CN106434557B - 由脐带间充质干细胞制备cd34阳性细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由脐带间充质干细胞制备CD34阳性细胞的方法。具体包括如下步骤：(a)提供脐带来源的间充质干细胞；(b)对间充质干细胞进行原代培养；(c)对间充质干细胞进行传代培养；(d)在传代培养过程中，向培养基中加入诱导剂对间充质干细胞进行诱导；(e)获得CD34+细胞。还涉及包括该方法制得的CD34阳性细胞的细胞制品，以及它们的用途。本发明方法具有如说明书所述优异技术效果。

Description

由脐带间充质干细胞制备CD34阳性细胞的方法
技术领域
本发明属于采用细胞生物学技术治疗临床疾病的领域。具体而言，本发明涉及一种以脐带源间充质干细胞为起始材料来制备CD34+细胞的方法。
背景技术
干细胞介导再生和遗传信息至后来细胞世代的传递。它们可自我更新和产生分化的后代。近年来，在我们对干细胞与它们的组织微生态环境之间的相互作用背后的分子机制的理解中已取得了进步。这已导致对在干细胞中起作用的分子调控机制有了更好的理解。
虽然基因疗法仍然是试验性方法，但该技术有希望对人健康产生重大影响。在过去数年中，基因疗法的范围和定义已发生了变化并且得到扩展。除了矫治遗传的遗传性障碍例如囊性纤维化、血友病和其他疾病外，基因治疗法还已发展至抵抗获得性疾病例如癌症、AIDS、慢性血管局部缺血、骨关节炎、糖尿病、帕金森病和阿尔茨海默病。
目前，种系基因疗法由于其复杂技术性质和伦理考虑而未被涉及。然而，只对单个个体有益的(不能代代相传的)体细胞基因疗法是干细胞研究的主要焦点。从至鼠类造血干细胞内的成功基因转移的最初描述至先天患有x-连锁联合免疫缺陷(SCID)和腺苷脱氨酶缺陷(ADA)-缺陷的患者中的第一例明确成功的临床试验花费了15年以上的时间。干细胞疗法的许多方面正在研究中。例如，逆转录病毒载体在许多情况下已被用于将基因转移入干细胞中以修复突变的或不完善的基因。此类情况包括严重联合免疫缺陷、范可尼贫血和其他血红蛋白病。
干细胞工程的中心议题是用于将治疗性基因导入祖细胞的特殊方法学。因为逆转录病毒倾向于插入活性基因(据认为凝缩的染色质在这些区域是打开的)，有人提出，它们的使用还可能增加癌症的风险，因为逆转录病毒载体插入参与细胞增殖的基因附近在理论上可产生前体癌干细胞。然而，该类型事件的总体风险难以确定。现在有许多在慢性肉芽肿病(CGD)患者中取得完全成功的实例，其中NADPH氧化酶的活性在输注经遗传改变的血液干细胞后得到恢复。
富有成效的基因疗法的最低要求是在矫治生物学背景中治疗性基因产物的持续产生，同时有害副作用最小。为了达到该目的，基因疗法中干细胞的应用将需要发展调节治疗性基因表达的新策略以及用于将外源基因有效递送至干细胞的方法。通过在确定的组织环境中分化干细胞来选择性控制治疗性基因的表达是干细胞工程的重要目标。该方法可以例如帮助控制干细胞分化成特定的谱系、维持它们的未分化状态以待日后移植、增殖，以及调控治疗性基因例如自杀基因、细胞因子或生长因子在确定的组织环境中的表达。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有多向分化潜能、免疫调节和自我复制等特点，日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，尤其对治疗衰老和组织器官损伤修复有很大的临床应用价值。
MSC在骨髓中蕴含丰富，但随着年龄的老化，骨髓中的干细胞数目也会显著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓MSC移植给异体可能引起免疫反应，且提取干细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了骨髓MSC的临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。
近期的研究显示，脐带组织中也含有间充质干细胞并且能成功分离。这种组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且分离出来的干细胞更原始，有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低，大大减低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对产妇及新生儿无任何危害及损伤。以上原因足以令脐带间充质干细胞成为骨髓间充质干细胞的理想替代物。
外周动脉病变(peripheral arterial disease，PAD)，尤其是下肢动脉病变往往由动脉硬化闭塞症和血栓闭塞性脉管炎导致的肢体动脉狭窄闭塞和糖尿病所引起。PAD主要体现为严重的肢体缺血，尤其是下肢缺血。
目前，临床上对于远端流出道通畅者，常以介入支架和外科手术治疗。PAD患者常表现为以下两种情况：
管腔狭窄早期：主要表现为以行走时出现疼痛为特征的间歇性跛行；
随着狭窄的加重，可出现静息痛，甚至丧失行走能力和伴随组织坏死与溃疡发生为特点的危重肢体缺血(critical limb ischaemia，CLI)。
CLI的预后极差，5年生存率仅为50％或更低。CLI的治疗不仅仅是缓解症状、改善受累肢体的功能和防止截肢，还要防止全身动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的进展，以预防心脑血管事件发生。目前主要的治疗手段为：控制高血糖、高血压、血脂异常；去除危险因素，如吸烟；强制性运动锻炼；抗血小板药物和扩血管药物；以及循环重建手术，如外科手术(如旁路移植术或动脉内膜切除术)、血管内介入技术(如支架置入或球囊扩张术)。
经过上述治疗后，约40％的CLI患者仍不能改善预后。对于这部分患者来说，截肢目前被认为是挽救生命所做出的最后治疗选择。但截肢后的总死亡率大约为25％-50％；截肢术围手术期的死亡率为5％-20％；二次截肢率大约为30％。到目前为止，CLI的治疗选择仍然有限，大约40％的患者不符合进行循环重建的指征，或进行循环重建不能得到有益的反应。对于这些“没有其它治疗选择”的患者，药物治疗对延缓病情进展和预防截肢的作用十分有限。
因此，探索缺血肢体血液循环重建的新治疗策略对于减少患者截肢和提高患者生活质量具有非常重要的临床意义。这促使研究者将研究重点转向寻求具有分化潜能的干细胞移植治疗PAD，研究者们希望在病变局部能够使干细胞被诱导为血管上皮细胞来修复损坏的血管。
基础研究发现，能分化为血管内皮细胞的干细胞类型有血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPCs)、骨髓源性单核细胞(bone marrow mononuclearcell，BMMNC)和外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMNC)。但这些干细胞受组织来源的限制，提取和扩增的数量有限。致使这种疗法目前尚处于临床前研究阶段。
