CN108207930A - 一种鸡尾酒式冷冻保护剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种鸡尾酒式冷冻保护剂及其应用，该鸡尾酒式冷冻保护剂包括如下组分：多糖1％～60％(w/v)，氨基酸1％～50％(w/v)，多元醇1％～20％(v/v)，含羟基的高分子聚合物0％～10％(w/v)。本发明的多糖、氨基酸、多元醇和含羟基的高分子聚合物，高浓度时毒性也较低，利用该配比的多糖、氨基酸、多元醇和含羟基的高分子聚合物，可以有效抑制细胞内冰晶的形成，降低低温环境对所冻存细胞的损伤，提高了冻存细胞经复苏培养后的存活率，大大较低了冻存细胞的毒性，因而本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂具有极高的安全可行性和应用推广价值。

Description

一种鸡尾酒式冷冻保护剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种鸡尾酒式冷冻保护剂及其应用。

背景技术

人多功能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)包括人类胚胎干细胞及人诱导多功能干细胞，这类细胞的获取标志着生物医学研究领域的新纪元。人多功能干细胞具有自我更新的能力，同时可以分化为几乎所有类型的人类组织细胞。这些卓越的特性使得hPSCs在组织工程，再生医学及细胞移植领域具有广阔的应用前景，将有望产生一系列细胞疗法用于帕金森疾病、糖尿病、心血管等疾病的治疗。然而，hPSCs细胞经冷冻保存后较低的恢复率严重影响并阻碍了其在生物和医学领域的广泛应用。

细胞冷冻保存是将细胞培养物悬浮在含有冷冻保护剂的溶液中，以一定的速率降至零度以下，并在低温下长期保存的过程。细胞冷冻保存一般是保存在－80℃或液氮－196℃的低温环境中。在冷冻过程中，细胞会发生胞内外的结晶，同时细胞内外的溶液浓度也会由于结晶发生相应的改变，曝露在低温下的细胞也会随之产生不同的压力。

截至目前，有两项技术应用于hPSCs的冷冻保存应用中，一种是传统的慢速冷冻，另一种则是玻璃化冻存。在这两种方法中，DMSO(DMSO)是普遍采用的冷冻保护剂。客观来说，DMSO广泛应用于小鼠胚胎干细胞、人类造血干细胞、人间充质干细胞、人脂肪干细胞的冷冻保存中，并在这些细胞中取得了良好的冷冻效果，可是DMSO在hPSCs上的应用效果却并不理想，细胞经慢速冷冻保存的恢复率仅为5％～25％，同时会导致大量干细胞分化。

与此对比，利用开放式拉长细管将细胞置于高浓度冷冻保护剂中并快速插入液氮的玻璃化冻存则可获得较高的细胞存活率(25％～75％)，但这项技术并不适合广泛应用。一是由于开放式拉长细管仅能容纳10～100ul的细胞悬浮液，同时操作需手动进行，并不适合大批量的hPSCs冷冻保存，再就是高浓度的冷冻保护剂在4℃以上毒性较大，尤其是在体温环境下会引起机体较大毒性反应，例如细胞中残留的DMSO会引起血管内溶血、高渗，并增加血清转氨酶水平。这些发现大大降低了经冷冻保存复苏后多功能干细胞生物利用的可靠性，因而发展高效低毒的人多功能干细胞冷冻保护剂迫在眉睫。DMSO联合海藻糖、乙二醇、羟乙基淀粉使用可有限度地提升冷冻保存效果，但仍无法满足要求。因此，寻求及发展有效的生物相容性冷冻保护剂体系并优化其配比是本领域亟需解决的技术难题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种鸡尾酒式冷冻保护剂，其包括如下组分：

说明：本发明中所述的w/v，其单位均为kg/l或mg/ml；本发明中所述的v/v，其单位均为l/l或ml/ml。

本发明的多糖、氨基酸、多元醇和含羟基的高分子聚合物具有良好的生物相容性，高浓度时毒性也较低，利用所述配比的多糖、氨基酸、多元醇和含羟基的高分子聚合物，可以最大限度地抑制细胞内冰晶的形成，降低低温环境对所冻存细胞的损伤，因而大大较低了冻存细胞的毒性，并提高了冻存细胞经复苏培养后的存活率。本发明通过所述简单的组合配比即能够发挥多糖、氨基酸、多元醇和含羟基的高分子聚合物等每种冷冻保护剂的最大保护优势，同时在冷冻细胞程序上并无增加。由所述组分所制备的冷冻保护剂呈现如鸡尾酒式的分层，这也是本发明名称的由来。

