CN107494521A - 细胞冻存液和细胞冻存方法 - Google Patents

细胞冻存液和细胞冻存方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种细胞冻存液和细胞冻存方法，涉及细胞技术领域，本发明提供的细胞冻存液，成分包括甲基纤维素、糖类、氨基酸和DMSO。本发明提供的细胞冻存液，不含有胎牛血清成分，从而彻底杜绝了过敏反应，以及一些动物病毒的污染引入；同时，降低了DMSO的含量，从而降低了冻存液的毒性对细胞的影响。另外，本发明提供的细胞冻存方法，利用梯度降温，提高冻存后细胞复苏的活率。经过实验验证，在细胞形态、增值率、诱导分化潜能等细胞主要考察内容，本发明提供的冻存液与冻存方法均优于传统冻存液及传统冻存方法。

Description

细胞冻存液和细胞冻存方法
技术领域
本发明涉及细胞技术领域，尤其是涉及一种细胞冻存液和细胞冻存方法。
背景技术
间充质干细胞来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，这意味着其在临床治疗和再生医学领域的应用前景十分广阔。
间充质干细胞的应用，对细胞数量需求较大，而其直接获取量较小，所以须在获取后进行体外扩增培养。而细胞扩增培养到一定数量后会失去部分功能特性，所以，为了保证细胞的有效性和一致性，体外培养进行到一定阶段时，必须进行低温保存(液氮，-196℃)。
在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能导致细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等，能引起细胞死亡。向冻存液中加入保护剂(一般为DMSO),可使冰点降低，在缓慢的冻存条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。
降温的速度与冻存效果直接相关，降温速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况也会不同。如果降温速度过慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，同时细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰；降温速度过快，细胞内水分没有足够时间外渗，随着温度的下降，细胞内会发生结冰；如果降温速度非常快，细胞内形成的冰晶反而非常小或不结冰而呈玻璃状凝固(玻璃化冷冻)。不同的降温速度也会使细胞内外产生不同的生理变化，同样也可能对细胞造成损伤。降温速度过慢，细胞严重脱水，体积急剧收缩，超过一定程度时细胞失去活性。降温速度过慢会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶液损伤。降温速度过快，细胞内水分来不及外渗，会在胞内形成较大冰晶，造成细胞膜和细胞器的损伤，产生细胞内冰晶损伤。
冻存保护剂可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。冻存保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成。同时冻存保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。冻存保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内。该类保护剂主要包括DMSO、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定时间进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。其保护机制的假设很多，其中一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量。使冰点降低。减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。
目前，最常用的冻存液通常为胎牛血清中添加10％二甲基亚砜(DMSO)，也有一些冻存液选用间充质干细胞培养基替代部分胎牛血清。使用胎牛血清容易引入疯牛病及其他病毒感染，异种生物制品还可能诱发过敏反应；此外，浓度较高的DMSO具有一定的生物毒性，会降低细胞活率，诱导干细胞分化。这意味着，目前普遍使用的两种物质都不是冻存液的最佳选择。