已有实验证明，人CD34+细胞(CD34是成熟血管的标志物)可以缓解CLI的症状、改善受累肢体的功能和防止截肢。但由于其在脐带沃尔通氏胶(Wharton′s jelly)中含量仅为5％-10％左右，因此，如何高效地生产该细胞就成为其能否获得广泛应用的重要前提。
截至目前，对脐带血中CD34+细胞的分离通常采取Ficoll分离法、羟乙基淀粉分离法和明胶自然沉降分离法，并在随后用免疫磁珠吸附法(MACS)进一步纯化所获得的CD34+细胞以获得符合要求的CD34+细胞。上述方法直接从人脐带血中分离并纯化原代CD34+细胞，鉴于人脐带血的供应量有限，利用上述方法所能获取的CD34+细胞的数量也极其有限。
因此，本领域仍然需要一种能够以相对简便的方法从人脐带生产大量CD34+细胞的方法。
发明内容
本发明的在于提供一种从脐带组织来制备CD34+细胞的方法。已经出人意料地发现，使用本发明方法制备CD34+细胞，已经呈现出例如本发明上下文所述优异的技术效果。本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种由脐带间充质干细胞制备CD34+细胞的方法，该方法包括如下步骤：
(a)提供脐带来源的间充质干细胞；
(b)对间充质干细胞进行原代培养；
(c)对间充质干细胞进行传代培养；
(d)在传代培养过程中，向培养基中加入诱导剂对间充质干细胞进行诱导；
(e)获得CD34+细胞。
本领域技术人员理解，可以采用本领域任何适合方式来提供脐带来源的间充质干细胞。例如，在一些实施方式中，将脐带组织进行酶解之后得到脐带来源的间充质干细胞。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(a)中，包括对脐带进行消毒和清洗的操作。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(a)中，包括对脐带进行消毒和清洗的如下操作：用消毒液(例如酒精)对脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开，平铺，通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗脐带组织，以减少脐带组织上红细胞。在一个实施方案中，所述酒精的浓度为25％-95％，优选75％。在一个实施方案中，其中所述PBS缓冲液是磷酸的钠盐和/或钾盐配制的，其pH为5.0-8.0，优选pH为5.5-7.6，优选pH为6.0-7.5。在一个实施方案中，所述PBS缓冲液中磷酸根的浓度为0.01-0.5M，优选0.02-0.1M。在本发明下文试验中，所用PBS缓冲液是磷酸钠盐，其中磷酸根的浓度为0.025M，pH为7.2。需要说明的是，本发明人发现，在上述范围内的PBS缓冲液浓度和pH值对于本发明方法的效果影响不大。在一个实施方案中，所述PBS缓冲液中包含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(a)中，还包括对脐带进行消化处理的操作。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(a)中，还包括对脐带进行消化处理的如下操作：将经过消毒和清洗处理得到的脐带组织剪成组织块，将组织块放入消化酶溶液(例如其非限制性地包含I型胶原酶、DMEM-F12)中，消化处理0.5-3小时(例如1-2小时，例如1.5小时)，过滤清除组织块后，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗，最终获得细胞悬液。在一个实施方案中，所述消化酶溶液是将I型胶原酶加入DMEM-F12，通过过滤器过滤得到的，其消化酶为0.05g-0.5g，优选消化酶为0.08g-0.2g，优选消化酶为0.1g，其DMEM-F12为50-500ml，优选DMEM-F12为80-200ml，优选DMEM-F12为100ml，其过滤器为5-50μm过滤器，优选20μm过滤器。在一个实施方案中，所述消化酶溶液是将0.1g的I型胶原酶加入到100ml的DMEM-F12中，混匀，过滤(例如用20um过滤器过滤)得到的。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(a)中，消化处理的时间为0.5-3小时，优选1-2.5小时，优选1.5-2小时。本发明人发现在1-2.5小时的消化处理时间内，对组织块的消化处理效果是最佳的，既可保证组织块得到充分的消化处理，也能避免细胞被破坏。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(a)中，消化处理是在人体体温附近的温度范围内进行的，优选34-40℃，优选36-38℃，优选37℃。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(a)中，消化处理是在恒温摇床里进行的。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(a)中，过滤清除组织块是通过滤网进行的，所述滤网为50-150μm滤网，优选约100μm滤网。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(a)中，终止消化的间充质干细胞培养基是按照2:1～1:2的比例加入，优选1:1的比例，所述比例为体积比。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(a)中，细胞清洗的具体步骤是离心5-15分钟，去除上清液，加入PBS缓冲液重悬细胞，再离心5-15分钟，去除上清液，加入间充质干细胞培养基，抽取小量样本进行细胞计数。离心转速为800-2000rpm，优选1250rpm，离心时间为优选10分钟。
本领域技术人员理解，可以采用本领域任何适合方式和任何适合的培养基对间充质干细胞进行原代培养。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(b)中，采用贴壁的培养方式对间充质干细胞进行原代培养。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(b)中，在补充有胎牛血清的RPMI1640培养液中对间充质干细胞进行原代培养。经原代培养的间充质干细胞称为P1代。在本发明的上下文中，原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行的首次培养。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(b)中，采用包括如下操作的步骤进行细胞的原代培养：将上一步骤所得得到的细胞悬液放入培养容器，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第2-7天(例如第3-6天，例如第4天，例如第5天)时将培养容器从培养箱中取出，补加适量(例如3ml)间充质干细胞培养基，继续培养；在第8-11天(例如第9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养；往后每1-3天(例如2天)进行一次全换液，当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40％-70％(例如60％)以后，利用消化酶(例如TrypLe Express)将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，即得原代细胞。
