CN104711226A - 一种胎盘造血干细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种胎盘造血干细胞的制备方法。该方法用灌洗液灌注清洗预处理后的胎盘；将酶解液从胎盘动脉灌注至胎盘静脉流出酶解液停止并结扎胎盘动静脉静置；松开胎盘动静脉并从动脉灌注灌洗液，从静脉处收集全部液体，离心取细胞沉淀，然后依次经羟乙基淀粉法和红细胞裂解法回收纯化包含造血干细胞的单个核细胞，重悬后获得所述胎盘造血干细胞。本发明改善酶解灌注法工艺，选择多种相互适宜的组分组成新型酶解液应用于胎盘造血干细胞制备过程中，不仅能够动员胎盘内部的造血干细胞并在短时间内迅速进入血液循环系统，而且同时提高了包含造血干细胞的单个核细胞数量及其活细胞数量以及CD34阳性细胞数量。

Description

一种胎盘造血干细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种胎盘造血干细胞的制备方法。

背景技术

造血干细胞(Hemopoietic Stem cell，HSC)是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，它不是组织固定细胞，可存在于造血组织及血液中。造血干细胞是所有造血细胞和免疫细胞的起源，具有自我更新和多向分化能力。它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞，同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。

随着对造血干细胞(HSC)日渐深入的研究，HSC移植已经成为治疗许多恶性血液系统疾病及其他肿瘤的有效手段。目前，HSC的主要来源是骨髓、外周血及脐血，骨髓和外周血HSC增殖和分化能力下降，并且易受供者健康状态影响，而脐血HSC数量有限，这些限制因素使其不能满足日渐增长的HSC临床应用需求。近年来，国内外学者研究发现，胎盘中含有大量的早期干细胞，包括数量丰富的造血干细胞。这些干细胞在胎盘中行使着造血的功能。小孩出生后剥离的胎盘内所含的造血干细胞，是脐带血的8-10倍，可供小孩自用几次，甚至可提供给多个成人患者的治疗。胎盘造血干细胞的成功分离和提取可解决临床上HSC的来源问题，具有广阔的临床应用前景。

目前，胎盘HSC的分离提取方法主要采用机械法、机械酶解法等，但这两种方法提取过程操作繁复、耗时长、成本高，不太适用于大规模的生产制备。

中国专利CN103789262A公开了一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其以酶解灌注法进行造血干细胞的制备，最终获得的CD34阳性细胞数在1.2-1.6×10⁹，但是，该方法在酶解时间极短的前提下，该效果数据基本不可能达到十亿级，并且经过对该专利方法试验验证，其单个核细胞总数最高在10⁸数量级，单个核细胞活率较低，在60-65％，CD34阳性细胞仅在10⁵数量级，明显与其记载的试验结果不相符。

同时，从其提供的流式检测图可知，只有FSC/SSC检测的细胞图，这个流式图代表的是细胞检测数量，且其提取出来的细胞并未经过流式CD34抗原的检测，其总提取细胞是单个核细胞，并非CD34阳性细胞。进行流式检测一般是对提取细胞进行重悬后(总体积V)，取少量细胞悬液(检测体积V1)、细胞数量约为1×10⁶cell，进行染色后上机检测。根据检测细胞中CD34阳性的细胞含量，从而计算出总细胞中含有的CD34阳性的细胞。

虽然，上述现有专利以酶解灌注法进行胎盘造血干细胞的制备，虽然相比机械法和机械酶解法更简便，耗时短、成本低，但是最终获得的细胞数量和活力却不够理想，需要进一步进行改进。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胎盘造血干细胞的制备方法，使得所述制备方法能够提包含造血干细胞的单个核细胞数量及其活细胞数量以及CD34阳性细胞数量。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种胎盘造血干细胞的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、胎盘预处理后，用灌洗液灌注清洗胎盘；

步骤2、将酶解液从胎盘动脉灌注至胎盘静脉流出酶解液停止并结扎胎盘动静脉静置，所述酶解液为包括Ⅰ型胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶、枸橼酸盐缓冲溶液、青-链霉素双抗、罂粟碱、N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖基础培养基；

