CN101203233A - 治疗与不孕症相关的氧化应激的n-乙酰半胱氨酸酰胺（nac酰胺） - Google Patents

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Abstract

一种含有N－乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)的体外培养和/或受精培养基，所述培养基能够减少或预防氧化应激和自由基形成所导致的体外培养、受精和维持的精子、卵母细胞和胚胎的细胞损伤和最终死亡。用于体外培养和受精的含有NAC酰胺的培养基组合物适用于卵母细胞的培养、早期胚胎的培养和发育、精子的制备或培养，以及卵母细胞或精子的预处理。含有NAC酰胺的组合物能够支持有活力的胚胎生长直到胚泡期。

Description

治疗与不孕症相关的氧化应激的N-乙酰半胱氨酸酰胺（NAC酰胺）
发明领域
本发明涉及使用抗氧化剂来减少导致卵母细胞质量、受精及胚胎存活力下降的氧化应激，以促进其体内和体外的存活率并改善精子、卵母细胞和胚胎的功能。
发明背景
自然情况下，受精是通过将精细胞置于热血动物种类(包括人类)雌性动物体内，其随后与卵母细胞结合并融合而发生的。受精的卵母细胞随后分裂形成胚胎。近几十年来，运用辅助生殖技术使得科学家和临床医生可以干预受精事件，治疗一些低生育力的个体或储存精液、卵母细胞或胚胎以用于不同的场合或时间。
在辅助生殖的情况下运用的操作包括洗涤精子样本以从非精液成份(如精液浆或碎片)中分离出富含精子的部分；进一步从无活力的精液或精液的白细胞中分离健康的、能动的(游动)精子；冰冻或冷藏精子(储存)以稍后使用或运至雌性的不同位置；扩散或稀释精子进行培养用于诊断试验或用于介入治疗(例如体外受精(IVF)或胞质内精子注射技术(ICSI))；培养或冷冻来自雌性动物的卵母细胞用于体外受精；以及在植入雌性动物以建立妊娠前培养或冷冻胚胎。
该方法的每一步骤中，体外介入都减少了精子、卵母细胞和胚胎的正常存活力和功能。已经有大量研究旨在改善这些过程，不过，鲜有完全成功的。例如，IVF(体外受精)术的婴儿出生率低于20％。此外，通常只有一半或更少的精子细胞在冷冻过程中存活，这使得来自供体的冷冻精子的妊娠率平均在10％与20％之间。卵母细胞和胚胎也在培养或冷冻后表现出明显的功能受损。特别是人的卵母细胞经冷冻过程后存活水平很低。因此，虽然有数十年的工作，但辅助生殖技术领域仍有很多改善空间，特别是在配对和胚胎处理、培养及储存方面。
用于精子收集的一个常用步骤是精子的洗涤。由于多种原因，在辅助生殖技术运用前洗涤精子是很重要的。精液浆除了含有精子外，还有在样本中含有可能对精子有毒的糖和蛋白。而且，冻结的精液样本中含有深低温保藏培养基，在一些种类的雌性动物(特别是鸟类和人类)受精前必须从精子中洗掉。对所有种类而言，深低温保藏培养基融化后引起脂质膜过氧化作用(LPO)和精子的退化。一般来说，洗涤包括精液样本的离心或通过经稀释的洗涤培养基融化精液，这样可以收集富集精子的沉淀物。尽管是一个非常常用的步骤，但离心本身可导致精液的脂质过氧化作用和膜破裂。
精液洗涤过程后，或可替代的，可从样本中用一种特殊步骤来分离活动精子。精液样本包含无活力的和垂死的精子，这些精子释放可对有活力的、活动精子造成损害的酶。此外，样本包含白细胞、红细胞和对健康精子也有毒性的细菌。精子的分离涉及分离有活力的、健康的和活动的精子用于诊断或治疗步骤。通常，精液的分离是通过使活动精子从无活力的精子和碎片中游走(精液上游(swim-up)法)、通过密度梯度离心精液或通过将精液穿过可结合无活力的精子和碎片的柱子来进行。这些技术的每一种都有其自身的缺点。上游法只能回收少量精子，并且需要的培养期长。通用的梯度离心试剂一般对精子有毒，这使得必需额外的洗涤步骤以从精液样本中去除梯度溶液。柱法对活动精子的选择性弱，并且有时回收率不高。
一旦精液被洗涤或分离，就可将其扩散(或稀释)于培养或把持培养基中。现存的精液培养技术导致活动精子的降低并且随着培养时间的推移损害精子的DNA。虽然在大多数种类的雌性动物中精子存活数日，但培养中的精子通常只能存活体内所见的一半长。质量差的精子甚至在培养时存活的时间更短。大多数这类损伤是由于膜和DNA的脂质过氧化作用或染色质的断裂造成的。精子在培养基中扩散用于精子分析和诊断试验；辅助生殖技术，如IVF、输卵管内配子移植术、雌性动物的受精、ICSI；和深低温保藏前的保存。这些扩散或稀释精子的每一种用法都需要组成多少有些不同的基础培养基，不过，除在雌性动物生殖道外，在所有情况下精子的存活率都是次于最佳的。
同样的，与体内条件相比，卵母细胞和胚胎常常在培养过程中异常发育(如染色体数、细胞骨架结构)。此外，目前的培养方法使用了大量的动物性蛋白，例如血清，这可能导致胎儿过大及子代的围产期并发症。
精子、卵母细胞和胚胎与细胞滋养层的共培养可克服辅助生殖技术中的部分困难。不过，共培养的质量不定、可靠性不定并且增加了病原体从饲养细胞传递到配子或胚胎的危险，这将传回给活体动物或人类。
精子、卵母细胞和胚胎的储藏在商业化的动物育种程序、人类受精和精子供体程序及一些疾病期的处理中具有广泛的重要性。例如，已经被诊断为癌症或其他可最终妨碍精子产生疾病的男子的精子样本可被冷冻。精子的冻结和储藏在濒危物种的保存方面是很关键的。许多这种物种有精液而在现存方法下未很好冻结。在标准的畜牧业中，85％的农场奶牛是用冻结的牛精液进行人工受精(AI)。由于大多数商品化的火鸡变得太重而不能自然交配，所以几乎所有的火鸡农场必需AI。在美国每周大约有六百万母火鸡被受精。不过，目前储存收集的火鸡精液的方法甚至不能支持精子存活过在农场间运送精液所必需的数小时，更不能长期冷冻。这局限了储藏或运输遗传物质进行生产的能力。人类供体AI也用于具有严重的男性不育症的夫妇，然而，用供体精液的怀孕几率只有自然生殖所出现的四分之一。而且，手术法受精可能是必需的。
冷冻来自所有物种的精液的通用技术导致膜损伤和随后样本中大约一半的精细胞死亡。多数这种损伤是通过活性氧中间体引起精子膜的脂质过氧化作用而出现的。尽管有这些普遍而严重的问题，该领域的技术水平和方法在过去15年很少变化。考虑到为了多种需要而冷冻精子的用处越来越多，培养、冷冻或储藏精液的新的方法和条件将有益于动物生产，也会对人类生育专家提供便利。
冷冻卵母细胞和胚胎对于保存将要绝种的物种的遗传物质、从有价值的家畜中繁殖子代产物或对于不能生育的夫妇在转移前保留胚胎也是重要的。目前冷冻卵母细胞和胚胎的方法决不是最佳的，通常发育潜力降低。实际上，人类卵母细胞被冷冻成功的很少，因此需要植入多个胚胎到女性子宫中，这增加了高危的多胎妊娠的危险数。此外，来自所有物种的IVF胚胎或遗传上改变的胚胎(例如那些基因治疗后获得的胚胎)，在目前的冷冻剂中具有很低的冻结后存活率。这包括被无性繁殖的胚胎和得自胚胎干细胞(ESC)的胚胎。
体外受精以及胚胎转移包括卵母细胞和精子的体外受精，及随后将发育的胚胎移植入雌性体内。自从1978年Edwards等在英国首次报道体外受精的人出生后，由于生殖技术的最新进展，该方法已经快速并广泛地用于世界各地，例如，在日本，体外受精现在是一种必不可少的治疗不育的方法。尽管体外受精技术和方法有了最新进展，但实际上仅少数几例导致了怀孕。虽然一种原因可能是由于不育的雄性病人中受精能力低，但是移植的卵母细胞较低的移植率似乎是一个主要原因。(Mori，Munehide等，Nippon sankahujinkagakukai zashi，45：397，(1993)；Cohen，J.等，关于体外受精和供选的辅助生殖技术的第8次世界大会，京都，9月，12-15(1993)，世界联合报道(1991))。
除技术因素之外，培养期间胚胎质量下降看起来是造成这种较低移植率的原因。(Inoue，Masahito，Rinsho fujinka sanka，48：148，(1994))。因为哺乳动物卵母细胞不具备与爬行动物和禽类的白蛋白相应的物质，卵母细胞中储备的营养量天生就少。因此，体外受精的胚胎早期，培养基中的营养素必须通过透明带来吸收。化学成本确定的培养液，例如常规的用于体外受精技术的Ham’s F-10培养基、MEM(最低基础培养基)、Dulbecco’s MEM等等，最初都不是用来辅助体外受精的。不过，这些培养基，或经改良的类似物，常用于组织培养；因此他们对于体外培养的早期胚胎所需营养素并不一定是最佳的。