本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂优选包括如下组分：

其中，所述多糖为海藻糖或蔗糖；优选为海藻糖。通过添加所述海藻糖，本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂在细胞冷冻和解冻过程中能够有效稳定细胞膜和蛋白质，并在冷冻过程中可以形成一种玻璃状基质，以此抑制潜在致命的细胞内的冰晶的形成，由此降低了细胞损伤。

其中，所述氨基酸为L-脯氨酸、甘氨酸或谷氨酸；优选为L-脯氨酸。通过添加所述L-脯氨酸，本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂在低温环境下可有效保护蛋白质分子，可以清除由于低温产生的活性氧，同时在低温胁迫结束后帮助冻存细胞的复苏。

其中，所述多元醇为丙三醇、甘露醇或山梨醇；优选为丙三醇。

其中，所述含羟基的高分子聚合物为聚乙烯醇或聚乙二醇；优选分子量为9～10kDa的聚乙烯醇。由于小分子聚乙烯醇具有很高的生物相容性，通过添加所述聚乙烯醇，本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂能够有效抑制细胞在复温过程中的重结晶。

本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂还包括如下组分中的一种或多种：

通过添加DMSO(二甲基亚砜)，并使其在所述鸡尾酒式冷冻保护剂中的含量控制在0.1％～5％(v/v)，使得本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂降低了细胞毒性，进而就提高了复苏后细胞生物利用的可靠性。通过添加抗氧化剂，并将其含量控制在0.5％～10％(w/v)，本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂可以避免细胞在失水状态下的氧化变质，从而增加了冷冻保存的效果。通过添加酸碱调整剂，并将其含量控制在1％～10％(w/v)，本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂能够缓冲溶剂在结晶过程中pH值的快速变化，防止细胞由于pH值的变化而导致变性，从而提高了细胞的存活率。通过添加胎牛血清，本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂能够稳定细胞结构，并且能够抑制小分子冷冻保护剂的结晶，进而起到有效的细胞冷冻保存作用。

优选的，所述抗氧化剂为维生素C、维生素E或卵磷脂；和/或，所述酸碱调整剂为HEPES或者EDTA。本发明提供了一种优选的鸡尾酒式冷冻保护剂，其包括如下组分(也可仅含有如下组分)：

该优选的鸡尾酒式冷冻保护剂在较低冻存细胞的毒性，提高冻存细胞经复苏培养后的存活率方面，具有更好的技术效果。

本发明还提供了一种所述鸡尾酒式冷冻保护剂在冷冻保存人多功能干细胞中的应用，尤其适用于人多功能干细胞的慢速冷冻保存和玻璃化冻存，所述人多功能干细胞优选为人类胚胎干细胞。

具体的：

1、人多功能干细胞的慢速冷冻保存及复苏，方法如下：

以hPSCs培养液作为基液，在室温下将本发明鸡尾酒式冷冻保护剂的各组分充分混合，并搅拌均匀，得到冷冻保护液。

慢速冷冻保存的一般步骤为：(1)收集贴壁细胞，并制成细胞悬浮液；(2)加入低浓度本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂，并将1ml细胞悬浮液转入1.8ml低温冻存管；(3)将冻存管置入程序降温盒，放入－80℃冰箱，其降温速率约为－1℃/min，细胞悬浮液中形成冰晶；(4)程序降温盒在－80℃冰箱过夜后，将冻存管取出，并放入液氮中长期保存。

复温过程：(1)将冻存管从液氮中取出，37℃恒温水浴，快速晃动，使得细胞快速升温；(2)将细胞悬浮液转移至15ml离心管，加入十倍体积细胞培养液稀释清洗，之后离心去除上清夜，加入新鲜培养液轻轻吹打，最后将细胞悬浮液转入培养皿，并置入CO₂细胞培养箱进行培养。

2、人多功能干细胞的玻璃化冷冻保存及复苏，方法如下：

同样以hPSCs培养液作为基液，将本发明鸡尾酒式冷冻保护剂的各组分充分混合，并搅拌均匀，得到冷冻保护液。

玻璃化冻存步骤为：(1)收集贴壁细胞，并制成高密度细胞悬浮液；(2)加入本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂，并将细胞转入热传导率较高的微型冷冻管，一般冷冻细胞体积在10～100ul；(3)将冷冻管快速置入液氮保存。

复温过程：(1)将冻存管从液氮中取出，放入37℃的多糖溶液中，快速晃动，使得细胞快速升温；(2)将细胞悬浮液转移至培养皿，加入10ml细胞培养液；(3)将细胞悬浮液转移至15ml离心管，之后离心去除上清夜，加入新鲜培养液轻轻吹打，最后将细胞悬浮液转入培养皿，并置入CO₂细胞培养箱进行培养。

本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂具有以下有益效果：

本发明的多糖、氨基酸、多元醇和含羟基的高分子聚合物具有良好的生物相容性，高浓度时毒性也较低，利用所述配比的多糖、氨基酸、多元醇和含羟基的高分子聚合物，可以最大限度地抑制细胞内冰晶的形成，降低低温环境对所冻存细胞的损伤，提高了冻存细胞经复苏培养后的存活率，大大较低了冻存细胞的毒性。本发明通过所述简单的组合配比即能够发挥多糖、氨基酸、多元醇和含羟基的高分子聚合物等每种冷冻保护剂的最大保护优势，同时在冷冻细胞程序上并无增加。

相比现有的hPSCs细胞冷冻保护剂，本发明是一种全新的配方，大大降低了毒性较大的冷冻保护剂DMSO的使用浓度，提高了冷冻复苏率，更好地保持了hPSCs细胞的原有功能。本发明在降低冻存干细胞毒性，提高冷冻效果的同时，可大大提高多功能干细胞在组织工程、细胞移植和再生医学领域应用的安全性，具有极高的可行性和应用推广价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例提供了一种鸡尾酒式冷冻保护剂，其包括如下组分：

本实施例同时还提供了一种上述鸡尾酒式冷冻保护剂在慢速冷冻保存人类胚胎干细胞中的应用。

实施例2

本实施例提供了一种鸡尾酒式冷冻保护剂，其包括如下组分：

本实施例同时还提供了一种上述鸡尾酒式冷冻保护剂在玻璃化冻存人诱导多功能干细胞中的应用。

实施例3

本实施例提供了一种鸡尾酒式冷冻保护剂，其包括如下组分：

本实施例同时还提供了一种上述鸡尾酒式冷冻保护剂在玻璃化冻存人类胚胎干细胞中的应用。

实施例4

本实施例提供了一种鸡尾酒式冷冻保护剂，其包括如下组分：

本实施例同时还提供了一种上述鸡尾酒式冷冻保护剂在慢速冷冻保存人诱导多功能干细胞中的应用。

实施例5

本实施例提供了一种鸡尾酒式冷冻保护剂，其包括如下组分：

实施例6

本实施例提供了一种鸡尾酒式冷冻保护剂，其包括如下组分：

对比试验

以人类胚胎干细胞和人诱导多功能干细胞作为试验对象，分别将这两种细胞在添加了不同细胞冷冻保护剂的冷冻保护液中进行冻存，然后复苏，最后分别观测在不同细胞冷冻保护剂的条件下，复苏培养后的人类胚胎干细胞和人诱导多功能干细胞的存活率。

细胞毒性为本领域的公知术语，其含义为化学物质(药物)作用于细胞基本结构和/或生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构，细胞的新陈代谢过程，细胞组分或产物的合成、降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程，导致细胞存活、增殖和/或功能的紊乱所引发的不良反应。具体到本发明，所述细胞毒性即指冷冻保护剂对所冻存细胞造成的杀伤事件。本发明采用WST-1细胞存活率和细胞增殖率检测方法检测经复苏培养后的冻存细胞的细胞存活率和细胞增殖率(详见表1和2)，并以所述细胞存活率和细胞增值率为指标，来验证细胞毒性；细胞存活率和细胞增值率越高就代表细胞毒性越低，反之，则代表细胞毒性越高。

为消除试验方法和试验条件的差异所造成的试验误差，本对比试验的冻存和复苏均采用上述发明内容中的慢速冷冻保存及复苏方法。

本对比试验所用的细胞冷冻剂，除了实施例1～6中所述的鸡尾酒式冷冻保护剂外，还设置了以下对照组的细胞冷冻剂：

对照组1：该细胞冷冻保护剂的有效成分仅为DMSO。

对照组2：该细胞冷冻保护剂与实施例1的鸡尾酒式冷冻保护剂基本相同，区别仅在于：不含有多糖。

对照组3：该细胞冷冻保护剂与实施例1的鸡尾酒式冷冻保护剂基本相同，区别仅在于：不含有氨基酸。

对照组4：该细胞冷冻保护剂与实施例1的鸡尾酒式冷冻保护剂基本相同，区别仅在于：不含有多元醇。

对照组5：该细胞冷冻保护剂与实施例1的鸡尾酒式冷冻保护剂基本相同，区别仅在于：海藻糖的配比为68％(w/v)。

对照组6：该细胞冷冻保护剂与实施例1的鸡尾酒式冷冻保护剂基本相同，区别仅在于：L-脯氨酸的配比为57.5％(w/v)。

对照组7：该细胞冷冻保护剂与实施例1的鸡尾酒式冷冻保护剂基本相同，区别仅在于：丙三醇的配比为25％(v/v)。

对照组8：该细胞冷冻保护剂与实施例1的鸡尾酒式冷冻保护剂基本相同，区别仅在于：DMSO的配比为10％(v/v)。

表1:各细胞冷冻剂用于冻存细胞并经复苏培养后的细胞存活率

	人类胚胎干细胞	人诱导多功能干细胞
			实施例1	72％	75％
实施例2	70％	65％
			实施例3	68％	63％
实施例4	63％	65％
			实施例5	72％	71％
实施例6	64％	60％
			对照组1	28％	36％
对照组2	36％	40％
			对照组3	40％	32％
对照组4	37％	42％
			对照组5	15％	18％
对照组6	43％	40％
			对照组7	25％	28％
对照组8	40％	46％

表2:各细胞冷冻剂用于冻存细胞并经复苏培养后的细胞增殖率

从表1和2可以看出，使用本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂所冻存的细胞，相对于使用其他对照组所述细胞冷冻剂所冻存的细胞，前者经复苏培养后的细胞存活率和细胞增殖率均明显高于后者。由此可以得出，经本发明的鸡尾酒式冷冻保护剂所冻存的细胞，相对于经其他对照组所述细胞冷冻剂所冻存的细胞，前者的细胞毒性明显低于后者。

本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。

Claims (10)

1.一种鸡尾酒式冷冻保护剂，其特征在于，包括如下组分：

2.根据权利要求1所述的鸡尾酒式冷冻保护剂，其特征在于，包括如下组分：

3.根据权利要求1或2所述的鸡尾酒式冷冻保护剂，其特征在于，所述多糖为海藻糖或蔗糖。

4.根据权利要求1～3任一项所述的鸡尾酒式冷冻保护剂，其特征在于，所述氨基酸为L-脯氨酸、甘氨酸或谷氨酸。

5.根据权利要求1～4任一项所述的鸡尾酒式冷冻保护剂，其特征在于，所述多元醇为丙三醇、甘露醇或山梨醇。

6.根据权利要求1～5任一项所述的鸡尾酒式冷冻保护剂，其特征在于，所述含羟基的高分子聚合物为聚乙烯醇或聚乙二醇；优选分子量为9～10kDa的聚乙烯醇。

7.根据权利要求1～6任一项所述的鸡尾酒式冷冻保护剂，其特征在于，还包括如下组分中的一种或多种：

8.根据权利要求7所述的鸡尾酒式冷冻保护剂，其特征在于，所述抗氧化剂为维生素C、维生素E或卵磷脂；

和/或，所述酸碱调整剂为HEPES或者EDTA。

9.根据权利要求1-8任一项所述的鸡尾酒式冷冻保护剂，其特征在于，包括如下组分：

10.权利要求1～9任一项所述鸡尾酒式冷冻保护剂在冷冻保存人多功能干细胞中的应用。