.25％的胰蛋白酶液(含0.02％EDTA)，37℃水浴消化20min，结束后颠倒摇晃15次，取出羊膜块后，保留消化液，在消化液中加入1mL FBS终止消化，即获得第一次消化的细胞悬液，此过程再重复2次，分别获得第二、三次消化的细胞悬液；第三次消化结束后，将取出的羊膜块用30mL的生理盐水涮洗3次，获得细胞涮洗液。
(4)将三次消化分别获得的细胞悬液和第三次消化后获得的细胞涮洗液合并，200目无菌滤网过滤收集，500g离心10min，20mL完全培养基重悬，AO/PI双荧光计数(见图2，绿色代表活细胞，红色代表死细胞)，流式检测SSEA-4、CD324、CD105的表达。计数结果及流式检测结果见下表1。
3、膜上皮细胞纯化：
(1)在组织处理过的T175瓶上铺上Laminin-521基质。
(2)将上述分离获得的细胞以6×104/cm2的接种密度接种在铺有Laminin-521基质的T175瓶上，放入二氧化碳培养箱培养40h后(见图3)，生理盐水清洗2遍去除非贴壁细胞(见图4)，消化收集细胞，即获得高纯度羊膜上皮细胞P0代细胞，AO/PI双荧光计数，流式检测SSEA-4、CD324、CD105的表达，以1.0×107/mL浓度冻存。计数结果及流式检测结果见下表1。
表1实施例1细胞计数结果及流式检测结果
| 细胞数 | 活率 | SSEA-4 | CD324 | CD105 | |
| 分离后细胞 | 2.45×10<sup>8</sup> | 95.58％ | 91.20％ | 98.40％ | 1.91％ |
| 纯化后P0代细胞 | 1.98×10<sup>8</sup> | 96.39％ | 95.90％ | 99.20％ | 2.49％ |
实施例2
1、胎盘采集运输：胎盘娩出后，机械剥离羊膜，将羊膜浸入含有运输保存液的保存瓶中，密封后2-8℃运输，4小时内运输至实验室。
2、羊膜上皮细胞分离：
(1)从运输保存液中取出羊膜，用生理盐水重复涮洗3次后放入无菌不锈钢圆盘中，剪除羊膜边缘血液污染部分，剔除羊膜非上皮面(即羊膜近胎盘侧，粗糙面)胶原，生理盐水清洗3次，将整张羊膜裁剪成6块；
(2)在2在50mL离心管中放入3块羊膜块，加入30mL 0.25％的胰蛋白酶液(含0.02％EDTA)，37℃水浴预消化10min，弃去消化液；
(3)将预消化后的羊膜块转入新的50mL离心管中，加入30mL 0.25％的胰蛋白酶液(含0.02％EDTA)，37℃水浴消化25min，结束后颠倒摇晃10次，取出羊膜块后，保留消化液，在消化液中加入1mL FBS终止消化，即获得第一次消化的细胞悬液，此过程再重复2次，分别获得第二、三次消化的细胞悬液；第三次消化结束后，将取出的羊膜块用30mL的生理盐水涮洗3次，获得细胞涮洗液。
(4)将三次消化分别获得的细胞悬液和第三次消化后获得的细胞涮洗液合并，200目无菌滤网过滤收集，500g离心10min，40mL完全培养基重悬，AO/PI双荧光计数，流式检测SSEA-4、CD324、CD105的表达。计数结果及流式检测结果见下表2。
3、膜上皮细胞纯化：
(1)在组织处理过的T175瓶上铺上Laminin-521基质。
(2)将上述分离获得的细胞以8×104/cm2的接种密度接种在铺有Laminin-521基质的T175瓶上，放入二氧化碳培养箱培养48h，生理盐水清洗2遍去除非贴壁细胞，消化收集细胞，即获得高纯度羊膜上皮细胞P0代细胞，AO/PI双荧光计数，流式检测SSEA-4、CD324、CD105的表达，以1.5×107/mL浓度冻存。计数结果及流式检测结果见下表2。