因此，开发一种安全、有效，能够减少细胞过敏反应的冻存液，以及提高冻存后细胞复苏的活率的冻存方法尤为重要。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种细胞冻存液，以缓解现有技术中存在的细胞冻存液易引入污染、产生过敏反应，毒性高、安全度低的技术问题。
本发明的第二个目的在于提供一种细胞冻存方法，以缓解现有技术中存在的细胞冻存方法对冻存后细胞复苏活率有所降低的技术问题。
本发明提供的一种细胞冻存液，所述细胞冻存液包括：甲基纤维素、糖类、氨基酸和DMSO。
进一步地，所述细胞冻存液主要由以下组分组成：
甲基纤维素0.1-2.0％(w/v)，糖类0.5-3.0％(w/v)，氨基酸0.5-3.0％(w/v)，DMSO2-8％(v/v)，PBS溶剂。
进一步地，所述细胞冻存液由以下组分组成：
甲基纤维素0.2-1.0％(w/v)，糖类1.0-2.0％(w/v)，氨基酸1.0-2.0％(w/v)，DMSO4-6％(v/v)，PBS溶剂；
优选地，所述细胞冻存液由以下组分组成：
甲基纤维素0.5％(w/v)，糖类1.5％(w/v)，氨基酸1.5％(w/v)，DMSO 5％(v/v)，PBS溶剂。
进一步地，所述糖类包括麦芽糖或葡糖糖中的至少一种。
进一步地，所述氨基酸包括脯氨酸或谷氨酰胺中的至少一种。
进一步地，所述细胞冻存液主要由以下组分组成：
甲基纤维素0.1-2.0％(w/v)，麦芽糖0.1-1.0％(w/v)，葡萄糖0.4-2.0％(w/v)，脯氨酸0.4-2.0％(w/v)，谷氨酰胺0.1-1.0％(w/v)，DMSO 2-8％(v/v)，PBS溶剂。
进一步地，所述细胞冻存液由以下组分组成：
甲基纤维素0.2-1.0％(w/v)，麦芽糖0.2-0.8％(w/v)，葡萄糖0.5-1.5％(w/v)，脯氨酸0.5-1.5％(w/v)，谷氨酰胺0.2-0.8％(w/v)，DMSO 4-6％(v/v)，PBS溶剂；
优选地，所述细胞冻存液由以下组分组成：
甲基纤维素0.5％(w/v)，麦芽糖0.5％(w/v)，葡萄糖1.0％(w/v)，脯氨酸1.0％(w/v)，谷氨酰胺0.5％(w/v)，DMSO 5％(v/v)，PBS溶剂。
另外，本发明还提供了一种细胞冻存方法，所述细胞冻存方法包括：
调整细胞密度后，梯度降温至-80℃，放置20-30小时后移入液氮保存。
进一步地，所述细胞密度为5×105个/mL-5×106个/mL。
进一步地，所述梯度降温的降温速率为5-15℃/min。
本发明提供的细胞冻存液，包括甲基纤维素、糖类、氨基酸和DMSO。本发明提供的细胞冻存液，不含有胎牛血清成分，从而彻底杜绝了过敏反应，以及一些动物病毒的污染引入；同时，降低了DMSO的含量，从而降低了冻存液的毒性对细胞的影响。另外，本发明提供的细胞冻存方法，利用梯度降温，提高冻存后细胞复苏的活率。经过实验验证，在细胞形态、增值率、诱导分化潜能等细胞主要考察内容，本发明提供的冻存液与冻存方法均优于传统冻存液及传统冻存方法。
附图说明
图1为本发明实验例2提供的细胞复苏后活率结果图；
图2A为本发明实验例3提供的脐带源间充质干细胞复苏培养后细胞增值率结果图；
图2B为本发明实验例3提供的脂肪源间充质干细胞复苏培养后细胞增值率结果图；
图2C为本发明实验例3提供的骨髓源间充质干细胞复苏培养后细胞增值率结果图；
图3A为本发明实验例4提供的脐带源间充质干细胞在使用传统冻存液和传统冻存方法冻存复苏后的细胞形态结果图；
图3B为本发明实验例4提供的脐带源间充质干细胞在使用本发明提供的冻存液和本发明提供的冻存方法冻存复苏后的细胞形态结果图；
图3C为本发明实验例4提供的脂肪源间充质干细胞在使用传统冻存液和传统冻存方法冻存复苏后的细胞形态结果图；
图3D为本发明实验例4提供的脂肪源间充质干细胞在使用本发明提供的冻存液和本发明提供的冻存方法冻存复苏后的细胞形态结果图；
图3E为本发明实验例4提供的骨髓源间充质干细胞在使用传统冻存液和传统冻存方法冻存复苏后的细胞形态结果图；
图3F为本发明实验例4提供的骨髓源间充质干细胞在使用本发明提供的冻存液和本发明提供的冻存方法冻存复苏后的细胞形态结果图；
图4A为本发明实验例5提供的脐带源间充质干细胞在使用传统冻存液和传统冻存方法冻存复苏并在成骨诱导培养基中培养后的结果图；