人输卵管液(HTF)培养基已经被发展成为一种适合的含有营养物的培养基用于人体外受精。HTF培养基包括一种组合物，其接近于人输卵管液的电解质组合物(Quinn，P.J.5等，生育力和不育，44：493(1982))。该培养基可从市场上购买，并且典型地代替了先前使用的Ham F-10培养基。然而，由于HTF培养基仅含有作为主要组分的电解质和作为能量来源的葡萄糖，显示不出该培养基对以含氨基酸作为营养组分的Ham F-10培养基上的改进。实际上，尽管利用了HTF培养基，胚胎的移植率并未获提高，并且胚胎质量的改良仍未获改善。
为了补偿这种缺点，采用了一种方法，其中通过加入经热处理失活的雌性血清到培养基中来维持培养的胚胎。除了蛋白质、碳水化合物、脂质、维生素和矿物质之外，该血清含有生长因子等作为营养物，这些是动物细胞培养中的基本要素。不过，已有报道，这种血清在体外受精胚--胎转移过程中不一定需要(Menezo，Y等，生育和不育，42：750(1984))。的确，胚胎生长甚至可能被加入的雌性血清所抑制(Mehita等，生殖生物学15，43：600(1990))。而且，由于血清本身难以收集且存在被病毒等污染的危险，所以雌性血清不适合用作体外受精的卵母细胞的培养基添加剂。
已经报道了自由基对胚胎具有显著的生长抑制作用。这是基于这样的理论，即所培养胚胎的生长由于体外的氧气与体内相比更直接接触细胞而受氧化应激的抑制(Whitten，W.，生物科学进展，6：129(1971)；Quinn，PJ.等，试验动物学杂志，206：73(1978))。因此，氧化应激的预防可以提高胚胎的生长。特定的组分，例如过氧化物歧化酶(SOD)、乙二胺四乙酸(EDTA)等已经被加入到培养基中试图克服氧化应激的影响(Abramczuk，J等，发育生物学，61：378(1977)；25 Nonozaki，T等，辅助生殖和遗传学杂志，第9卷：274(1992))。此外，也有报道采用输卵管的上皮细胞(其有效组分未知)进行的共同培养对于胚胎生长是有效的(Xu，K.P等，生殖和生育杂志，94：33(1992))，并且生长因子如胰岛素样生长因子直接刺激胚胎生长(Matui，Motozumi等，Honyudoubutu ranshigakkaishi，11：132(19949)。然而，也已经报道了所述共培养最多对于培养基的解毒有效，并且没有可用的证据表明胚胎获得了适当的营养物(Bavister，B.D.，人类的生殖，7：1339(1992))。无论如何，用于体外受精的最常规培养基以及用于加入添加剂到现有培养基的方法包括加入过氧化物歧化酶、EDTA等，仅局部预防了体外的生长停止。此外，已报道的培养基类型非常不便于处理，这是因为在胚胎的实际培养期间，对胚胎生长阶段最佳的培养基，在每个阶段都必须经适当的挑选和调换。
相应的，体外受精领域的需求是这样的，即培养的卵母细胞、精子和胚胎需要一种培养基和环境，其中不含有病毒污染物而含有在体外培养条件下尽可能长的维持这些细胞的活力和功能的营养物以及成分。这种培养基应当避免伤害精子和卵母细胞细胞以及发育的胚胎，通过预防或减小氧化应激以及培养物中在细胞内和周围形成的自由基。培养基也应当在体外受精的胚胎转移过程期间适于处理和/或预处理精子和卵母细胞，以及用于生长的早期胚胎。理想的培养基是安全的并可以维持早期胚胎的所有生长阶段。
本领域需要的是新的化合物和方法，用于安全地补充培养和培养基以及生育产品，以维护卵母细胞和精子的活力。也需要用于体外受精的培养基中的化合物和方法，以便在受精前后提供合适的条件使卵母细胞和精子存活及成熟，使所得胚胎正确和健康的发育。
发明简述
本发明提供了使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸酰胺(即2-乙酰氨基-3-巯基丙酰胺(N-acetylcysteine amide))(NAC酰胺)或其生理学上可接受的衍生物作为在卵母细胞成熟和受精期间的孵育和培养的培养基中的补充物，并且在体外受精和随后的早期植入前胚胎发育后作为胚胎培养的孵育和培养的培养基的补充物。NAC酰胺用在改善生殖细胞(精子和卵母细胞)、胚胎和体内及体外形成的受精卵的活力和功能的方法和组合物中。
本发明提供了一种组合物、制剂或药剂，其包括NAC酰胺，或生理学上可接受的盐或其酯，其对精子、卵母细胞或胚胎无害，并且在体外处理和操作期间，还改善了他们的功能和存活率。含有NAC酰胺的组合物改善了精子和卵母细胞的功能，为试图自然怀孕的夫妇使用，也用于人和动物的多种辅助生殖技术中。本发明还提供了其它相关优点。
本发明一方面提供了一种方法，通过使用包括或添加NAC酰胺或生理学上可接受的衍生物或盐或其酯的培养基，增加体外受精技术期间精子和卵母细胞的受精率。补充有NAC酰胺的培养基也被用于提高哺乳动物胚胎的受精率。
本发明另一方面提供了NAC酰胺，用作培养基中的一种成分，用于卵和/或精子成熟、精子和卵母细胞之间的受精以及胚胎和受精卵的发育。胚胎移植前，在移植培养基中存在的NAC酰胺可以通过减少培养期间可能出现的自由基和氧化伤害而增加胚胎的形成、存活和发育。
与前一方面相关的另一方面，本发明提供了NAC酰胺与另一组分或因子联用，例如，粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)，用于增加活力以及胚胎发育到胚泡期并超越该阶段的成功率。
另一方面，本发明提供了NAC酰胺，用于涉及产生和维持转基因动物胚胎和卵的方法和组合物中。根据这一方面，供给转基因动物的卵和胚胎的NAC酰胺将改善在体外以及体内培养期间转基因生物的完全发育率。
在该方面的另一方面，本发明提供了包括NAC酰胺的方法和组合物，以养育和支持干细胞或其它的生殖细胞移植到动物内，包括人，也支持在体外和体内的细胞生长和克隆。
本发明的另一方面提供了一种生理学上或药学上可接受的组合物或药剂，其包括NAC酰胺，用于当胚胎移植入子宫后被雌性体摄取，以便提供一种抗氧化剂来预防或减少植入后的氧化应激症状。
本发明的另一方面提供了一种生理学上或药学上可接受的组合物或药剂，其包括NAC酰胺，用于被雄性体摄取，以便提供一种抗氧化剂使健康的精子发育，减少自由基或氧化应激对精子产生和发育以及整个生育力的副作用。
本发明的再一方面提供了一种药学上可接受的组合物，包括NAC酰胺，或生理学上可接受的衍生物或盐或其酯，以预防、减少、抵消或减轻与动物包括人中的伴随不育的氧化应激。
在另一方面，本发明提供了一种药学上可接受的组合物，包括NAC酰胺，或生理学上可接受的衍生物或盐或其酯，以预防、减少、抵消或减轻血红素加氧酶和胆红素过量而引起的氧化应激，其对早产新生儿的存活和发育的影响不利。
在另一方面，本发明提供了一种不杀精子的润滑剂以增加动物的受精潜力。该润滑剂包括NAC酰胺，或生理学上可接受的衍生物或盐或其酯，以及不杀精子的润滑化合物。该润滑化合物可以包括丙三醇、甲基纤维素、丙二醇、植物油或凡士林，或丙三醇和凡士林的组合物，或聚氧化乙烯、羧基聚亚甲基钠和对羟基苯甲酸甲酯的组合物。该润滑剂可以通过在性交或人工受精前给药或放置到阴道内而在体内使用，或者在采集精液期间使用，例如在射精到容器前通过将该润滑剂涂到雄性的性器官，或者将精子采集到含有润滑剂的容器中。润滑剂也可以在生殖手术前用于润滑医疗器具中。
本发明提供的其它方面、特征和优点将从下文的详述和实例中显示。
发明详述
本发明涉及用一种有效的抗氧化剂谷胱甘肽N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)，或生理学上或药学上可接受的衍生物或盐或其酯，作为用于体外受精的培养基组合物中的补充物。这种补充有NAC酰胺的培养基尤其适用于培养卵母细胞、精子、早期的胚胎(受精的卵母细胞)，或者在受精前预处理卵母细胞或精子。包含NAC酰胺例如水溶性NAC酰胺的组合物，也可以在依照本发明加入培养基前进行配制和浓缩。浓缩药剂在被加入培养基时或在加入培养基前进行稀释。NAC酰胺或含有NAC酰胺或其生理学上可接受的盐或酯的药剂可有效地用于刺激早期胚胎的生长以及质量的稳定，并且适合于在体外培养和成功发育早期的胚胎。
