CN109609454A - 一种胎盘来源的造血干细胞制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及造血干细胞制备技术领域，尤其为一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，包括以下步骤：将胎盘脐带内的脐带血采集，用一次性注射器吸取采集保护液从脐带的动脉灌注采集保护液至胎盘组织后结扎脐带，生理盐水清洗胎盘外表面后，用一次性注射器吸取细胞动员液从脐带的动脉灌注，动员结束后，用一次性注射器吸取消化液从脐带的动脉灌注并回收动员的到的细胞悬液，消化结束后，利用一次性注射器吸取生理盐水从脐带的动脉灌注回收所有的细胞悬液，回收的细胞悬液经羟乙基淀粉沉淀和红细胞裂解液破碎去除红细胞后即制得造血干细胞。本方法能高效的从胎盘组织中分离包含造血干细胞的有核细胞，保证提取的细胞有稳定的数量、纯度和活性。
Description
技术领域
本发明涉及造血干细胞制备技术领域，尤其涉及一种胎盘来源的造血干细胞制备方法。
背景技术
造血干细胞Hematopoietic stem cells,HSCs)是血液系统中的成体干细胞，具有自我更新能力，并能分化为各种血细胞前体细胞，它不是组织固定细胞，可存在于造血组织及血液中。造血干细胞是所有造血细胞和免疫细胞的起源，包括红细胞、白细胞和血小板，具有自我更新和多向分化能力，是体内各种血细胞和免疫细胞的唯一来源。
随着对造血干细胞(HSC)日渐深入的研究，HSC移植已经成为治疗许多恶性血液系统疾病及其他肿瘤的有效手段。目前HSC的主要来源是骨髓、外周血和脐带血。但是以骨髓为来源的HSC在采集时会对供者产生一定的损伤。而且骨髓和外周血HSC增殖和分化能力随供者年龄增加而下降，并且易受供者健康状态影响。而脐血作为一个较为优秀的造血干细胞来源受限制于采集获得的细胞数量已经不能满足日渐增长的HSC临床应用需求，目前一次HSC移植大约需要3个供者的脐带血。近年来，国内外学者研究发现，胎盘组织中含有大量的早期干细胞，包括数量丰富的造血干细胞。这些干细胞在胎盘中行使着造血的功能。小孩出生后剥离的胎盘内所含的造血干细胞，是脐带血的8-10倍，可供小孩自用几次，甚至可提供给多个成人患者的治疗。胎盘造血干细胞的成功分离和提取可解决临床上HSC的来源问题，具有广阔的临床应用前景。
目前，胎盘HSC的分离的主要分离方法主要采取机械梅消化法、动员法等。机械酶消化法通过机械剪切整个胎盘组织，将其分解为小组织块用缓冲液重洗回收其中一部分造血干细胞。再利用蛋白酶对组织块进行消化回收细胞悬液。而动员法是采用造血干细胞动员的药物对组织内的造血干细胞进行动员以使其脱离出原来的微环境，再利用缓冲液重洗回收所有细胞。其中中国专利CN103789262A公开了一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法，其以酶解灌注法进行造血干细胞的制备，经过对该专利方法进行试验验证，发现其回收的总有核细胞数量最高仅为10^8数量级，且单个核细胞活率较低，在60-65％， CD34阳性细胞仅在10^5数量级，相关的制备方法仍然不甚理想。
这些制备工艺存在一系列的不足：(1)将胎盘组织完全剪碎消化容易使胎盘表面的微生物污染回收的细胞；(2)使用消化液分离，消化酶作用的时间过短会导致最终的细胞回收数量过低，而消化时间过长会对细胞造成不可逆的伤害，影响细胞质量；(3)采用消化法，无论是将胎盘组织完全剪碎后消化还是将消化酶往胎盘灌注酶消化液，残留的血液成分都有会影响酶消化的效率；(4)如采用灌注动员法，因为采集时产生的凝血块可能会堵塞灌注的通路影响动员效果。其次采用灌注法只要胎盘组织的血管通路有任何的破损都会影响灌注效果；(5)目前的制备工艺的制备操作较多，耗时较长，尤其是动员法药物的作用时间需要数小时以上，越长的制备时间造成的造血干细胞活性损失越大；(6)分离的胎盘造血干细胞数量和纯度受胎盘采集质量影响较大。
综上所述，本发明提出一种胎盘来源的造血干细胞制备方法来改善此类存在的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种胎盘来源的造血干细胞制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，包括以下步骤：
S1，胎盘于医院进行采集后，使用采血袋或注射器将脐带内部的脐带血全部采集，或者将脐带剪开把残留的脐带血全部弃去；