图4B为本发明实验例5提供的脐带源间充质干细胞在本发明提供的冻存液和本发明提供的冻存方法冻存复苏并在成骨诱导培养基中培养后的结果图；
图4C为本发明实验例5提供的脂肪源间充质干细胞在使用传统冻存液和传统冻存方法冻存复苏并在成骨诱导培养基中培养后的结果图；
图4D为本发明实验例5提供的脂肪源间充质干细胞在本发明提供的冻存液和本发明提供的冻存方法冻存复苏并在成骨诱导培养基中培养后的结果图；
图4E为本发明实验例5提供的骨髓源间充质干细胞在使用传统冻存液和传统冻存方法冻存复苏并在成骨诱导培养基中培养后的结果图；
图4F为本发明实验例5提供的骨髓源间充质干细胞在本发明提供的冻存液和本发明提供的冻存方法冻存复苏并在成骨诱导培养基中培养后的结果图；
图5A为本发明实验例6提供的脐带源间充质干细胞在使用传统冻存液和传统冻存方法冻存复苏并在成脂肪诱导培养基中培养后的结果图；
图5B为本发明实验例6提供的脐带源间充质干细胞在本发明提供的冻存液和本发明提供的冻存方法冻存复苏并在成脂肪诱导培养基中培养后的结果图；
图5C为本发明实验例6提供的脂肪源间充质干细胞在使用传统冻存液和传统冻存方法冻存复苏并在成脂肪诱导培养基中培养后的结果图；
图5D为本发明实验例6提供的脂肪源间充质干细胞在本发明提供的冻存液和本发明提供的冻存方法冻存复苏并在成脂肪诱导培养基中培养后的结果图；
图5E为本发明实验例6提供的骨髓源间充质干细胞在使用传统冻存液和传统冻存方法冻存复苏并在成脂肪诱导培养基中培养后的结果图；
图5F为本发明实验例6提供的骨髓源间充质干细胞在本发明提供的冻存液和本发明提供的冻存方法冻存复苏并在成脂肪诱导培养基中培养后的结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种细胞冻存液，包括：甲基纤维素、糖类、氨基酸和DMSO。
本发明提供的细胞冻存液不含有胎牛血清成分，从而彻底杜绝了过敏反应，以及一些动物病毒的污染引入；同时，降低了DMSO的含量，从而降低了冻存液的毒性对细胞的影响。
在一个优选的实施方式中，细胞冻存液主要由以下组分组成：
甲基纤维素0.1-2.0％(w/v)，糖类0.5-3.0％(w/v)，氨基酸0.5-3.0％(w/v)，DMSO2-8％(v/v)，PBS溶剂。
其中，甲基纤维素例如可以为，但不限于0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1.0％(w/v)、1.1％(w/v)、1.2％(w/v)、1.3％(w/v)、1.4％(w/v)、1.5％(w/v)、1.6％(w/v)、1.7％(w/v)、1.8％(w/v)、1.9％(w/v)或2.0％(w/v)；糖类例如可以为，但不限于0.5％(w/v)、0.8％(w/v)、1.0％(w/v)、1.2％(w/v)、1.5％(w/v)、1.8％(w/v)、2.0％(w/v)、2.2％(w/v)、2.5％(w/v)、2.8％(w/v)或3.0％(w/v)；氨基酸例如可以为，但不限于0.5％(w/v)、0.8％(w/v)、1.0％(w/v)、1.2％(w/v)、1.5％(w/v)、1.8％(w/v)、2.0％(w/v)、2.2％(w/v)、2.5％(w/v)、2.8％(w/v)或3.0％(w/v)；DMSO例如可以为，但不限于2％(v/v)、3％(v/v)、4％(v/v)、5％(v/v)、6％(v/v)、7％(v/v)或8％(v/v)；PBS使用HyClone磷酸盐缓冲液(1x)，0.0067M(PO4)，货号SH30256.01B。
在一个更优选的实施方式中，细胞冻存液由以下组分组成：
甲基纤维素0.5％(w/v)，糖类1.5％(w/v)，氨基酸1.5％(w/v)，DMSO5％(v/v)，PBS溶剂。
在一个优选的实施方式中，糖类包括麦芽糖或葡糖糖中的至少一种。
在一个优选的实施方式中，氨基酸包括脯氨酸或谷氨酰胺中的至少一种。
在一个优选的实施方式中，细胞冻存液主要由以下组分组成：
甲基纤维素0.1-2.0％(w/v)，麦芽糖0.1-1.0％(w/v)，葡萄糖0.4-2.0％(w/v)，脯氨酸0.4-2.0％(w/v)，谷氨酰胺0.1-1.0％(w/v)，DMSO 2-8％(v/v)，PBS溶剂。