步骤3、松开胎盘动静脉并从动脉灌注所述灌洗液，从静脉处收集全部酶解液体，离心取细胞沉淀，然后依次经羟乙基淀粉法和红细胞裂解法回收纯化包含造血干细胞的单个核细胞，重悬后获得所述胎盘造血干细胞。

针对现有酶解灌注法获取的胎盘造血干细胞数量以及活率不高的问题，本发明从改进酶解液组成出发，以多种适宜的组分组成全新的酶解液，使其不仅能够动员胎盘内部的造血干细胞并在短时间内迅速进入血液循环系统，同时提高了造血干细胞的数量和活率，解决了现有技术的问题。

本发明所用胎盘由某医院妇产科提供，选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯乙烯胎盘采集盒作为运送容器，内装胎盘保存液，采集后4℃条件下12小时内送到制备处分离制备胎盘造血干细胞。

本发明技术方案中所用试剂均市售获得，例如DMEM高糖基础培养基可购自于Gibco公司。

作为优选，步骤1所述灌洗液灌注清洗胎盘为：

将0-4℃灌洗液灌注进胎盘中的动脉，直至胎盘内血清清洗干净。

为了进一步配合所述酶解液，共同作用于胎盘制备出大量高活力的胎盘造血干细胞，本发明所述灌洗液优选为包括青-链霉素双抗、EDTA、枸橼酸盐缓冲溶液、罂粟碱和N-乙酰半胱氨酸的PBS缓冲液；更优选地，所述灌洗液为包括1-3倍的青-链霉素双抗、0.01-0.04％(质量百分比)EDTA、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、0.01-0.1mg/mL的罂粟碱和0.5-2mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的pH值为7.0的PBS缓冲液；最优选地，所述灌洗液为包括1倍的青-链霉素双抗、0.02％EDTA、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、0.05mg/mL的罂粟碱和1.0mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的pH值为7.0的PBS缓冲液。

本发明所述1-3倍的双抗或1倍的枸橼酸盐缓冲液均为本领域常规的试剂浓度表示方法，一般所购买的青-链霉素双抗或所配置的枸橼酸盐缓冲液均为高倍母液，在使用时会稀释配置成低倍数，如所购买的青-链霉素双抗多数为100倍，而枸橼酸盐缓冲液一般配制成5倍或10倍，其配制方法如磷酸缓冲液属于本领域公知，作为优选，本发明提供5倍枸橼酸盐缓冲液配制方法，如下：

称取枸橼酸钠粉末26.3g、枸橼酸粉末3.27g、葡萄糖12.7g、磷酸二氢钠4.44g、腺嘌呤0.55g，把上述各组分溶于400mL的去离子水中，充分搅拌混匀后形成5倍枸橼酸盐缓冲溶液，0.22μm过滤，分装。

在本发明所述制备方法的起始阶段，需要对胎盘进行预处理，这一措施属于本领域公知，即对胎盘进行消毒、除去胎盘羊膜以及洗涤等步骤，在制备造血干细胞前，本领域技术人员均知晓这些预处理步骤并能够根据实际情况选择具体的预处理步骤。作为优选，本发明预处理为剥离羊膜并用灌洗液清洗胎盘。

作为优选，所述酶解液为包括0.01-0.1mg/mL的Ⅰ型胶原酶、0.01-0.1mg/mL的透明质酸酶、0.001-0.005％(质量百分比)的胰蛋白酶、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、1倍的青-链霉素双抗、0.01-0.1mg/mL的罂粟碱、0.5-2mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖基础培养基。

更优选地，所述酶解液为包括0.05mg/mL的Ⅰ型胶原酶、0.02mg/mL的透明质酸酶、0.001％(质量百分比)的胰蛋白酶、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、1倍的青-链霉素双抗、0.05mg/mL的罂粟碱、1.0mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖基础培养基。