谷胱甘肽N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)，N-乙酰半胱氨酸(NAC)的酰胺形式是一种新的低分子量硫醇抗氧化剂和Cu2+螯合剂。NAC酰胺作为自由基的净化剂对细胞伤害提供了保护作用。在哺乳动物的红细胞(RBC)中，已经表明NAC酰胺抑制叔-丁基羟基过氧化物(BuOOH)诱导的细胞内氧化，并延缓RBC中BuOOH诱导的硫醇耗竭和血红蛋白氧化。通过外部应用NAC酰胺而恢复硫醇耗竭的RBC的作用明显地大于采用NAC时的作用。不象NAC，NAC酰胺使血红蛋白免受氧化。(L.Grinberg等，自由基生物药.，2005年1月1日，38(1)：136-45)。在无细胞的系统中，NAC酰胺表现出与氧化型谷胱甘肽(GSSG)反应以产生还原型谷胱甘肽(GSH)。NAC酰胺很容易透过细胞膜，补充细胞内的GSH，并且通过参与到细胞的氧化还原系统中而保护细胞免受氧化。由于其中性的羧基，NAC酰胺具有增强的亲脂性和细胞渗透性。(例如D.Atlas等的美国专利No.5,874,468)。NAC酰胺在跨越细胞膜以及血脑屏障时也优于NAC和GSH。
NAC酰胺可在许多重要的生物现象中直接或间接发挥作用，包括蛋白质和DNA的合成、运输、酶活性、新陈代谢，并保护细胞不受自由基介导的伤害。NAC酰胺是一种有效的细胞抗氧化剂，负责维持细胞内适当的氧化态。NAC酰胺被大多数细胞合成，并且可以将被氧化的生物分子再利用回到其活性的还原型。作为一种抗氧化剂，NAC酰胺即使不比GSH更有效，也是一样有效的。
在本发明的一个实施方案中，一种方法被用来通过将NAC酰胺补充到卵母细胞培养基(实施例1)，以增加配子特别是卵母细胞中GSH的细胞内浓度。需要理解的是，NAC酰胺可以是添加在培养基的组合物、制剂或药剂中。NAC酰胺，以及生理学上可接受的衍生物、盐或其酯，适用于本发明的用途。NAC酰胺也是水溶性的。NAC酰胺可以增加谷胱甘肽的细胞内浓度是本发明的一个优点，由于细胞内谷胱甘肽浓度的增加可以减少氧化应激，并因此增强受精过程以及早期的胚胎发育。根据本发明，NAC酰胺补充给药的功能是减少氧化应激，从而减少氧化应激导致的卵母细胞质量降低、受精力降低以及体外系统中的胚胎活力降低。
术语“胚胎”指生物体包括人和非人的哺乳动物发育的早期，在受精后直到胚泡期。胚胎的特征在于具有未分化的全能细胞。相反，个体的体细胞为分化的机体细胞，不是全能的。
在另一实施方案中，本发明包含了一种培养基组合物，包括NAC酰胺，或生理学上可接受的盐或其酯，用于体外受精，尤其是用于卵母细胞(卵)或早期的胚胎(已受精的卵母细胞)的培养，或预处理卵母细胞或精子。尤其是，培养基组合物对于刺激早期胚胎的生长和质量稳定是有效的，并且适于体外培养早期胚胎。
在另一实施方案中，本发明包括一种提高精子功能的方法，其中精子使卵母细胞受精的能力增强。此功能可以通过许多可测量的细胞功能进行检测。这种可检测的功能包括精子活动力、精子成活力、精子的膜完整性、体外受精、精子染色体稳定性、培养存活时间、精子宫颈液接触试验，以及精子穿透检测和半合子检测。精子在接触到组合物或方法后功能增强，与对照组相比(即，不包括PCAGH进行的检测)，如果采用PCAGH时，它们明显进行的更好(p＜0.05)。对可用于评价精子功能的各种有代表性的检测方法，在J.E.Ellington等的美国专利No.6,539,309中公开描述，如本文实施例1所示。
在受精前、受精中或受精后，将NAC酰胺配制到润滑剂内以减少氧化应激和自由基形成的实施方案中，润滑剂的基础是不杀精子的润滑化合物。所述润滑剂包括凡士林、植物油、甘油、聚卡波非、羟基乙基纤维素、甲基纤维素、硅油、卡波姆(例如，卡波姆934)、藻酸盐、对羟基苯甲酸甲酯、棕榈油、可可油、芦荟、其它的植物油、藻酸丙二醇、unibase(Warner-25 Chilcott)、矿物油，以及聚环氧乙烷、羧基聚亚甲基钠和对羟基苯甲酸甲酯的组合物等。例如，具有50％凡士林/50％甘油的基础润滑剂是适合的。附加的成分，例如pH稳定剂和抗氧化剂可以添加。优选加入氢氧化钠使pH为7.4。其它的pH稳定剂包括EDTA或两性离子缓冲液(例如，TES、PIPES、MOPS、HEPES)。其它的抗氧化剂或自由基清除剂，例如，维生素E是可以添加的。在某些实施例中，可以加入硅油或聚乙烯醇。
润滑剂优选为不刺激的并且容易使用的。其形式可以为凝胶、泡沫、霜、胶状物、栓剂等(参见Kazrmiroski的US专利No.4,384,003)。润滑剂可以包装在试剂盒中，其含有润滑剂和涂药器，用于阴道的应用，例如，在性交或人工受精期间使用。在通过各种方式从精子捐赠人收集精子期间也可以使用。此外，润滑剂可用于各种辅助生殖技术和诊断过程中。例如，润滑剂可以用于涂覆导尿管，插入到膀胱以用于退行性精子收集。在进行胚胎转移、人工受精或诊断方法例如内窥镜检查法、X放射线照相术或活组织检查前，它可以被用于润滑导尿管、吸液管或指针。润滑剂可以用在任何动物物种中，用于精子收集、性交、辅助生殖技术等。动物包括但不局限于人、牛、马、犬、绵羊、鸟类、猫，以及各种外来的或稀有的物种(例如，大象、狮子、犀牛)。
在本发明的另一实施方案中，提供了一种用于扩散精子(例如，稀释或悬浮精子)以获得功能改善的精子的方法。精子的功能改善指的是精子使卵母细胞受精的可能性提高。这种可能性可以通过运动性、成活力、存活时间、膜稳定性、脂质过氧化的损伤水平、染色体稳定性、粘液渗透、卵母细胞受精或随后的胚胎发育等来评价，如实施例2中所描述的。类似地，卵母细胞的功能改善指的是卵母细胞被精子受精的可能性提高，随后是正常发育。胚胎的功能改善指的是正常发育和生产后代的可能性提高。通过估计染色体数目、细胞数目、细胞骨架形成和代谢活动来评价卵母细胞和胚胎的这种可能性。功能改善也可以指通过不同的测定方法来评价，与适当的对照相比，由于培养基或润滑剂中存在NAC酰胺使精子、卵母细胞或胚胎的性能、活力和存活率提高。
扩散的精子通常在分离或清洗之后再悬浮成精子小球，以便稀释精液样本、稀释精子培养物等。以这种方式，精子被置于培养基中，或含有NAC酰胺的培养基中，适于多种操作包括如这里所述的培养、受精、受精可能性的检测、体外受精、冷冻、子宫内受精、宫颈套受精等。精子可被加入到培养基中，或者培养基可被加入到精子中。
在其它实施例中，本发明包括用于培养扩散精子以提高其在大约室温(例如，20℃)到体温(例如，37℃或39℃)的温度范围内进行保存或培养时存活率的方法。这包括在毒性筛选试验中培养精子，并保存精子，以通过流式细胞仪分选含有X和Y染色体的部分来产生有性别的后代。此外，精子扩散培养基被用于制备精子，以便直接受精、深低温保藏，对于胞质内精子注射技术(ICSI)，需要一种更粘的培养基以减慢游动精子，使其被移液管拾取而注射入卵中。样本培养基包括但不局限于平衡盐溶液，它可以含有两性离子缓冲液，例如TES、HEPES、PIPES；其它的缓冲液，例如碳酸氢钠；TALP或HTF。附加成分可以包括大分子，例如，白蛋白、输卵管素、凝胶、透明质酸、牛奶、蛋黄、激素、添加的自由基清除剂(例如，黑色素、维生素E衍生物、硫氧还蛋白)、酶(例如，SOD、过氧化氢酶)、生长因子(例如，EGF、IGF、PAF、VIP)、聚合物分子(例如，肝素、葡聚糖、聚赖氨酸、PVP或PVA)。此外，该培养基可以包括精子运动性刺激物，例如咖啡因、滤泡液、钙、催产素、激肽释放酶(kallikrinen)、前列腺素、胸腺提取物、己酮可可碱、2-脱氧腺苷、纤维醇、类黄酮、血小板活化因子、亚牛磺酸、硫酸软骨素以及巯基乙醇。咖啡因(例如，5mM)和己酮可可碱(例如，1mM)是合适的刺激物。抗生素和抗真菌素也可以包括于其中。
在另一实施方案中，本发明包含用于提高卵母细胞、胚胎或胚胎干细胞(ESC)在体外培养系统中的存活率和成熟度的方法。被培养的卵母细胞、胚胎、或ESC用在各种诊断和毒理学检测、体外受精或用于繁殖后代中。这些方法包括用含有NAC酰胺或生理学上可接受的衍生物或盐或其酯培养基接触含有卵母细胞、胚胎或ESC的样本。
根据本发明的方法和组合物，NAC酰胺被给予、提供或与另一组分或因子联合使用，例如，粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)，用于增加胚胎发育到胚泡期及较迟阶段的成活力和成功率。
在另一实施方案中，NAC酰胺被用在涉及生产和维持转基因动物胚胎和卵的方法和组合物中，包括非人转基因动物，如猪、绵羊、山羊以及啮齿动物，作为非限定性的实施例。转基因动物的卵和胚胎自然产生的GSH是典型的低水平，并且充分发育的成功率低。因此，根据该实施例，供给转基因动物的卵和胚胎的NAC酰胺将增加转基因生物的在体外以及体内培养期间的充分发育率，从而增加了获得足孕转基因动物的成功率。本发明也考虑到具有生产能力的转基因动物产品，例如，人和动物氨基酸、异种蛋白，例如，凝血因子、生长因子、抗癌因子等。根据本发明生产的转基因动物也可以被用作人移植物的无抗原器官来源。
