CN109652372A - 一种人胎盘组织源造血干细胞的快速分离、制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人胎盘组织源造血干细胞的快速分离、制备方法，所述方法是将孕妇分娩后的胎盘经过预处理，然后去除多余组织，再经多种消化酶联合消化、细胞过滤和分离富集得到人胎盘组织源造血干细胞。与现有技术相比，本发明的有益效果是，一方面通过采用多种消化酶联合消化，使得本发明方法得到的细胞数较多，所得细胞中造血干细胞(CD34+细胞)含量较脐血高3‑5倍，对细胞活性损伤较小，而且能够快速的得到造血干细胞；另一方面本发明组织处理过程简单方便，污染率低。

Description

一种人胎盘组织源造血干细胞的快速分离、制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人胎盘组织源造血干细胞的快速分离、制备方法。
背景技术
造血干细胞是指具有自我更新能力并能分化为各种血细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板等。目前，造血干细胞移植是临床治疗必不可少的一部分，治愈了许多以前无法治愈的血液系统疾病或非血液系统疾病。脐带血作为一种移植用的造血干细胞来源始于20年前，但是脐带血作为造血干细胞来源仍面临一个重要问题，单位脐带血所含的造血干细胞数量对于年纪较小、体重较轻的儿童足够，但是对于成人不足，而胎盘由于其大量的造血干细胞含量可改善及弥补这一缺陷。除了含量上的优势，人胎盘组织还具有淋巴细胞亚群低比例和抑制性T细胞高比例的特点，因而具有有效的免疫抑制性，能够大大提高移植的成功率。
本研究通过多种酶联合消化法，首先将细胞从组织中消化下来，再用滤网分别过滤，最后用淋巴细胞分离液分离、富集获得造血干细胞。
目前，分离胎盘组织造血干细胞的方法主要是酶解法。胎盘组织结构复杂，单纯的酶解所得细胞数量相对较少，而且由于酶作用时间较长，对细胞活性影响很大；其次现有方法步骤繁琐，特别是细胞过滤耗时费力，容易造成污染并且成本较高。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明提供一种人胎盘组织造血干细胞的快速分离、制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种人胎盘组织源造血干细胞的快速分离、制备方法，将孕妇分娩后的胎盘经过预处理，然后去除多余组织，再经多种消化酶联合消化、细胞过滤和分离富集得到人胎盘组织源造血干细胞，具体包括以下步骤：
步骤一，胎盘的保存，将孕妇分娩后的胎盘，置于含有胎盘保存液的胎盘储存盒中，2～8℃保存；
步骤二，胎盘组织的预处理，将步骤一得到的胎盘从胎盘保存液中取出，置于无菌托盘中，注意检查胎盘完整性，弃用不完整胎盘，止血钳夹闭脐带动静脉，采用生理盐水反复冲洗胎盘，去除血凝块及胎便等污物，随后用含1％双抗的生理盐水再次对胎盘进行冲洗至冲洗液清亮，得到预处理胎盘；
步骤三，胎盘组织的分离，将步骤二得到的预处理胎盘置于无菌托盘中，首先去除脐带及羊膜，再去除绒毛膜、血管后，用无菌剪刀将其剪成小块，置于无菌培养皿，采用含1％双抗的生理盐水反复冲洗至洗涤液无色透明，收集清洗液，将清洗后组织1300rpm离心5～15分钟，得到沉淀组织，用PBS冲洗及1300rpm离心5～15分钟，重复3遍，得到清洗胎盘组织；
步骤四，胎盘组织的消化，将步骤三得到的清洗胎盘组织添加DMEM/F12培养基、多种消化酶和人血白蛋白，得到混悬液，将混悬液置于37℃孵箱震荡消化30～60分钟，得到消化胎盘组织；
步骤五，消化细胞的过滤，将步骤四得到的消化胎盘组织，先加入生理盐水稀释，然后分别经50目、100目及200目滤网过滤，并用PBS清洗2遍后过70μm滤网，收集细胞过滤悬液；
步骤六，造血干细胞的分离富集，将步骤五得到的细胞过滤悬液缓慢加入淋巴细胞分离液进行分离，然后2100rpm离心20～30min，弃上清，加入生理盐水，反复清洗3次，去掉上清，得到人胎盘组织源造血干细胞；
步骤七，细胞的冻存，将步骤六得到的人胎盘组织源造血干细胞加入胎牛血清混悬，并缓慢加入DMSO至终浓度10％，同时迅速混匀(液体要保持在4℃)，分装于5mL冻存管中，冻存管装入程序降温盒放置于-80℃冰箱，24小时后转入液氮中长期保存。
优选地，所述步骤一中胎盘保存液采用500mL的注射用生理盐水加入5mL的双抗储存液，再加入2mL注射用硫酸庆大霉素制备而成，所述双抗储存液采用注射用青霉素和硫酸链霉素，经过注射用生理盐水稀释至每毫升1万单位制备而成。
优选地，所述多种消化酶由中性蛋白酶、胶原酶II和透明质酸酶组成。