其中，甲基纤维素例如可以为，但不限于0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1.0％(w/v)、1.1％(w/v)、1.2％(w/v)、1.3％(w/v)、1.4％(w/v)、1.5％(w/v)、1.6％(w/v)、1.7％(w/v)、1.8％(w/v)、1.9％(w/v)或2.0％(w/v)；麦芽糖例如可以为，但不限于0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)或1.0％(w/v)；葡萄糖例如可以为，但不限于0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.8％(w/v)、1.0％(w/v)、1.2％(w/v)、1.5％(w/v)、1.8％(w/v)或2.0％(w/v)；脯氨酸例如可以为，但不限于0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.8％(w/v)、1.0％(w/v)、1.2％(w/v)、1.5％(w/v)、1.8％(w/v)或2.0％(w/v)；谷氨酰胺例如可以为，但不限于0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)或1.0％(w/v)；DMSO例如可以为，但不限于2％(v/v)、3％(v/v)、4％(v/v)、5％(v/v)、6％(v/v)、7％(v/v)或8％(v/v)；PBS使用HyClone磷酸盐缓冲液(1x)，0.0067M(PO4)，货号SH30256.01B。
在一个更优选的实施方式中，细胞冻存液由以下组分组成：
甲基纤维素0.5％(w/v)，麦芽糖0.5％(w/v)，葡萄糖1.0％(w/v)，脯氨酸1.0％(w/v)，谷氨酰胺0.5％(w/v)，DMSO 5％(v/v)，PBS溶剂。
另外，本发明还提供了一种细胞冻存方法，包括：
调整细胞密度后，梯度降温至-80℃，放置20-30小时后移入液氮保存。
在一个优选的实施方式中，调整细胞密度为5×105个/mL-5×106个/mL，例如可以为，但不限于5×105个/mL、8×105个/mL、1×106个/mL、3×106个/mL或5×106个/mL。
在一个更优选的实施方式中，调整细胞密度为1×106个/mL。
在一个优选的实施方式中，梯度降温的降温速率为5-15℃/min，例如可以为，但不限于5℃/min、8℃/min、10℃/min、12℃/min或15℃/min。
在一个更优选的实施方式中，梯度降温的降温速率为10℃/min；使用程序降温仪进行梯度降温。
在一个优选的实施方式中，放置时间为20-30小时，例如可以为，但不限于20小时、22小时、24小时、26小时、28小时或30小时。
在一个更优选的实施方式中，放置时间为24小时。
在一个优选的实施方式中，在梯度降温前还包括放置于冰面5-15分钟，例如可以为，但不限于5分钟、7分钟、10分钟、12分钟或15分钟。
在一个更优选的实施方式中，放置于冰面10分钟。
在一个优选的实施方式中，上述细胞为间充质干细胞。
本发明提供的细胞冻存方法，利用梯度降温，提高冻存后细胞复苏的活率。经过实验验证，在细胞形态、增值率、诱导分化潜能等细胞主要考察内容，本发明提供的冻存液与冻存方法均优于传统冻存液及传统冻存方法。
为了有助于更清楚的理解本发明，下面将结合实施例和对比例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
实施例1
一种细胞冻存液，由以下组分组成：
甲基纤维素0.5％(w/v)，麦芽糖0.5％(w/v)，葡萄糖1.0％(w/v)，脯氨酸1.0％(w/v)，谷氨酰胺0.5％(w/v)，DMSO 5％(v/v)，PBS溶剂。
实施例2
一种细胞冻存液，由以下组分组成：
甲基纤维素0.2％(w/v)，麦芽糖0.2％(w/v)，葡萄糖0.5％(w/v)，脯氨酸0.5％(w/v)，谷氨酰胺0.2％(w/v)，DMSO 4％(v/v)，PBS溶剂。
实施例3
一种细胞冻存液，由以下组分组成：
甲基纤维素1.0％(w/v)，麦芽糖0.8％(w/v)，葡萄糖1.5％(w/v)，脯氨酸1.5％(w/v)，谷氨酰胺0.8％(w/v)，DMSO 6％(v/v)，PBS溶剂。
实施例4
一种细胞冻存液，由以下组分组成：
甲基纤维素0.1％(w/v)，麦芽糖0.1％(w/v)，葡萄糖0.4％(w/v)，脯氨酸0.4％(w/v)，谷氨酰胺0.1％(w/v)，DMSO 2％(v/v)，PBS溶剂。
实施例5
一种细胞冻存液，由以下组分组成：
甲基纤维素2.0％(w/v)，麦芽糖1.0％(w/v)，葡萄糖2.0％(w/v)，脯氨酸2.0％(w/v)，谷氨酰胺1.0％(w/v)，DMSO 8％(v/v)，PBS溶剂。