S2，对采集的胎盘灌注采集保护液进行预处理，该采集保护液的成分为每100ml的CPDA含30mg的罂粟碱，利用一次性注射器吸取采集保护液从脐带的动脉灌注80ml的采集保护液至胎盘组织后结扎脐带，预处理30min；
S3，在洁净环境下,生理盐水清洗胎盘外表面后，利用一次性注射器吸取细胞动员液从脐带的动脉灌注，当静脉流出来的液体为动员剂时，结扎动静脉后置于室温4h；
S4，松开动静脉，一次性注射器吸取80ml的细胞消化液灌注进胎盘中的两条动脉，收集从静脉流出全部液体，结扎动静脉后置于 37℃环境下2h；
S5，松开动静脉，一次性注射器吸取400ml的生理盐水灌注进胎盘中的两条动脉，收集从静脉流出全部液体；
S6，将收集的液体300g离心8min,弃去上清，细胞沉淀用DMEM 基础培养基重悬至100ml；
S7，该细胞悬液和注射用6％羟乙基淀粉按照体积比1:1混合，室温静置40min,吸取上清至离心管中300g离心8min,弃去上清；
S8，收集的细胞沉淀：1倍红细胞裂解液体积比＝1:10的比例用 1倍红细胞裂解液重悬细胞沉淀，涡旋震荡5s,室温下裂解残留的红细胞10min；
S9，细胞悬液300g离心5min,离心后弃上清，获得包含造血干细胞在内的单个核细胞，加入40ml DMEM培养基重悬细胞沉淀，300g 离心5min,离心后弃上清，沉淀用用DMEM培养基重悬细胞，获得胎盘来源的造血干细胞。
优选的，所述S2，采集保护液的成分为每100ml的CPDA含30mg 的罂粟碱，具体配制方法为99ml的CPDA加入1ml(30mg/ml)的罂粟碱注射液。
优选的，所述S3，细胞动员液的成分为每500ml DMEM含有青霉素-链霉素双抗5ml、AMD3100 5mg、30mg罂粟碱，其中AMD3100为一种人工合成的大环类SDF-1受体CXCR4特异性拮抗剂。
优选的，所述S4，细胞消化液的成分为每100ml DMEM含有Ⅰ型胶原酶100mg、胰蛋白酶50mg、青霉素-链霉素双抗1ml、EDTA20mg。
优选的，所述S1，选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书，术前准备无菌聚苯乙烯胎盘采集盒作为运送容器，内装胎盘采集保护液和注射器，采集前4℃条件下暂存于医院。
优选的，所述S2，采集后4℃条件下12小时内送到制备处。
优选的，所述S3，洁净环境为无菌生物安全柜内。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明能够提供一种从胎盘组织中分离和制备造血干细胞的方法，最终得到的造血干细胞其CD34阳性细胞数量比同一供者来源的脐带血造血干细胞多，可以作为临床中代替脐带血作为造血干细胞的优秀来源。
2.本发明制备过程中的CPDA血液保存液中所含枸橘酸可以阻止血液凝固，同时罂粟碱具有血管扩张的功能，可以提高后续灌注和消化的效果。
3.本发明采集的胎盘造血干细胞纯度大，细胞质量高，并且活性高。
本发明中，该装置中未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现，本发明方法能高效的从胎盘组织中分离包含造血干细胞的有核细胞，并且保证提取的细胞有稳定的数量、纯度和活性。
附图说明
图1为本发明检测单个核细胞中CD34阳性细胞比例的流式结果分析图
具体实施方式
下面将结合本发明具体实施例中的具体实施案例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
本发明提供一种技术方案：
一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，包括以下步骤：
S1，胎盘于医院进行采集后，使用采血袋或注射器将脐带内部的脐带血全部采集，或者将脐带剪开把残留的脐带血全部弃去；
S2，对采集的胎盘灌注采集保护液进行预处理，该采集保护液的成分为每100ml的CPDA含30mg的罂粟碱，利用一次性注射器吸取采集保护液从脐带的动脉灌注80ml的采集保护液至胎盘组织后结扎脐带，预处理30min；
S3，在洁净环境下,生理盐水清洗胎盘外表面后，利用一次性注射器吸取细胞动员液从脐带的动脉灌注，当静脉流出来的液体为动员剂时，结扎动静脉后置于室温4h；
S4，松开动静脉，一次性注射器吸取80ml的细胞消化液灌注进胎盘中的两条动脉，收集从静脉流出全部液体，结扎动静脉后置于 37℃环境下2h；
S5，松开动静脉，一次性注射器吸取400ml的生理盐水灌注进胎盘中的两条动脉，收集从静脉流出全部液体；
S6，将收集的液体300g离心8min,弃去上清，细胞沉淀用DMEM 基础培养基重悬至100ml；
