CN109362712A - 一种脂肪组织冻存液、冻存方法及其应用 - Google Patents

一种脂肪组织冻存液、冻存方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脂肪组织冻存液、冻存方法及其应用，所述冻存液包括DMEM培养基、蔗糖、丙二醇、脯氨酸、四氢甲基嘧啶、超氧化歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、生育酚。本发明制备的冻存液中没有添加血清，避免了病原微生物的污染和排异反应的发生，且没有添加具有强烈毒性的DMSO，避免了培养出具有毒性的脂肪组织。本发明对脂肪组织的冻存效果好，脂肪组织细胞活性高，细胞凋亡率低，且制备方法简单易操作，可为该领域的研究和发展提供新的思路。

Description

一种脂肪组织冻存液、冻存方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种脂肪组织冻存液、冻存方法及其应用。
背景技术
随着生活水平的提高，人们不只是满足于身体的健康，而是将更多的注意力转移到自身的形象上，对美的追求也更加迫切。自体脂肪是一种理想的填充材料，几乎可用于全身各个部位软组织缺损治疗，国内外的研究人员进行了大量的研究以提高成活率和减少吸收率，然而，目前进行填充移植后保存的脂肪组织体积最终也只能保持在注射时的20-30％左右，因此为了达到满意的填充效果，临床上常常需要进行再次或者多次填充移植。反复的脂肪抽取操作既增加了医生的工作量，又增加了患者为取材而吸脂的手术痛苦和手术风险，并且造成较高的费用也为患者带了了较大的经济负担。
在此背景下如果能通过一次吸脂手术获得足够的脂肪组织，同时将获取的富余脂肪进行体外长期冷冻储存，在需要脂肪组织移植时复温即可使用，则会大大减轻患者的压力。目前国内外关于人颗粒脂肪组织储存冷冻保护剂的研究较少，用于冻存其他细胞或组织时的冷冻保护剂是否可保存脂肪组织中细胞的完整结构和活力的研究还鲜见报道，本专利将提供一种脂肪组织冻存液，以满足目前冻存脂肪组织的需求。
中国专利申请CN 106719600A公开了一种脂肪组织冻存液，该冻存液由二甲基亚砜10～20％、含非必需氨基酸的基础培养基65～90％和右旋糖酐1～20％和0.5～1.5g/ml的海藻糖组成，通过将预处理过的脂肪组织放入冻存液的冻存管内制成冻存样品，然后将所述冻存样品放入程序降温盒中，再将所述程序降温盒放入-80℃冰箱内，24h后将所述冻存样品转入液氮，完成冻存。该发明能为脂肪组织提供良好的环境和充足的营养，对脂肪组织的冻存效果好，并能实现长时间的冻存，但是该方案中添加了DMSO，存在严重的毒性作用，与蛋白质疏水集团发生作用，可导致蛋白质变性。本发明没有添加DMSO，消除了脂肪组织毒性的危险性，并且能达到对比例2中所实现的技术效果。
中国专利申请CN 106465710A公开了脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法，该冻存液由由4％～6％的二甲基亚砜(DMSO)、0.5％～10％的羟乙基淀粉以及10％～20％的人血白蛋白组成，将脂肪组织样本清洗后移入装有缓冲液的离心管中离心，然后将脂肪组织移至新的离心管内并剪成碎块，加缓冲液并离心，最后将脂肪组织移出并与预冷的脂肪组织冻存液混合得到混合液，将所述混合液冷冻后移入液氮中保存。该发明方法简便易操作，制作成本较低，制备的脂肪组织具有良好的活性，但是该发明中添加了DMSO和人血白蛋白，除了增加了脂肪组织的毒性外，还容易造成病原微生物的污染，并引起排异反应，不利于脂肪组织的保存。本发明没有添加DMSO和人血白蛋白，能在排除毒性和污染危险的情况下，保存出具有良好的活性、细胞特异性的脂肪组织细胞，达到甚至优于上述发明的技术效果。
发明内容
为解决现有技术中存在的缺点和不足，本发明的主要目的在于提供一种脂肪组织冻存液及其制备方法，该冻存液中没有添加血清，避免了病原微生物的污染和排异反应的发生，且没有添加具有强烈毒性的DMSO，避免了培养出具有毒性的脂肪组织。该方法对脂肪组织的冻存效果好，能长时间保存，制备方法简单易操作，为该领域的研究和发展提供了新的思路。
为了达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供一种脂肪组织冻存液，其特征在于，包括DMEM培养基、蔗糖、丙二醇、脯氨酸、四氢甲基嘧啶、超氧化歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、生育酚。