实施例6
一种细胞冻存液，由以下组分组成：
甲基纤维素0.5％(w/v)，葡萄糖1.0％(w/v)，谷氨酰胺0.5％(w/v)，DMSO 5％(v/v)，PBS溶剂。
对比例1
一种细胞冻存液，由以下组分组成：
甲基纤维素0.5％(w/v)，脯氨酸1.0％(w/v)，谷氨酰胺0.5％(w/v)，DMSO 5％(v/v)，PBS溶剂。
对比例2
一种细胞冻存液，由以下组分组成：
甲基纤维素0.5％(w/v)，麦芽糖0.5％(w/v)，葡萄糖1.0％(w/v)，DMSO 5％(v/v)，PBS溶剂。
对比例3
一种细胞冻存液，由以下组分组成：
麦芽糖0.5％(w/v)，葡萄糖1.0％(w/v)，脯氨酸1.0％(w/v)，谷氨酰胺0.5％(w/v)，DMSO 5％(v/v)，PBS溶剂。
对比例4
一种细胞冻存液，由以下组分组成：
甲基纤维素0.05％(w/v)，麦芽糖1.5％(w/v)，葡萄糖0.2％(w/v)，脯氨酸2.5％(w/v)，谷氨酰胺0.05％(w/v)，DMSO 10％(v/v)，PBS溶剂。
对比例5
一种细胞冻存液，由以下组分组成：
甲基纤维素2.5％(w/v)，麦芽糖0.05％(w/v)，葡萄糖2.5％(w/v)，脯氨酸0.2％(w/v)，谷氨酰胺1.5％(w/v)，DMSO 1％(v/v)，PBS溶剂。
对比例6
一种细胞冻存液，由以下组分组成：
胎牛血清90％(v/v)，DMSO 10％(v/v)。
实施例7
一种细胞冻存方法，包括：
调整细胞密度至1×106个/mL后，放置于冰面10分钟，使用程序降温仪以10℃/分钟的降温速率梯度降温至-80℃，在-80℃冰箱放置24小时后移入液氮保存。
对比例7
一种细胞冻存方法，包括：
调整细胞密度至1×106个/mL后，放置于-80℃冰箱中，在-80℃冰箱放置24小时后移入液氮保存。
为了有助于更好地理解本发明提供的细胞冻存液对细胞的影响，进行以下实验：
实验例1细胞培养
步骤a.选取P2代脂肪源间充质干细胞，骨髓源间充质干细胞，脐带源间充质干细胞，分别按1.5×106个/T75分别接种于T75培养瓶中，加入无血清培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
步骤b.当细胞融合度达到90％时，使用胰蛋白酶消化，继续传代培养至P5代；
步骤c.将消化后的P5代细胞按1×106个/mL，采用本发明实施例1-6及对比例1-5提供的细胞冻存液冻存，及本发明实施例7提供的细胞冻存方法进行细胞冻存。同时采用传统冻存液(对比例6)及传统冻存方法(对比例7)作为对照。
实验例2细胞活率
细胞在液氮中冻存14天后取出，复苏，计算活率，结果如表1所示。
表1冻存后细胞复苏活率
从上述结果中可以看出，应用本发明实施例1-6提供的细胞冻存液及实施例7提供的细胞冻存方法冻存细胞后，细胞复苏的活率均高于应用对比例6提供的细胞冻存液或对比例7提供的细胞冻存方法冻存细胞后，细胞复苏的活率，并且，应用本发明实施例1提供的细胞冻存液及本发明实施例7提供的细胞冻存方法冻存细胞后，细胞的复苏活率达到93％以上。
为了更直观的体现本发明的有益效果，本发明实施例1+实施例7组、实施例1+对比例7组和对比例6+对比例7组的实验结果如图1所示。从结果图中可以看出，应用本发明实施例1提供的细胞冻存液及本发明实施例7提供的细胞冻存方法冻存细胞后，细胞复苏的活率高于应用实施例1提供的细胞冻存液及对比例7提供的细胞冻存方法冻存细胞后，细胞复苏的活率，也高于应用对比例6提供的细胞冻存液及对比例7提供的细胞冻存方法冻存细胞后，细胞复苏的活率。
实验例3细胞增值率
细胞在液氮中冻存14天后取出，复苏，按1.0×104个/孔接种于12孔板，于第3、5、7天分别计数。结果如图2A、图2B和图2C所示。从图中可以看出应用本发明实施例1提供的细胞冻存液及实施例7提供的细胞冻存方法冻存细胞后，细胞复苏的增值速率及增值率均高于应用对比例6提供的细胞冻存液及对比例7提供的细胞冻存方法冻存细胞后，细胞复苏的增值速率及增值率。
实验例4细胞形态
P5代干细胞在液氮中冻存14天后取出，复苏，按1.5×106个/瓶接种于T75培养瓶中，48小时后镜下观察细胞形态，结果如图3A、图3B、图3C、图3D、图3E和图3F所示，从图中可以看出应用本发明实施例1提供的细胞冻存液及实施例7提供的细胞冻存方法冻存细胞，复苏后的细胞形态优于应用对比例6提供的细胞冻存液及对比例7提供的细胞冻存方法冻存细胞，复苏后的细胞形态。