优选地，所述中性蛋白酶和胶原酶II使用前配置成2％(m/v)的中性蛋白酶/胶原酶II储存液，所述中性蛋白酶/胶原酶II储存液通过分别称取1g的中性蛋白酶与1g的胶原酶II，溶解于50mL生理盐水中并采用0.22μm滤膜过滤，制备而成。
优选地，所述透明质酸酶使用前配置成3.5％(m/v)的透明质酸酶储存液，所述透明质酸酶储存液通过称取1g透明质酸酶，溶解于28.6mL生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，制备而成。
优选地，所述步骤二和步骤三中的双抗是指青霉素和链霉素。
优选地，所述步骤四中混悬液包含0.2％中性蛋白酶/胶原酶II、0.35％透明质酸酶、1mg/ml人血白蛋白。
优选地，所述步骤四中将混悬液置于37℃孵箱震荡消化30～60分钟，优选为将混悬液置于37℃孵箱震荡消化50分钟。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
一方面通过采用多种消化酶联合消化，使得本发明方法得到的细胞数较多，所得细胞中造血干细胞(CD34+细胞)含量较脐血高3～5倍，对细胞活性损伤较小，而且能够快速的得到造血干细胞；另一方面本发明组织处理过程简单方便，污染率低。
附图说明
图1是本发明的流式检测图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
实施例1
一、试剂：
1.胎盘保存液及清洗液
注射用青霉素和硫酸链霉素用注射用生理盐水配置成每毫升1万单位的储存液，即为1％的双抗储存液；
500mL的注射用生理盐水加入5mL的双抗储存液，再加入2mL注射用硫酸庆大霉素，即配置成胎盘保存液或清洗液；
2.中性蛋白酶/胶原酶II储存液
分别称取1g的中性蛋白酶与1g的胶原酶II，溶解于50mL生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为2％(m/v)的中性蛋白酶/胶原酶II储存液；
3.透明质酸酶储存液
称取1g透明质酸酶，溶解于28.6mL生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，即为3.5％(m/v)的透明质酸酶储存液；
4.人血白蛋白，华兰生物，5g/50mL(10％)；
5.淋巴细胞分离液，200mL/瓶，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；
6.胎牛血清，Gibco公司；
7.二甲基亚砜(DMSO)，德国WAK公司；
8.DMEM培养液；
9.0.4％台盼蓝。
二，造血干细胞的分离、制备
1.胎盘的运输
孕妇分娩后的胎盘，置于含有保存液的胎盘储存盒中，2～8℃及时运送回实验室；样本接收室检查运输温度、胎盘盒是否完整，避免出现污染，并对其进行编号。
2.胎盘组织的预处理
规定时间内将取得的胎盘从胎盘保存液中取出，置于无菌托盘中，注意检查胎盘完整性，弃用不完整胎盘。止血钳夹闭脐带动静脉，采用生理盐水反复冲洗胎盘，去除血凝块及胎便等污物，随后用含1％双抗(青霉素及链霉素)的生理盐水再次对胎盘进行冲洗至冲洗液清亮，得到待处理胎盘，称重留档。
3.胎盘组织的分离
预处理后的胎盘置于无菌托盘中，首先去除脐带及羊膜，剩余组织去除绒毛膜、血管等，用无菌剪刀将其剪成小块(约1～3mm3)，置于无菌培养皿，采用含1％双抗的生理盐水反复冲洗至洗涤液无色透明，收集清洗液，清洗后组织1300rpm离心6分钟，得到的沉淀组织用PBS冲洗及离心，重复3遍。
4.胎盘组织的消化
清洗后组织添加DMEM/F12培养基及消化酶，得到含量为0.2％胶原酶、0.35％透明质酸酶、1mg/ml人血白蛋白的混悬液。混悬液置于37℃孵箱震荡消化50分钟；
5.消化细胞的过滤
消化后的混悬液，先加入生理盐水稀释，终止酶活性，然后分别经50目、100目及200目滤网过滤，并用PBS清洗2遍后过70μm滤网，收集细胞过滤悬液；
6.造血干细胞的分离富集
收集的细胞悬液用注射用生理盐水重悬，缓慢加入淋巴细胞分离液中，2100rpm离心20min，升降速度均设为最低。离心后平稳取出离心管，电动移液器移取中间层细胞至洁净离心管，加入生理盐水，反复清洗3次，弃上清。
7.细胞的冻存
所得细胞加入胎牛血清混悬，并缓慢加入DMSO(终浓度10％)，并同时迅速混匀(液体要保持在4℃)，分装于5ml冻存管中，冻存管装入程序降温盒放置于-80℃冰箱，24小时后转入液氮罐长期保存。
三，流式检测胎盘造血干细胞表面标志物
1.取单细胞悬液，1200rpm离心5min；
2.用PBS重悬细胞沉淀，调节细胞浓度为1.0～1.2×106cell/ml；
3.加抗体CD34，轻轻吹打混匀，4℃避光孵育30min，同时设置同型对照；
4.加1mlPBS于流式检测管中，1200rpm，5min，弃上清；
