CN106256203B - 一种干细胞冻存体系及其使用方法 - Google Patents

一种干细胞冻存体系及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种干细胞冻存体系，包括基础液、冷冻保护剂和悬浮于干细胞冻存体系中供干细胞附着的微载体，基础液包括DMEM培养基、抗生素，冷冻保护剂包括5％的DMSO、10％的乙二醇、体积分数为50％的FBS、1％‑10％的BSA和2mmol/L的谷氨酰胺。本发明具有以下优点和效果：采用DMSO和乙二醇联合作为冷冻保护剂，降低DMSO的细胞毒性，其次，再使用FBS与DMSO、乙二醇联合，提高干细胞的生存力和对DMSO的抵抗力，进一步降低DMSO对干细胞的损伤，再次，在降低DMSO使用浓度的同时采用海藻糖在干细胞外对干细胞进行保护，再次，运用微载体技术，兼具高复苏率和大量冻存的优点，达到了细胞毒性低、复苏率高、能大量冻存和降低冻存成本的效果。

Description

一种干细胞冻存体系及其使用方法
技术领域
本发明涉及干细胞保存领域，特别涉及一种干细胞冻存体系及其使用方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。它是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。但是干细胞的广泛应用还受到诸多限制，其中建立安全有效标准化的冷冻保存方案是面临的重大挑战。
公开号为CN103004751A的中国专利《一种造血干细胞冻存的方法及保护剂》公开了一种造血干细胞冻存的方法及保护剂，具体是在无菌条件下，将造血干细胞悬液或骨髓液与干细胞保护剂混合冷冻保存即可，所述的干细胞保护剂成分包括：DMSO，1640无菌培养基和血液保存液Ⅰ，三者体积比例：9-10：5：5-6。该方法能够减低造血干细胞保护剂的成本，无需程序降温仪等高造价设备，无需添加液氮的繁琐、高风险程序，操作简单，易于在各级医疗机构推广。
但是该造血干细胞冻存的方法及保护剂存在以下缺点：DMSO是一种双极性的细胞内冻存保护剂，可与细胞中的蛋白质结合，常导致细胞破坏死亡，具有一定的细胞毒性，在单独使用时会在细胞冻存后复苏时易引起干细胞凝集，会降低复苏后的细胞存活率。
发明内容
本发明的目的是提供一种干细胞冻存体系，具有低细胞毒性的效果。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种干细胞冻存体系，其特征在于：包括基础液、冷冻保护剂和悬浮于所述干细胞冻存体系中供干细胞附着的微载体，所述基础液包括DMEM培养基、抗生素，所述冷冻保护剂包括5％的DMSO、10％的乙二醇、体积分数为50％的FBS、1％-10％的BSA和2mmol/L的谷氨酰胺。
通过采用上述技术方案，本发明选用DMEM培养基和抗生素制作而成的基础液，为细胞提供养分，同时防止细菌对干细胞冷冻体系的污染。在冷冻保护剂中选用DMSO,DMSO是指二甲基亚砜，是一种含硫化合物，DMSO是一种渗透性保护剂，它穿过细胞膜后进入细胞内部形成一定的浓度，使细胞内水分不会过分外渗，避免细胞过分脱水，又能降低细胞内未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤。在渗透到细胞内时，DMSO能与细胞内具有活性的水分子进行结合，减缓水的结晶，防止细胞低温冻存损伤。但是DMSO也可与细胞内的蛋白质结合，会导致细胞破坏和死亡，因而也具有一定的细胞毒性。
为达到既能充分发挥DMSO低温保护细胞的效应又能有效降低DMSO的细胞毒性作用的效果，DMSO浓度选为5％，首先通过降低浓度来降低DMSO的细胞毒性，其次，选用同为渗透性保护剂的乙二醇，乙二醇同样也能进入细胞内，防止细胞内形成冰晶对细胞造成损伤，同时乙二醇毒性小于DMSO，选择10％的乙二醇与5％的DMSO联合作用，在低温下保护干细胞的同时也降低冷冻保护剂对细胞的毒性。