S7，该细胞悬液和注射用6％羟乙基淀粉按照体积比1:1混合，室温静置40min,吸取上清至离心管中300g离心8min,弃去上清；
S8，收集的细胞沉淀：1倍红细胞裂解液体积比＝1:10的比例用 1倍红细胞裂解液重悬细胞沉淀，涡旋震荡5s,室温下裂解残留的红细胞10min；
S9，细胞悬液300g离心5min,离心后弃上清，获得包含造血干细胞在内的单个核细胞，加入40ml DMEM培养基重悬细胞沉淀，300g 离心5min,离心后弃上清，沉淀用用DMEM培养基重悬细胞，获得胎盘来源的造血干细胞。
所述S2，采集保护液的成分为每100ml的CPDA含30mg的罂粟碱，具体配制方法为99ml的CPDA加入1ml(30mg/ml)的罂粟碱注射液。
所述S3，细胞动员液的成分为每500ml DMEM含有青霉素-链霉素双抗5ml、AMD31005mg、30mg罂粟碱，其中AMD3100为一种人工合成的大环类SDF-1受体CXCR4特异性拮抗剂。
所述S4，细胞消化液的成分为每100ml DMEM含有Ⅰ型胶原酶100mg、胰蛋白酶50mg、青霉素-链霉素双抗1ml、EDTA20mg。
所述S1，选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书，术前准备无菌聚苯乙烯胎盘采集盒作为运送容器，内装胎盘采集保护液和注射器，采集前4℃条件下暂存于医院。
所述S2，采集后4℃条件下12小时内送到制备处。
所述S3，洁净环境为无菌生物安全柜内。
具体实施案例：
实施例1：(1)选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的产妇，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书，胎盘与期待娩出后，用无菌脐带夹结扎脐带；
(2)消毒脐带离开胎盘的远端后，用含有CPDA血液保存液的采血袋穿刺脐静脉，尽可能抽取所有脐带血，采集完成或采集的脐带血体积达到100ml后，后用脐带夹结扎脐带；
(3)采集的脐带血4℃在12小时内运输至制备设施开始制备分离脐带血造血干细胞；
(4)在无菌生物安全柜内转移采血袋内的脐带血，并按照与6％羟乙基淀粉按照体积比4:1混合，室温静置60min,吸取上清至离心管中300g离心10min,弃去上清；
(5)所得到的细胞沉淀即为脐带血造血干细胞，用DMEM重悬即可用作接下来的检测。
实施例2：(1)选取与对照组同一供者来源的胎盘组织，在脐带血采集完成而未结扎脐带前，用一次性注射器吸取采集保护液从脐带的动脉灌注80ml的采集保护液至胎盘组织后结扎脐带；
(2)结扎脐带的位置略低于灌注采集保护液和抽取脐带血的进针口，采集的胎盘4℃在12小时内运输至制备设施开始制备分离胎盘来源的造血干细胞；
(3)之后按照本专利所描述完成胎盘造血干细胞的制备，制得的胎盘造血干细胞用DMEM重悬即可用作接下来的检测。
实验结果1：单个核细胞的总数和活率
从5个不同供者的脐带血和胎盘中制备造血干细胞，利用台盼蓝 1:1稀释对应的细胞悬液，显微镜下计数细胞数量和活率，统计结果见表1：
表1.实施例1(脐带血造血干细胞)与实施例2(本专利所述胎盘来源的造血干细胞)制备得到的单个核细胞的总数和活率对比统计 (n＝5)
实验结果2：CD34阳性细胞数量
从5个不同供者的脐带血和胎盘中制备造血干细胞，取细胞悬液用含10％胎牛血清的PBS清洗两遍；分成两管细胞，用10％ FBS的PBS重悬，其中一管(样品组)加入2.5uLCD34FITC +2.5uL CD45PE的抗体，充分混匀，另一管(空白组)不添加抗体，同时避光孵育30min，用10％FBS的PBS洗两遍后，用1640 培养基重悬，上流式仪检测彻底CD45+CD34+的细胞含量，检测结果见图1，统计结果见表2：
表2.实施例1(脐带血造血干细胞)与实施例2(本专利所述胎盘来源的造血干细胞)制备得到的CD34阳性细胞数量对比统计(n＝5)
实验结果3：造血集落形成的检测结果
从5个不同供者的脐带血和胎盘中制备造血干细胞，取细胞悬液用含10％胎牛血清的PBS清洗两遍，300g离心收集细胞调整密度至1*10^5cells/ml，去100ul的细胞悬液与1ml造血干细胞集落形成检测培养基，接种于6孔细胞培养板。于37℃5％的培养14d，显微镜下计数各样本的血细胞集落数量(BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMN), 统计结果见表3.
