CN109536442B - 一种胎盘间充质干细胞的分离方法 - Google Patents
一种胎盘间充质干细胞的分离方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109536442B CN109536442B CN201811472346.6A CN201811472346A CN109536442B CN 109536442 B CN109536442 B CN 109536442B CN 201811472346 A CN201811472346 A CN 201811472346A CN 109536442 B CN109536442 B CN 109536442B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- filter plate
- placenta
- centrifuge tube
- tissue
- stem cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 41
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 title claims abstract description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 83
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 57
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 48
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims abstract description 34
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 17
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 15
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 15
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 11
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 10
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 9
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 9
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 9
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 7
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 7
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 7
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 7
- 210000003785 decidua Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 7
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 6
- 210000001136 chorion Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000011164 ossification Effects 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 claims description 3
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 239000006226 wash reagent Substances 0.000 claims 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 abstract description 4
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 9
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 8
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 3
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 3
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- FKEKCYXKBMKFGI-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methylpropylamino)-3,7-dihydropurin-6-one Chemical compound N1C(NCC(C)C)=NC(=O)C2=C1N=CN2 FKEKCYXKBMKFGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKYKXTRKURYNGW-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxy-9,10-dioxo-9,10-dihydroanthracene-2-sulfonic acid Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C(O)=C(O)C(S(O)(=O)=O)=C2 JKYKXTRKURYNGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N L-ascorbic acid 2-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N 0.000 description 1
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000035010 Term birth Diseases 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000011759 adipose tissue development Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种胎盘间充质干细胞的分离方法，属于生物技术领域。本发明先取离心管，在垂直于离心管轴线的平面上放置一片滤板，使滤板下方的离心管容积占离心管总容积的20～40％，滤板中心位置设置圆孔；滤板还设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔；然后通过圆孔向离心管中加入细胞分离液至液面没过滤板；再将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中，1000～2000rpm离心10～30min；最后倒掉滤板上层消化液，用吸管穿过圆孔，吸取得到含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液。本发明提供的方法不用中和胰酶，不须用100um细胞筛网过滤，操作简单、快速，能提高干细胞产量和活力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胎盘间充质干细胞的分离方法。
背景技术
干细胞是人体内一类能够自我更新分化的细胞，其来源广泛，分化潜能多样，具有多种生理效应。随着人们对干细胞的鉴定和认识，其逐渐受到临床应用的青睐，在治疗疾病、提高病人生存质量上已取得显著成效。干细胞的应用是一个转化医学的问题，其应用主要涉及细胞治疗、细胞美容、细胞诊断以及干细胞相关副产品的开发。
间充质干细胞是干细胞中来源最广的一类细胞，其来源主要有胎盘、脐带、骨髓和脂肪。胎盘和脐带是生育后的无用组织，在组织采集过程对人体没有创伤，其组织内的间充质干细胞没有随成人生长接触过多的不利因素，获取到的间充质干细胞更加安全，因此胎盘和脐带是间充干细胞的理想来源。近几年来，间充质干细胞的安全性和有效性在临床中得到了证实。国际上已有间充质干细胞药物成功上市，实现了传统化学药物向现代化细胞药物的转变。
如何安全有效的分离间充干细胞，是干细胞产品质量和产业化的保障。在现有的技术体系中，胎盘间充质干细胞的分离方法主要两大类：胰酶消化法和灌注法。
酶消化法，是将胎盘组织剪成碎块后，用胰蛋白酶或胶原酶消化1-2小时，用含胎牛血清的培养基终止酶消化，然后洗涤细胞弃去消化酶，将洗涤后的细胞接种至培养器皿中进行培养扩增。该方法在组织剪切和消化过程中会破坏大量细胞，释放大量染色体，导致消化液非常粘稠。在细胞培养环境中如果含有大量DNA，将干扰细胞的贴壁和生长。因此，一般需要使用100um孔径的细胞筛网过滤消化液，细胞过滤需要1～2小时。细胞筛网过滤消化液的操作时间过长，容易导致获得的细胞活力低、增殖慢。另外，因为消化液非常粘稠，其在过滤的过程中也极易阻塞细胞筛网。
灌流法是利用胎盘特殊的解剖结构，用灌流液孵育胎盘，从灌流液中分离单个核细胞，洗涤后再用间充质干细胞培养基悬浮所获细胞，进行培养。该方法从胎盘组织中提取间充质干细胞，由于胎盘中血液含量多，冲洗时消耗的试剂量极大，且血液难以彻底冲洗。
发明内容
有鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种胎盘间充质干细胞的分离方法，获得的胎盘干细胞活性高，红细胞含量少，为胎盘干细胞的临床应用以及产业化提供保障。
本发明提供了一种胎盘间充质干细胞的分离方法，包括如下步骤：
(1)取离心管，在垂直于离心管轴线的平面上放置一片滤板，使滤板下方的离心管容积占离心管总容积的20～40％，所述滤板的中心位置设置一个用于加液的圆孔，所述圆孔的直径为0.45～0.75cm；所述滤板还设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔，所述筛孔的宽为0.15～0.25cm；
(2)通过步骤(1)所述圆孔向离心管中加入细胞分离液，所述细胞分离液的添加量以没过滤板为标准；
(3)将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中，1000～2000rpm离心10～30min，实现组织消化液的分层；
(4)倒掉滤板上层消化液，穿过圆孔吸取滤板下的含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液。
优选的，所述步骤(2)中细胞分离液为添加有5～15％体积含量胎牛血清和20～60g/L葡聚糖的DMEM培养基。
优选的，所述步骤(3)中胎盘组织消化液的制备方法包括如下步骤：
