CN106359368A

CN106359368A - 细胞冻存液及冻存方法

Info

Publication number: CN106359368A
Application number: CN201610882019.2A
Authority: CN
Inventors: 陈海佳; 王飞; 王一飞; 葛啸虎; 戚康艺; 王小燕
Original assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2017-02-01

Abstract

本发明涉及细胞领域，特别涉及细胞冻存液及冻存方法。该细胞冻存液包括DMSO、人血白蛋白和无血清培养基。该冻存液不含有动物源血清，避免了引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。同时，本发明的GMSCs冻存液又能很好保持冻存细胞活性。

Description

细胞冻存液及冻存方法

技术领域

本发明涉及细胞领域，特别涉及细胞冻存液及冻存方法。

背景技术

牙周病造成了牙齿周围支持组织的不可逆性损坏，而目前广泛用于牙周再生的治疗方法都没能完全实现牙周组织的生理性和功能性再生。牙周组织工程技术的发展为牙周缺损组织的修复和再生提供了新的思路和空间。牙周膜干细胞自被发现以来，其良好的干细胞性就已经得到了广泛认可，但其来源有限，需拔牙才能获取牙周膜组织，使其临床应用的潜能受到限制。而在组织工程学研究中，寻求来源广泛、取材方便的种子细胞一直是研究的重点和核心。同是牙周组织来源的牙龈组织，则具有取材方便、组织愈合能力强并且能够无疤愈合的特点。因此，来源于牙龈组织的牙龈间充质干细胞近几年受到了高度关注。

间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，在1966年首先由Friedenstein等从骨髓中发现的。大量研究发现，间充质干细胞不仅可以分化为多种间质组织的细胞，如骨、脂肪、软骨、肌肉、肌腱和韧带等。同时在一定的诱导条件下还可以横向分化为外胚层和内胚层细胞。如上皮细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞、表皮干细胞等。目前研究表明，间充质干细胞来源十分广泛，除骨髓外，脂肪、脐带华通胶、胎盘、羊膜、肌肉、韧带、等均已分离培养出。近年来大量研究证明人体和动物的颅颌面部，特别是牙源性组织中存在具有特殊分化和再生功能的间充质干细胞。近年来因其在组织工程和细胞替代治疗的临床前研究而备受关注。牙龈间充质干细胞(gingiva－derivedmesenchymal stem cells，GMSCs)是组成牙龈结缔组织的主要间充质细胞。它是来源于中胚层的纤维母细胞，不仅具有活跃的自我更新的能力，并且还具有合成和降解胶原等细胞外基质的功能：I型和Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白等。因此GF在许多生理和病理过程中都起着十分重要的作用，可以维持胶原动态平衡，调节细胞相互作用，保护和修复牙龈组织，维持牙龈组织自身稳定性。

近几年，干细胞库建立的需要以及临床上对干细胞的需求增加，对干细胞冻存与复苏方面的研究引起了越来越多的关注。与其他来源MSCs一样，GMSCs作为组织工程学研究和潜在临床应用的种子细胞，其过度传代会表现明显衰老或凋亡，且长期体外培养易发生自发分化，失去多分化潜能，增殖、黏附能力下降，细胞凋亡率增加，所以冻存GMSCs也是其研究应用的重要环节之一。

细胞冻存液是一种细胞冻存时使用的溶液，它可以供给细胞生命代谢所必须的营养物质，同时可以防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用。目前常用的细胞冻存液或市售的细胞冻存液中通常是由二甲基亚砜(dimathyl sulfoxide,DMSO)和胎牛血清(fetalbovine serum,FBS)混合组成。DMSO是一种分子量小，且具有强溶解能力和渗透能力的化学物质。在许多研究中，DMSO是最常用的细胞冻存保护剂，用其保存的细胞复苏后与新鲜细胞比较，具有相似的表型、细胞表面标记及生长速率。DMSO的作用机制是在降温过程中透过细胞膜进入细胞内，降低细胞内、外未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质损伤，同时细胞内水分不会过度外渗，避免细胞过度脱水皱缩。然而，DMSO对细胞有一定毒性作用，浓度过高会引起较高的渗透压，不利于细胞复苏。因此，目前DMSO常规使用浓度为1％～5％。FBS属于异源性物质，成分复杂，并存在引入污染和过敏原的风险，不适合于临床应用。特别是在细胞治疗中，异源性蛋白的存在，可能会引起不必要的，甚至是未知的不良反应，严重影响治疗结果。