FBS是指胎牛血清，在干细胞冻存体系中，FBS含有丰富的细胞生长必需的营养成分，是干细胞附着于微载体上所需因子的来源，另外，FSB还具有酸碱缓冲液的作用，能对干细胞冻存体系中的PH变化进行缓冲。体积分数为50％的FBS与5％的DMSO、10％的乙二醇联合作用，提高了干细胞对DMSO的耐受力,进一步降低DMSO的细胞毒性，有效提高干细胞冻存体系中干细胞的复苏率。
在干细胞冻存过程中，细胞形态对冻存后复苏率有着重要影响。当细胞在冻存体系中处于悬浮状态时，即处于不贴壁的状态，在冻存过程中干细胞克隆的内部会出现大量细胞死亡或损伤，这是细胞悬浮克隆复苏率低的主要原因。而在冻存过程中干细胞如果处于贴壁状态，由于细胞之间存在连接和信号传导，会显著增强干细胞的生存力和复苏率。虽然细胞贴壁后会增强细胞生存力和提高复苏率，但是存在一个主要的缺点就是受限于培养容器的内壁表面积，无法大量冻存细胞。针对上述两种方法的优缺点进行比较后，本发明采用在冻存体系中加入微载体，本发明将细胞培养中的微载体技术运用到细胞冻存体系中，使干细胞冻存体系中的干细胞既能附着于微载体表面进行贴壁连接，又能随微载体悬浮于干细胞冻存体系中摆脱容器内壁表面积的限制，兼具大量冻存和高复苏率的优点，同时还具有抑制干细胞分化的作用。
为使干细胞贴合于微载体表面，除了FBS中包含的生长因子能促进干细胞贴壁外，还能提供结合蛋白，另外再加入BSA，与FBS联合作用，促进干细胞与微载体之间、干细胞与干细胞之间的连接，进一步提高干细胞的复苏率。
本发明的进一步设置为：所述干细胞冷冻体系还包括ROCK抑制剂Y-27632。
通过采用上述技术方案，ROCK抑制剂是一类丝、苏氨酸蛋白激酶，能调节细胞分裂周期、分化和凋亡，提高干细胞在干细胞冻存体系中的存活率和复苏率。在干细胞冻存体系中加入ROCK抑制剂Y-27632后，使干细胞在微载体上的粘附能力更强，同时与DMSO、乙二醇联合作用，在维持干细胞全能性或多能性的同时，增加干细胞的生存力和复苏率，达到抑制干细胞分化、生存力强、复苏率高的优点。
本发明的进一步设置为：所述冷冻保护剂还包括0.1mmol/L的海藻糖。
通过采用上述技术方案，海藻糖是一种安全可靠的生物糖类，海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，对低温下的干细胞起到保护作用，其次，海藻糖作为一种非渗透性保护剂，与渗透性保护剂DMSO、乙二醇联合作用，DMSO和乙二醇通过渗透进入细胞内部对细胞进行保护，而非渗透性保护剂海藻糖则在细胞表面形成粘性透明保护壳，保护干细胞的正常形态，避免在低温下收到损伤，由于海藻糖是安全无细胞毒性，所以加入海藻糖在保护干细胞的同时降低冷冻保护剂的细胞毒性；再次，海藻糖还能与干细胞细胞膜磷脂中的磷酸基团结合成稳定质膜结构，保护细胞膜的正常形态，使干细胞能粘附与微载体表面，达到降低细胞毒性、保护干细胞正常形态、促进干细胞的连接和附着能力。
本发明的进一步设置为：所述微载体为Cytodex3、Cytopore和Cytoline中的一种。
通过采用上述技术方案，三种微载体均为商品化的微载体，可通过商购直接获取，不需要单独为干细胞冻存体系制备微载体，降低干细胞冻存体系制造成本。
本发明的进一步设置为：所述抗生素包括100U/mL的青霉素和100U/mL的链霉素。
通过采用上述技术方案，青霉素是抗菌素的一种，是指分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。链霉素是一种氨基酸糖苷类药，经主动转运通过细菌细胞膜后，抑制蛋白质合成使RNA发生读错，导致无功能蛋白的合成，使多聚核糖体分裂失去合成蛋白的功能，使大量氨基核苷类进入菌体，细菌细胞膜断裂，导致细菌细胞死亡。通过青霉素抑制细菌繁殖，链霉素进行杀菌，两者起到协同抗菌的作用。
本发明的另一个目的是提供一种干细胞冻存体系的使用方法。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：发明的进一步设置为：一种上述干细胞冷冻体系的使用方法，a)按配方量配置基础液和冷冻保护剂后混合均匀，得到冷冻液a；b)从培养基中分离出附着有干细胞的微载体，将微载体加入到冷冻液a中，得到冷冻液b；c)将冷冻液放置于-80℃下处理12小时以上，得到冷冻液c)；d)将冷冻液c放入液氮中保存。
通过采用上述技术方案，将基础液和冷冻剂进行混合均匀，将微载体放入干细胞的生长培养基进行培养和附着，然后吸弃生长培养基后，将附着有干细胞的微载体放入到冷冻液a中，其次采用二级预冷进行冷冻，先在-80℃下处理12个小时以上，再放入液氮中长期保存。干细胞冻存体系中的乙二醇能形成玻璃化的状态，防止冰晶的形成而造成对细胞的损伤。现有技术中有程序性降温会用到费用昂贵的专用设备，相比于现有技术中程序性降温法，本发明的操作简便快捷，易操作，降低干细胞冻存成本。
综上所述，本发明具有以下有益效果：采用DMSO和乙二醇联合作为冷冻保护剂，降低DMSO的细胞毒性，其次，再使用FBS与DMSO、乙二醇联合，模拟出干细胞在体内所处的内环境，提高干细胞的生存力和对DMSO的抵抗力，进一步降低DMSO对干细胞的损伤，再次，在降低DMSO使用浓度的同时采用非渗透性保护剂海藻糖在干细胞外对干细胞进行保护，保证干细胞的复苏率，降低冷冻保护剂的细胞毒性，再次，通过将细胞培养中的微载体技术运用至干细胞冻存体系中，兼具高复苏率和大量冻存的优点，达到了细胞毒性低、复苏率高、能大量冻存和降低冻存成本的效果。
具体实施方式
具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
实施例1：一种干细胞冻存体系的使用方法，a)配制基础液和冷冻保护剂，干细胞冻存体系包括基础液和冷冻保护剂，基础液选用商购的DMEM培养基，加入100U/ml的青霉素和100U/ml的链霉素组成。冷冻保护剂按以下表1中所列出的组分和比例进行配制，将配制好的基础液和冷冻保护剂混合均匀，得到冷冻液a；b)兔是一种重要的实验动物，在生理上比小鼠更加接近人，而且其干细胞体积较大，易于实验操作。可选用购买的兔体外受精胚制备胚胎干细胞系，也可以从商业渠道直接购买兔的胚胎干细胞。按10％的FBS和90％的DMEM高糖培养基进行配制，加入2mmol/L的谷氨酰胺、1％的非必需氨基酸和0.1mmol/L的β-疏基乙醇溶液，商购Cytodex3微载体，加入到生产培养基内进行培养，使兔的胚胎干细胞附着于Cytodex3微载体进行生长，培养5天后吸弃生长培养基，分离出带有兔胚胎干细胞的Cytodex3微载体后加入到步骤a得到的冷冻液a中，得到冷冻液b；c)将冷冻液b放入-80℃的冰箱中保存12小时，得到冷冻液c；d)将得到的冷冻液c放入液氮中进行保存。
干细胞的复苏，将自液氮中取出的干细胞冷冻液置于40℃的水浴中快速解冻，转入含有10％血清的培养基中，离心5分钟洗去干细胞冷冻体系，将细胞接种于准备好的饲养层上培养。
细胞复苏后存活率试验：干细胞的存活和复苏需从两个方面评估，首先是细胞的存活率，其次是在存活的情况下保持干细胞的干性。复苏后取出部分细胞，用台盼蓝染色和计数，得到细胞存活率。再取出部分细胞接种到饲养层上，培养5天后观察细胞集落形态，计算出集落分化率。在观察细胞集落形态时，如果集落较紧且立体感强，则为未分化；如果集落形态较大而扁平，集落松散，则为分化细胞。将得到的数据采用SPSS10.0软件，百分率经平方根的反正弦转换，通过单因素方差分析和最小显著差数法比较数据之间的显著性差异(P＜0.05)。并将结果在表1中列出。
实施例2：一种干细胞冻存体系的使用方法，与实施例1的不同之处在于，微载体为Cytopore，并进行细胞复苏后存活率试验，并在表1中列出试验结果。
实施例3：一种干细胞冻存体系的使用方法，与实施例1的不同之处在于，微载体为Cytoline，并进行细胞复苏后存活率试验，并在表1中列出试验结果。
实施例4：一种干细胞冻存体系的使用方法，与实施例1的不同之处在于，冷冻保护剂的各组分按以下表1中所列的组分进行配制，并进行细胞复苏后存活率试验，并在表1中列出试验结果。
实施例5：一种干细胞冻存体系的使用方法，与实施例1的不同之处在于，冷冻保护剂的各组分按以下表1中所列的组分进行配制，并进行细胞复苏后存活率试验，并在表1中列出试验结果。
对比例1：一种干细胞冻存体系的使用方法，与实施例1的不同之处在于，冷冻保护剂的各组分按以下表1中所列的组分进行配制，并进行细胞复苏后存活率试验，并在表1中列出试验结果。
对比例2：一种干细胞冻存体系的使用方法，与实施例1的不同之处在于，冷冻保护剂的各组分按以下表1中所列的组分进行配制，并进行细胞复苏后存活率试验，并在表1中列出试验结果。
对比例3：一种干细胞冻存体系的使用方法，与实施例1的不同之处在于，冷冻保护剂的各组分按以下表1中所列的组分进行配制，并进行细胞复苏后存活率试验，并在表1中列出试验结果。
对比例4：一种干细胞冻存体系的使用方法，与实施例1的不同之处在于，冷冻保护剂的各组分按以下表1中所列的组分进行配制，并进行细胞复苏后存活率试验，并在表1中列出试验结果。
对比例5：一种干细胞冻存体系的使用方法，与实施例1的不同之处在于，冷冻保护剂的各组分按以下表1中所列的组分进行配制，其中不含有微载体，直接将干细胞制成细胞悬液加入到冷冻液a中，并进行细胞复苏后存活率试验，并在表1中列出试验结果。
对比例6：一种干细胞冻存体系的使用方法，与实施例1的不同之处在于，冷冻保护剂的各组分按以下表1中所列的组分进行配制，其中不含有微载体，直接将干细胞制成细胞悬液加入到冷冻液a中，并进行细胞复苏后存活率试验，并在表1中列出试验结果。
对比例7：一种干细胞冻存体系的使用方法，与实施例1的不同之处在于，冷冻保护剂的各组分按以下表1中所列的组分进行配制，其中不含有微载体，直接将干细胞制成细胞悬液加入到冷冻液a中，并进行细胞复苏后存活率试验，并在表1中列出试验结果。
表1

Claims (5)

1.一种干细胞冻存体系，其特征在于：包括基础液、冷冻保护剂和悬浮于所述干细胞冻存体系中供干细胞附着的微载体，所述基础液包括DMEM培养基、抗生素，所述冷冻保护剂包括5％的DMSO、10％的乙二醇、体积分数为50％的FBS、1％-10％的BSA和2mmol/L的谷氨酰胺；所述冷冻保护剂还包括0.1mmol/L的海藻糖。
2.根据权利要求1所述的一种干细胞冻存体系，其特征在于：所述干细胞冷冻体系还包括ROCK抑制剂Y-27632。
3.根据权利要求2所述的一种干细胞冻存体系，其特征在于：所述微载体为Cytodex3、Cytopore和Cytoline中的一种。
4.根据权利要求3所述的一种干细胞冻存体系，其特征在于：所述抗生素包括100U/mL的青霉素和100U/mL的链霉素。
5.一种用权利要求1所述的干细胞冷冻体系的使用方法，其特征在于：
a)按配方量配置基础液和冷冻保护剂后混合均匀，得到冷冻液a；
b)从培养基中分离出附着有干细胞的微载体，将微载体加入到冷冻液a中，得到冷冻液b；
c)将冷冻液放置于-80℃下处理12小时以上，得到冷冻液c；
d)将冷冻液c放入液氮中保存。
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