在另一实施方案中，本发明包括含有NAC酰胺的方法和组合物，以培养并支持干细胞或其它的生殖细胞移植入动物中，包括人，以及在体外和体内支持细胞生长和克隆。
在再一实施方案中，本发明包括一种药学上可接受的组合物，其含有NAC酰胺，或生理学上可接受的衍生物或盐或其酯，用于操作中预防、减少、抵消或减轻由于血红素加氧酶和胆红素过量而引起的氧化应激对早产新生儿的存活和发育产生的不利影响。给予新生儿NAC酰胺可以进一步用于改善早产婴儿和新生儿中支气管肺的发育异常，这是通过改善并补充其抗氧化剂的防御措施以及通过预防感染和发炎的易感性。提供给这种新生儿以及早产儿的NAC酰胺也可以预防细胞凋亡及其衰弱和不利的影响。
根据本发明，为了治疗目的，NAC酰胺可以通过适合于处理或治疗方法的多种途径给药，这为本领域技术人员所熟知。NAC酰胺的给药途径和方式的非限定性实例包括肠胃外的注射途径，包括皮下、静脉内、肌肉和胸骨内注射。其它的给药方式包括但不限于口服、吸入、局部、鼻内、鞘内、皮内、经眼、阴道、直肠、经皮、肠内、注射插管、连续输注、定时释放以及舌下途径。在本发明的一个实施方案中，NAC酰胺的给药可以通过内窥镜手术来介导。为了治疗影响大脑的各种神经学上的疾病或紊乱，NAC酰胺可以被引入到大脑室内层组织中。几乎整个大脑区域的脑室系统都允许更容易的进入受疾病或紊乱影响的不同大脑区域。例如，为了进行治疗，一种设备例如套管和渗透泵可以被植入，以便给予治疗性的化合物，例如作为药学上可接受的组合物的一种组分的NAC酰胺。也包括直接注射NAC酰胺。例如，在被NAC酰胺治疗的位置内以及周围，与许多大脑区域紧密靠近的脑室有助于分泌的或导入的神经物质的扩散。
对于受体的给药，例如，注射给予一种被配制成含有水溶性NAC酰胺的组合物或制剂，典型的是在无菌液或悬浮液中。或者，NAC酰胺可以被重悬于药学上和生理学上可接受的水性或油性赋形剂中，其可以含有防腐剂、稳定剂以及用于使溶液或悬浮液与受体的体液(即血液)等渗的物质。适用的辅料的非限定性实例包括水、磷酸盐缓冲生理盐水(pH 7.4)、0.15M氯化钠水溶液、葡萄糖、丙三醇、稀释乙醇等，及其混合物。例举的稳定剂为聚乙二醇、蛋白质、糖类、氨基酸、无机酸和有机酸，它们中任一个都可单独或混合使用。
包含NAC酰胺用于局部给药的制剂可以包括但不局限于洗液、药膏、凝胶、霜、栓剂、滴剂、液体、喷剂和粉末。NAC酰胺可以液体、凝胶、霜和胶状物的形式吸收到衬垫或棉球上给药到黏膜。常规的药物载体，水基、粉基或油基、增稠剂等可以为必要的或所需的。含有NAC酰胺供口服给药的组合物包括粉末或颗粒、水或非水介质的悬浮液或溶液、囊剂、胶囊或片剂。增稠剂、稀释剂、调味剂、分散助剂、乳化剂或粘合剂可以是所需的。用于肠胃外给药的制剂可以包括但不限于灭菌溶液，也可以含有缓冲液、稀释剂和其它适合的添加剂。
NAC酰胺的剂量、分量或数量以及所用的给药途径取决于个体的基础，和相似的应用或适应症类型所用的量相应，是本领域技术人员所知道的。正如本领域本领域技术人员所理解的，剂量取决于治疗情况的严重性和响应性，但正常的是一次或多次剂量/天，疗程持续几天到几个月，或者直到治愈或疾病状态减轻。通常本领域技术人员可以很容易确定最佳剂量、定量方法和重复率。例如，用于可口服给药的剂型的药学制剂可以包括NAC酰胺，或药学上可接受的盐、酯或其衍生物，剂量与至少25-500mg的单次剂量相当，或者与至少50-350mg的单次剂量相当，或者与至少50-150mg的单次剂量相当，或者与至少25-250mg的单次剂量相当，或者与至少50mg的单次剂量相当。人和非人的哺乳动物都可以被给予NAC酰胺。因此，它可以应用于人类医学和兽医学。
适合于NAC酰胺的酯的例子包括烷基和芳基酯，选自甲基酯、乙基酯、羟基乙基酯、叔-丁基酯、胆固醇酯、异丙基酯和甘油基酯。
大体上，适合扩散或培养精子、卵母细胞、胚胎或ESC的培养基为一种平衡盐溶液，例如M199、合成的输卵管液体、PBS、BO、试验卵黄、Tyrode、HBSS、Ham’s F10、HTF、Menezo B2、Menezo B3、Ham’s F12、DMEM、TALP、Earle′s缓冲盐、CZB、KSOM、BWW培养基和emCare培养基(PETS，Canton，Tex.)。在一个实施方案中，M199培养基被用于培养卵母细胞。在特定的实施例中，TALP或HTF被用于精子培养基，并且CZB被用于胚胎培养基。
NAC酰胺在用于卵母细胞或胚胎的培养基中的适当的浓度范围为0.001-15％，或0.001-10％，或0.001-5％，或0.01-5％，或0.05-1％，或0.05-0.5％，或0.1-5％，或0.1-1％。优选的，可以存在其它的添加剂，例如氨基酸(例如，谷氨酸)。通常，添加剂包括但不限于大分子、缓冲液、抗生素，并且如果要实现受精可能是精子刺激物。激素或其它的蛋白质也可以被加入。这种激素和蛋白质包括促黄体激素、雌激素、黄体酮、促卵胞激素、人体绒毛膜促性腺激素、生长因子、滤泡液和输卵管素、白蛋白和氨基酸。通常，培养基也含有大约1％-20％的血清。优选的，血清与所述卵母细胞或胚胎的动物来源相同。精子、卵母细胞或胚胎在5％CO2和37℃的潮湿空气里在所述培养基中进行典型培养。培养物还可以含有滋养层，包括体细胞，通常为被照射的细胞、培养细胞，或者在培养物中具有有限生存期的细胞(例如，胸腺细胞)。
在其它的实施例中，本发明包括减少功能性精子的损失、减少对卵母细胞的细胞伤害或减少对胚胎或ESC(胚胎干细胞)的细胞损伤的方法，这些损伤是由于冷却、冷冻或玻璃态储藏所导致的。方法包括将可减少损失或伤害的有效量的PCAGH与含有精子、卵母细胞、胚胎或ESC的样本混合，并在冷却、冷冻或玻璃态储存该样本。
NAC酰胺可以是精子、卵母细胞、胚胎和ESC的防冻介质中的一种添加剂。防冻介质典型的逐滴缓慢加入到细胞中。所述防冻介质包括渗透和非渗透的化合物。最常用的是DMSO、丙三醇、丙二醇、乙二醇或类似物。其它的渗透剂包括丙二醇、二甲基甲酰胺和乙酰胺。非渗透剂包括聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷、防冻的鱼或植物蛋白质、羧甲基纤维素、血清白蛋白、羟乙基淀粉、聚蔗糖、葡聚糖、凝胶、白蛋白、蛋黄、乳制品、脂囊泡或卵磷脂。可以添加的辅助化合物包括糖醇、简单糖(例如，蔗糖、棉子糖、海藻糖、半乳糖和乳糖)、糖胺聚糖(例如，肝素、硫酸鲨鱼软骨素(chrondroitin))、丁基化羟基甲苯、清洁剂、自由基清除剂、其它的抗氧化剂(例如，维生素E、牛磺酸)、氨基酸(例如，氨基乙酸、谷氨酸)，以及类黄酮和紫杉醇(优选0.5-5μm)。丙三醇优选用于精子的冷冻，并且乙二醇或DMSO用于冷冻卵母细胞、胚胎或ESC。通常，丙三醇以3-15％加入；其它适当的浓度可以很容易地采用已知的方法和检测来确定。可以加入其它的试剂，典型地浓度范围大约为0.1-5％。也可以加入蛋白质，例如人白蛋白、牛血清白蛋白、胎牛血清、蛋黄、脱脂乳、凝胶、酪蛋白或输卵管素。
将细胞悬浮在防冻介质中后(例如，对于储藏)，容器被密封并随后被冷藏或冷冻。简单来说，为了冷藏，样本在充满水的容器内于冰箱中置一个小时或者直到温度达到4℃。样本随后被放入聚苯乙烯泡沫塑料器皿中，其带有冷却包装，并且可为受精而被运输，至于精子则是到第二天。如果样本将被冷冻，冷却的样本被分入冷冻小瓶或吸管内，并且放在液氮的蒸气相中一到两个小时，并随后投入液氮的液相中进行长期储藏，或者在可编程的计算机化制冷器中冷冻。冷冻的样本通过在37℃的水浴中加热来解冻，并直接被受精或在受精前被清洗。可以使用其它的冷却和冷冻方案。玻璃化涉及利用糖、水溶性聚蔗糖或类似物使卵母细胞或胚胎脱水。所述卵母细胞或胚胎随后被加入到防冻剂中并迅速迁移入液氮中。
根据本发明的方法和组合物，可以按照如上所述制备并储藏精子、卵母细胞或胚胎。冷藏通常为一种适用于短期储藏的方式，而冷冻或玻璃化通常为适用于长期或短期储藏的方式。
本发明的组合物和方法增强了动物的生育力。这些方法通常适用于许多物种，包括人、牛、犬、马、猪、绵羊、鸟类、啮齿动物及其它。尽管只要想受精时就是有用的，本发明尤其用于有受精机能障碍的动物和人，以便增加怀孕的可能性。