作为优选，所述羟乙基淀粉法具体步骤为：

将细胞沉淀和羟乙基淀粉按体积比细胞沉淀：羟乙基淀粉＝1:1-3的比例，用羟乙基淀粉重悬细胞沉淀，室温下静置20-40min，吸取上清离心，离心后弃上清。

作为优选，所述红细胞裂解法具体步骤为：

将经羟乙基淀粉法处理后的细胞沉淀和1倍的红细胞裂解液，按体积比细胞沉淀：1倍红细胞裂解液＝1:5-10的比例，用1倍的红细胞裂解液重悬细胞沉淀，涡旋振荡5s，室温下裂解残留的红细胞10min，离心后弃上清获得包含造血干细胞的单个核细胞。

作为优选，步骤3所述重悬以DMEM高糖基础培养基重悬。

在造血干细胞数量和活率的对比试验中，以本发明所述制备方法和专利CN103789262A进行对比，结果显示，在包含造血干细胞的单个核细胞数量及其活细胞数量、CD34阳性细胞数量上均显著高于现有对照方法。

由以上技术方案可知，本发明改善酶解灌注法工艺，选择多种相互适宜的组分组成新型酶解液应用于胎盘造血干细胞制备过程中，不仅能够动员胎盘内部的造血干细胞并在短时间内迅速进入血液循环系统，而且同时提高了包含造血干细胞的单个核细胞数量及其活细胞数量以及CD34阳性细胞数量。

附图说明

图1所示为实施例1制备的造血干细胞不加抗体的流式检测图(对照组)；

其中，图1-A为检测单个核细胞总数的流式检测图，所圈区域P2即表示单个核细胞总数所占百分比(5.4％)，图1-B为检测CD34阳性细胞数的流式检测图，右侧百分比为CD34阳性细胞在单个核细胞中的百分比；

图2所示为实施例1制备的造血干细胞加抗体的流式检测图(检测组)；

其中，图2-A为检测单个核细胞总数的流式检测图，所圈区域P2即表示单个核细胞总数所占百分比(5.2％)，图2-B为检测CD34阳性细胞数的流式检测图，右侧百分比为CD34阳性细胞在单个核细胞中的百分比。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种胎盘造血干细胞的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种胎盘造血干细胞的制备方法进行详细说明。

实施例1：本发明所述胎盘造血干细胞的制备方法

选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯乙烯胎盘采集盒作为运送容器，内装胎盘保存液，采集后4℃条件下12小时内送到制备处分离制备胎盘造血干细胞。

在无菌超净台内，取1-2ml胎盘采集液做无菌检测，然后将胎盘剥离羊膜，用0-4℃灌洗液初步清洗胎盘，用一次性注射器吸取灌洗液灌注进胎盘中的两条动脉，直至胎盘内血清被清洗干净；灌洗液：包括1倍的青-链霉素双抗、0.02％EDTA、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、0.05mg/mL的罂粟碱和1.0mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的pH值为7.0的PBS缓冲液。

用一次性注射器吸取酶解液灌注进胎盘中的两条动脉，当静脉流出来的液体为酶解液时，结扎动静脉后置于室温2-5h；酶解液：0.05mg/mL的Ⅰ型胶原酶、0.02mg/mL的透明质酸酶、0.001％(质量百分比)的胰蛋白酶、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、1倍的青-链霉素双抗、0.05mg/mL的罂粟碱、1.0mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖基础培养基。

松开动静脉，一次性注射器吸取灌洗液灌注进胎盘中的两条动脉，收集全部酶解液体。

收集的液体300-800g离心5-10min，弃去上清；按细胞沉淀：HES(V:V)＝1:2的比例，用HES重悬细胞沉淀，室温下静置20-40min，吸取上清至50mL离心管中，300-800g离心5-10min；离心后弃去上清；按细胞沉淀：1倍红细胞裂解液(V:V)＝1:8的比例，用1倍红细胞裂解液重悬细胞沉淀，涡旋振荡5s，室温下裂解残留的红细胞10min，200-500g离心5-10min；离心后弃上清，获得包含造血干细胞的单个核细胞，加入20-40mL DMEM高糖培养基，重悬细胞沉淀，200-500g离心5-10min，沉淀用DMEM高糖基础培养基重悬细胞，获得所述胎盘造血干细胞。