优选地，包括100mLDMEM培养基、2～10g蔗糖、15～50mL丙二醇、2～10g脯氨酸、10～35mL四氢甲基嘧啶、800IU/mL超氧化歧化酶1～3mL、750IU/mL谷胱甘肽过氧化物酶0.5～3mL、3.5mg/mL生育酚1～5mL。
优选地，包括100mLDMEM培养基、5～10g蔗糖、20～50mL丙二醇、8～10g脯氨酸、20～35mL四氢甲基嘧啶、800IU/mL超氧化歧化酶1.5～3mL、750IU/mL谷胱甘肽过氧化物酶1.5～3mL、3.5mg/mL生育酚2～5mL。
优选地，包括100mLDMEM培养基、5g蔗糖、20mL丙二醇、8g脯氨酸、20mL四氢甲基嘧啶、800IU/mL超氧化歧化酶1.5mL、750IU/mL谷胱甘肽过氧化物酶1.5mL、3.5mg/mL生育酚2mL。
本发明还提供一种脂肪组织的冻存方法，用所述的脂肪组织冻存液冻存所述的脂肪组织。
优选地，将脂肪组织与权利要求1-4任一项所述的脂肪组织冻存液混合，冻存。
优选地，包括以下步骤：
A、将脂肪组织放入冻存液的冻存管中；
B、将冻存样品放入4℃冰箱中30min，-20℃冰箱中2h，然后放入-80℃冰箱中8h；
C、转入液氮，完成冻存。
优选地，所述步骤A中脂肪组织的冻存密度为1-10×106cell/mL。
本发明还提供了所述脂肪组织冻存液在脂肪组织冻存中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的冻存液不添加血清，避免了病原微生物的污染及异体蛋白免疫原性的发生；不添加DMSO，消除了脂肪组织毒性的危险；
(2)本发明的冻存液对脂肪组织的冻存效果良好，能对脂肪组织进行长时间的冻存，使之保持完整的结构，细胞特异性好，细胞内脂滴含量有所改善，细胞内活性氧水平和细胞凋亡水平明显降低。
(3)本发明制备方法简单易操作，且成本较低，可以为该领域的研究和发展提供新的思路。
附图说明
图1为脂肪细胞各表型流式检测结果；
图2为脂肪细胞凋亡情况检测结果；
图3为脂肪细胞活性情况检测结果。
具体实施方式
实施例1
配制一种脂肪组织冻存液，其配方如下：
蔗糖：5g
丙二醇：20ml
脯氨酸：8g
四氢甲基嘧啶：20ml
800IU/mL超氧化歧化酶：1ml
750IU IU/mL谷胱甘肽过氧化物酶：0.5ml
3.5mg/mL生育酚：2ml
DMEM培养基：100ml
实施例2
100mLDMEM、2g蔗糖、15mL丙二醇、2g脯氨酸、10mL四氢甲基嘧啶、800IU/mL超氧化歧化酶1mL、750IU IU/mL谷胱甘肽过氧化物酶1mL、3.5mg/mL生育酚1mL。
实施例3
100mLDMEM、10g蔗糖、50mL丙二醇、10g脯氨酸、35mL四氢甲基嘧啶、800IU/mL超氧化歧化酶3mL、750IU/mL谷胱甘肽过氧化物酶3mL、3.5mg/mL生育酚5mL。
对比例1
100mLDMEM、5g蔗糖、20mL丙二醇、8g脯氨酸、20mL四氢甲基嘧啶、750IU/mL谷胱甘肽过氧化物酶1.5mL、3.5mg/mL生育酚2mL。
与实施例1相比，去除了超氧化歧化酶。
对比例2
100mLDMEM、5g蔗糖、20mL丙二醇、8g脯氨酸、20mL四氢甲基嘧啶、800IU/mL超氧化歧化酶1.5mL、3.5mg/mL生育酚2mL。
与实施例1相比，去除了谷胱甘肽过氧化物酶。
对比例3
100mLDMEM、5g蔗糖、20mL丙二醇、8g脯氨酸、20mL四氢甲基嘧啶、800IU/mL超氧化歧化酶1.5mL、750IU/mL谷胱甘肽过氧化物酶1.5mL。
与实施例1相比，去除了生育酚。
对比例4
100mLDMEM、5g蔗糖、20mL丙二醇、20g四氢甲基嘧啶、800IU/mL超氧化歧化酶1.5mL、750IU/mL谷胱甘肽过氧化物酶1.5mL、3.5mg/mL生育酚2mL。
与实施例1相比，去除了脯氨酸。
对比例5
100mLDMEM、5g蔗糖、20mL丙二醇、8g脯氨酸、800IU/mL超氧化歧化酶1.5mL、750IU/mL谷胱甘肽过氧化物酶1.5mL、3.5mg/mL生育酚2mL。
与实施例1相比，去除了四氢甲基嘧啶。
对比例6
传统冻存液，由70％DMEM、10％DMSO、20％FBS组成。
对比例7
通过对比文件1中提供的技术方案制备得到的冻存液。