在一些实施方式中，可以采用本领域任何适合方式和任何适合的培养基对间充质干细胞进行传代培养。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(c)中，采用贴壁的培养方式对间充质干细胞进行传代培养。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(c)中，在补充有人血浆的RPMI1640培养液中对间充质干细胞进行传代培养。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(c)中，采用包括如下操作的步骤进行细胞的传代培养：将上一步骤所得原代细胞接种于培养容器进行传代并进行扩增培养(可以参考原代细胞培养的方法进行)，此后每1-3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90％(例如80％)后，即得脐带间充质干细胞，必要时进行传代。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(c)中，在传代培养过程中，向培养基中加入诱导剂对间充质干细胞进行诱导。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(c)中，从第5次传代培养起，向传代的间充质干细胞培养基中加入诱导剂，使间充质干细胞诱导成CD34+细胞。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述诱导剂为CD34抗体。CD34抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。CD34抗体可以是鼠源、兔源、猪源、牛源、羊源、马源、狗源的；优选鼠源、兔源、马源；最优选鼠源或兔源。在一个优选的实施方式中，CD34抗体是鼠单克隆抗体。在一个优选的实施方式中，CD34抗体是鼠抗人CD34单克隆抗体。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述CD34抗体在传代培养基中的终浓度为0.01μmol/L至1μmol/L；优选0.1μmol/L至1μmol/L；最优选0.1μmol/L至0.2μmol/L。
在不含CD34抗体的培养条件下，间充质干细胞表达非成熟血管标志物CD105，不表达成熟血管内皮细胞标记物CD34；而在CD34抗体存在条件下，间充质干细胞被诱导表达CD34，成为CD34阳性(+)细胞。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中自加入诱导剂后，对间充质干细胞传代培养2至15次；优选5至7次；最优选5次。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述间充质干细胞培养基中包含FBS、L-Glutamine(L-谷氨酸)、Gentamicin(庆大霉素)和DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有10-20％的FBS。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约15％的FBS。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有0.5-2％的L-Glutamine。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约1％的L-Glutamine。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约0.01-0.1％的Gentamicin。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约0.05％的Gentamicin。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有80-90％的DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约84％的DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞培养基中含有约15重量份的FBS、约1重量份的L-Glutamine、约0.05重量份的Gentamicin和约84重量份的DMEM-F12。本发明人发现，含有约15重量份的FBS、约1重量份的L-Glutamine、约0.05重量份的Gentamicin和约84重量份的DMEM-F12的间充质干细胞培养基是特别优选的，比之于使该培养基的任一成分含量变化10％以上的配方在增加脐带组织贴壁、减短贴壁细胞从组织爬出的时间等效果方面具有显著优势。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中培养容器为T25细胞培养瓶。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(b)原代培养中，所述细胞悬液以密度0.2-2×104/cm2加入培养容器中，优选以密度约1×104/cm2加入。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(b)原代培养中，所述培养箱中CO2浓度为3-7％，优选浓度为5％，培养箱温度控制在人体体温附近范围内，优选34-40℃，优选36-38℃，优选37℃。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供脐带来源的间充质干细胞：
(a1)消毒和清洗：在生物安全柜内，用酒精对脐带组织表面进行消毒，将脐带从中间剪开，平铺在无菌10cm细胞培养平皿上，利用PBS缓冲液清洗组织，以减少组织上面的红细胞；
(a2)消化处理：把0.1g的I型胶原酶加入100ml的DMEM-F12，然后用20μm过滤器过滤得到消化液，将步骤(1)得到的脐带组织转移至另一个10cm细胞培养平皿中，把脐带组织剪成1mm3大小的组织块，把组织块放入已配好的消化液里，在37℃的恒温摇床里消化1.5小时，利用100μm滤网清除余下的组织块，按1:1的体积比加入间充质干细胞培养基(15％FBS+1％L-Glutamine+0.05％Gentamicin+84％DMEM-F12)以终止消化，以转速1250rpm离心10分钟，把上清液去掉并加入PBS缓冲液重悬细胞后再以转速1250rpm离心10分钟，去上清液并加入间充质干细胞培养基，抽取小量样本进行细胞计数；
(b)对间充质干细胞进行原代培养：