表3.实施例1(脐带血造血干细胞)与实施例2(本专利所述胎盘来源的造血干细胞)制备得到的造血干细胞集落形成能力对比统计 (n＝5)
| BFU-E | CFU-GM | CFU-GEMN | |
| 实施例1 | 38.27±15.61 | 58.41±28.51 | 6.54±4.85 |
| 实施例2 | 121.25±30.78 | 108.65±20.38 | 24.56±15.78 |
结论：从实验结果1、2、3可以对比证明采用本发明的方法从胎盘中制得的造血干细胞在单个核细胞数量、活性、CD34阳性细胞的数量上均优于实施例1从脐带血中制得的造血干细胞。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，胎盘于医院进行采集后，使用采血袋或注射器将脐带内部的脐带血全部采集，或者将脐带剪开把残留的脐带血全部弃去；
S2，对采集的胎盘灌注采集保护液进行预处理，该采集保护液的成分为每100ml的CPDA含30mg的罂粟碱，利用一次性注射器吸取采集保护液从脐带的动脉灌注80ml的采集保护液至胎盘组织后结扎脐带，预处理30min；
S3，在洁净环境下,生理盐水清洗胎盘外表面后，利用一次性注射器吸取细胞动员液从脐带的动脉灌注，当静脉流出来的液体为动员剂时，结扎动静脉后置于室温4h；
S4，松开动静脉，一次性注射器吸取80ml的细胞消化液灌注进胎盘中的两条动脉，收集从静脉流出全部液体，结扎动静脉后置于37℃环境下2h；
S5，松开动静脉，一次性注射器吸取400ml的生理盐水灌注进胎盘中的两条动脉，收集从静脉流出全部液体；
S6，将收集的液体300g离心8min,弃去上清，细胞沉淀用DMEM基础培养基重悬至100ml；
S7，该细胞悬液和注射用6％羟乙基淀粉按照体积比1:1混合，室温静置40min,吸取上清至离心管中300g离心8min,弃去上清；
S8，收集的细胞沉淀：1倍红细胞裂解液体积比＝1:10的比例用1倍红细胞裂解液重悬细胞沉淀，涡旋震荡5s,室温下裂解残留的红细胞10min；
S9，细胞悬液300g离心5min,离心后弃上清，获得包含造血干细胞在内的单个核细胞，加入40ml DMEM培养基重悬细胞沉淀，300g离心5min,离心后弃上清，沉淀用用DMEM培养基重悬细胞，获得胎盘来源的造血干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，其特征在于，所述S2，采集保护液的成分为每100ml的CPDA含30mg的罂粟碱，具体配制方法为99ml的CPDA加入1ml(30mg/ml)的罂粟碱注射液。
3.根据权利要求1所述的一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，其特征在于，所述S3，细胞动员液的成分为每500ml DMEM含有青霉素-链霉素双抗5ml、AMD3100 5mg、30mg罂粟碱，其中AMD3100为一种人工合成的大环类SDF-1受体CXCR4特异性拮抗剂。
4.根据权利要求1所述的一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，其特征在于，所述S4，细胞消化液的成分为每100ml DMEM含有Ⅰ型胶原酶100mg、胰蛋白酶50mg、青霉素-链霉素双抗1ml、EDTA20mg。
5.根据权利要求1所述的一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，其特征在于，所述S1，选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的胎盘，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书，术前准备无菌聚苯乙烯胎盘采集盒作为运送容器，内装胎盘采集保护液和注射器，采集前4℃条件下暂存于医院。
6.根据权利要求1所述的一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，其特征在于，所述S2，采集后4℃条件下12小时内送到制备处。
7.根据权利要求1所述的一种胎盘来源的造血干细胞制备方法，其特征在于，所述S3，洁净环境为无菌生物安全柜内。
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