①将胎盘组织置于质量体积比为0.1～0.3％g/ml的胰蛋白酶溶液中，预消化10～20min，得到预消化后的胎盘组织；
②将所述预消化后的胎盘组织剪碎，得到单个体积为1～2mm3的肉糜；
③将所述肉糜与胎盘消化液按照1:4～8的体积比混合，36～38℃消化20～40min，得到胎盘组织消化液。
优选的，所述步骤①胎盘组织为经病毒检测合格的绒毛膜组织或者底蜕膜组织。
优选的，所述步骤①胎盘组织在预消化前，还包括清洗，所述清洗用试剂为含有80～250kU/L青霉素和80～250kU/L链霉素的PBS缓冲液。
优选的，所述步骤③中胎盘消化液为添加有质量体积比为0.1～0.3％g/ml的胰蛋白酶和质量体积比为0.2～0.4％g/ml胶原蛋白酶的PBS缓冲液。
优选的，所述步骤(4)得到含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液后，培养所述胎盘间充质干细胞。
优选的，所述培养前包括离心分离的步骤，所述离心分离的离心力为500～700g，时间为5～15min。
优选的，所述培养开始后36～60h全量换液，继续培养，所述继续培养每2～4天进行半量换液。
优选的，当细胞融合度达到90％时，进行细胞的成软骨、成骨和成脂肪诱导。
有益效果：本发明提供了一种胎盘间充质干细胞的分离方法，先取离心管，在离心管容积20～40％处放置滤板，滤板中心位置设置圆孔，圆孔的直径为0.45～0.75cm；滤板上设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔，筛孔的宽为0.15～0.25cm；然后通过圆孔向离心管中加入细胞分离液至液面没过滤板；再将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中，1000～2000rpm离心10～30min；最后倒掉滤板上层消化液，用吸管穿过圆孔，吸取得到含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液。本发明提供的方法改进了传统的酶消化法分离细胞技术，使用滤板和细胞分离液，从而不需要传统酶消化法中和胰酶步骤，避免使用细胞筛过滤消化液。细胞分离液的密度梯度可以仅通过一次离心将胎盘间充质干细胞和红细胞以及DNA初步分离，并通过细胞分离液初步将干细胞和红细胞分离，从而不须用100um细胞筛网过滤，简化了操作步骤，缩短操作时间，提高效率的同时提高了细胞的得率和活性。
附图说明
图1为本发明所述离心管的结构示意图；其中图1-A表示滤板，a表示圆孔直径，b表示滤板直径；图1-B表示加入细胞分离液和胎盘组织消化液后的离心管经离心操作后的分层状态；其中①表示染色体团，②表示滤板，③表示单核细胞层，④表示红细胞层；
图2为本发明实施例1所述成骨、成软骨、成脂肪诱导后的结果图；
图3为本发明实施例1所述流式分析细胞表面Mark的结果图；
图4为本发明实施例2所述流式分析细胞表面Mark的结果图；
图5为本发明实施例3所述细胞活力测定的对比结果；
图6为本发明实施例3所述细胞分离时间统计的对比结果。
具体实施方式
本发明提供了一种胎盘间充质干细胞的分离方法，包括如下步骤：
(1)取离心管，在垂直于离心管轴线的平面上放置一片滤板，使滤板下方的离心管容积占离心管总容积的20～40％，所述滤板的中心位置设置一个用于加液的圆孔，所述圆孔的直径为0.45～0.75cm；所述滤板还设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔，所述筛孔的宽为0.15～0.25cm；
(2)通过步骤(1)所述圆孔向离心管中加入细胞分离液，所述细胞分离液的添加量以没过滤板为标准；
(3)将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中，1000～2000rpm离心10～30min，实现组织消化液的分层；
(4)倒掉滤板上层消化液，穿过圆孔吸取滤板下的含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液。
本发明取离心管作为反应容器，所述离心管的规格优选为20～100ml，更优选为50ml。本发明在垂直于离心管轴线的平面上放置一片滤板，所述滤板的直径优选为2.5～3cm，更优选为2.75cm。所述滤板下方的离心管容积占离心管总容积的20～40％，优选占离心管总容积的30％。本发明在所述滤板的中心位置设置一个圆孔，所述圆孔的直径为0.45～0.75cm，优选为0.5cm。所述圆孔能使移液管通过，便于加液或者吸液；同时其孔径大小的设置不会影响滤板的筛滤功能。本发明还在滤板平面上设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔，所述筛孔的宽为0.15～0.25cm，优选为0.2cm。所述筛孔能有效阻止胎盘组织消化液中的染色体成分通过。
本发明通过上述圆孔向离心管中加入细胞分离液。在本发明中，所述细胞分离液用于容纳胎盘组织消化液中离散出来的胚胎间充质干细胞。本发明所述细胞分离液优选为添加有胎牛血清和葡聚糖的DMEM培养基。在本发明中，所述胎牛血清的添加终浓度优选为5～15％培养基体积，更优选为10％培养基体积。所述葡聚糖的添加终浓度优选为20～60g/L，更优选为30～50g/L，更优选为40g/L。本发明对细胞分离液各成分的来源不作特别限定，本领域常规市售产品即可。在本发明的实施例中，所述胎牛血清购买自Gibico公司，货号10099141；所述葡聚糖购买自Sigma公司，货号9004-54-0；所述DMEM培养基购买自HyClone公司，货号SH30021.01B。在本发明中，所述细胞分离液的添加量以其液面没过滤板为标准，优选与滤板齐平。