所述机能障碍包括精子数低、精子的活动能力减少，以及精子的形态异常。除了这些机能障碍之外，本发明的方法和组合物可有效地用于人工受精过程中。经常，在商业化的饲养过程中，雄性和雌性的地理位置很遥远，这就需要输送精子来受精。由于获得精子样本和受精之间的时间段期间，冷藏或冷冻态运输是必要的。此外，对于特别有价值的或稀有的动物，可能需要长期储藏。对于人而言，地理位置上的距离或时间上的考虑可能使精子储藏成为必要。患病的男人在辐射治疗为一部分治疗或者在输精管切除术前可能希望储存精子以便将来使用。在冷冻储藏后，配子细胞经常在最终使用期间被培养。通过将NAC酰胺加入到培养物和/或防冻介质中，可以提高培养物中的配子细胞的存活率和健康状况。
根据本发明的润滑剂可有效地用于所有情况包括精子收集、性交和人工受精。当前，由于商用润滑剂和唾液的杀精性，不进行润滑就收集精子(Goldenberg等，生育力和不育，26：872-723，1975，Scoeman & Tyler，J.Reprod.Fert.2：275-281，1985，Miller等，生育力和不育，61：1171-5 1173，1994)。为了使供体舒适，希望利用含NAC酰胺的不杀精子的润滑剂，以改善精子的功能并增加潜在的受精能力。这样，润滑剂可以施加到避孕套或其它的收集装置中，例如导尿管或小瓶中。不育的夫妇也经常需要润滑剂。然而，由于润滑剂为杀精子的，它们不被推荐使用。在这些情况下，在阴道内应用润滑剂，包括/未包括涂药器，是所希望的和有益的，因为精子的功能可被增强。类似地，可以在人工受精前在阴道内使用润滑剂以提高怀孕的机会。
采用NAC酰胺补充培养物、受精和成熟培养基为卵母细胞、精子和胚胎提供了一种环境，使得在体外受精和胚胎发育前、期间和以后并在转移入雌性体前，在它们处于培养物期间它们的活力、存活能力、常态和功能延长。NAC酰胺优于其它的抗氧化剂，如GSH和NAC，被本文的实施例1所证实。本发明包括NAC酰胺用作胚胎成熟培养基中的补充物，与对照组、未补充的培养基相比，使胚胎继续发育并具有增强的功能直到胚泡期(实施例1)。
以下的实施例进一步阐述本发明，而绝不是用来限制本发明。
实施例
实施例1
本实施例描述了在猪的卵母细胞成熟、受精和胚胎培养期间，将NAC酰胺、谷胱甘肽(GSH)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)补充到孵育和培养培养基中，对受精和胚胎发育的各种测量值以及对GSH的细胞内浓度的影响所做的评价。
实验设计：做了三次实验，对于每一处理组，每次实验采用30个猪的卵母细胞(四个处理组中的每一个都具有90个完整的卵母细胞)。卵母细胞购自Trans OvaGenetics，Sioux City，IA。处理组为：1)对照组(未补充抗氧化剂)；2)补充GSH的组(1.0mM)；3)补充NAC的组(1.0mM)；以及4)补充NAC酰胺的组(1.0mM)。
化学品：所有的化学品，除非另有说明，均得自Sigma化学品公司(St.Louis，MO)并具有胚胎级质量。NAC酰胺由Glenn Goldstein博士提供。NAC酰胺可以按照例如D.Atlas等在美国专利No.6,420,429中描述的方法制备，其内容通过引用并入本文。
体外成熟：卵母细胞在组织培养基199(带有Earle′s盐、0.01U/mLLH和FSH，10ng/mL EGF，抗生素，以及矿物油下的10％胎牛血清(专门培养基，Phillipsburg(菲利浦斯勃格)，NJ))中于39℃在含5％CO2的空气中成熟20-24小时，并随后在无激素条件下再进行20-24h。
卵母细胞的体外受精(IVF)：通过采用0.1％的透明质酸酶搅拌而去除堆积的细胞，清洗并放入Tris-受精培养基中(113.1mM NaCl，3mM KCl，7.5mM CaCl2·2H2O，20mM Tris，11mM D(+)-葡萄糖，5mM丙酮酸钠，1mg/moL BSA，2mM咖啡因)，其带有矿物油覆盖层，并且以2000精子/卵母细胞的浓度加入冻融的精子。配子在39℃下在含5％CO2的空气中培养约6小时。
体外受精参数评价：IVF 12小时后，通过将卵母细胞固定在显微镜载物片上而分析受精，采用25％(v∶v)的乙酸/乙醇在室温下进行48小时。卵母细胞采用1％苔红素在45％(v∶v)的乙酸中染色，并采用400X放大的相差显微镜进行检测。
体外培养：清洗推断的合子，并孵育在NCSU-23培养基中(108.73mM NaCl，4.78mM KCl，1.19mM KH2PO4，1.19mMMgSO4·7H2O，5.5mM葡萄糖，1mM谷氨酰胺，7mM牛磺酸5mM亚牛磺酸，25.07mM NaHCO3，1.7mMCaCl2·2H2O，75μg/mL青霉素G，50μg/mL链霉素，4mg/mL BSA，pH 7.4)，其带有矿物油覆盖层，于39℃下在含5％CO2的空气中孵育48小时。48小时后，将已经历首次细胞分裂的胚胎以与如上描述的相同的方式放入新鲜的NCSU 23培养基中，直到IVF 144小时后形成胚泡。
谷胱甘肽检测：在PBS中清洗卵母细胞、冷冻，并在磷酸中采用钝玻璃棒使之破裂。采用前述方法进行检测(B.D.Whitaker和J.W.Knight，2004，Theriogenology(动物生殖学)，62：311-322)，并用GSH浓度对吸光度变化率的标准曲线来测定GSH的量。
表1总结了每个卵母细胞的细胞内GSH浓度，以pmol表示。与对照组相比，补充有NAC酰胺导致细胞内GSH的浓度增加至2.2倍。对于补充物的检测，与补充GSH本身相比，NAC酰胺引起细胞内GSH的增加大于40％，并且与补充NAC相比，NAC酰胺引起细胞内的GSH增加大于15％。
                表1
  处理组   GSH浓度/卵母细胞(pmol)
  对照组   3.19
  GSH   4.18
  NAC   6.00
  NAC酰胺   7.03
NAC酰胺和NAC显著(P＜.05)高于对照组。NAC酰胺显著(P＜.05)高于GSH。
在完成IVF 12小时后，通过核染色来自每个处理组的推断受精卵样本(n＝4)而主观地测定受精参数(注解1，*表示原核)，在初步分析中，仅少数受精卵进行染色，这是由于本文描述的研究目的是估算继续发育到2-细胞和胚泡期的受精卵数量。该分析仅仅是察看是否发生任何明显的异常。基于最初进行核染色的少量受精卵，采用GSH、NAC或NAC酰胺补充培养基对受精事件不具有任何显著的改变。
基于以前的发现(B.D.Whitaker和J.W.Knight，2004，动物生殖学，62：311-322)，即增加卵母细胞中谷胱甘肽的浓度减少了多精入卵的发生，以及文献报道的谷胱甘肽促进卵母细胞-精子复合物在IVF后发育为雄原核，令人鼓舞的是，NAC酰胺可能在这些过程中发挥有益的作用。
剩下的受精卵在发育的胚泡阶段(148小时)在它们各自的培养基中被培养，并且纪录它们的发育和生存力进展(表2)。补充有NAC酰胺的培养基促使受精卵发育到2-细胞期，并且进一步帮助随后最终百分比的达到2-细胞期的那些胚胎继续发育达到胚泡期(体外分析的终点)。
                            表2
  处理组   发育到2-细胞期的胚胎百分数   发育到胚泡期的胚胎百分数(即占2-细胞期中观察到的胚胎的百分数)
  对照组   19   40
  GSH   25   40
  NAC   30   55
  AD4   45   85
NAC酰胺导致胚胎发育到2-细胞(P＜.05)和胚泡(P＜.10)期的百分数明显增大。
来自实施例1的研究结果表明，用NAC酰胺补充的培养基明显增加了谷胱甘肽在细胞内的浓度。由于有充足的证据表明，增加细胞内的谷胱甘肽浓度将减少氧化应激并因此增强受精过程以及早期的胚胎发育，这是生物学上的重大发现。在本实施例中提出的发现证明，补充有NAC酰胺的培养基增加了分裂形成2-细胞胚胎的受精卵的百分数。最重要地，这些培养在补充有NAC酰胺的培养基中的胚胎中的85％，继续发育到达到发育的胚泡期的终点。这比发育到胚泡期的对照组(未补充的)胚胎的百分数的两倍还高。
在测定的三种抗氧化剂中(GSH、NAC和NAC酰胺)，NAC酰胺始终比两种自然出现的产品有效。这些结果类似于其它研究的结果，其中，GSH本身(相对于其它的γ-谷氨酰环化合物)仅是边际有效(与未补充的对照组培养基相比)。(B.D.Whitaker和J.W.Knight，2004，动物生殖学，62：311-322)。尽管补充NAC确实增大了所有测定的参数，但在程度上它比NAC酰胺小。
迄今为止，这些结果强烈地暗示出通过增加谷胱甘肽在卵母细胞中的细胞内浓度，NAC酰胺减少了氧化应激引起的卵母细胞质量、受精以及胚胎在体外系统中的活力降低。
实施例2