实施例2：本发明所述胎盘造血干细胞的制备方法

选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯乙烯胎盘采集盒作为运送容器，内装胎盘保存液，采集后4℃条件下12小时内送到制备处分离制备胎盘造血干细胞。

在无菌超净台内，取1-2ml胎盘采集液做无菌检测，然后将胎盘剥离羊膜，用0-4℃灌洗液初步清洗胎盘，用一次性注射器吸取灌洗液灌注进胎盘中的两条动脉，直至胎盘内血清被清洗干净；灌洗液：包括3倍的青-链霉素双抗、0.04％EDTA、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、0.01mg/mL的罂粟碱和2mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的的PBS缓冲液。

用一次性注射器吸取酶解液灌注进胎盘中的两条动脉，当静脉流出来的液体为酶解液时，结扎动静脉后置于室温2-5h；酶解液：0.01mg/mL的Ⅰ型胶原酶、0.1mg/mL的透明质酸酶、0.001％(质量百分比)的胰蛋白酶、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、1倍的青-链霉素双抗、0.01mg/mL的罂粟碱、2mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖基础培养基。

松开动静脉，一次性注射器吸取灌洗液灌注进胎盘中的两条动脉，收集全部酶解液体。

收集的液体300-800g离心5-10min，弃去上清；按细胞沉淀：HES(V:V)＝1:3的比例，用HES重悬细胞沉淀，室温下静置20-40min，吸取上清至50mL离心管中，300-800g离心5-10min；离心后弃去上清；按细胞沉淀：1倍红细胞裂解液(V:V)＝1:5的比例，用1倍红细胞裂解液重悬细胞沉淀，涡旋振荡5s，室温下裂解残留的红细胞10min，200-500g离心5-10min；离心后弃上清，获得包含造血干细胞的单个核细胞，加入20-40mL DMEM高糖培养基，重悬细胞沉淀，200-500g离心5-10min，沉淀用DMEM高糖基础培养基重悬细胞，获得所述胎盘造血干细胞。

实施例3：本发明所述胎盘造血干细胞的制备方法

选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备无菌聚苯乙烯胎盘采集盒作为运送容器，内装胎盘保存液，采集后4℃条件下12小时内送到制备处分离制备胎盘造血干细胞。

在无菌超净台内，取1-2ml胎盘采集液做无菌检测，然后将胎盘剥离羊膜，用0-4℃灌洗液初步清洗胎盘，用一次性注射器吸取灌洗液灌注进胎盘中的两条动脉，直至胎盘内血清被清洗干净；灌洗液：包括1倍的青-链霉素双抗、0.01％EDTA、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、0.1mg/mL的罂粟碱和0.5mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的的PBS缓冲液。

用一次性注射器吸取酶解液灌注进胎盘中的两条动脉，当静脉流出来的液体为酶解液时，结扎动静脉后置于室温2-5h；酶解液：0.1mg/mL的Ⅰ型胶原酶、0.01mg/mL的透明质酸酶、0.005％(质量百分比)的胰蛋白酶、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、1倍的青-链霉素双抗、0.1mg/mL的罂粟碱、0.5mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖基础培养基。

松开动静脉，一次性注射器吸取灌洗液灌注进胎盘中的两条动脉，收集全部酶解液体。

收集的液体300-800g离心5-10min，弃去上清；按细胞沉淀：HES(V:V)＝1:1的比例，用HES重悬细胞沉淀，室温下静置20-40min，吸取上清至50mL离心管中，300-800g离心5-10min；离心后弃去上清；按细胞沉淀：1倍红细胞裂解液(V:V)＝1:10的比例，用1倍红细胞裂解液重悬细胞沉淀，涡旋振荡5s，室温下裂解残留的红细胞10min，200-500g离心5-10min；离心后弃上清，获得包含造血干细胞的单个核细胞，加入20-40mL DMEM高糖培养基，重悬细胞沉淀，200-500g离心5-10min，沉淀用DMEM高糖基础培养基重悬细胞，获得所述胎盘造血干细胞。