表2实施例2细胞计数结果及流式检测结果
| 细胞数 | 活率 | SSEA-4 | CD324 | CD105 | |
| 分离后细胞 | 4.51×10<sup>8</sup> | 96.33％ | 80.05％ | 97.60％ | 1.12％ |
| 纯化后P0代细胞 | 4.42×10<sup>8</sup> | 94.39％ | 93.90％ | 98.40％ | 7.28％ |
实施例3
1、胎盘采集运输：胎盘娩出后，机械剥离羊膜，将羊膜浸入含有运输保存液的保存瓶中，密封后2-8℃运输，4小时内运输至实验室。
2、羊膜上皮细胞分离：
(1)从运输保存液中取出羊膜，用生理盐水重复涮洗3次后放入无菌不锈钢圆盘中，剪除羊膜边缘血液污染部分，剔除羊膜非上皮面(即羊膜近胎盘侧，粗糙面)胶原，生理盐水清洗3次，将整张羊膜裁剪成4块；
(2)在50mL离心管中放入2块羊膜块，加入30mL 0.25％的胰蛋白酶液(含0.02％EDTA)，37℃水浴预消化10min，弃去消化液；
(3)将预消化后的羊膜块转入新的50mL离心管中，加入30mL 0.25％的胰蛋白酶液(含0.02％EDTA)，37℃水浴消化20min，结束后颠倒摇晃15次，取出羊膜块后，保留消化液，在消化液中加入1mL FBS终止消化，即获得第一次消化的细胞悬液，此过程再重复2次，分别获得第二、三次消化的细胞悬液；第三次消化结束后，将取出的羊膜块用30mL的生理盐水涮洗3次，获得细胞涮洗液。
(4)将三次消化分别获得的细胞悬液和第三次消化后获得的细胞涮洗液合并，200目无菌滤网过滤收集，500g离心10min，20mL完全培养基重悬，AO/PI双荧光计数，流式检测SSEA-4、CD324、CD105的表达。计数结果及流式检测结果见下表3。
3、膜上皮细胞纯化：
(1)在组织处理过的T175瓶上铺上Matrigel基质。
(2)将上述分离获得的细胞以4×104/cm2的接种密度接种在铺有Matrigel基质的T175瓶上，放入二氧化碳培养箱培养48h，生理盐水清洗2遍去除非贴壁细胞，消化收集细胞，即获得高纯度羊膜上皮细胞P0代细胞，AO/PI双荧光计数，流式检测SSEA-4、CD324、CD105的表达，以1.0×107/mL浓度冻存。计数结果及流式检测结果见下表3。
表3实施例3细胞计数结果及流式检测结果
| 细胞数 | 活率 | SSEA-4 | CD324 | CD105 | |
| 分离后细胞 | 3.52×10<sup>8</sup> | 95.98％ | 82.40％ | 98.20％ | 0.91％ |
| 纯化后P0代细胞 | 2.85×10<sup>8</sup> | 96.43％ | 93.20％ | 99.40％ | 15.50％ |
对比例1本发明所使用的分离方法与一次消化法进行对比
1、胎盘采集运输：胎盘娩出后，机械剥离羊膜，将羊膜浸入含有运输保存液的保存瓶中，密封后2-8℃运输，4小时内运输至实验室。
2、羊膜上皮细胞分离：
(1)从运输保存液中取出羊膜，用生理盐水重复涮洗3次后放入无菌不锈钢圆盘中，剪除羊膜边缘血液污染部分，剔除羊膜非上皮面(即羊膜近胎盘侧，粗糙面)胶原，生理盐水清洗3次，将整张羊膜裁剪成等质量的4块；
(2)在两个50mL离心管中分别放入2块羊膜块，分为AB两组，两组均加入30mL0.25％的胰蛋白酶液(含0.02％EDTA)，37℃水浴预消化15min，弃去消化液；
(3)将预消化后的羊膜块分别转入新的50mL离心管中：