将步骤(a2)得到的细胞悬液加入T25细胞培养瓶里，把T25细胞培养瓶放进CO2浓度为5％的37℃培养箱中进行培养，培养至第5天时将T25细胞培养瓶从培养箱中取出，补加3ml间充质干细胞培养基，继续培养；在第9天时将T25细胞培养瓶从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养；往后每2天进行一次全换液；当T25细胞培养瓶中的贴壁细胞融合率达到60％以后，利用消化酶(TrypLeExpress)将贴壁细胞脱离T25细胞培养瓶底部，离心，抽走上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，即得原代细胞；
(c)对间充质干细胞进行传代培养：
参照原代培养的操作，将原代培养所得原代细胞悬液接种于T25细胞培养瓶进行传代并进行扩增培养，此后每2天换液一次，直至融合率达到80％，即得脐带间充质干细胞；完成第一次传代培养；根据需要再将所得经传代的细胞进一步重复进行下一次的传代培养；
从第5次传代培养起，向传代的间充质干细胞培养基中加入诱导剂，使间充质干细胞诱导成CD34+细胞。
根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其包括如下步骤：
步骤1、人脐带样本的预处理
在无菌条件下，用酒精对脐带组织表面进行消毒，将脐带从中间剪开；
用含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS充分洗涤，去除残余血渍；
将脐带等分为0.5cm的脐带段，仔细剔除动静脉后，取50mL离心管盛装脐带段，1段/离心管；
在离心管中，将脐带段剪成大小约为1mm×1mm×1mm的碎片，剪碎过程中滴加LG-DMEM培养液保持组织湿润；
用含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS缓冲液(pH7.2，磷酸钠盐，磷酸根浓度0.025M)洗涤2次后备用；
步骤2、酶解
将步骤1中获得的脐带碎片，用混合酶液(0.1％Ⅰ型胶原酶、0.1％胰酶、0.1％透明质酸酶、0.1％DNA酶、0.02％EDTA)，在37℃下消化2h；
消化后，以离心力400g，温度4±2℃，离心15分钟；
弃去混合酶液，获得脐带来源的单个细胞；
步骤3、细胞的原代培养
将步骤2处理所得的细胞，按1×106细胞/ml的密度，接种到T-25培养瓶中，在20ml补充有10％(v/v)胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于37℃、5％CO2(v/v)、95％湿度的培养箱中孵育培养3天；
3天后第1次换液，去除未贴壁的细胞；
以后每48h更换培养液；
步骤4、细胞的传代培养
倒置显微镜下观察细胞的形态，待细胞长满至培养瓶底的80％左右，弃去培养液；
PBS(pH7.2)漂洗1次后，加0.25％胰蛋白酶-EDTA，在37℃下消化约2min；
轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后加入含10％(v/v)人AB血浆的RPMI1640培养液终止消化；
收集吹打后所得细胞，以1000g离心10min，弃上清；
用含10％(v/v)人AB血浆的RPMI1640培养液重悬，按照1∶2的比例进行传代接种，置于37℃、5％(v/v)CO2、95％湿度的培养箱中孵育培养；
每2天更换培养液1次；
待细胞增殖并覆盖瓶底80％左右时，用同样方法传代，传代4次后，获得P5代细胞；
步骤5、诱导条件下的传代培养
倒置显微镜下观察P5代细胞的形态，待长满至培养瓶底的80％左右，弃去培养液；
PBS(pH7.2)漂洗1次后，加0.25％胰蛋白酶-EDTA，在37℃下消化约2min；
轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后加入含10％(v/v)人AB血浆的RPMI1640培养液终止消化；
收集吹打后所得细胞，以1000g离心10min，弃上清；
用含10％(v/v)人AB血浆和0.1μmol/L CD34抗体、0.1μmol/L己二酸二钠、0.25％(w/v)麦芽糖的RPMI1640培养液重悬，按照1∶3的比例进行传代接种，置于37℃、5％(v/v)CO2、95％湿度的培养箱中孵育培养；
每24小时更换培养液1次；
待细胞增殖并覆盖瓶底80％左右时，完成一次传代；
将该代细胞用同样方法继续传代，最多可以传代15次；
步骤6、CD34+细胞的收集
待传代培养的细胞增殖并覆盖瓶底80％左右时，弃去培养液；
PBS(pH7.2)漂洗1次后，加0.25％胰蛋白酶-EDTA，在37℃下消化约2min；
轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后终止消化；
吹打后所得细胞以1000g离心10min，弃上清；
收集CD34+细胞，即得。
进一步的，本发明第二方面提供了一种细胞制品，其包括根据本发明第一方面任一实施方案所述方法制备的CD34+细胞和可药用载体。
本发明的细胞制品可以根据本领域常规方法胃肠外施用。目前临床应用中细胞制品的施用途径包括但不限于局部注射移植、循环注射移植。根据本发明的细胞制品可以制备成任何适合施用的形式。例如制备成适合通过微量泵将含有CD34+细胞的细胞制品泵入目标区域的形式；或者制备成适合通过穿刺针将将含有CD34+细胞的细胞制品注入目标区域的形式。根据移植方式、治疗目的的不同，本领域技术人员可以确定自行选择适当的可药用载体。在一些实施方式中，可药用载体是生理盐水。
进一步的，本发明第三方面提供了本发明第一方面任一实施方案所述方法制备的CD34+细胞在制备用于缓解或改善血管病变的药物中的用途。
根据本发明第三方面任一实施方案所述的用途，其中所述血管病变为肢体动脉狭窄闭塞或糖尿病引起的外周动脉病变(peripheral arterial disease，PAD)；优选肢体动脉狭窄闭塞或糖尿病引起的下肢动脉病变。
下面对本发明作进一步的说明。本发明所引用的文献，以及该文献中所引用的文献，它们的全部内容通过引用并入本文。
在本发明中，本发明任一方面的任一技术方案中，其任一技术特征同样适用于本发明的任一方面的任一实施方案，只要它们不会引起矛盾，并且这种相互适用在必要时可以作适当的修改。
在本发明中，术语“脐带间充质干细胞”是指来源于脐带的间充质干细胞。因此在本发明中，特别是涉及本发明的语境中，术语“脐带间充质干细胞”可以与“脐带干细胞”、“干细胞”、“间充质干细胞”互换使用，除非另有明确指明。
在本发明中，术语“PBS缓冲液”或者“PBS”是指磷酸盐缓冲液。本领域技术人员熟知在本发明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它们的一般性质例如pH值或pH范围。
在本发明中，术语“脐带”是指新生儿脐带，特别是指产后4小时之内的脐带。
根据本发明任一方面的任一实施方案，其中配制消化处理所用的所述混合酶液的基础培养基为DMEM-F12，即所述混合酶液是通过向该DMEM-F12培养基中添加相应酶而获得的。