本实施例描述了用于评估精子功能/受精潜力的各种检测方式和方法。可以在J.E.Ellington等的美国专利No.6,593,309中找到进一步的说明。精子活动性为可用于评估精子功能并因此评估受精潜力的一个函数。精子活动性被表示为游动精子的总百分数，向前游动精子的总百分数(向前游动)，或精子的向前游动速度。这些测量值可以通过各种检测方法进行，但方便地采用两种方式之一进行检测。当精子被放入血细胞计或显微镜载物片上时，采用相差显微镜进行主观目测，或采用计算机辅助的精液分析仪确定。在相差显微镜下，计数游动的和总的精子数，并且将速度评估为快速、中速或慢速。采用计算机辅助的精液分析仪(Hamilton Thorn，Beverly，Mass.)客观地测定样本中单个精子细胞的活动性能。分析仪追踪单个的精子细胞并测定精子的活动性和速度。数据被表示为游动百分数，并且获得对路径速度和轨迹速度的测定。
采用几种不同方法之一测定精子活力。举例而言，这些方法中的两种分别是用膜排斥染色剂进行染色以及测定ATP水平。简单地说，将精子样本采用生存力染料孵育，例如Hoechst 33258或曙红-苯胺黑染色剂。将细胞放入血细胞计并采用显微镜检测。膜破裂的死精子被这些染料染色。将未染色的细胞数除以计数的细胞总数，得出活细胞的百分数。通过胞溶精子并采用存在ATP时发出荧光的荧光素酶培养该溶解产物而测定精子样本中的ATP水平。在光度计中测定荧光(精子活力测定；Firezyme，Nova Scotia，Canada)。将样本中的荧光量与标准曲线中的荧光量相比，测定样本中存在的活精子数。
精子的膜完整性通常通过低渗透膨胀测验检测，其测定精子如果暴露到非等渗的环境中抽吸水或盐的能力。简单地说，在低渗透膨胀测验中，精子被悬浮在含有75mM果糖和25mM柠檬酸钠的溶液中，其为低渗透溶液(150mOsm)。具有完整健康膜的精子将盐抽吸出细胞，导致膜收缩，就好像细胞越长越小。精子的尾巴卷曲在该更紧密的膜内。因此，带弯曲尾巴的精子被计数为活的健康精子，具有正常膜。当与存在的精子总数相比时，可以确定功能精子的百分数。
膜的完整程度优选通过脂质过氧化(LPO)测量方法而被测定，其评价了处理期间被释放的自由基产生的精子膜伤害。通过采用硫酸亚铁和抗坏血酸在37℃水浴中培养精子1小时而检测脂质膜过氧化。蛋白质用冰冷的三氯乙酸沉淀。通过离心收集上清液，并通过用硫代巴比妥酸和NaOH沸腾而进行反应。通过测量534nm的吸光度而确定最终的丙二醛(MDA)形成量，与MDA标准相比(M.Bell等，男科学杂志，14：472-478，1993)。LPO被表示为nM MDA/108精子。PCAGH的稳定作用引起LPO的产生减少。根据本发明，当NAC酰胺用在放有精子的培养基或环境中时，可以减少或减轻处理精子时遇到的氧化应激(过氧化反应)。
染色体DNA的稳定性采用精子染色质灵敏度检测(SCSA)进行分析。这种检测是基于采用488nm的光激发后，单链和双链DNA被吖啶橙染色剂进行的异染性染色。绿色荧光指示双链DNA，并且红色荧光指示单链DNA。样本中DNA变性的程度表示为“α”，并且采用公式α＝红色/(红色+绿色)计算。在所有的情况下，精子与TNE缓冲液混合(0.01M Tris氨基甲烷-HCl，0.015M NaCI，和1mMEDTA)以及在新鲜时被冷冻。精子样本随后投入0.01％Triton-X、0.08N HCl和0.15M NaCI中，其诱导带反常染色质的精子中DNA局部变性。精子采用6g/ml吖啶橙染色，并在流式细胞仪中运行以测定“α”。
通过测定卵母细胞体外受精百分数而测定体外受精率。成熟的卵母细胞在M199培养基中体外培养22小时，该培养基中加入了7.5％胎牛血清和50μg/ml黄体生成素LH。培养4小时后，通过加入10IU的肝素而使精子化学上获能，并与卵母细胞孵育24小时。孵育结束后，采用乙酰-苔红素染色剂或等同物将卵母细胞染色，来测定已受精卵母细胞百分数。或者，已受精的卵母细胞可以留在培养物中2天，期间出现分裂，并且计数裂开的胚胎数(即，2个或更多的细胞)。
精子在培养物中的存活时间(至丧失活动性的时间)为确定精子功能的另一便利方法。该参数与特定雄性的实际授精能力很好地相关。简单地说，将一等份精子放入培养基中，例如Tyrode培养基，pH 7.4，并在37℃、5％CO2的潮湿空气中孵育。在设定的时间间隔，例如每8小时，采用反向显微镜，或带有计算机辅助的精子分析仪，通过视觉分析测定培养物中的游动精子百分数。作为终点，当少于5％的细胞具有向前游动性时，精子样本被视为不再有活力。
精子功能的另一参数为穿透宫颈粘液的能力。可以在体外或体内做这种穿透测试。简单地说，在体外，制备含有宫颈粘液的商业试剂盒(Tru-Trax，生育技术，Natick，Mass.)，通常是含有牛宫颈粘液的商品试剂盒。精子被放置在轨道一端，并且在设定的时间段后测定精子穿透进入粘液的距离。或者，精子穿透粘液的测定可以在妇女体内进行。在性交后的不同时间，取出宫颈粘液样本并用显微镜检测样本中存在的精子数。在性交后的测试中，如果暴露于PCAGH润滑剂后的粘液样本中比暴露于对照润滑剂后的病人的粘液样本中看到更多精子具有更快的速度，则确定精子的功能增强。
精子功能潜力的其它检测方法包括精子穿透和半合子检测。在精子穿透检测中，测定了精子穿透进入卵母细胞的能力。简单的说，使用了可从市场上购买的无带状疱疹的仓鼠卵母细胞(FertilityTechnologies(生育技术)，Natick，Mass.)。仓鼠的卵母细胞适合于检测任何物种的精子。获能的精子，例如用牛血清白蛋白培养18小时的那些，与仓鼠的卵母细胞孵育3小时。孵育后，卵母细胞用acetolacmoid或等同的染色剂进行染色，并且采用显微镜计数穿透每一卵母细胞的精子数目。半合子检测测定了精子经历获能并结合到卵母细胞的能力。简单的说，在该检测中，活的正常精子孵育在含牛血清白蛋白的培养基，这引发了获能。精子随后与被透明带—卵母细胞的一种非细胞覆盖层围绕的死卵母细胞孵育。获能的精子结合到带状疱疹并采用显微镜计数精子的数目。
实施例3
本实施例描述了用于清洗和分离精子以及含精子样本的方法，以获得富含精子的样本和具有最多游动精子的样本。所述样本含有功能改善的精子。通过将含精子的样本接触含多糖的溶液而清洗精子，其中，该多糖不是阿拉伯半乳聚糖。(J.E.Ellington等的美国专利No.6,593,309)。通过将含精子的样本接触包含多糖的培养基溶液而分离游动精子，其中，该多糖不是阿拉伯半乳聚糖，并将该混合物置于足以分离精子的条件下。所述培养基包括，但不局限于，Tyrode白蛋白乳酸磷酸(TALP)，人输卵管溶液(HTF；生育技术，Natick，Mass.)，Ham′s F10，Ham′s F12，Earle′s缓冲盐，Biggers、Whitten和Whitingham(BWW)，CZB，T6，Earle′s MTF，KSOM，SOF，以及Benezo B2或B3培养基。这些培养基的配方是众所周知的，并且预先配制的培养基可购得(例如，Gibco有限公司，或生育技术，Natick，Mass.)。此外，可以加入两性离子缓冲液(例如，MOPS，PIPES，HEPES)。多糖类可以包括用于分离和清洗精子的果胶、瓜尔豆树胶或阿拉伯树胶。阿拉伯树胶的加入量可以为约20％，或者瓜尔豆树胶的加入量可以为约5％。NAC酰胺可以作为抗氧化剂组分被加入。
这些培养基还可以含有高分子，只要溶液保持平衡的盐溶液。所述高分子包括聚乙烯醇、白蛋白(牛血清白蛋白或人血清白蛋白)、输卵管素(Gandolfi等，Repro.Fert.Dev.5：433，1993)、过氧化物歧化酶、维生素E、凝胶、透明质酸、过氧化氢酶、蛋黄、酪蛋白，或其它的蛋白质。白蛋白或凝胶通常的加入量为0.5％，并且透明质酸或聚乙烯醇的加入量为1.0％；其它的高分子可以以相似的浓度被加入(例如，0.05-5％)。除了用于离心方法的密度梯度化合物或用于上游(swim-up)分离方法的高分子之外，精子分离培养基含有至少一种多糖，大约为0.01-5％(例如，0.1-5％、0.1-1％、1％-5％)。密度梯度材料通常加至浓度为5-90％。所述材料包括葡聚糖、碘克沙醇、蔗糖聚合物、nycodenz或聚乙烯吡咯烷酮涂覆的硅石(即Percoll)。在常规应用中，含有精子的溶液在梯度材料上分层，优选30-90％的Percoll与0.05％胶质混合，并随后进行离心以收集功能增强的精子。当精子上游方法被用于分离精子时，加入一种高分子，例如上面所讨论的那些。优选使用1-10mg/ml的透明质酸。在这些方法的任何一种中使用的培养基还可以包括一种平衡盐溶液。