A组：按照本发明方法进行操作，即：加入30mL 0.25％的胰蛋白酶液(含0.02％EDTA)，37℃水浴消化20min；结束后颠倒摇晃15次，取出羊膜块后，保留消化液，在消化液中加入1mL FBS终止消化，即获得第一次消化的细胞悬液，此过程再重复2次，分别获得第二、三次消化的细胞悬液；第三次消化结束后，将取出的羊膜块用30mL的生理盐水涮洗3次，获得细胞涮洗液。将三次消化分别获得的细胞悬液和第三次消化后获得的细胞涮洗液合并，200目无菌滤网过滤收集，500g离心10min，20mL完全培养基重悬，AO/PI双荧光计数,计数结果见下表4。
B组：加入30mL 0.25％的胰蛋白酶液(含0.02％EDTA)，37℃水浴消化60min，结束后颠倒摇晃15次，取出羊膜块后，保留消化液，在消化液中加入1mL FBS终止消化，即获得消化后的细胞悬液；将取出的羊膜块用30mL的生理盐水涮洗3次，获得细胞涮洗液。将细胞悬液和细胞涮洗液合并，200目无菌滤网过滤收集，500g离心10min，20mL完全培养基重悬，AO/PI双荧光计数，计数结果见下表4。
表4对比例1AB组分离等质量羊膜获得的细胞数、细胞活率比较
结果显示本发明的分离方法相比于长时间的一次消化方法，能分离获得更多的细胞，且细胞活率和贴壁率更高。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Claims (3)
1.一种羊膜上皮细胞的分离、纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，胎盘采集运输
胎盘娩出后，机械剥离羊膜，将羊膜浸入含有运输保存液的保存瓶中，密封后2-8℃运输，4小时内运输至实验室；
步骤二，羊膜上皮细胞分离
(1)从运输保存液中取出羊膜，用生理盐水重复涮洗3-5次后放入无菌不锈钢圆盘中，剪除羊膜边缘血液污染部分，剔除羊膜非上皮面胶原，生理盐水清洗至少3次，将整张羊膜裁剪成4-6块；
(2)在离心管中放入2-3块羊膜块，加入含0.02％EDTA的0.25％的胰蛋白酶液，37℃水浴预消化10-15min，弃去消化液，所述百分比浓度为质量体积百分比浓度；
(3)将预消化后的羊膜块转入新的离心管中，加入含0.02％EDTA的0.25％的胰蛋白酶液，37℃水浴消化20-25min，结束后颠倒摇晃10-15次，取出羊膜块后，保留消化液，在消化液中加入FBS终止消化，即获得第一次消化的细胞悬液，此过程再重复2次，分别获得第二、三次消化的细胞悬液；第三次消化结束后，将取出的羊膜块用的生理盐水涮洗3次，获得细胞涮洗液，所述百分比浓度为质量体积百分比浓度；
(4)将三次消化分别获得的细胞悬液和第三次消化后获得的细胞涮洗液合并，200目无菌滤网过滤收集，500g离心10min，用完全培养基重悬，AO/PI双荧光计数；
步骤三，羊膜上皮细胞纯化
(1)在培养器材上铺上促进羊膜上皮细胞贴壁的商品化基质；
(2)将上述分离获得的细胞以(4-8)×104/cm2的接种密度接种在铺有基质的培养器材上，放入二氧化碳培养箱培养40-48h，生理盐水清洗至少2遍去除非贴壁细胞，消化收集细胞，即获得高纯度羊膜上皮细胞P0代细胞，以(1.0-1.5)×107/mL浓度冻存。
2.根据权利要求1所述羊膜上皮细胞的分离、纯化方法，其特征在于，所述基质为Matrigel、Laminin-521或CollagenIV可促进羊膜上皮细胞贴壁的商品化基质产品。
3.根据权利要求1所述羊膜上皮细胞的分离、纯化方法，其特征在于，所述培养器材为组织处理过的培养瓶、培养板或培养皿。
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