间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(Caplan AI.Mesenchymal stem cells.JOrthop Res.1991,9:641-650.Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells.Science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。
目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中MSC的含量极其稀少，每105～106个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。起源于胚胎发育期胚外中胚层的脐带是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。
最新的研究表明脐带中含有丰富的干细胞，从脐带中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。
现有的分离干细胞从而建立干细胞库的方法尚有诸多缺点，例如纯度不足、和/或数量不高，进而显示出这些方法尚不能满足人们的期待。例如CN 101270349A(中国专利申请号200810061267.6，公开日2008年9月24日)公开的题为“胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法”的发明；CN 101693884A(中国专利申请号200910117522.9，公开日2010年4月14日)公开的题为“一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法”的发明；CN102146359A(中国专利申请号201110005964.1，公开日2011年8月10日)公开的题为“从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法”的发明。这些方法在提取物的纯度和/或回收率方面是有待进一步改善的。
本发明公开了一种从脐带中大量分离间充质干细胞的方法，并可利用这种方法保存脐带间充质干细胞并建立脐带干细胞库。本发明的发明人在总结以往分离培养间充质干细胞的基础上，利用组织消化酶消化脐带组织块，结合贴壁培养法，成功自脐带中分离得到大量间充质干细胞。本发明方法得到的间充质干细胞纯度高、数量多，具有与骨髓间充质干细胞相同的生物学特性，能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞等分化。由于脐带中干细胞较成体干细胞幼稚，含量丰富，在临床上具有广泛的应用前景，我们运用常规的细胞冻存方法将间充质干细胞像脐血一样冻存起来，建立脐带干细胞库，为以后干细胞的深入研究和临床治疗奠定基础。
由于脐血中含有丰富的造血干细胞，人们建立脐血库把脐血造血干细胞这一重要的生物资源储存起来，为多种血液系统疾病和免疫系统疾病提供一种治疗手段。同样脐带间充质干细胞作为一种更加重要的干细胞资源，我们运用常规的细胞冻存方法将其冷冻在-196摄氏度的深低温液氮中长期保存，建立脐带干细胞库，为日后的干细胞治疗保存种子。
根据本发明的方法，其中间充质干细胞培养基配方能成功并有效的对脐带间充质干细胞进行体外扩增。根据本发明的方法，其中换液和组织清除时间的设定缩短了贴壁细胞达到指定融合率的时间。根据本发明的方法,消化酶的配方和脐带组织的消化时间和方法能成功并有效地把组织里的全细胞分离出来。
本发明操作简单，方便实用，能得到大量的间充质干细胞，分化性能好，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、神经细胞等细胞分化的能力。与现有方法的比较:目前MSC主要采用手术法抽取供者骨髓或灌流法分离脐带，贴壁培养获得。该法分得细胞数量少，而且供者在取髓中和取髓后均有感染的可能。本发明成功自脐带中分离获得大量纯度较高的间充质干细胞，并运用此法建立脐带干细胞库来储备这种极具应用前景的干细胞。该法简便易行，且由于脐带与脐血一样，细胞成份较幼稚，来源广泛，方便易得，因此本发明的方法在干细胞的临床应用上将具有广泛的前景。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。例如，RPMI1640培养液可以购自GENMED，GMS12049.2A，LG-DMEM培养液和完全培养液均可以从Gibco购得，CD34抗体为可购自Cell Signal的鼠抗人CD34单克隆抗体，可从Becton Dickinson购得兔抗人CD105抗体。
实施例1、人脐带样本的预处理
在无菌条件下，取正常足月生产的近胎儿段脐带，用酒精对脐带组织表面进行消毒，将脐带从中间剪开；
用含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS充分洗涤，去除残余血渍；
将脐带等分为0.5cm的脐带段，仔细剔除动静脉后，取50mL离心管盛装脐带段，1段/离心管；
在离心管中，将脐带段剪成大小约为1mm×1mm×1mm的碎片，剪碎过程中滴加LG-DMEM培养液保持组织湿润；
用含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS缓冲液(pH7.2，磷酸钠盐，磷酸根浓度0.025M，如下文未具体说明，亦使用此PBS缓冲液)洗涤2次后备用。
实施例2、酶解
将实施例1中获得的脐带碎片，用混合酶液(0.1％Ⅰ型胶原酶、0.1％胰酶、0.1％透明质酸酶、0.1％DNA酶、0.02％EDTA；％表示质量浓度百分比)，在37℃下消化2h；
消化后，以离心力400g，温度4±2℃，离心15分钟；
弃去混合酶液，获得脐带来源的单个细胞。
实施例3、细胞的原代培养
将实施例2处理所得的细胞，按1×106细胞/ml的密度，接种到T-25培养瓶中，在20ml补充有10％(v/v)胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于37℃、5％CO2(v/v)、95％湿度的培养箱中孵育培养3天；
3天后第1次换液，去除未贴壁的细胞；
以后每48h更换培养液。
实施例4、细胞的传代培养
倒置显微镜下观察细胞的形态，待细胞长满至培养瓶底的80％左右，弃去培养液；
PBS(pH7.2)漂洗1次后，加0.25％胰蛋白酶-EDTA，在37℃下消化约2min；
轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后加入含10％(v/v)人AB血浆的RPMI1640培养液终止消化；
收集吹打后所得细胞，以1000g离心10min，弃上清；
用含10％(v/v)人AB血浆的RPMI1640培养液重悬，按照1∶2的比例进行传代接种，置于37℃、5％(v/v)CO2、95％湿度的培养箱中孵育培养；
每2天更换培养液1次；
待细胞增殖并覆盖瓶底80％左右时，用同样方法传代，传代4次后，获得P5代细胞。
实施例5、诱导条件下的传代培养
倒置显微镜下观察P5代细胞的形态，待长满至培养瓶底的80％左右，弃去培养液；
PBS(pH7.2)漂洗1次后，加0.25％胰蛋白酶-EDTA，在37℃下消化约2min；
轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后加入含10％(v/v)人AB血浆的RPMI1640培养液终止消化；
收集吹打后所得细胞，以1000g离心10min，弃上清；
用含10％(v/v)人AB血浆和0.1μmol/L CD34抗体、0.1μmol/L己二酸二钠、0.25％(w/v)麦芽糖的RPMI1640培养液重悬，按照1∶3的比例进行传代接种，置于37℃、5％(v/v)CO2、95％湿度的培养箱中孵育培养；
每24小时更换培养液1次；
待细胞增殖并覆盖瓶底80％左右时，完成一次传代(通常培养约3天即可达到此覆盖度)；
将该代细胞用同样方法继续传代，最多可以传代15次。
在本步骤中，已经发现，如果在RPMI1640培养液中不添加0.1μmol/L己二酸二钠和0.25％(w/v)麦芽糖，则在按1∶3的比例传代接种后进行孵育培养，即使在观察的10天之内细胞都不能增殖到能够覆盖瓶底80％，而最高的仅约能够覆盖瓶底60％。这表明，细胞太稀后不能正常生长，无法满足一般的细胞传代要求。但是出人意料的是，通过向RPMI1640培养液中添加0.1μmol/L己二酸二钠和0.25％(w/v)麦芽糖，即使是按1∶3的比例传代接种，细胞仍然能够在较短时间内实现期望的增殖，并且这样的方案传代可达15代。这种效果是具有极大的临床意义的，因为通过这样的方案可以将有限的间充质干细胞扩增并收集到更大量的子代细胞，解决临床应用时细胞不足的问题。另外，补充的试验已经发现，如果在上述培养液中只增添己二酸二钠或者只增添麦芽糖(而不是同时增添己二酸二钠和麦芽糖)则不能实现1：3比例传代且在3天达80％覆盖的效果。
实施例6、CD34+细胞的收集
待传代培养的细胞增殖并覆盖瓶底80％左右时，弃去培养液；
PBS(pH7.2)漂洗1次后，加0.25％胰蛋白酶-EDTA，在37℃下消化约2min；
轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后终止消化；
吹打后所得细胞以1000g离心10min，弃上清；
收集CD34+细胞。
实施例7、人脐带源间充质干细胞(hUC-MSCs)向CD34+细胞分化的细胞增殖活性分 析(MTT法)
1.检测步骤：
将实施例4培养的P5代细胞用0.25％的胰酶消化，300×g离心10分钟；
PBS(pH7.2)清洗2次，弃上清；
用完全培养液调整细胞浓度，接种于96孔板，每孔90μL，使细胞数为每孔1×105个；
设空白组、对照组、用药组(其中用药组培养液中分别加入0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L CD34抗体(且三种抗体浓度培养液中均添加了0.1μmol/L己二酸二钠和0.25％(w/v)麦芽糖；对照组加细胞但不加CD34抗体和己二酸二钠、麦芽糖；空白组不加细胞亦不加CD34抗体及两种试剂而是只加培养液)；
每组复种12孔，在37℃、5％(v/v)的CO2培养箱中培养96h；
每孔加20μL的MTT溶液，4h后每孔加100μL的10％SDS，18h后用酶标仪测定570nm处吸光度值(A值)。
细胞增殖率＝(各实验组A值-对照组A值)/对照组A值×100％。
2.结果：
与对照组相比，hUC-MSCs与CD34抗体孵育(0.01μmol/L、0.1μmol/L或1μmol/L)96h后，分别增殖了33.8％、71.4％和37.9％。另外，补充的试验已经发现，如果在上述培养液中只增添己二酸二钠或者只增添麦芽糖(而不是同时增添己二酸二钠和麦芽糖)则三种抗体浓度条件下的增殖分别小于5％、小于55％、小于25％。
实施例8、人脐带源间充质干细胞(hUC-MSCs)向CD34+细胞分化过程中CD34和 CD105的表达检查(免疫荧光染色检查)
1.分组：
按照实施例1至6的方法，将hUC-MSCs与CD34抗体进行孵育。区别仅在于：CD34抗体浓度分别为0.01μmol/L、0.1μmol/L和1μmol/L；且从第5次传代起，CD34抗体加入到传代培养基中，并且随CD34抗体一起还添加了0.1μmol/L己二酸二钠和0.25％(w/v)麦芽糖；分别继续再传代2次(约7天)和5次(约14天)。
无CD34抗体且无两种试剂的hUC-MSCs孵育组作为对照组。
2.检测方法：
分别在加入CD34抗体后第7天和14天收集贴壁细胞(即P7代细胞和P10代细胞)，用4％冷多聚甲醛固定15分钟；
0.1％的Triton X100-PBS洗10分钟后，细胞用3％牛血清白蛋白封闭30分钟；
各组用CD34抗体(1:200)和兔抗人CD105抗体(1:200)孵育，4℃过夜；
抗体去除后，细胞用PBS(pH7.2)洗三次；
然后，FITC标记的二抗(多克隆山羊抗兔IgG抗体1:100；Abcam)和TRITC标记的二抗(多克隆山羊抗小鼠IgG抗体1:100；Abcam)37℃孵育1小时；
细胞用PBS(pH7.2)洗三次；
细胞核用DAPI染色(4’,6-diamidino-2-phenylindole)；
Leica DM5000B荧光显微镜下观察细胞染色情况。
3.结果：
(1)在不含CD34抗体的孵育组中，hUC-MSC在第7天和第14天仅呈现CD105阳性，CD34阴性。
对于0.01μmol/L CD34抗体孵育组，在7天和14天时，呈现CD105和CD34双阳性，且细胞形态及成份趋于均一。
对于0.1μmol/L CD34抗体孵育组，在7天和14天时，呈现CD105和CD34双阳性，且细胞形态及成份趋于均一。
对于1μmol/L CD34抗体孵育组，在7天和14天时，呈现CD105和CD34双阳性；但是在14天时，细胞数量明显少于本组第7天时的细胞数量(数据未显示)。另外，补充的试验已经发现，如果在上述培养液中只增添己二酸二钠或者只增添麦芽糖(而不是同时增添己二酸二钠和麦芽糖)则三种抗体浓度均不能在7天时见到双阳性结果。
以上结果表明，CD34抗体可以促进hUC-MSC向CD34+细胞的转化。然而在高浓度组(如1μmol/L的CD34抗体)，细胞增殖率早期提高较快，随着培养的进展呈现减缓。因此，对于较长时间的培养，0.1μmol/L浓度最为适宜。
(2)发明人进一步考察了CD105+细胞以及CD34+细胞在细胞群中所占的比例，发现：
对于0.01μmol/L CD34抗体孵育组，在7天时双阳性比例达53％，第14天双阳性比例达70％。
对于0.1μmol/L CD34抗体孵育组，从第7至14天，双阳性比例从68％提高至85％。
对于1μmol/L CD34抗体孵育组，从第7至14天，双阳性比例变化不大，在54～61％范围附近。
这一结果表明，CD34抗体可以促进hUC-MSC向CD34+细胞转化。不同浓度的CD34抗体对转化细胞的增殖率影响不同，其中以0.1μmol/L浓度为最佳诱导浓度。并且，随着时间的增加，CD34+细胞所占比例也增加，这为大量生产CD34+细胞提供了可能。
(3)产量：
发明人对实施例6所收集的CD34+细胞进行了免疫荧光染色检查。发现在加入0.1μmol/L的CD34抗体之前，P5代细胞不表达可检测到的CD34；而在0.1μmol/L的CD34抗体存在条件下传代5次后，hUC-MSC被诱导为CD34+细胞；至多可以传代15次(即P20代细胞)，阳性率高达95～98％；从形态上观察，CD34+细胞的形态及成份均一。本发明的方法不仅操作简便，且使得能够大量生产CD34+细胞，为满足临床需求提供了可能。