向离心管中加完细胞分离液后，本发明将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中。在本发明中，所述胎盘组织消化液的制备方法优选包括如下步骤：
①将胎盘组织置于质量体积比0.1～0.3％g/ml的胰蛋白酶溶液中，预消化10～20min，得到预消化后的胎盘组织；
②将所述预消化后的胎盘组织剪碎，得到单个体积为1～2mm3的肉糜；
③将所述肉糜与胎盘消化液按照1:4～8的体积比混合，36～38℃消化20～40min，得到胎盘组织消化液。
本发明优选用胰蛋白酶溶液对胎盘组织进行预消化，去除胎盘组织中的杂质，软化疏松胎盘中的结缔组织。在本发明中，所述胎盘组织是经孕妇产前知情同意胎盘组织将用于科研，由青岛大学附属医院在其产后收集脱落的胎盘组织。在预消化前，本发明优选对所述胎盘组织进行清洗。所述清洗用试剂优选为含有青霉素和链霉素的PBS缓冲液。所述青霉素的含量优选为80～250kU/L，更优选为100～200kU/L。所述链霉素的含量优选为80～250kU/L，更优选为100～200kU/L。本发明对上述清洗用试剂中各成分的来源不作特别限定，本领域常规市售产品即可。在本发明的实施例中，所述青霉素购买自山东鲁抗，国药准字H37020079；所述链霉素购买自山东鲁抗，国药准字H37020187；所述PBS缓冲液购买自Corning公司，货号12-040-CRV。
清洗后，本发明将胎盘组织置于胰蛋白酶溶液中预消化。在本发明中，所述胰蛋白酶溶液的浓度优选为质量体积比0.1～0.3％g/ml，更优选为质量体积比0.2％g/ml。所述预消化的时间优选为10～20min，更优选为15min。在本发明中，所述胎盘组织优选为经病毒检验合格的绒毛膜组织或者底蜕膜组织。本发明优选根据分离需要对胎盘组织的来源进行选择，避免绒毛膜组织和底蜕膜组织的相互掺杂污染。
得到预消化后的胎盘组织后，本发明将所述预消化后的胎盘组织剪碎。剪碎后的单个肉块体积优选为1～2mm3。剪碎后得到肉糜。
本发明将所述肉糜与胎盘消化液混合、消化，得到胎盘组织消化液。在本发明中，所述胎盘消化液优选为添加有胰蛋白酶和胶原蛋白酶的PBS缓冲液。所述胰蛋白酶的添加终浓度优选为质量体积比0.1～0.3％g/ml，更优选为质量体积比0.2％g/ml。所述胶原蛋白酶的添加终浓度优选为质量体积比0.2～0.4％g/ml，更优选为质量体积比0.2％g/ml。本发明对上述胎盘消化液中各成分的来源不作特别限定，本领域常规市售产品即可。在本发明的实施例中，所述胰蛋白酶Amresco公司，货号458；所述胶原蛋白酶购买自Gibico公司，货号17100-017；所述PBS缓冲液购买自Corning公司，货号12-040-CRV。在本发明中，所述肉糜与所述胎盘消化液的混合体积比优选为1:4～8，更优选为1:6；所述消化的温度优选为36～38℃，更优选为37℃。所述消化的时间优选为20～40min，更优选为30min。
本发明对加入细胞分离液和胎盘组织消化液的离心管进行离心，实现组织消化液的分层。在本发明中，所述离心的转速为1000～2000rpm，优选为1200～1800rpm，更优选为1500rpm。所述离心的时间为10～30min，优选为15～25min，更优选为20min。离心后，胎盘组织消化液分层：染色体成分被阻隔在滤板上方，形成染色体团；红细胞附于离心管底部；胚胎间充质干细胞分散于细胞分离液中，形成单核细胞层。
组织消化液分层后，本发明倒掉滤板上层消化液，穿过圆孔吸取滤板下方的含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液。
得到含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液后，本发明优选对得到的细胞进行检测，验证其干细胞特性。本发明优选对细胞分离液进行离心分离、去上清、加入干细胞培养液重悬，培养。所述培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃。本发明优选在培养开始后的36～60h全量换液，更优选在培养开始后的48h全量换液。全量换液后继续培养，所述继续培养优选按照每2～4天进行半量换液。所述半量换液优选按照“弃3mL培养液，并添加4mL新的培养液”的标准进行。当细胞融合度达到90％时，本发明对细胞进行成软骨、成骨和成脂肪诱导(通过验证细胞分化能力，表示分离的细胞符合标准)。结果证明本发明提供的方法能分离得到胚胎间充质干细胞，且不用中和胰酶，不须用100μm的细胞筛网过滤(常规一般使用100μm孔径的细胞筛网，一般材质为塑料支架固定的尼龙网)，操作简单、快速，能提高干细胞产量和活力。
下面结合实施例对本发明提供的一种胎盘间充质干细胞的分离方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1)经产妇知情同意，在胎儿足月出生后，采集脱落的胎盘组织。经过病毒检测合格后，使用生理盐水冲洗掉污物，将胎盘浸泡在运输液(DMEM，加入终浓度为100kU/L青霉素及100kU/L链霉素)中，在4℃条件下运输到实验室内，器皿表面消毒后转移至超净工作台中，使用3％PBS(PBS加入终浓度为300kU/L的青霉素及300kU/L的链霉素)继续冲洗两次。
2)从底蜕膜中剪取多块组织块，注意防止混入绒毛膜组织。
3)胎盘组织中存在大量红细胞，使用1％PBS(PBS加入终浓度为100kU/L青霉素及100kU/L链霉素)缓冲液冲洗4次，以去除部分红细胞。
4)将组织块浸没在0.2％g/ml的胰蛋白酶溶液中，预消化15min，避免组织块内的杂质粘附或其他部分细胞，减少污染的可能性。消化完成后弃掉胰蛋白酶液，使用1％PBS(PBS加入终浓度为100kU/L青霉素及100kU/L链霉素)冲洗2～3次，至洗液不再变色为止。
