CN109864064A - 一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法 - Google Patents

一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法 Download PDF

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冷毅斌
吴亭
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Abstract

本发明提供一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法，包括DMSO、乙二醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、葡萄糖、细胞稳定剂。免疫细胞冻存液能有效保护免疫细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高免疫细胞的复苏存活率，且复苏后细胞活率高、细胞增殖数量大、细胞不易老化，并保证了免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，微生物检测指标符合要求，延长了免疫细胞的存活期，减少了免疫细胞表面抗原的丢失。

Description

一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法。
背景技术
细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的作用。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1到-2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
冻存保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质(常为溶液)。细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。
冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂：可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等；非渗透性冷冻保护剂：不能渗透到细胞内，一般是一些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。现在常用的细胞冻存方案是使用DMSO为冻存保护剂，同时加入牛血清，这样的方案可以用于科研产品的保存，但是存在细胞毒性、成分不确定、可能引入细菌和病毒等污染源的问题。
发明内容
本发明提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法，免疫细胞冻存液能有效保护免疫细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高免疫细胞的复苏存活率，且复苏后细胞活率高、细胞增殖数量大、细胞不易老化，并保证了免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，微生物检测指标符合要求，延长了免疫细胞的存活期，减少了免疫细胞表面抗原的丢失。
根据本发明实施例的第一个方面，提供一种免疫细胞冻存液，包括DMSO、乙二醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、葡萄糖、细胞稳定剂。
作为优选的，每100mL冻存液中含DMSO 6.4mL、羟乙基淀粉45.6mL和细胞稳定剂34mL。
作为优选的，所述细胞稳定剂包括甘油和人血清蛋白。
作为优选的，还包括甲基纤维素和磷酸缓冲盐溶液PBS。
根据本发明实施例的第二个方面，提供一种免疫细胞冻存方法，包括：
基于免疫细胞冻存液调整细胞密度至2～5.5×105/mL，梯度降温至-80℃，放置20-30小时后移入液氮保存。
作为优选的，包括：
当温度不低于-25℃时，降温速率为-1～-2℃/min；当温度低于-25℃时，降温速率为-5℃～-10℃/min；当温度为-80℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-80℃过夜后移入液氮保存。
作为优选的，所述细胞密度为5×105个/mL-5×106个/mL。
本发明提出一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法，包括DMSO、乙二醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、葡萄糖、细胞稳定剂。免疫细胞冻存液能有效保护免疫细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高免疫细胞的复苏存活率，且复苏后细胞活率高、细胞增殖数量大、细胞不易老化，并保证了免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，微生物检测指标符合要求，延长了免疫细胞的存活期，减少了免疫细胞表面抗原的丢失。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
根据本发明实施例的第一个方面，提供一种免疫细胞冻存液，包括DMSO、乙二醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、葡萄糖、细胞稳定剂。
作为优选的，每100mL冻存液中含DMSO 6.4mL、羟乙基淀粉45.6mL和细胞稳定剂34mL。
作为优选的，所述细胞稳定剂包括甘油和人血清蛋白。
作为优选的，还包括甲基纤维素和磷酸缓冲盐溶液PBS。
根据本发明实施例的第二个方面，提供一种免疫细胞冻存方法，包括：
基于免疫细胞冻存液调整细胞密度至2～5.5×105/mL，梯度降温至-80℃，放置20-30小时后移入液氮保存。
作为优选的，包括：
当温度不低于-25℃时，降温速率为-1～-2℃/min；当温度低于-25℃时，降温速率为-5℃～-10℃/min；当温度为-80℃时，浸入液氮；或
置于-20℃冰箱2h，然后置于-80℃过夜后移入液氮保存。
作为优选的，所述细胞密度为5×105个/mL-5×106个/mL。
本发明提出一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法，包括DMSO、乙二醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、葡萄糖、细胞稳定剂。免疫细胞冻存液能有效保护免疫细胞免受冷冻损伤，安全性高，对细胞的损伤小，可以提高免疫细胞的复苏存活率，且复苏后细胞活率高、细胞增殖数量大、细胞不易老化，并保证了免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，微生物检测指标符合要求，延长了免疫细胞的存活期，减少了免疫细胞表面抗原的丢失。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的实施例的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明的实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明的实施例各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于，包括DMSO、乙二醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、葡萄糖、细胞稳定剂。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，每100mL冻存液中含DMSO6.4mL、羟乙基淀粉45.6mL和细胞稳定剂34mL。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述细胞稳定剂包括甘油和人血清蛋白。
4.根据权利要求2所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，还包括甲基纤维素和磷酸缓冲盐溶液PBS。
5.一种免疫细胞冻存方法，其特征在于，包括：
基于免疫细胞冻存液调整细胞密度至2～5.5×105/mL，梯度降温至-80℃，放置20-30小时后移入液氮保存。
6.根据权利要求5所述的免疫细胞冻存方法，其特征在于，包括：
当温度不低于-25℃时，降温速率为-1～-2℃/min；当温度低于-25℃时，降温速率为-5℃～-10℃/min；当温度为-80℃时，浸入液氮；或置于-20℃冰箱2h，然后置于-80℃过夜后移入液氮保存。
7.根据权利要求5所述的免疫细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞密度为5×105个/mL-5×106个/mL。
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