实施例9、含有CD34+细胞的细胞制品的制备
在无菌条件下，将实施例6生产的CD34+细胞加入到0.9％生理盐水溶液中，制成悬浮液备用。该悬浮液可以通过注射器和立体定位架注射至患者的损伤区域。
实施例11、人脐带样本的预处理
在无菌条件下，取正常足月生产的近胎儿段脐带，用酒精对脐带组织表面进行消毒，将脐带从中间剪开；
用含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS充分洗涤，去除残余血渍；
将脐带等分为0.5cm的脐带段，仔细剔除动静脉后，取50mL离心管盛装脐带段，1段/离心管；
在离心管中，将脐带段剪成大小约为1mm×1mm×1mm的碎片，剪碎过程中滴加LG-DMEM培养液保持组织湿润；
用含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS缓冲液(pH7.2，磷酸钠盐，磷酸根浓度0.025M，如下文未具体说明，亦使用此PBS缓冲液)洗涤2次后备用。
实施例12、酶解
将实施例11中获得的脐带碎片，用混合酶液(0.1％Ⅰ型胶原酶、0.1％胰酶、0.1％透明质酸酶、0.1％DNA酶、0.02％EDTA；％表示质量浓度百分比)，在37℃下消化2h；
消化后，以离心力400g，温度4±2℃，离心15分钟；
弃去混合酶液，获得脐带来源的单个细胞。
实施例13、细胞的原代培养
将实施例12处理所得的细胞，按1×106细胞/ml的密度，接种到T-25培养瓶中，在20ml补充有10％(v/v)胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于37℃、5％CO2(v/v)、95％湿度的培养箱中孵育培养3天；
3天后第1次换液，去除未贴壁的细胞；
以后每48h更换培养液。
实施例14、细胞的传代培养
倒置显微镜下观察细胞的形态，待细胞长满至培养瓶底的80％左右，弃去培养液；
PBS(pH7.2)漂洗1次后，加0.25％胰蛋白酶-EDTA，在37℃下消化约2min；
轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后加入含10％(v/v)人AB血浆的RPMI1640培养液终止消化；
收集吹打后所得细胞，以1000g离心10min，弃上清；
用含10％(v/v)人AB血浆的RPMI1640培养液重悬，按照1∶2的比例进行传代接种，置于37℃、5％(v/v)CO2、95％湿度的培养箱中孵育培养；
每2天更换培养液1次；
待细胞增殖并覆盖瓶底80％左右时，用同样方法传代，传代4次后，获得P5代细胞。
实施例15、诱导条件下的传代培养
倒置显微镜下观察P5代细胞的形态，待长满至培养瓶底的80％左右，弃去培养液；
PBS(pH7.2)漂洗1次后，加0.25％胰蛋白酶-EDTA，在37℃下消化约2min；
轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后加入含10％(v/v)人AB血浆的RPMI1640培养液终止消化；
收集吹打后所得细胞，以1000g离心10min，弃上清；
用含10％(v/v)人AB血浆和0.1μmol/L CD34抗体的RPMI1640培养液重悬，按照1∶2的比例进行传代接种，置于37℃、5％(v/v)CO2、95％湿度的培养箱中孵育培养；
每2天更换培养液1次；
待细胞增殖并覆盖瓶底80％左右时，用同样方法传代，最多可以传代15次。
实施例16、CD34+细胞的收集
待传代培养的细胞增殖并覆盖瓶底80％左右时，弃去培养液；
PBS(pH7.2)漂洗1次后，加0.25％胰蛋白酶-EDTA，在37℃下消化约2min；
轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后终止消化；
吹打后所得细胞以1000g离心10min，弃上清；
收集CD34+细胞。
实施例17、人脐带源间充质干细胞(hUC-MSCs)向CD34+细胞分化的细胞增殖活性 分析(MTT法)
1.检测步骤：
将实施例14培养的P5代细胞用0.25％的胰酶消化，300×g离心10分钟；
PBS(pH7.2)清洗2次，弃上清；
用完全培养液调整细胞浓度，接种于96孔板，每孔90μL，使细胞数为每孔1×105个；
设空白组、对照组、用药组(其中用药组培养液中分别加入0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L CD34抗体；对照组不加CD34抗体；空白组不加CD34抗体只加培养液)；
每组复种12孔，在37℃、5％(v/v)的CO2培养箱中培养96h；
每孔加20μL的MTT溶液，4h后每孔加100μL的10％SDS，18h后用酶标仪测定570nm处吸光度值(A值)。
细胞增殖率＝(各实验组A值-对照组A值)/对照组A值×100％。
2.结果：
与对照组相比，hUC-MSCs与CD34抗体孵育(0.1μmol/L或1μmol/L)96h后，分别增殖了52.3％和28.1％，CD34抗体浓度为0.1μmol/L时细胞增殖率约为0。
实施例18、人脐带源间充质干细胞(hUC-MSCs)向CD34+细胞分化过程中CD34和 CD105的表达检查(免疫荧光染色检查)
1.分组：
按照实施例11至16的方法，将hUC-MSCs与CD34抗体进行孵育。区别仅在于：CD34抗体浓度分别为0.01μmol/L、0.1μmol/L和1μmol/L；且从第5次传代起，CD34抗体加入到传代培养基中；分别继续再传代2次(约7天)和5次(约14天)。
无CD34抗体的hUC-MSCs孵育组作为对照组。
2.检测方法：
分别在加入CD34抗体后第7天和14天收集贴壁细胞(即P7代细胞和P10代细胞)，用4％冷多聚甲醛固定15分钟；
0.1％的Triton X100-PBS洗10分钟后，细胞用3％牛血清白蛋白封闭30分钟；
各组用CD34抗体(1:200)和兔抗人CD105抗体(1:200)孵育，4℃过夜；
抗体去除后，细胞用PBS(pH7.2)洗三次；
然后，FITC标记的二抗(多克隆山羊抗兔IgG抗体1:100；Abcam)和TRITC标记的二抗(多克隆山羊抗小鼠IgG抗体1:100；Abcam)37℃孵育1小时；
细胞用PBS(pH7.2)洗三次；
细胞核用DAPI染色(4’,6-diamidino-2-phenylindole)；
Leica DM5000B荧光显微镜下观察细胞染色情况。
3.结果：
(1)在不含CD34抗体的孵育组中，hUC-MSC在第7天和第14天仅呈现CD105阳性，CD34阴性。
对于0.01μmol/L CD34抗体孵育组，在7天时hUC-MSC仅呈现CD105阳性，未见CD34阳性；在14天时，呈现CD105和CD34双阳性。
对于0.1μmol/L CD34抗体孵育组，在7天时就已经有效诱导CD34阳性；在14天时，呈现CD105和CD34双阳性，且细胞形态及成份趋于均一。