5)将胎盘组织块剪碎成1～2mm3肉糜状。每5mL组织加入30mL胎盘消化液(PBS加入终浓度0.2％g/ml的胰蛋白酶和0.3％g/ml的胶原蛋白酶，使用0.2um过滤器过滤，在4℃冰箱保存，一周内使用)，混匀后在37℃培养箱中消化30min。
6)取带有滤板的50ml离心管(如图1-B所示，滤板直径2.75cm，中心圆的孔径0.5cm)，从滤板中央的大孔中加入15mL细胞分离液(DMEM培养基，加入终浓度10％(V/V)的胎牛血清和40g/L的葡聚糖，0.2um滤器过滤，在4℃冰箱中保存，一周内使用)。
7)将消化液直接倒入上述离心管中，反复吹打上层消化液20次，1500rpm离心20min。倒掉离心管上层的消化液，使用3ml小吸管从滤板中央的大孔深入分离液，吸取细胞分离液至新的离心管中，注意不要吸取红细胞层。
8)在分离液中加入两倍体积的DMEM混匀，600g离心10min。倒掉上清，加入10ml干细胞培养基重悬，接种于10cm2细胞培养皿中，37℃细胞培养箱中培养。
9)48h后全量换液，使用DMEM冲洗未贴壁细胞，加入干细胞培养基继续培养。
10)之后每3天进行半量换液，融合度90％时，细胞消化传代，使用流式鉴定干细胞表面Mark，取部分细胞接种24孔板做成软骨、成骨和成脂肪诱导；
a.成骨诱导分化：诱导分化培养基为含有10mol/L的地塞米松，10mmol/L的β-磷酸甘油，0.05mmol/L的2-磷酸抗坏血酸(均为Sigma公司产品)和10％FBS的DMEM培养基。每周换液2次，培养21天左右，染色镜检(PBS冲洗1次，95％酒精室温固定30min，0.2％茜素红S染色30min)。
b.成软骨诱导分化：诱导分化培养基为含有0.1umol/L的地塞米松、50ug/ml的L-抗坏血酸、1mmol/L的丙酮酸钠，10ng/ml的TGF-β，50mg/ml的ITS(均为Sigma公司产品)和10％FBS的DMEM培养基。每周2次换液，诱导培养14天后，染色镜检(PBS冲洗1次，95％酒精室温固定30min，1％阿新兰染色30min)。
c.成脂肪诱导分化：诱导分化培养基为含有10-6mol/L的地塞米松，10μg/ml的胰岛素，0.5mmol/L的异丁基黄嘌呤(IBMX)，200μmol/L的消炎痛(均为Sigma公司产品)和10％FBS的DMEM培养基。每周换液2次，培养14天左右(镜下见到细胞中出现油滴)，染色镜检(PBS冲洗2次，75％酒精室温固定30min，油红O室温染色30min)。
三种诱导结果如图2所示。图2结果表明本发明分离培养的细胞在特定的诱导分化条件下，可以诱导分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，具有多向分化潜能。
d.流式分析细胞表面Mark：
用PBS悬浮细胞，使用尼龙网过滤细胞。分别加入抗体，4℃冰箱避光孵育30min。之后使用PBS离心洗涤细胞一次。加入多聚甲醛悬浮细胞。上机检测。
检测结果如图3所示。图3结果表明本实施例分离培养的细胞高表达CD44、CD105、CD146；不表达CD34、CD45、HLA-DR，符合间充质干细胞表型特征。
实施例2
将实施例1步骤(2)替换为：从绒毛膜中剪取多块组织块，注意防止混入底蜕膜组织。其他步骤同实施例1。
流式分析细胞表面Mark的检测结果如图4所示。图4结果表明本实施例分离培养的细胞高表达CD44、CD105、CD146；不表达CD34、CD45、HLA-DR，符合间充质干细胞表型特征。
实施例3
本发明采用常规酶消化法分离得到底蜕膜中的间充质干细胞，具体参见赵基栋等，人胎盘间充质干细胞促进血管生成，中国组织工程研究，第17卷第23期，第4218页，2013-06-04，“胎盘来源间充质干细胞的分离培养”。
(1)利用细胞计数仪分别对实施例1以及上述常规酶消化法得到的间充质干细胞活力进行测定，在细胞分离完成之后，取少量细胞使用细胞计数仪测定分离细胞的数目和细胞活力，结果如图5所示。图5表明，常规酶消化法所分离得到的细胞活力极低，而实施例1所述方法能提高分离细胞的活力。
(2)分别对实施例1以及上述常规酶消化法的细胞分离时间(从分离组织开始到细胞接种到细胞培养皿的时间)进行统计，结果如图6所示。图6表明，常规酶消化法过滤环节耗时过多，实施例1相比于常规酶消化法可以节省将近一个小时，分离过程得以改良。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种胎盘间充质干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取离心管，在垂直于离心管轴线的平面上放置一片滤板，使滤板下方的离心管容积占离心管总容积的20～40％，所述滤板的中心位置设置一个用于加液的圆孔，所述圆孔的直径为0.45～0.75cm；所述滤板还设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔，所述筛孔的宽为0.15～0.25cm；
(2)通过步骤(1)所述圆孔向离心管中加入细胞分离液，所述细胞分离液的添加量以没过滤板为标准；
(3)将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中，1000～2000rpm离心10～30min，实现组织消化液的分层；
(4)倒掉滤板上层消化液，穿过圆孔吸取滤板下的含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液；
所述步骤(2)中细胞分离液为添加有5～15％体积含量胎牛血清和20～60g/L葡聚糖的DMEM培养基。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(3)中胎盘组织消化液的制备方法包括如下步骤：