通过将含有精子的培养基混合物放入足以从样本中分离所需精子的条件下而清洗或分离精子。简单地，通过将细胞放入溶液中而使细胞与溶液接触从简短的时间直到孵育4小时。优选地，发生接触的温度为从大约从20℃到约39℃。在该最初的接触后，不同的方法可以被用于分离精子，例如离心、上游、分离柱等。例如，这样的一种方法为将精子样本离心通过连续梯度的含多糖溶液，特别是如J.E.Ellington等在美国专利No.6,593,309中所描述的PCAGH。在该方法中，含PCAGH的溶液被放入离心管中，并且精液样本或精子细胞在培养基上分层，近似于一份精液(或样本)与一份培养基的比率。离心管在近似300xg下被离心10到20分钟。功能增强从而受精潜力增加的富含精子部分，被回收在离心管底部的小球内。由于PCAGH对精子无害，不需要去除PCAGH的后续清洗步骤。可采用类似于上述清洗过程的方法进行分离；然而，PCAGH溶液可以在精子样本下但在密度梯度如Percoll上方形成层，或者直接混入Percoll梯度内。或者，通过上游方法分离精子。简单的说，通过将1.5ml清洗培养基放入12×75mm的圆底试管中而制备精子上游试管。精子在该清洗培养基下形成层，采用27G穿刺针和1ml的注射器，将1部分的精子悬浮液变为2部分的清洗培养基。将试管静置孵育1小时。孵育后，取出清洗培养基(游动精子已经游入)并在300xg下离心10分钟。随后回收游动精子的最终沉淀以进行分析或使用。或者，可以使用其它的方法，例如柱分离。分离精子后，可以进一步清洗精子，例如离心，通过Percoll梯度。清洗精子可以被用于将精子从一种溶液转移到其它溶液。对于这些方法中的任意一种，样本可以为精液、部分纯化的精子或纯化的精子。此外，适用于本发明的精子可以得自的动物物种包括人、牛、犬、马、猪、绵羊、啮齿动物、鸟类或外来的动物，例如狮子、老虎、长颈鹿、猴子、斑马、熊猫、美洲虎、大象、犀牛，以及其它。
实施例4
本实施例研究了在猪的卵母细胞成熟、受精和胚胎培养期间将NAC酰胺补充到培养基中，对卵母细胞成熟后GSH的细胞内浓度、IVF参数、成功地进行胞浆内精子注射(ICSI)以及在ICSI后胚胎发育和原核显微注射的影响。
所有的化学品，除非另有说明，均得自Sigma化学品公司(St.Louis，MO)，并具有胚胎级质量。Glenn Goldstein博士和同事提供了NAC酰胺。卵母细胞(BoMed，Madison，WI)在组织培养基199(其补充有Earle′s盐、0.01U/mL LH和FSH、抗生素以及矿物油下的10％胎牛血清(专用培养基，Phillipsburg，NJ))中在39℃、在含5％CO2的空气中成熟20-24h，并随后在无激素时进行另外的20-24h。
体外成熟后，通过在含有0.1％透明质酸酶的成熟培养基中重复吸液而从卵母细胞中除去堆积的细胞。随后，在含有10mM EDTA(pH 7.2)的100μL 0.2M磷酸钠缓冲液的液滴中清洗卵母细胞。采用含有10mM EDTA(pH 7.2)的5μL 0.2M磷酸钠缓冲液将约30个卵母细胞转移到1.5mL微型离心管中(Fischer Scientific，Pittsburgh，PA)，并且储藏在-80℃直到进行检测。每一试管中含有5μL 1.25M磷酸，并且利用钝玻璃棒使卵母细胞破裂。每一试管中的物质被加入到单孔的分光光度计试管中。采用先前在B.D.Whitaker和J.W.Knight，2004，动物生殖学，62：311-322中描述的方法进行检测。利用分光光度计在412nm连续读取样本的吸光度共计10分钟。随后采用GSH浓度相对于吸光度变化率的标准曲线测定GSH的量。
通过采用0.1％透明质酸酶搅拌而去除堆积的细胞，清洗并放入Tris-受精培养基中(113.1mM NaCl，3mM KCl，7.5mMCaCl2·2H2O，20mM Tris，11mM D(+)-葡萄糖，5mM丙酮酸钠，1mg/mL BSA，2mM咖啡因)，带有矿物油覆盖层，并且以2000精子/卵母细胞的浓度加入冻融的精子。配子在39℃、含5％CO2的空气中孵育约6h。
在IVF 12h后，通过将卵母细胞固定到显微镜载物片上分析受精，采用25％(v∶v)乙酸/乙醇在室温下进行48h。采用1％苔红素在45％(v∶v)乙酸中对卵母细胞染色，并采用相差显微镜以400X放大进行检测。
在39℃下、在15000xg下离心后，通过采用0.1％透明质酸酶搅拌而去除堆积的细胞，清洗并放入NCSU-23培养培养基的微液滴中(108.73mM NaCl，4.78mM KCl，1.19mM KH2PO4，1.19mMMgSO4·7H2O，5.5mM葡萄糖，1mM谷氨酰胺，7mM牛磺酸5mM亚牛磺酸，25.07mM NaHCO3，1.7mM CaCl2·2H2O，75μg/mL青霉素G，50μg/mL链霉素，4mg/mL BSA，pH 7.4)，带有矿物油覆盖层。随后将冻融的精子放入邻近的微滴中。在10μL HbT的液滴中，在石蜡油下进行操控，利用了Narishige操控器和Nikon的反向显微镜，其装有Hoffman调节器光学元件。采用把持(holding)吸液管稳定卵母细胞，外径为大约200μm，并且内径为大约50μm。采用PiezoDrill微量吸管注射精子，其外径为8-9μm，并且内径为6μm(Humagen，Charlottesville VA)。卵母细胞的极体被放置在6或12点钟位置，并且注射点位于3点钟位置。单个的卵母细胞被注入的微量吸管穿透，并且少量的细胞质被吸入微量吸管中，以确保穿透卵母细胞。随后，细胞质连同一个精子和少量培养基被注入卵母细胞中。卵浆注射后，立即快速抽出注射吸液管，并且从把持吸液管释放卵母细胞以减少胞质内的压力。
清洗推定的受精卵并在39℃下、在5％CO2的空气中在NCSU-23培养基中孵育48h(108.73mM NaCl，4.78mM KCl，1.19mMKH2PO4，1.19mM MgSO4·7H2O，5.5mM葡萄糖，1mM谷氨酰胺，7mM牛磺酸5mM亚牛磺酸，25.07mM NaHCO3，1.7mMCaCl25·2H2O，75μg/mL青霉素G，50μg/mL链霉素，4mg/mLBSA，pH 7.4)，其带有矿物油覆盖层。48h后，以与上述相同的方式，将已经历首次细胞分裂的胚胎放入新鲜的NCSU 23培养基中，直到TVF 144h后形成胚泡。
这里的结果表明：与对照组相比，补充有NAC酰胺产生了极好的结果。
                                表3
  处理组   受精方法   卵母细胞的总数   发育到2-细胞期的胚胎数目   发育到胚泡期的胚胎数目
  对照组   IVF   67   10   6
  NAC酰胺   IVF   70   22   12
  对比组   ICSI   25   5   2
  NAC酰胺   ICSI   24   12   5
不脱离本发明描述的范围和精神，可以对以上方法和组合物做各种变化，以上说明书中包含的、在附图中显示的或者在权利要求书中限定的所有主题都应被解释为说明性的，而非限定性。

Claims (56)

1.一种用于减小或预防体外培养的一种或多种卵母细胞、精子或胚胎中的氧化应激的方法，所述方法包括在培养基中培养一种或多种卵母细胞、精子或胚胎，其中培养基中补充有有效减少或预防氧化应激量的N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)，或其生理学上可接受的盐或酯。
2.权利要求1的方法，其中一种或多种卵母细胞、精子或胚胎来自非人的动物。
3.权利要求1的方法，其中一种或多种卵母细胞、精子或胚胎来自人。
4.权利要求1的方法，其中一种或多种卵母细胞、精子或胚胎来自转基因动物。
5.权利要求1的方法，其中培养基补充有NAC酰胺和GM-CSF。
6.一种用于减小或预防体外培养的卵母细胞中自由基形成的方法，所述方法包括在培养基中培养所述卵母细胞，其中培养基补充有有效减少或预防自由基形成量的N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)，或其生理学上可接受的盐或酯。
7.权利要求6的方法，其中卵母细胞来自非人的动物。
8.权利要求6的方法，其中卵母细胞来自人。
9.权利要求6的方法，其中卵母细胞来自转基因动物。
10.权利要求6的方法，其中培养基补充有NAC酰胺和GM-CSF。