实施例4：对比试验

试验方法：实施例1方法；

对照方法1-3：专利CN103789262A实施例1酶消化方法A-C；

所有制备方法采用同一来源的胎盘，试验环境和条件除去应有区别外，其余均一致。台盼蓝法进行单个核细胞数量计算及活率检测，流式细胞仪进行CD34阳性细胞数量的检测，方法如下：

取细胞悬液用含10％FBS的PBS清洗两遍；分成两管细胞，用10％FBS的PBS重悬，其中一管(样品组)加入2.5uL CD34的抗体，充分混匀，另一管(对照组)不添加抗体，同时避光孵育30min，用10％FBS的PBS洗两遍后，用1640培养基重悬，上流式仪检测CD34⁺的细胞含量。结果见表1和图1-图2。

表1试验结果

由上表可知，在包含造血干细胞的单个核细胞数量及其活细胞数量、CD34阳性细胞数量上均显著高于现有对照方法。

此外，按照上述方法将实施例2和实施例3两种方法进行检测，结果见表2。

表2试验结果

由表1和表2可知，本发明实施例2和实施例3两种方法同样能够在包含造血干细胞的单个核细胞数量及其活细胞数量、CD34阳性细胞数量上显著高于现有对照方法。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、胎盘预处理后，用灌洗液灌注清洗胎盘；

步骤2、将酶解液从胎盘动脉灌注至胎盘静脉流出酶解液停止并结扎胎盘动静脉静置，所述酶解液为包括Ⅰ型胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶、枸橼酸盐缓冲溶液、青-链霉素双抗、罂粟碱、N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖基础培养基；

步骤3、松开胎盘动静脉并从动脉灌注所述灌洗液，从静脉处收集全部酶解液体，离心取细胞沉淀，然后依次经羟乙基淀粉法和红细胞裂解法回收纯化包含造血干细胞的单个核细胞，重悬后获得所述胎盘造血干细胞。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1所述灌洗液灌注清洗胎盘为：

将0-4℃灌洗液灌注进胎盘中的动脉，直至胎盘内血清清洗干净。

3.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，所述灌洗液为包括青-链霉素双抗、EDTA、枸橼酸盐缓冲溶液、罂粟碱和N-乙酰半胱氨酸的PBS缓冲液。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述灌洗液为包括1-3倍的青-链霉素双抗、0.01-0.04％EDTA、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、0.01-0.1mg/mL的罂粟碱和0.5-2mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的的pH值为7.0的PBS缓冲液。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述预处理为剥离羊膜并用灌洗液清洗胎盘。

6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述酶解液为包括0.01-0.1mg/mL的Ⅰ型胶原酶、0.01-0.1mg/mL的透明质酸酶、0.001-0.005％的胰蛋白酶、1倍的枸橼酸盐缓冲溶液、1倍的青-链霉素双抗、0.01-0.1mg/mL的罂粟碱、0.5-2mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖基础培养基。

7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述羟乙基淀粉法具体步骤为：

将细胞沉淀和羟乙基淀粉按体积比细胞沉淀：羟乙基淀粉＝1:1-3的比例，用羟乙基淀粉重悬细胞沉淀，室温下静置20-40min，吸取上清离心，离心后弃上清。

8.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述红细胞裂解法具体步骤为：

将经羟乙基淀粉法处理后的细胞沉淀和1倍的红细胞裂解液，按体积比细胞沉淀：1倍红细胞裂解液＝1:5-10的比例，用1倍的红细胞裂解液重悬细胞沉淀，涡旋振荡5s，室温下裂解残留的红细胞10min，离心后弃上清获得包含造血干细胞的单个核细胞。

9.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤3所述重悬以DMEM高糖基础培养基重悬。