①将胎盘组织置于质量体积比为0.1～0.3％的胰蛋白酶溶液中，预消化10～20min，得到预消化后的胎盘组织；
②将所述预消化后的胎盘组织剪碎，得到单个体积为1～2mm3的肉糜；
③将所述肉糜与胎盘消化液按照1:4～8的体积比混合，36～38℃消化20～40min，得到胎盘组织消化液。
3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，所述步骤①胎盘组织为经病毒检测合格的绒毛膜组织或者底蜕膜组织。
4.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，所述步骤①胎盘组织在预消化前，还包括清洗，所述清洗用试剂为含有80～250kU/L青霉素和80～250kU/L链霉素的PBS缓冲液。
5.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，所述步骤③中胎盘消化液为添加有质量体积比为0.1～0.3％的胰蛋白酶和质量体积比为0.2～0.4％胶原蛋白酶的PBS缓冲液。
6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(4)得到含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液后，培养所述胎盘间充质干细胞。
7.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于，所述培养前包括离心分离的步骤，所述离心分离的离心力为500～700g，时间为5～15min。
8.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于，所述培养开始后36～60h全量换液，继续培养，所述继续培养每2～4天进行半量换液。
9.根据权利要求6所述的分离方法，其特征在于，当细胞融合度达到90％时，进行细胞的成软骨、成骨和成脂肪诱导。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811472346.6A CN109536442B (zh) | 2018-12-04 | 2018-12-04 | 一种胎盘间充质干细胞的分离方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811472346.6A CN109536442B (zh) | 2018-12-04 | 2018-12-04 | 一种胎盘间充质干细胞的分离方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109536442A CN109536442A (zh) | 2019-03-29 |
| CN109536442B true CN109536442B (zh) | 2024-05-03 |
Family
ID=65852782
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811472346.6A Active CN109536442B (zh) | 2018-12-04 | 2018-12-04 | 一种胎盘间充质干细胞的分离方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109536442B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1958776A (zh) * | 2006-10-13 | 2007-05-09 | 深圳市达科为生物技术有限公司 | 淋巴细胞分离管及分离血液中淋巴细胞的方法 |
| CN104818243A (zh) * | 2015-03-17 | 2015-08-05 | 青岛奥克生物开发有限公司 | 一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法 |
| WO2017132358A1 (en) * | 2016-01-26 | 2017-08-03 | Kansas State University Research Foundation | Methods for isolation and expansion of umbilical cord mesenchymal stem cells |
| CN107236704A (zh) * | 2017-06-15 | 2017-10-10 | 博雅干细胞科技有限公司 | 从胎盘分离间充质干细胞的方法和使用的消化酶组合物 |
| CN107746829A (zh) * | 2017-10-19 | 2018-03-02 | 佛山科学技术学院 | 一种分离与原代培养犬胎盘来源的间充质干细胞的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015170347A2 (en) * | 2014-05-09 | 2015-11-12 | Reelabs Private Limited | Foetal polymix of mesenchymal stem cells under hypoxic conditions for the treatment of clinical disorders |
-
2018
- 2018-12-04 CN CN201811472346.6A patent/CN109536442B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1958776A (zh) * | 2006-10-13 | 2007-05-09 | 深圳市达科为生物技术有限公司 | 淋巴细胞分离管及分离血液中淋巴细胞的方法 |