对于1μmol/L CD34抗体孵育组，在7天时就已经有效诱导CD34阳性；在14天时，呈现CD105和CD34双阳性；但是在14天时，细胞数量明显少于本组第7天时以及0.1μmol/L孵育组第14天时的细胞数量(数据未显示)。
以上结果表明，CD34抗体可以促进hUC-MSC向CD34+细胞的转化。然而在高浓度组(如1μmol/L的CD34抗体)，细胞增殖率早期提高较快，随着培养的进展呈现减缓。因此，对于较长时间的培养，0.1μmol/L浓度最为适宜。
(2)发明人进一步考察了CD105+细胞以及CD34+细胞在细胞群中所占的比例，发现：
对于0.01μmol/L CD34抗体孵育组，在7天时hUC-MSC仅呈现CD105+，CD34为阴性，双阳性细胞百分比为0％；在14天时，双阳性比例提高到62％。
对于0.1μmol/L CD34抗体孵育组，从第7至14天，双阳性比例从55％提高至74％。
对于1μmol/L CD34抗体孵育组，从第7至14天，双阳性比例变化不大，在40-46％范围附近。
这一结果表明，CD34抗体可以促进hUC-MSC向CD34+细胞转化。不同浓度的CD34抗体对转化细胞的增殖率影响不同，其中以0.1μmol/L浓度为最佳诱导浓度。并且，随着时间的增加，CD34+细胞所占比例也增加，这为大量生产CD34+细胞提供了可能。
(3)产量：
发明人对实施例16所收集的CD34+细胞进行了免疫荧光染色检查。发现在加入0.1μmol/L的CD34抗体之前，P5代细胞不表达可检测到的CD34；而在0.1μmol/L的CD34抗体存在条件下传代5次后，hUC-MSC被诱导为CD34+细胞；至多可以传代15次(即P20代细胞)，阳性率高达90-95.5％；从形态上观察，CD34+细胞的形态及成份均一。本发明的方法不仅操作简便，且使得能够大量生产CD34+细胞，为满足临床需求提供了可能。
实施例19、含有CD34+细胞的细胞制品的制备
在无菌条件下，将实施例16生产的CD34+细胞加入到0.9％生理盐水溶液中，制成悬浮液备用。该悬浮液可以通过注射器和立体定位架注射至患者的损伤区域。
本发明实际施用给患者的CD34+细胞的量可以根据多种相关因素(包括疾病的严重程度、施用途径、患者的体重、年龄和性别等)由临床操作者自行确定。根据治疗目的，细胞制品中还可以添加细胞因子和/或药物。
本发明方法制备的CD34+细胞单独使用、或者配合传统治疗方案(如控制高血糖、高血压、血脂异常；去除危险因素如吸烟；强制性的运动锻炼；施用抗血小板药物和扩血管药物；循环重建手术)联合使用，从而促进局部微循环形成，以提高、巩固治疗效果。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (3)

1.由脐带间充质干细胞制备CD34+细胞的方法，该方法包括如下步骤：
(a)提供脐带来源的间充质干细胞；
(b)对间充质干细胞进行原代培养；
(c)对间充质干细胞进行传代培养；
(d)在传代培养过程中，向培养基中加入诱导剂对间充质干细胞进行诱导；
(e)获得CD34+细胞；
该方法具体包括如下步骤：
步骤1、人脐带样本的预处理
在无菌条件下，用酒精对脐带组织表面进行消毒，将脐带从中间剪开；
用含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS充分洗涤，去除残余血渍；
将脐带等分为0.5cm的脐带段，仔细剔除动静脉后，取50mL离心管盛装脐带段，1段/离心管；
在离心管中，将脐带段剪成大小为1mm×1mm×1mm的碎片，剪碎过程中滴加LG-DMEM培养液保持组织湿润；
用含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS缓冲液洗涤2次后备用；所述PBS缓冲液是pH7.2、磷酸根浓度0.025M的磷酸钠缓冲液；
步骤2、酶解
将步骤1中获得的脐带碎片，用混合酶液在37℃下消化2h；混合酶液包含：0.1％Ⅰ型胶原酶、0.1％胰酶、0.1％透明质酸酶、0.1％DNA酶、0.02％EDTA；
消化后，以离心力400g，温度4±2℃，离心15分钟；
弃去混合酶液，获得脐带来源的单个细胞；
步骤3、细胞的原代培养
将步骤2处理所得的细胞，按1×106细胞/ml的密度，接种到T-25培养瓶中，在20ml补充有体积/体积百分数10％的胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于37℃、体积/体积百分数5％的CO2、95％湿度的培养箱中孵育培养3天；
3天后第1次换液，去除未贴壁的细胞；
以后每48h更换培养液；
步骤4、细胞的传代培养
倒置显微镜下观察细胞的形态，待细胞长满至培养瓶底的80％左右，弃去培养液；
用pH7.2的PBS漂洗1次后，加0.25％胰蛋白酶-EDTA，在37℃下消化2min；
轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后加入含体积/体积百分数10％的人AB血浆的RPMI1640培养液终止消化；
收集吹打后所得细胞，以1000g离心10min，弃上清；
用含体积/体积百分数10％的人AB血浆的RPMI1640培养液重悬，按照1∶2的比例进行传代接种，置于37℃、体积/体积百分数5％的CO2、95％湿度的培养箱中孵育培养；
每2天更换培养液1次；
待细胞增殖并覆盖瓶底80％左右时，用同样方法传代，传代4次后，获得P5代细胞；
步骤5、诱导条件下的传代培养
倒置显微镜下观察P5代细胞的形态，待长满至培养瓶底的80％左右，弃去培养液；
用pH7.2的PBS漂洗1次后，加0.25％胰蛋白酶-EDTA，在37℃下消化2min；
轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后加入含体积/体积百分数10％的人AB血浆的RPMI1640培养液终止消化；
收集吹打后所得细胞，以1000g离心10min，弃上清；
用含体积/体积百分数10％的人AB血浆和0.1μmol/L CD34抗体、0.1μmol/L己二酸二钠、重量/体积百分数0.25％的麦芽糖的RPMI1640培养液重悬，按照1∶3的比例进行传代接种，置于37℃、体积/体积百分数5％的CO2、95％湿度的培养箱中孵育培养；所述CD34抗体是鼠抗人CD34单克隆抗体；
每24小时更换培养液1次；
待细胞增殖并覆盖瓶底80％左右时，完成一次传代；
将该代细胞用同样方法继续传代，最多可以传代15次；
步骤6、CD34+细胞的收集
待传代培养的细胞增殖并覆盖瓶底80％左右时，弃去培养液；
用pH7.2的PBS漂洗1次后，加0.25％胰蛋白酶-EDTA，在37℃下消化2min；
轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后终止消化；
吹打后所得细胞以1000g离心10min，弃上清；
收集CD34+细胞，即得。
2.根据权利要求1的方法，所述步骤3原代培养中，所述细胞以密度0.2-2×104/cm2加入培养瓶中。
3.根据权利要求1的方法，所述步骤3原代培养中，所述细胞以密度1×104/cm2加入培养瓶中。
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