11.一种用于减小或预防体外培养的精子中自由基形成的方法，所述方法包括在培养基中培养精子，其中培养基补充有有效减少或预防自由基形成量的N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)，或其生理学上可接受的盐或酯。
12.权利要求11的方法，其中精子来自非人的动物。
13.权利要求11的方法，其中精子来自转基因动物。
14.权利要求11的方法，其中精子来自人。
15.一种用于减小或预防体外培养的植入前胚胎中自由基形成的方法，所述方法包括在培养基中培养所述植入前胚胎，其中培养基补充有有效减少或预防自由基形成量的N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)或其生理学上可接受的盐或酯。
16.权利要求15的方法，其中植入前胚胎发育到胚泡期。
17.权利要求15的方法，其中植入前胚胎来自非人的动物。
18.权利要求15的方法，其中植入前胚胎来自人。
19.权利要求15的方法，其中植入前胚胎来自转基因动物。
20.权利要求15的方法，其中培养基补充有NAC酰胺和GM-CSF。
21.一种体外受精的方法，所述方法包括在培养基中培养卵母细胞和精子，其中培养基补充有N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)或其生理学上可接受的盐或酯，其中所述卵母细胞在所述补充有NAC酰胺的培养基中由所述精子受精。
22.权利要求21的方法，其中卵母细胞和精子来自非人的动物。
23.权利要求21的方法，其中卵母细胞和精子来自人。
24.权利要求21的方法，其中卵母细胞和精子来自转基因动物。
25.权利要求21的方法，其中培养基补充有NAC酰胺和GM-CSF。
26.一种培养植入前胚胎以使其发育为胚泡的方法，所述方法包括在培养基中培养植入前胚胎，其中培养基补充有有效使植入前胚胎发育为胚泡量的N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)或其生理学上可接受的盐或酯。
27.权利要求26的方法，其中植入前胚胎来自非人动物。
28.权利要求26的方法，其中植入前胚胎来自人。
29.权利要求26的方法，其中植入前胚胎来自转基因动物。
30.权利要求26的方法，其中培养基补充有NAC酰胺和GM-CSF。
31.一种用于预防或减小早产或新生婴儿的氧化应激的方法，包括给予所述婴儿药学上可接受的组合物，所述组合物包含有效预防或减少氧化应激量的N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)或其生理学上可接受的盐或酯。
32.一种用于预防或减小胚胎植入后在雌性体中与植入后的氧化应激有关的症状的方法，包括给予所述雌性体药学上可接受的组合物，所述组合物包含有效预防或减少植入后的氧化应激量的N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)或其生理学上可接受的盐或酯。
33.一种用于预防或减小与雄性体中精子的产生和发育有关的自由基形成或氧化应激的方法，包括给予所述雄性体药学上可接受的组合物，所述组合物包含有效预防或减少自由基形成或氧化应激量的N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)或其生理学上可接受的盐或酯。
34.一种用于减小或预防体外培养的卵母细胞、精子或胚胎中的氧化应激的细胞培养基，其中所述培养基包含N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)或其生理学上可接受的盐或酯。
35.权利要求34的培养基，其中卵母细胞、精子或胚胎来自非人动物。
36.权利要求34的培养基，其中卵母细胞、精子或胚胎来自人。
37.权利要求34的培养基，其中卵母细胞、精子或胚胎来自转基因动物。
38.权利要求34的培养基，还包括平衡盐溶液，所述平衡盐溶液选自M199、合成的输卵管液体、PBS、BO、试验卵黄、Tyrode’s、HBSS、Ham’s F10、HTF、Menezo’s B2、Menezo’s B3、Ham’s F12、DMEM、TALP、Earle’s缓冲盐、CZB、KSOM、BWW培养基，以及emCare培养基。
39.权利要求38的培养基，其中细胞为精子，并且所述平衡盐溶液为TALP或HTF。
40.权利要求38的培养基，其中细胞为胚胎，并且所述平衡盐溶液为CZB。
41.权利要求34的培养基，还包括缓冲液、一种或多种高分子、一种或多种附加的自由基清除剂、一种或多种酶、一种或多种生长因子、一种或多种聚合物分子、一种或多种抗生素、一种或多种抗真菌素、一种或多种激素，或者一种或多种蛋白质。
42.权利要求34的培养基，其中细胞为精子，并且其中所述培养基包括任选的精子活动性刺激物。
43.权利要求42的培养基，其中精子活动性刺激物包括咖啡因、滤泡液、钙、后叶催产素、激肽释放酶、前列腺素、胸腺提取物、己酮可可碱、2-脱氧腺苷、纤维醇、类黄酮、血小板活化因子、亚牛磺酸、硫酸软骨素或巯基乙醇。
44.权利要求34的培养基，其中培养基还包括GM-CSF。
45.一种细胞培养补充物，用于减小或预防体外培养的卵母细胞、精子或胚胎中的氧化应激，其中所述补充物包括N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)或其生理学上可接受的盐或酯。
46.一种防冻组合物，用于减小或预防在冷冻的卵母细胞、精子或胚胎中的氧化应激，其中所述组合物包括N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)或其生理学上可接受的盐或酯、渗透和/或非渗透剂，以及任选的辅助化合物。
47.权利要求46的防冻组合物，其中所述渗透剂包括DMSO、丙三醇、丙二醇，或乙二醇。
48.权利要求46的防冻组合物，其中所述非渗透剂包括聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、防冻的鱼或植物蛋白质、羧甲基纤维素、血清白蛋白、羟乙基淀粉、水溶性聚蔗糖、葡聚糖、凝胶、白蛋白、蛋黄、乳制品、脂质囊或卵磷脂。
49.权利要求46的防冻组合物，其中所述辅助化合物包括糖醇、简单糖、糖胺聚糖、丁基化羟基甲苯、清洁剂、自由基清除剂、添加的抗氧化剂、氨基酸、类黄酮或紫杉醇。
50.一种不杀精子的润滑组合物，包括N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)或其生理学上可接受的盐或酯，以及不杀精子的润滑化合物。
51.权利要求50的润滑组合物，其中所述润滑化合物包括丙三醇、甲基纤维素、丙二醇、植物油、凡士林、蔬菜油、聚卡波非、羟乙基纤维素、硅油、卡波姆、藻酸盐、对羟基苯甲酸甲酯、棕榈油、可可油、芦荟、藻酸丙二醇、unibase、矿物油、聚环氧乙烷、羧基聚亚甲基钠，或其组合物。
52.权利要求50的润滑组合物，还包括pH稳定剂和附加的抗氧化剂。
53.一种药用组合物，包括N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)或其生理学上可接受的盐或酯，用于在胚胎植入后被雌性体摄取，以预防或减少与植入后的氧化应激相关的症状。
54.一种药用组合物，包括N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)或其生理学上可接受的盐或酯，用于被雄性体摄取，以减少或预防精子产生和发育中的自由基形成或氧化应激。
55.一种药用组合物，包括N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)或其生理学上可接受的盐或酯，以预防、减少、抵消或减轻与动物不育相关的氧化应激。
56.一种药用组合物，包括N-乙酰半胱氨酸酰胺(NAC酰胺)或其生理学上可接受的盐或酯，以预防、减少、抵消或减轻与早产新生儿中的血红素加氧酶和/或胆红素过量相关的氧化应激。
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PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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