发明内容

有鉴于此，本发明提供细胞冻存液及冻存方法。本发明公开了一种临床安全性高，同时又能很好保持冻存细胞活性的细胞冻存液，用于冻存GMSCs。本冻存液由DMSO、人血白蛋白和无血清培养基组成。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种细胞冻存液，包括DMSO、人血白蛋白和无血清培养基。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的细胞冻存液以质量份计，包括如下组分：

DMSO 1份

无血清培养基 2～7份

人血白蛋白 0.4～1.4份。

DMSO 1份

无血清培养基 2～7份

质量浓度为20％的人血白蛋白注射液 2～7份。

DMSO 1份

无血清培养基 3～6份

质量浓度为20％的人血白蛋白注射液 3～6份。

DMSO 1份

无血清培养基 4～5份

质量浓度为20％的人血白蛋白注射液 4～5份。

DMSO 1份

无血清培养基 3份

质量浓度为20％的人血白蛋白注射液 6份。

DMSO 1份

无血清培养基 4份

质量浓度为20％的人血白蛋白注射液 5份。

DMSO 1份

无血清培养基 5份

质量浓度为20％的人血白蛋白注射液 4份。

DMSO 1份

无血清培养基 6份

质量浓度为20％的人血白蛋白注射液 3份。

本发明还提供了所述细胞冻存液在冻存间充质干细胞中的应用。

本发明还提供了所述细胞冻存液在冻存牙龈间充质干细胞中的应用。

本发明还提供了一种细胞冻存方法，取细胞与本发明提供的细胞冻存液混合，冻存。

在本发明的一些具体实施方案中，所述细胞冻存方法中所述细胞为牙龈间充质干细胞。

在本发明的一些具体实施方案中，所述细胞冻存方法中所述冻存液的添加量为：每1.5×10⁶个细胞添加所述冻存液1mL。

在本发明的一些具体实施方案中，所述细胞冻存方法中所述冻存为于4℃预冷，再置于-80℃超低温冰箱2～3天后，液氮保存。

本发明公开一种GMSCs冻存液，由DMSO、人血白蛋白和无血清培养基组成。该冻存液不含有动物源血清，避免了引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。同时，本发明的GMSCs冻存液又能很好保持冻存细胞活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示GMSCs表面marker流式结果图；

图2示GMSCs细胞形态图；其中，图2(A)示40×，图2(B)示100×；

图3示各组复苏后细胞活率比较；

图4示GMSCs生长曲线；其中，图4(A)示对比例GMSCs生长曲线，图4(B)示实施例3GMSCs生长曲线；

图5示GMSCs形态图；

图6示冻存前GMSCs表面marker流式结果图；

图7示实施例3GMSCs复苏培养表面marker流式结果图；

图8示对比例GMSCs复苏培养表面marker流式结果。

具体实施方式

本发明公开了一种细胞冻存液及冻存方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的GMSCs冻存液不含有动物源血清，避免了引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。

采用本发明的GMSCs冻存液冻存GMSCs，复苏后GMSCs活率显著提高，并保持良好的干细胞特性。

本发明提供的细胞冻存液及冻存方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：GMSCs原代分离培养

1)原材料来源：取临床上正畸导萌术切下的牙龈或阻生拔牙需要而切除包

绕在恒牙周围的牙龈组织。要求患者没有牙龈增生、炎症及使用过导致牙龈增生的药物。切取的牙龈组织快速浸入含3倍双抗的4℃预冷的PBS中。

2)漂洗：用含3倍双抗的PBS冲洗3次，再将牙龈置于间充质干细胞无血清培养基中(含青霉素100u/mL、链霉素100u/mL)浸泡5min；

3)消化：将牙龈组织剪成1cm³大小，加入适量胶原酶-Dispase酶1:1混合消化液(胶原酶3g/L，Dispase酶4g/L)，置37℃恒温摇床中消化60min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，1000r/min离心5min，弃上清。Ⅰ型胶原酶-Dispase酶混合消化液与组织块体积比为1:1～5:1，优选体积比为2:1。

4)接种：加入含10ng/mL EGF(表皮生长因子)的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，接种于六孔板，5％CO₂培养箱37℃培养。

5)纯化：待细胞长满80-90％，收集细胞，用磁珠分选法纯化细胞。将收集的细胞与STRO-1单抗4℃孵育1h，与磁珠30min4℃孵育，在磁力设备作用下筛选出STRO-1⁺GMSCs，接种于新的六孔板中，5％CO₂培养箱37℃培养。