5.加100ulPBS，轻轻吹打混匀，上机检测，胎盘造血干细胞表面标志物CD34，所得细胞中造血干细胞(CD34+细胞)含量较脐血高3-5倍，结果如图1所示。
由以上实施例可知本研究的方法，与现有的组织源造血干细胞分离方法相比，该方法得到的细胞数较多，对细胞活性损伤小；组织处理过程简单方便，污染率低；所得细胞中造血干细胞(CD34+细胞)含量较脐血高3-5倍。
以上所述仅为发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的简单修改或变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种人胎盘组织源造血干细胞的快速分离、制备方法，其特征在于，所述方法是一种将孕妇分娩后的胎盘经过预处理，然后去除多余组织，再经多种消化酶联合消化、细胞过滤和分离富集得到人胎盘组织源造血干细胞的方法。
2.根据权利要求1所述的人胎盘组织源造血干细胞的快速分离、制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一，胎盘的保存，将孕妇分娩后的胎盘，置于含有胎盘保存液的胎盘储存盒中，2～8℃保存；
步骤二，胎盘组织的预处理，将步骤一得到的胎盘从胎盘保存液中取出，置于无菌托盘中，注意检查胎盘完整性，弃用不完整胎盘，止血钳夹闭脐带动静脉，采用生理盐水反复冲洗胎盘，去除血凝块及胎便等污物，随后用含1％双抗的生理盐水再次对胎盘进行冲洗至冲洗液清亮，得到预处理胎盘；
步骤三，胎盘组织的分离，将步骤二得到的预处理胎盘置于无菌托盘中，首先去除脐带及羊膜，再去除绒毛膜、血管后，用无菌剪刀将其剪成小块，置于无菌培养皿，采用含1％双抗的生理盐水反复冲洗至洗涤液无色透明，收集清洗液，将清洗后组织1300rpm离心5～15分钟，得到沉淀组织，用PBS冲洗及1300rpm离心5～15分钟，重复3遍，得到清洗胎盘组织；
步骤四，胎盘组织的消化，将步骤三得到的清洗胎盘组织添加DMEM/F12培养基、多种消化酶和人血白蛋白，得到混悬液，将混悬液置于37℃孵箱震荡消化30～60分钟，得到消化胎盘组织；
步骤五，消化细胞的过滤，将步骤四得到的消化胎盘组织，先加入生理盐水稀释，然后分别经50目、100目及200目滤网过滤，并用PBS清洗2遍后过70μm滤网，收集细胞过滤悬液；
步骤六，造血干细胞的分离富集，将步骤五得到的细胞过滤悬液加入到淋巴细胞分离液进行分离，然后2100rpm离心20～30min，弃上清，加入生理盐水，反复清洗3次，去掉上清，得到人胎盘组织源造血干细胞。
步骤七，细胞的冻存，将步骤六得到的人胎盘组织源造血干细胞加入胎牛血清混悬，并缓慢加入DMSO至终浓度10％，同时迅速混匀，分装于5mL冻存管中，程序降温盒置于-80℃冰箱，24小时后转入液氮中长期保存。
3.根据权利要求1或2所述的人胎盘组织源造血干细胞的快速分离、制备方法，其特征正在于，所述步骤一中胎盘保存液采用500mL的注射用生理盐水加入5mL的双抗储存液，再加入2mL注射用硫酸庆大霉素制备而成，所述双抗储存液采用注射用青霉素和硫酸链霉素，经过注射用生理盐水稀释至每毫升1万单位制备而成。
4.根据权利要求1所述的人胎盘组织源造血干细胞的快速分离、制备方法，其特征正在于，所述多种消化酶由中性蛋白酶、胶原酶II和透明质酸酶组成。
5.根据权利要求1或4所述的人胎盘组织源造血干细胞的快速分离、制备方法，其特征正在于，所述中性蛋白酶和胶原酶II使用前配置成2％(m/v)的中性蛋白酶/胶原酶II储存液，所述中性蛋白酶/胶原酶II储存液通过分别称取1g的中性蛋白酶与1g的胶原酶II，溶解于50mL生理盐水中并采用0.22μm滤膜过滤，制备而成。
6.根据权利要求1或4所述的人胎盘组织源造血干细胞的快速分离、制备方法，其特征正在于，所述透明质酸酶使用前配置成3.5％(m/v)的透明质酸酶储存液，所述透明质酸酶储存液通过称取1g透明质酸酶，溶解于28.6mL生理盐水中，0.22μm滤膜过滤，制备而成。
7.根据权利要求1或2所述的人胎盘组织源造血干细胞的快速分离、制备方法，其特征正在于，所述步骤二和步骤三中的双抗是指青霉素和链霉素。
8.根据权利要求1或2所述的人胎盘组织源造血干细胞的快速分离、制备方法，其特征正在于，所述步骤四中混悬液包含0.2％中性蛋白酶/胶原酶II、0.35％透明质酸酶、1mg/ml人血白蛋白。
9.根据权利要求1或2所述的人胎盘组织源造血干细胞的快速分离、制备方法，其特征正在于，所述步骤四中将混悬液置于37℃孵箱震荡消化30-60分钟，优选为将混悬液置于37℃孵箱震荡消化50分钟。
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