对比例8
通过对比文件2中提供的技术方案制备得到的冻存液。
实验例1
脂肪组织的分离及脂肪细胞的培养实验，具体操作如下所示：
(1)取出液氮中的脂肪组织冻存管，在37℃水浴锅中充分摇晃加速解冻；
(2)转入细胞培养实验室，将脂肪组织混合液移入离心管内，加入适量PBS，洗涤3遍，将上层脂肪组织转移至50ml无菌离心管内，加PBS充分浸泡30min，然后在3000rpm下离心5min。
(3)弃去液体，加入等体积量的0.25％I型胶原酶，放入37℃恒温摇床中以100rpm振荡消化1h。
(4)用滤网过滤，转至离心管内1000rpm离心10min后除去上清液，将脂肪细胞培养液重悬细胞接种至培养瓶，放置于细胞培养箱内，37℃下5％CO2进行培养。
(5)待脂肪间充质干细胞融合度达到90％，弃去还有培养基，加入pH7.0的PBS洗细胞表面一次，弃去。
(6)加入0.25％胰蛋白酶液消化30s，弃去，加入2mLDMEM培养液，用移液枪轻轻吹打使细胞脱落，将细胞悬液移至15mL离心管中，离心1000rpm，离心3min，弃上清，加入PBS洗细胞两次，细胞沉淀加入各实施例及对比例所制备的冻存液5ml，混均，分装至冻存管内，冻存密度1×106cell/mL,每管1.5mL；(7)将冻存管移至程序降温盒中放于4℃，30min；然后放入-20℃，2h；再放入-80℃，8h；最后移入液氮中保存。
实验例2
脂肪细胞活性的检测实验，具体步骤如下所示：
(1)上述冻存6个月的细胞进行复苏培养收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将：
①补足的1640(无血清)培养基40ul；
②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培养液稀释(储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；
③需检测物10ul；
④细胞悬液50ul(即5×104cell/孔)，共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。
(2)置37℃，5％CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
(3)每孔加入10ul MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。
(4)离心(1000转×10min)，小心吸掉上清液，每孔加入100ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD560nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。
根据实验得到的实验结果如表1所示：
表1各实施例与对比例1的脂肪细胞的活力检测
上述实验结果表明，实施例1和3的细胞活力均优于对比例1～6，，其中，实施例1的细胞活力最好，效果最显著，而实施例2、实施例3的各组分质量分数有所差别，结果也与实施例1出现了明显的差异，可表明实施例1为本发明冻存液的更优配比。对比例1～5与实施例1相比，都缺少一组成分，其实验结果也出现了明显的差异，表明各组分的缺失均能影响到细胞活力的大小变化，各组分之间具有良好的相互协同作用。虽然对比例7和对比例8的细胞活力良好，但是二者的技术方案中均有添加DMSO，保存的脂肪细胞存在毒性，不利于其再次使用。综上所述，本发明的技术方案与现有技术相比能更好地维持脂肪组织细胞的活力。
实验例3
脂肪细胞表面标记物流式检测，具体步骤如下所示：
(1)各实施例和对比例1～6所获得的各脂肪细胞进行扩增培养；
(2)当细胞融合度达到90％时，0.25％胰酶消化并收集细胞，分装于1.5mLEP管中，每份细胞数为2×105个；
(3)细胞胞重悬于1mLPBS中洗涤2次，200g，离心5min；
(4)离心弃去上清液，加入200μL鼠源CD36、CD49、CD48、CD104一抗抗体(稀释度为1:100)常温下孵育30min；
(5)1mLPBS洗涤，分别与FITC标记二抗IgG(稀释度为1:2000)常温避光孵育1h；
(6)PBS洗两次后，弃去PBS，根据细胞量加入适量的PBS重悬细胞，利用流式细胞仪检测。
实验结果如附图1所示。