实验例5成骨分化
细胞在液氮中冻存14天后取出，复苏，在成骨诱导培养基中培养3周后，至于显微镜下观察，结果如图4A、图4B、图4C、图4D、图4E和图4F所示，从图中可以看出应用本发明实施例1提供的细胞冻存液及实施例7提供的细胞冻存方法冻存细胞，复苏后的细胞成骨分化优于应用对比例6提供的细胞冻存液及对比例7提供的细胞冻存方法冻存细胞，复苏后的成骨分化。
实验例6成脂分化
细胞在液氮中冻存14天后取出，复苏，在成脂诱导培养基中培养7天，然后在脂肪维持液中培养7天，至于显微镜下观察，结果如图5A、图5B、图5C、图5D、图5E和图5F所示，从图中可以看出应用本发明实施例1提供的细胞冻存液及实施例7提供的细胞冻存方法冻存细胞，复苏后的细胞成脂分化优于应用对比例6提供的细胞冻存液及对比例7提供的细胞冻存方法冻存细胞，复苏后的成脂分化。
综上所述，本发明提供的细胞冻存液，不含有胎牛血清成分，从而彻底杜绝了过敏反应，以及一些动物病毒的污染引入；同时，降低了DMSO的含量，从而降低了冻存液的毒性对细胞的影响。另外，本发明提供的细胞冻存方法，利用梯度降温，提高冻存后细胞复苏的活率。经过实验验证，在细胞形态、增值率、诱导分化潜能等细胞主要考察内容，本发明提供的冻存液与冻存方法均优于传统冻存液及传统冻存方法。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液包括：甲基纤维素、糖类、氨基酸和DMSO。
2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液主要由以下组分组成：
甲基纤维素0.1-2.0％(w/v)，糖类0.5-3.0％(w/v)，氨基酸0.5-3.0％(w/v)，DMSO 2-8％(v/v)，PBS溶剂。
3.根据权利要求2所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液由以下组分组成：
甲基纤维素0.2-1.0％(w/v)，糖类1.0-2.0％(w/v)，氨基酸1.0-2.0％(w/v)，DMSO 4-6％(v/v)，PBS溶剂；
优选地，所述细胞冻存液由以下组分组成：
甲基纤维素0.5％(w/v)，糖类1.5％(w/v)，氨基酸1.5％(w/v)，DMSO 5％(v/v)，PBS溶剂。
4.根据权利要求1-3任一项所述的细胞冻存液，其特征在于，所述糖类包括麦芽糖或葡糖糖中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的细胞冻存液，其特征在于，所述氨基酸包括脯氨酸或谷氨酰胺中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液主要由以下组分组成：
甲基纤维素0.1-2.0％(w/v)，麦芽糖0.1-1.0％(w/v)，葡萄糖0.4-2.0％(w/v)，脯氨酸0.4-2.0％(w/v)，谷氨酰胺0.1-1.0％(w/v)，DMSO 2-8％(v/v)，PBS溶剂。
7.根据权利要求6所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液由以下组分组成：
甲基纤维素0.2-1.0％(w/v)，麦芽糖0.2-0.8％(w/v)，葡萄糖0.5-1.5％(w/v)，脯氨酸0.5-1.5％(w/v)，谷氨酰胺0.2-0.8％(w/v)，DMSO 4-6％(v/v)，PBS溶剂；
优选地，所述细胞冻存液由以下组分组成：
甲基纤维素0.5％(w/v)，麦芽糖0.5％(w/v)，葡萄糖1.0％(w/v)，脯氨酸1.0％(w/v)，谷氨酰胺0.5％(w/v)，DMSO 5％(v/v)，PBS溶剂。
8.一种细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞冻存方法包括：
调整细胞密度后，梯度降温至-80℃，放置20-30小时后移入液氮保存。
9.根据权利要求8所述的细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞密度为5×105个/mL-5×106个/mL。
10.根据权利要求8所述的细胞冻存方法，其特征在于，所述梯度降温的降温速率为5-15℃/min。
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