6)GMSCs鉴定：待细胞长满80-90％，收集细胞(约1×10⁶个)，加入3g/L Triton浸泡20min，PBS洗3遍，10％山羊血清室温封闭2h，分别滴加1:200稀释的CD146、CD105、CD90、HLA-DR、CD34、CD45抗体各50uL，同时对照组滴加单纯PBS 50uL，4℃处理16h。次日室温放置30min，PBS漂洗3遍，各组分别滴加1:500稀释的FITC标记二抗IgG，常温避光孵育1h，PBS漂洗2遍，10％福尔马林固定细胞，上机测定抗原的阳性率。流式细胞仪结果显示，克隆细胞表面抗原CD146、CD105、CD90表达阳性，而HLA-DR、CD34、CD45表达阴性，说明本发明中得到的GMSCs属来源于中胚层的间充质干细胞。

表1 GMSCs细胞表面marker表达率结果

细胞表面marker	CD146	CD105	CD90	HLA-DR	CD34	CD45
							阳性表达率(％)	99.90	99.70	99.70	0.10	0.00	0.20

GMSCs表面marker流式结果图见图1。

7)传代：待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入2～3mL 0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入5～10mL含间充质干细胞无血清培养基终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入5～10mL含10ng/mLEGF的间充质干细胞无血清培养基，进行细胞计数，按5×10⁴cell/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO₂培养箱37℃培养，每隔2-3天换液一次。

培养过程中观察细胞形态，结果如图2所示。细胞接种约4h后开始贴壁，2-3d进入指数生长期，细胞增殖速度较快，5-7d进入平台期。细胞生长速度平稳，呈单层贴壁生长。大部分细胞呈长梭形，形态不规则。

对比例

冻存液配制：细胞收集前先配制冻存液，配方为10％DMSO+90％FBS。4℃冰箱冷藏备用。

细胞收集：选取第3代GMSCs，待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入2～3mL 0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入5～10mL间充质干细胞无血清培养基终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。

冻存：用配好的冻存液按1.5×10⁶个/ml密度冻存细胞。分装到2mL冻存管内，每管1mL，放入恢复室温的程序降温盒，放置-80℃超低温冰箱，2-3天后转移到液氮保存。

实施例2

冻存液配制：细胞收集前先配制冻存液，配方为DMSO:间充质干细胞无血清培养液:人血白蛋白注射液(20％)＝1:3:6。4℃冰箱冷藏备用。

实施例3

冻存液配制：细胞收集前先配制冻存液，配方为DMSO:间充质干细胞无血清培养液:人血白蛋白注射液(20％)＝1:4:5。4℃冰箱冷藏备用。

冻存：用配好的冻存液按1.5×10⁶个/mL密度冻存细胞。分装到2mL冻存管内，每管1mL,放入恢复室温的程序降温盒，放置-80℃超低温冰箱，2-3天后转移到液氮保存。

实施例4

冻存液配制：细胞收集前先配制冻存液，配方为DMSO:间充质干细胞无血清培养液:人血白蛋白注射液(20％)＝1:5:4。4℃冰箱冷藏备用。

实施例5

冻存液配制：细胞收集前先配制冻存液，配方为DMSO:间充质干细胞无血清培养液:人血白蛋白注射液(20％)＝1:6:3。4℃冰箱冷藏备用。

冻存：用配好的冻存液按1.5×10⁶个/mL密度冻存细胞。分装到2mL冻存管内，每管1mL,放入4℃预冷的程序降温盒，放置-80℃超低温冰箱，2-3天后转移到液氮保存。

实施例6

细胞冻存步骤为：

1)、程序降温盒先从-80℃冰箱取出恢复室温；2)冻存液现配完成，放入4℃预冷；3)细胞收集完成后用冻存液重悬，分装到冻存管；4)把冻存管放入程序降温盒，放置-80℃超低温冰箱；程序降温盒能保证温度以1℃/10min的速度下降；5)2-3天后转移到液氮保存。

实施例7

细胞复苏：对比例与实施例2～实施例5冻存的细胞于液氮冻存一个月后，分别取出三支细胞复苏，冻存管取出立即放入37℃水浴锅中溶解，溶解过程中需不断摇晃冻存管。1-2min液体融化后，用10mL培养基稀释细胞悬液(用培养基把冻存管洗一遍)，混匀后取0.5mL细胞悬液进行细胞计数与活性检测。实验结果显示由表2及图3结果可见。各实施例复苏后细胞活率与对比例(常规冻存液)比较皆有极显著差异(**，p<0.01)，实施例3与其他实施例比较皆有极显著差异(※，p<0.01)；采用本发明所述人GMSCs冻存液冻存GMSCs，即实施例3中，复苏后细胞数量更接近冻存前GMSCs的细胞数量，细胞存活率极显著高于常规的细胞冻存液冻存GMSCs(**，p<0.01)，表明本发明所述GMSCs冻存液可以更好的保持GMSCs冻存复苏后的细胞活性，本发明所述GMSCs冻存液冻存效果明显优于常规细胞冻存液(表2)。

表2 各组细胞复苏后计数结果及细胞活率

注：**表示各实施例复苏后细胞活率与对比例(常规冻存液)比较皆有极显著差异，※表示实施例3与其他实施例比较皆有极显著差异p<0.01。

各组复苏后细胞活率比较见图3。

实施例9

细胞生长曲线比较：对比例与实施例3冻存的细胞于液氮冻存一个月后，冻存管取出立即放入37℃水浴锅中溶解，溶解过程中需不断摇晃冻存管。1-2min液体融化后，用10mL间充质干细胞无血清培养基稀释细胞悬液(用培养基把冻存管洗一遍)，1000r/min离心5min，弃上清。用含10ng/mL EGF的间充质干细胞无血清培养基重悬后，细胞按1×10⁴个/mL密度接种于24孔板中，放入5％CO₂培养箱37℃培养，第四天换液一次。每天收集细胞进行细胞计数，每次随机收集计算3个孔，连续7天，绘制细胞生长曲线。结果显示采用本发明所述人GMSCs冻存液冻存GMSCs，复苏后培养细胞生长规律正常，其增殖活性略高于常规的细胞冻存液冻存GMSCs，如表3，图4(A)、图4(B)。每天细胞收集前在倒置显微镜下连续观察两组细胞的生长形态并采集图像。结果如图5所示。

表3 对比例冻存的GMSCs复苏培养每天计数结果

表4 实施例3冻存的GMSCs复苏培养每天计数结果

对比例GMSCs生长曲线见图4(A)，实施例3GMSCs生长曲线见图4(B)，GMSCs形态图见图5。

实施例10

细胞表面marker测定：对比例与实施例3冻存的细胞于液氮冻存一个月后，冻存管取出立即放入37℃水浴锅中溶解，溶解过程中需不断摇晃冻存管。1-2min液体融化后，用10mL间充质干细胞无血清培养基稀释细胞悬液(用培养基把冻存管洗一遍)，1000r/min离心5min，弃上清。用10mL含10ng/mLEGF的间充质干细胞无血清培养基重悬后，细胞接种于10cm培养皿中，放入5％CO₂培养箱37℃培养。48h后收集细胞，流式细胞仪检测其表面marker如CD146、CD105、CD90、CD34、CD45、HLA-DR等的表达情况。结果如表4、图6、图7、图8。检测结果表明，采用本发明所述GMSCs冻存液冻存细胞，复苏后的GMSCs表达干细胞典型的表面markerCD146、CD105、CD90阳性表达，而CD34、CD45、HLA-DR阴性表达，且与冻存前GMSCs比较无显著性差异。表明本发明所述GMSCs冻存液对GMSCs的冻存不会影响细胞表面标记物的表达。

表4 GMSCs细胞表面marker表达率结果

冻存前GMSCs表面marker流式结果图见图6，实施例3GMSCs复苏培养表面marker流式结果图见图7，对比例1GMSCs复苏培养表面marker流式结果见图8。

取实施例2、实施例4和实施例5制得的冻存液进行上述试验，试验结果与实施例3制得的冻存液的实验结果相近，无显著差异(P＞0.05)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种细胞冻存液，其特征在于，包括DMSO、人血白蛋白和无血清培养基。

2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，以质量份计，包括如下组分：

DMSO 1份

无血清培养基 2～7份

人血白蛋白 0.4～1.4份。

3.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，以质量份计，包括如下组分：

DMSO 1份

无血清培养基 2～7份

质量浓度为20％的人血白蛋白注射液 2～7份。

4.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，以质量份计，包括如下组分：

DMSO 1份

无血清培养基 3～6份

质量浓度为20％的人血白蛋白注射液 3～6份。

5.根据权利要求1至4任一项所述的细胞冻存液在冻存间充质干细胞中的应用。

6.根据权利要求1至4任一项所述的细胞冻存液在冻存牙龈间充质干细胞中的应用。

7.一种细胞冻存方法，其特征在于，取细胞与如权利要求1至4任一项所述的细胞冻存液混合，冻存。

8.根据权利要求7所述的细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞为牙龈间充质干细胞。

9.根据权利要求7所述的细胞冻存方法，其特征在于，所述冻存液的添加量为：每1.5×10⁶个细胞添加所述冻存液1mL。

10.根据权利要求7所述的细胞冻存方法，其特征在于，所述冻存为于4℃预冷，再置于-80℃超低温冰箱2～3天后，液氮保存。