由实验结果可以表明，通过流式细胞仪分析显示，实施例1～3的阳性蛋白CD36、CD49与对比例1～6相比表达量高，而实施例3的表达量比对比例1略低一些；实施例1的阴性蛋白CD48、CD104与对比例1～6相比表达量低，而实施例2和3的表达比对比例1略高一点。由此可以说明各实施例所制备的脂肪细胞特异性良好，而由于实施例配比的不同其实验结果也所差异，表明实施例1为更优方案。
实验例4
脂肪细胞凋亡检测实验，具体操作步骤按照AnnexinV-FITC/PI试剂盒检测方法进行。实验结果如附图2所示。
实验结果显示，实施例1冻存的细胞凋亡率要低于对比例1～6，具有显著性差异；实施例2和3的凋亡率略高于对比例1，但均低于对比例2～6，说明各成分含量及缺失均能影响细胞的凋亡率，而本发明技术方案冻存得到的脂肪组织细胞的凋亡率均低于现有技术，可为脂肪组织细胞创造一个良好的生存环境，能对脂肪组织进行更好的保存。
实验例5
脂肪细胞活性氧检测实验，具体操作步骤可按照DCFH-DA试剂盒检测方法进行。实验检测结果如附图3所示。
活性氧是细胞进行有氧代谢的产物，可引起组织细胞的损伤。实验结果显示，实施例1和2中的活性氧含量低于对比例1～6，实施例3的活性氧含量略高于对比例1，但实施例1～3的含量均低于对比例2～6，说明各成分含量及缺失均能影响细胞活性氧的产生，而本发明的技术方案能显著减少活性氧的含量，最大程度上减小组织细胞的损伤。
综上所述，本发明制备的冻存液能对脂肪组织进行良好的保存，在最大程度上减少细胞凋亡率的同时，为细胞提供良好的生存环境，保持脂肪细胞的活力并减少脂肪细胞活性氧的产生，降低细胞组织的损伤以维持其结构的完整。本发明通过多次实验确定了技术方案以及各组分的配比，实验表明，各组分的配比变化和部分成分的缺失均会对冻存液的保存效果产生一定影响，因此本发明的技术方案是通过多次的创造性劳动所确定的，具有突出的实质性特点和显著的进步。
上述实施例仅示例性说明本发明的原理及其性能，不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员而言，皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通知常识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种脂肪组织冻存液，其特征在于，包括DMEM培养基、蔗糖、丙二醇、脯氨酸、四氢甲基嘧啶、超氧化歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、生育酚。
2.根据权利要求1所述的一种脂肪组织冻存液，其特征在于，包括100mL DMEM培养基、2～10g蔗糖、15～50mL丙二醇、2～10g脯氨酸、10～35mL四氢甲基嘧啶、800IU/mL超氧化歧化酶1～3mL、750IU/mL谷胱甘肽过氧化物酶0.5～3mL、3.5mg/mL生育酚1～5mL。
3.根据权利要求1所述的一种脂肪组织冻存液，其特征在于，包括100mL DMEM培养基、5～10g蔗糖、20～50mL丙二醇、8～10g脯氨酸、20～35mL四氢甲基嘧啶、800IU/mL超氧化歧化酶1.5～3mL、750IU/mL谷胱甘肽过氧化物酶1.5～3mL、3.5mg/mL生育酚2～5mL。
4.根据权利要求1或2所述的一种脂肪组织冻存液，其特征在于，包括：100mLDMEM培养基、5g蔗糖、20mL丙二醇、8g脯氨酸、20mL四氢甲基嘧啶、800IU/mL超氧化歧化酶1.5mL、750IU/mL谷胱甘肽过氧化物酶1.5mL、3.5mg/mL生育酚2mL。
5.一种脂肪组织的冻存方法，其特征在于，用如权利要求1-4任一项所述的脂肪组织冻存液冻存所述的脂肪组织。
6.根据权利要求5所述的冻存方法，其特征在于，将脂肪组织与权利要求1-4任一项所述的脂肪组织冻存液混合，冻存。
7.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将脂肪组织放入冻存液的冻存管中；
B、将冻存样品放入4℃冰箱中30min，-20℃冰箱中2h，然后放入-80℃冰箱中8h；
C、转入液氮，完成冻存。
8.根据权利要求7所述的一种脂肪组织冻存液的制备方法，其特征在于，所述步骤A中脂肪组织的冻存密度为1-10×106cell/mL。
9.根据权利要求1-4任一所述脂肪组织冻存液在脂肪组织冻存中的应用。
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