| CN104818243A (zh) * | 2015-03-17 | 2015-08-05 | 青岛奥克生物开发有限公司 | 一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法 |
| WO2017132358A1 (en) * | 2016-01-26 | 2017-08-03 | Kansas State University Research Foundation | Methods for isolation and expansion of umbilical cord mesenchymal stem cells |
| CN107236704A (zh) * | 2017-06-15 | 2017-10-10 | 博雅干细胞科技有限公司 | 从胎盘分离间充质干细胞的方法和使用的消化酶组合物 |
| CN107746829A (zh) * | 2017-10-19 | 2018-03-02 | 佛山科学技术学院 | 一种分离与原代培养犬胎盘来源的间充质干细胞的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 人胎盘间充质干细胞4种消化分离方法的效果比较;陆琰;陈丽;张洹;;中国组织工程研究与临床康复;20090205(06);材料和方法，第3节，第2.2节 * |
| 人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化;沙文琼;王自能;王冬菊;;中国组织工程研究与临床康复;20100305(10);第1833-1837页 * |
| 密度梯度离心法分离脐血干细胞:分离介质的筛选;郭继强;刘爱兵;王东平;王黎明;;中国组织工程研究;20130604(23);第4189-4195页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109536442A (zh) | 2019-03-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9453200B2 (en) | Apparatus and methods for cell isolation | |
| CN109234229B (zh) | 从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物 | |
| CN107921182B (zh) | 用于分离基质血管部分的机械仪器和方法 | |
| CN108315297B (zh) | 一种从脂肪组织中分离、纯化脂肪干细胞的方法 | |
| TW201510223A (zh) | 一種組織勻漿法分離活細胞構建細胞庫的方法 | |
| CN107354130B (zh) | 一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离方法 | |
| CN109628388B (zh) | 用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞 | |
| CN113913375A (zh) | 一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒和培养方法 | |
| CN111454896B (zh) | 一种提高间充质干细胞促进急性髓系白血病分化能力的诱导方法 | |
| CN109536442B (zh) | 一种胎盘间充质干细胞的分离方法 | |
| CN108660108A (zh) | 一种可增强脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法 | |
| CN116555168A (zh) | 一种原代羊膜上皮细胞的纯化方法 | |
| CN116948960A (zh) | 一种诱导生成巨核细胞的方法及其应用 | |
| CN103305453A (zh) | 一种脐带间充质干细胞的微载体培养系统 | |
| CN111733128A (zh) | 人脂肪间充质干细胞制备方法及体外分化能力鉴定方法 | |
| CN108034634B (zh) | 一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法 | |
| CN110628706A (zh) | 一种体外提取并培养胚胎神经干细胞的方法及培养基的制备 | |
| CN114752590B (zh) | 一种高效且经济的猪肌肉干细胞的分离方法及其应用 | |
| CN109652372A (zh) | 一种人胎盘组织源造血干细胞的快速分离、制备方法 | |
| CN112280735B (zh) | 脐带来源的间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
| CN110106143B (zh) | Bcl-2小分子抑制剂在制备成熟红细胞中的用途 | |
| CN115044540A (zh) | 一种羊膜上皮细胞的分离、纯化方法 | |
| CN109439614B (zh) | 一种维持和恢复毛乳头细胞干性的外泌体制剂 | |
| CN114480261A (zh) | 一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法 | |
| CN109652367B (zh) | 一种制备临床级脂肪干细胞的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |