JP6316833B2

JP6316833B2 - 体外受精で用いるｎ−アセチル−ｌ−システイン

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Publication number: JP6316833B2
Application number: JP2015541119A
Authority: JP
Inventors: ランデバーグ、トーマス; パラサッシ、ティジアナ; ピッタルガ、エウゲニア; ブルネッリ、ロベルト
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Priority date: 2012-11-09
Filing date: 2013-11-06
Publication date: 2018-04-25
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Description

本発明は、体外受精におけるＮ−アセチル−Ｌ−システインの新しい使用に関する。

体外受精（ＩＶＦ）は、卵子が精子によって体外で受精される処置のことである。体外受精は、生殖介助術のその他の方法が機能しなかった場合の不妊症の主な治療法である。この処置は、女性の排卵過程を観察すること、女性の卵巣から卵子または複数の卵子を除去すること、および、実験室中の流体媒体中にて精子をそれらに受精させることを含む。受精用に自然に選択された卵（卵子）を集めるために女性の自然周期が観察される場合は、自然周期ＩＶＦとして知られている。その後、受精された卵子（受精卵）は、妊娠の成功を確立することを意図として、患者の子宮へと移植される。最初の成功した"試験管ベビー"ルイーズ・ブラウンの誕生は、１９７８年のことだった。ルイーズ・ブラウンは、自然周期ＩＶＦの結果生まれた。この治療法を開発した生理学者のロバート・Ｇ・エドワーズは、２０１０年にノーベル生理学・医学賞を受賞した。（S K Kalra et al. Fertility and Sterility Vol 95, no 6 p 1888-1889. In vitro fertilization and adverse Childhood outcomes: what we know, where we are going, and how we will get there. A glimpse into what lies behind and beckons ahead。B Almog et al. Fertility and Sterility Vol 94, No 6 p 2026-2028. Promoting implantation by local injury to the endometrium。）

この２５年間にわたる生殖介助術の劇的な発展にもかかわらず、ＩＶＦ／胚移植（ＩＶＦ／ＥＴ）のような最先端の治療法でさえも、全体としての有効性はかなり低く、平均して、治療周期当り約２０−３０％の生児出生である（Nyboe-Andersen et al., Hum Reprod. 2009;24(6):1267-87）。

胚移植は、治療法の結果に影響を及ぼす独立な因子である。胚移植の成功の決定要因は、胚の品質、子宮受容能、および子宮内環境の品質を含む（Cavagna and Mantese, Placenta. 2003;24 Suppl B:S39-47）。

子宮収縮は、子宮受容能の最も基本的な要素を構成する。子宮の収縮活動は、胚着床において重要な役割を果たす。過度の子宮収縮は、収縮活動によって胚を子宮から排出するかもしれないので、ＩＶＦ周期における着床率を減少させ得る（Fanchin et al. Hum Reprod, 1998;13: 1968-74）。今日まで、ベータ作用薬または非ステロイド性抗炎症薬の使用のような、胚移植前に子宮収縮を低減するための治療戦略は、十分な恩恵を与えることが示されていない（Moon et al.,Fertil Steril 2004;82:816-20; Tsirigotis et al.Human Reproduction and Embryology, June 25-28,2000; Bologna, Italy）。

治療周期は、エストラジオール濃度の豊富な増加を誘起し、自然周期における排卵前の２ｎｍｏｌ／ｌ未満と比べて、卵巣刺激の最後には約１０−２０ｎｍｏｌ／ｌである。エストラジオールの超生理学的濃度は、局所的な（子宮内膜の）オキシトシンの生成、オキシトシン受容体の形成、および、間接的に、出産前の状態に事実上類似したＰＧＦ２ａの形成／放出を誘起することが予測される。また、オキシトシンおよびバソプレシンの両者は、出産の間の子宮収縮の誘起および持続に関与する。

自然周期の排卵前の状況と比べて、胚移植の前に測定された場合に、ＩＶＦ周期における子宮収縮活動がおおよそ６倍増大されることが示されてきた。子宮収縮は、迅速で指向された精子輸送および高い基底部胚着床に積極的に関与され、ヒトの繁殖において重要な役割を果たす。

ＩＶＦ／ＥＴ治療法においては、採卵後に、子宮収縮の進行性の減少が観察され、胚盤胞移植の時点（採卵の５−６日後）では、ほとんど静止状態に達する（Fanchin et al.,Fertil Steril 2001;75: 1136-40）。収縮活動のそのような減少は、胚盤胞移植により達成されるより高い着床率をさらに増大させるものと考えられる。しかしながら、胚の大部分は依然として、顕著な子宮収縮活動の周期の間である受精後２日または３日で移植されている。

胚移植処置自体は、局所的なオキシトシンおよびプロスタグランジンの放出を増大させることが予測されている。支持鉤の使用のような、膣または子宮頸部に対する任意の追加的な操作は、子宮収縮の増大に結び付く、オキシトシン／プロスタグランジン放出に対する追加的な刺激を与える（Dorn et al., 1999）。Mansour等は、メチレンブルー染料による模擬胚移植を受けた患者のうち半数よりも多くにおいて、この処置後に染料が膣内へと輸送されることが見られることを立証した（Mansour et al.,Hum Reprod 1994;9 : 1257-9）。移植された胚のうちの５０％未満が、移植の１時間後に子宮中に残っていたこと、および、約１５％の胚が、胚移植後に膣内において発見され得たこともまた立証された（Poindexteret al.Fertil Steril, 1986;46:262-7）。

上記を考慮すると、胚移植時点での子宮収縮活動、および、特に基底部−頚部（fundo-cervical）収縮は、子宮から胚を排出し得ることが示唆された。Fanchin等は、胚移植を受けた患者の約３０％が、著しい子宮収縮を有するものと推定した（Human Reprod1998;13:1968-74）。そのグループにおいては、ＩＶＦ／ＥＴ治療法の成功率は、"活動しない"子宮の患者の個体数に比べて、３倍まで低かった（臨床的妊娠の１６％対５３％）。この差異は、評価の間に認められた子宮収縮の方向とは独立であった。これは、胚移植時点における増大した収縮の薬理学的な抑制は、可能性のある治療法に対する魅力的な目標となり得ることを暗示しているであろう。

ＰＧＦ２ａ／オキシトシン系に干渉すること、および、場合によっては子宮内膜灌流を向上させることは、子宮収縮を減少させ、子宮受容能を改善するであろう１つのメカニズムであり得る。

体外受精−胚移植（ＩＶＦ−ＥＴ）の有効性は、通常、治療周期当たり３０％を越えることはなく（NyboeAndersen A, Gianaroli L, Felberbaum R, de Mouzon J, Nygren K. Assisted reproductive technology in Europe, 2001. Results generated from European registers by ESHRE. Hum Reprod 2005;20:1158-76）、３６歳よりも年齢の高い女性においてはさらに減少する（Stolwijk A, Wetzels A, Braat D. Cumulative probability of achieving an ongoing pregnancy after in-vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection according to a woman's age, subfertility diagnosis and primary or secondary subfertility. Hum Reprod 2000;15:203-9）。

胚の良好な品質および最適な子宮内環境は、ＥＴ、およびＩＶＦ−ＥＴ処置全体の成功に対する基本的な決定要因である。着床を可能にする理想的な子宮内条件は、適切な子宮内膜の状態、十分な子宮内膜灌流、および過度の子宮収縮が存在しないことを含む。特に、増大した子宮収縮活動は、子宮から胚を排出する可能性がある（Mansour R, Aboulghar MA, Serour GI, Amin YM. Dummy embryo transfer using methylene blue dye. Hum Reprod 1994;9:1257-9）（Poindexter A, Thompson D, Gibbons W. Residual embryos in failed embryo transfer. Fertil Steril 1986;46:262-7）。

着床および妊娠率は、子宮収縮の頻度およびプロスタグランジン合成（ＰＧ合成）と逆の相関がある。ＥＴにおける高い子宮収縮活動（１分当たりの収縮が５回またはそれ以上）が患者の約３分の１に見られ、これらの女性においては、臨床的妊娠率は各周期当たり１３％であり、より低い子宮活動（１分当たりの収縮が３回またはそれ以下）の女性における妊娠の成功５３％とは対照的である（Fanchin R, Righini C, Olivennes F, Taylor S, de Ziegler D, Frydman R. Uterine contractions at the time of embryo transfer alter pregnancy rates after in-vitro fertilization. Hum Reprod 1998;13:1968-74）。さらに、ＥＴカテーテルによる子宮頚部の刺激は、さらなるＰＧ合成および収縮性の反射を誘起するようであり、胚着床の成功の機会をさらに減少させるようである（Lesny P, Killick S, Tetlow R, Robinson J, Maguiness S. Embryo transfer−can we learn anything new from the observation of junctional zone contractions? Hum Reprod 1998;13:1540-6）。

しかしながら、子宮受容能の重要な構成要件である子宮収縮活動は、現在のところ、ＥＴ受容者における特定の診断または治療法の主題ではない。プロゲステロン補充は、たとえ子宮受容能に作用し、子宮内膜の状態を向上し、子宮収縮を減少させるとしても、ＩＶＦ−ＥＴ後の妊娠率に対する役には立たない（Fanchin R, Righini C, de Ziegler D, Olivennes F, Ledee N, Frydman R. Effects of vaginal progesterone administration on uterine contractility at the time of embryo transfer. Fertil Steril 2001;75:1136-40）。

ピロキシカム（シクロオキシゲナーゼ阻害剤）およびリトドリン（β２−アドレナリン受容体作用薬）の有効性を評価する複数の研究が、妊娠率に対する好ましい効果を示してきた（Moon H, Park S, Lee J, Kim K, Joo B. Treatment with piroxicam before embryo transfer increases the pregnancy rate after in vitro fertilization and embryo transfer. Fertil Steril 2004;82:816-20；Tsirigotis M, Pelekanos M, Gilhespie S, Gregorakis S, Pistofidis G. Ritodrine use during the peri-implantation period reduces uterine contractility and improves implantation and pregnancy rates post-implantation。European Society of Human Reproduction and Embryologyの第１６回年次大会、６月２５−２８日、２０００年、ボローニャ、イタリアにて提示された）。上記した複数の薬剤は、安全性の懸念のため、日常的な臨床用途には入っていない。

最近、Moraloglu等は、Treatment with oxytocin antagonists before embryo transfer may increase implantation rates after IVF. Reproductive biomedicine online 09/2010; 21(3): 338-43にて、１６０人の患者において、胚移植の前および胚移植の２時間後までに総ｉ．ｖ．投与量として３７．５ｍｇのアトシバン（オキシトシン拮抗薬）の点滴を受けた場合の任意抽出されたプラシーボ対照試験を報告した。著者達は、着床率および臨床的妊娠の両者における著しい改善を認識した。移植された胚当たりの着床率は２０．４％対１２．６％であり、各周期当たりの臨床的妊娠率は４６．７％対２８．９％であった（アトシバン対プラシーボ）。試験群においては、より少ない早期流産が認められた（１６．７％対２４．４％、アトシバン対プラシーボ）。

Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（以降、ＮＡＣと記載する）はよく知られた薬剤であり、粘液溶解薬として、および、パラセタモール中毒の治療において主に使用されてきた。近年、それは、抗炎症性および抗増殖性のようなその他の有益な特性を有することも認識されてきており、子宮内膜症、また統合失調症、糖尿病、および癌に加えて、様々な異なる疾患および症状の治療に対して示唆されてきている。

今日まで、ＮＡＣは、欧州特許第２３０５２３８号明細書に記載されるように、子宮内膜症の経口治療用に使用されてきたが、不妊治療の薬剤とは考えられてこなかった。その研究においては、妊娠に関する結論は出されなかった。それとは反対に、子宮内膜症に対して処置された場合に妊娠が起き得るとは予測されていなかった。以前には開示されていなかったが、データを解析すると、子宮内膜症に対してＮＡＣを経口で摂取し、ＩＶＦ治療法において成功した人が１人いたことに本発明者達は気付いた。また、以前の２度のＩＶＦの試みは失敗し、堕胎に終わった。これは、ＩＶＦと関連してＮＡＣが使用され得るかどうかを調査することを本発明者達が始めた理由の１つであった。

実際のところ、マウスにおいては、ＮＡＣが胚着床を支援することが確認された。動物モデルにおいては、マウスにオキシトシンが与えられた場合、胚着床率は減少した。ＮＡＣは、投与量に依存して、オキシトシン治療されたマウスにおける着床率を回復させた。これは、胚着床におけるオキシトシンの関与に対する証拠を与えた。

従来技術
癌の治療におけるＮＡＣの分子効果を記載した背景技術は、T. Parasassi, et al. Cell Death and Differentiation (2005), Vol. 12, No. 10, pages 1285-1296；E. K. Krasnowska et al. Free Radicals Biology and Medicine 2008, 45(11):1566-72；A. C. Gustafsson et al. BMC Cancer (2005), 5:75を含む。子宮内膜症の治療におけるＮＡＣはPittaluga等のMore than an antioxidant: N-acetyl-L-Cysteine in a murine model of endometriosis. Fertil & Steril 2010; 94(7): 2905-8に記載される。さらに、C.H. Kim等は、インスリン感受性を改善するためのＮ−アセチル−システインによる治療を記載する（ＥＳＨＲＥの第２２回年次大会の要約、プラハ、チェコ共和国、６月１８−２１日、２００６年、P-463）。Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）をそれ自体で、または（ｉｉ）セレノメチオニンの形態としてのセレン、および／または（ｉｉｉ）メラトニン、および／または生理学的に許容されるそれらの塩と共に含有する調製物が、欧州特許出願第１２７１００６２．６号明細書に記載される。そのような調製物は、ＩＶＦの治療にも使用され得る。

発明の目的
ＩＶＦの開始時から既に、ＩＶＦ治療における臨床結果が低いことが問題であった。ＩＶＦの費用は高く、治療は通常、治療周期当たりわずかに２０−３０％の生児出生を与えるのみなので、より高い生児出生率を与えるために、多くの異なる治療法が試験されてきている。好ましくはＩＶＦ治療の数日前におけるＮＡＣの投与が、より高い生児出生率を与えることが、思いがけず、今、わかってきた。さらに、多くの前のＩＶＦ治療が成功しなかった場合において、新しいＩＶＦ治療に関連したＮＡＣの事前投与が生児出生につながった。

本出願の請求項において定義されるＮＡＣ治療の体外受精（ＩＶＦ）における臨床結果は、本発明者達の知る限りでは、従来技術においては決定されておらず、また、ＩＶＦの治療に対する効率の良い投薬計画も無く、あるいは、ＩＶＦに関連した症状の治療に対するＮＡＣの使用も提案されていない。

従って、ヒトおよび哺乳類におけるＩＶＦおよびＩＶＦに関連した症状の治療に対する、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）を含む医薬組成物を提供することにおける問題の解決法を与えることが、本発明の一般的な目的である。

本発明に従うと、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）を含む医薬組成物が、静脈内投与および／または経口投与に使用される。この調製物は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）をそれ自体で、または、（ｉｉ）セレノメチオニンの形態でのセレン、および／または（ｉｉｉ）メラトニン、および／または生理学的に許容されるそれらの塩と共に含有する。

ＮＡＣそれ自体による調製物は、７０−１５０ｍｇ／ｋｇ体重の間のＮＡＣを含み、ＩＶＦ治療と関連して、１日１回、１−３日間投与される。一度だけ、すなわち、ＩＶＦの日の投与にて投与することも可能である。その場合、投与は、ＩＶＦの約１時間前に行われる。

例

胚毒性
ＮＡＣ胚毒性の最終的な発生が予備的に試験された。ＮＡＣの胚毒性を検証するために、２つの胚毒性試験（ウサギ胚バイオアッセイおよびヒト精子運動性バイオアッセイ）の適用が使用された（Pierzynski et al., 2007a参照）。どちらも、治療血液濃度の５０倍の濃度まで、ＮＡＣの胚毒性効果を検出できなかった。ＮＡＣは、１細胞ウサギ胚の生存に対して影響を及ぼさず、また、孵化されたウサギ胚盤胞の割合を減少させないことが示された。ヒト精子に実行された試験もまた、悪影響は示さなかった。

毒性試験−ヒト精子運動性バイオアッセイ
精子運動性および速度を含めた良好な精子のパラメータを有する３人の健康なドナーから採取されたばかりのサンプルに対して、ヒト精子運動性の評価が実行された。ヒト精子調製媒体上での泳動または"泳ぎ上がる"ことが、運動型の精子を選択するために適用された。選択後に、各精液サンプルは３つのアリコートに分割され、エッペンドルフチューブに移された。１つの対照チューブに加えて、２つのチューブは、１００および１，０００ｎＭの濃度で加えられたＮＡＣを有した。これらのチューブは、５％ＣＯ_２環境において、一定の温度および湿度条件で２４時間インキュベートされた。精子運動性は、ＮＡＣへの暴露の１時間後および２４時間後に、位相差顕微鏡を用いて倍率４００倍で評価された。評価は、２分という固定された時間間隔で実行された。９つのサンプルが、３６回の測定（各サンプル当たり、１時間および２４時間において２回測定）により、精子運動性および速度について評価された。

ヒト精子運動性バイオアッセイ評価においては、対照と比べて、ヒト精子運動性または速度に対するＮＡＣの影響は検出されなかった。しかしながら、実験の継続期間は運動性に影響を与え、精子の活動および速度の漸減として検出された。この減少は対照およびＮＡＣ処置されたもののどちらにおいても見られ、グループ間の違いは無かった。時間と濃度との間に相互作用は見出されなかったので、濃度１００および１,０００の２つのグループにおいて、時間の効果に著しい違いは無かった。

体外
着床の間、母体胎児境界において、非常に制御された様式でインテグリンが発現される。しかしながら、子宮内膜へのインテグリン媒介された胚付着の間の細胞外基質（ＥＣＭ）配位子の重要性は、十分には理解されていない。従って、ラットの子宮および胚盤胞におけるフィブロネクチンの分布が、着床の時点において研究された。フィブロネクチンは子宮管腔上皮細胞内には無かったが、栄養膜細胞および内細胞塊中には強く発現された。これは、胚盤胞から分泌されたフィブロネクチンが、母体胎児境界において発現されたインテグリンに対する架橋配位子である可能性があることを示唆する。Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドが、インテグリン上のＲＧＤ認識部位をブロックするために使用され、イシカワ細胞へのラット胚盤胞付着に対する効果が調査された。胚盤胞またはイシカワ細胞のどちらかがＲＧＤブロックペプチドによって事前インキュベートされた場合、胚盤胞付着における著しい低減があった。従って、子宮内膜への胚の付着が成功するには、子宮内膜および胚盤胞の両者にあるインテグリンが、フィブロネクチンのようなＥＣＭ配位子のＲＧＤ配列と相互作用する必要がある。ＲＧＤペプチドによる胚盤胞およびイシカワ細胞両者の前処理はまた、胚盤胞付着を抑制したが、完全ではなかった。これは、ＲＧＤ配列を含まないＥＣＭ架橋配位子もまた胚の付着に関与することを示唆する（Kaneko Y, Murphy CR, Day ML. Extracellular matrix proteins secreted from both the endometrium and the embryo are required for attachment: A study using a co-culture model of rat blastocysts and Ishikawa cells. J Morphol. 2013;274(1):63-72）。

実験１
本実験は、インテグリン／フィブロネクチンを含む結合（接着）タンパク質にＮＡＣ治療が影響を及ぼすかどうかを解明するために実行された。

細胞接着アッセイ
７μｇ／ｍｌのヒトフィブロネクチン（Sigma Aldrich Chem Co）が２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によって３０分間、３７℃において飽和され、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって２回洗浄された。その後ジャーカット細胞は３７℃で２時間ウェル上に播種され、次いで非接着性細胞が吸引され、ウェルはＰＢＳですすぎ洗いされた。接着性細胞は、２％ホルムアルデヒドによって一晩固定され、エオシンＹで３０分間染色された。エオシンＹは、その後、１％の氷酢酸および５０％のエタノールの混合物の添加によって抽出され、５４０ｎｍにおいて吸光度が測定された。

インテグリンアルファ−４（ＶＬＡ−４）発現
モノクローナル抗−ＶＬＡ−４（クローンＨＰ１／７）による間接免疫蛍光法およびフローサイトメトリーによって、ジャーカット細胞におけるＶＬＡ−４抗原発現が検出された。細胞の染色は標準的な手順に従って実行され、フローサイトメトリー解析は、FACS-Caliburサイトメトリー（Becton Dickinson）を用いて実行された。

図１に関連した結果
ＮＡＣは、フィブロネクチンへのジャーカット細胞の接着性を増大させる。対照またはＮＡＣ処置された（５ｍＭ、２時間）ジャーカット細胞を用いて接着アッセイが実行された。エオシンＹによって染色した後、細胞の写真が撮られた。ＮＡＣ治療後における、抗−ＶＬＡ−４抗体による細胞のインキュベーションは、接着を抑制した。その後、細胞接着は、結合タンパク質コートされたプレートに対して付着された細胞をエオシンＹで染色し、マイクロプレートリーダーの吸光度を読み取ることにより、定量化された。図１に示されるように、ＮＡＣ前処理は、細胞接着をほぼ３５％増大させた。抗−ＶＬＡ−４により無効化された効果であった。

細胞は可溶化され、エオシンＹおよび吸光度が５４０ｎｍにおいて定量化された。抗体無しは黒の棒グラフで示され、抗−ＶＬＡ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）は灰色の棒グラフで示され、抗−ＶＬＡ−４（１０μｇ／ｍｌ）は白の棒グラフで示される。データは平均±ＳＥ（ｎ＝３）である。^＊は対照に対して０．０１よりも小さいＰである。図１より、ＮＡＣ治療は接着（結合タンパク質分子）を増大させることが結論される。

実験２
本実験は、インテグリンおよびフィブロネクチン遺伝子発現にＮＡＣ治療が影響を及ぼすかどうかを、Affymetrix GeneChipプラットフォームを使用した遺伝子発現解析によって解明するために実行された。

正常なヒト表皮角化細胞のマイクロアレイベースの遺伝子発現解析が、ＮＡＣを添加してから１時間後および１２時間後に、非処置（すなわち、同一時点における対照サンプル）と比べて実行された。GeneChip解析から得られたデータは、ＲＮＡ解析手法を使用して処理され、複数のサンプルは、それぞれ対応する対照に対して規格化された。２つの基準（ｐ値＜０．１、且つ、＞１．５倍上方制御または＞０．５下方制御）に基づいて、各時点に対してフィルタリングが行われた。ラベリングおよびハイブリダイゼーションは、デュプリケートで行われた。

ＮＡＣ治療の１時間後、インテグリンアルファ２は上方制御されていることが見出された。１２時間においては、フィブロネクチンが上方制御されていることが見出された。これらの結果は、インテグリンおよびフィブロネクチンの逐次的な上方制御を介して、増大した接着をＮＡＣ治療がもたらすこと、および、複数の効果のいくつかは、治療の１時間後には既に見えていることを示唆している。

実験３
マウスにおいて、ＮＡＣは胚着床を支援することが確認された。動物モデルにおいては、マウスにオキシトシンが与えられた場合、胚着床率は減少した。ＮＡＣは、投与量に依存して、オキシトシン治療されたマウスにおける着床率を回復させた。これは、胚着床におけるオキシトシンの関与に対する証拠を与えた。

ＮＡＣの胚毒性を検証するために、２つの胚毒性技術（ウサギ胚バイオアッセイおよびヒト精子運動性バイオアッセイ）の適用が使用された。どちらも、治療血液濃度の５０倍の濃度まで、ＮＡＣの胚毒性効果を検出できなかった。ＮＡＣは、１細胞ウサギ胚の生存に対して影響を及ぼさず、また、孵化されたウサギ胚盤胞の割合を減少させないことが示された。ヒト精子に実行された試験もまた、悪影響は示さなかった。

実験４
ＮＡＣが子宮の収縮を減少させることを示す動物モデル
実験計画
動物達は２２℃に保たれ、各ケージ当たり３匹収容され、自由に餌を与えられた。日常の膣スミアの調査によって決定された、発情期にある未交尾のウィスター系ラット（２００−２８０ｇ）から単離された子宮が使用された。

試薬
硫酸プロタミン（ＰＳ）およびＮＡＣが純水中に溶解された。

分離オルガンバス研究
全てのラットは頸椎脱臼によって犠牲とした。子宮角が切除され、注意深くきれいにされ、De Jalon液（ＮａＣｌ１５４ｍＭ、ＫＣｌ５．６ｍＭ、ＣａＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ０．４１ｍＭ、ＮａＨＣＯ_２５．９ｍＭ、および、グルコース２．８ｍＭ）を含み、３７℃において９５％の酸素および５％の二酸化炭素で通気された、体積１０ｍｌのオルガンバス中に１ｇの張力下で垂直に取り付けられた。（４５分間の）平衡期間の後、子宮が（自発的またはカルシウムイオンにより誘起された）安定な収縮を示した時、インドメタシン（１μｇ／ｍｌ）がＰＳの前に加えられた。１０分後、収縮の完全な停止が観察されるまで、増加する濃度のＰＳが加えられた。

子宮筋張力が等尺性的に、オルガンバスおよびトランスデューサーにより記録された。

データ解析および統計手順
子宮収縮に対する治療の複数の効果が、対照、非処置、および収縮条件に対するパーセントとして計算された。各データ値は、平均±ＳＥＭとして表されている。複数のグループ間の差は、２要因の分散分析によって解析された。ＥＣ５０値が、１要因の分散分析を使用して比較された。

結果
ＰＳは、投与量に依存した、自発的に活動する子宮の弛緩を引き起こした。ＮＡＣ前処理（１μｇ／ｍｌ）は、ＰＳにより誘起された弛緩を増大させた。ＰＳはまた、投与量に依存した、カルシウムイオンにより誘起された子宮収縮の弛緩を引き起こした。ＮＡＣ前処理は、子宮収縮のＰＳにより誘起された弛緩を調節し、ＰＳにより誘起された弛緩の曲線を変化させた。

ＰＳ処置された子宮に対するＥＣ５０値が解析された。使用された収縮のタイプおよび使用された治療法に関して、ＥＣ５０値における有意な差が見られた。カルシウムイオンにより誘起された子宮中よりも、自発的に活動する子宮中において、ＥＣ５０は低かった。インドメタシン（１μｇ／ｍｌ）によって前処理された自発的に活動する子宮に対するＥＣ５０値は、取得されたその他２つのＥＣ５０値よりも著しく低かった。しかしながら、インドメタシンによって前処理されたカルシウムイオンにより誘起された活動する子宮は、ＰＳ処置された子宮と比べて、より高いＥＣ５０値を示した。

本発明の実施形態によるＮＡＣの効果を示す。

一般的なＮＡＣ
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）は、良く知られた低分子量の調合薬であり、次の化学式を有する。

ＮＡＣの特徴は主にそのチオール基に関連しており、１０ｍＭを越える程の比較的高い濃度で全てのヒトの組織中に存在するトリペプチドグルタチオン（ＧＳＨ）が作用する大抵の生化学的経路においてＮＡＣを有効にする。システインは実際のところ、ＧＳＨを構成する３つのアミノ酸のうちのひとつであるので、ＮＡＣは、その脱アセチル化されたシステインを有するＧＳＨの前駆体とみなされる。ＮＡＣは、これまで粘液溶解薬として広く使用されてきたし、また依然としてそうである。そこでの作用モードは、一般的に、粘液タンパク質中の感受性のシステイン二硫黄架橋の酸化還元破壊に起因するとされている。実際のところＮＡＣは、いくつかの酵素が作用する、チオール基の複雑な酸化還元サイクルに関与する。実際、生理学的に極めて重要なことは、ジスルフィド形成およびサイクルの破壊であり、これによりタンパク質活性および細胞の信号伝達が制御される共通のメカニズムである。例えば、タンパク質チロシンホスファターゼおよびチロシンキナーゼのような複数の酵素が、細胞周期、細胞増殖および分化の制御において極めて重要な役割を果たす。それらの多くは、それらのシステインの酸化還元状態によって制御される。

全体としては、作用の詳細なメカニズムは最終的には解明されていないが、ＮＡＣは、ＧＳＨが作用する全ての生化学的経路において作用するようである。ＧＳＨによってその活動が調節される複数の酵素およびタンパク質は、直接に、または、複数の信号変換経路網を通じてのどちらかで、いくつかのプロセスにおいて働く。この状況においてＮＡＣは、ＧＳＨの作用と匹敵し得るか、あるいは、ＧＳＨよりも効果的でさえあり得る。

ＧＳＨは、例えば、通常はパラセタモールによって形成された反応性代謝物に共役され、それらを解毒することを促進する。しかしながら、パラセタモールが過剰に投与されるとＧＳＨが消耗され、パラセタモール代謝産物が細胞のタンパク質と反応を開始し、最終的には細胞死につながる。パラセタモール中毒後の劇症肝不全の治療においてＮＡＣは、ＧＳＨの代わりに、パラセタモール代謝産物の解毒に作用する。ＮＡＣには、望ましくない副作用が実質的に無いと信じられている。これはまた、パラセタモール中毒の治療において使用される、７０ｋｇの人に対して約４０ｇ／日と推定される高いＮＡＣ投与量によっても示される。

胃の中で既に分解されることができるトリペプチドＧＳＨとは反対に、単純なＮＡＣ分子は、ほとんど全ての組織および細胞中に自由に拡散する。ＮＡＣ薬物動態研究は、約１時間で血漿のピーク濃度に到達し、半減期が約３時間であると決定した。完全な除去は、６から１２時間の間に起きる。

抗増殖性分化誘導薬としてのＮＡＣ
本発明者達は、最近、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）が、上皮性起源の癌細胞に対して著しい抗増殖効果を持つことを見出した（Cell Death and Differentiation 2005, 12(10): 1285-1296）。

全て上皮性起源である、２つの腺がん細胞株において、および原発性正常角化細胞において、増殖を阻止し、分化を誘起するためにＮＡＣが使用された。これらの系において、形態学的に、生化学的に、および遺伝子発現解析を介して、分化が特徴付けられた（遺伝子発現解析はBMC Cancer 2005, 5: 75において広く報告されている）。

癌の研究におけるＮＡＣの抗増殖効果は、細胞死または毒性とは関連していなかった。その代わり、生理学的な分化経路の活性化によるものであった。これは、原発組織に向かった細胞機能の正常化とみなすことができる。

増殖の減少に加えて、ＮＡＣ処置された癌細胞の形態も変えられた。体外において、増殖中の上皮細胞は、不規則な形態−間葉の形態−を示し、しばしば、いくつかの多重細胞層を形成する。これとは反対に、細胞が、それらの最終目標組織の構造および機能に向けて分化プロセスを行う場合、それらは増殖を停止し、それらの形態は規則的な多角形状となり、各細胞は時としてより厚く、隣接する複数の細胞の単一の層を形成する。このプロセスは、増大した細胞−細胞および細胞−基質結合によって達成され、増殖する間葉型から、接着性で運動性の低い分化した表現型への転換と一致する。

概して、無制限増殖を阻止し、それらの末端分化を誘起することに全て収束する、複雑な一連の代謝変化が、癌細胞に対するＮＡＣの補給後に検出された。特に、ＮＡＣ治療は、細胞−細胞および細胞−基質接着複合体のかなりの増加を誘起した。無制限増殖は、細胞が接触阻止および分化信号に対して応答するそれらの能力を失った状態とみなすことができる。分化経路に入っている細胞は、細胞−細胞結合複合体の著しい増加を示し、プロセスはまた、概して接触阻止として示された。細胞が分化終点に入るための信号は、細胞−細胞複合体自体の構成成分に由来することをいくつかの証拠が示している。これらの結合はまた、複数の細胞間での信号の拡散に対する通路でもある。

投薬計画
腺がん細胞株および原発性正常角化細胞に対するＮＡＣ治療の研究（Cell Death and Differentiation 2005, 12(10): 1285-1296）から、抗増殖−分化効果の誘起に対して効果的なＮＡＣの投与量は変化すること、および、細胞のタイプに依存することが結論された。従って、原発組織は増殖の完全な阻止を観察するために必要とされる効果的なＮＡＣ濃度に影響を及ぼし、それぞれの組織に対して決定されねばならない。さらに、ＮＡＣの投与量はまた、細胞悪性度にも関連した。詳細に言うと、正常細胞は、増殖することを停止し、分化を開始するために低い投与量を必要としたのに対し、特徴的な予後不良を有する癌細胞は、より高いＮＡＣ濃度を必要とした。

本発明の目的のために、ヒトを含めた哺乳類におけるＩＶＦの治療に対するＮＡＣの投薬計画が、以下の基準に基づいて開発された。
１）その他の現在の臨床治療に従ったものであり、望ましくない副作用が無いと考えられる一日当たりのＮＡＣの投与量。
２）長期にわたる治療後のＮＡＣ血漿レベルにおける減少が報告されている（Pendyala L, Creaven PJ. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1995; 4:245-51）ことを前提として、２ヶ月またはそれよりも長い間の治療における最適な生物学的反応に対して、各週の約半分に及ぶ治療の停止が考慮された。

本発明の組成物は、一実施形態に従ったＩＶＦの治療に向けたものであり、おおよそ５０から１５０ｍｇ／ｋｇ／日の間の投与量で静脈内投与されるべきＮＡＣを含む。下限はＩＶＦにおいて効果的であることが示され、上限は実質的に副作用が無いことが知られている。

本発明のさらに別の実施形態において組成物は、おおよそ３０−４５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で経口で投与されるべきＮＡＣを含む。この低い投与量は、驚くべきことに子宮内膜症の治療において効果的であることが示されており、また、ＩＶＦに関連しても効果を与える。

一実施形態においては、経口組成物は、２ヶ月またはそれ以上、あるいは、好ましくは３ヶ月またはそれ以上の期間にわたって投与されるべきものである。長期にわたる治療後のＮＡＣ血漿レベルの減少に対抗するために、ＮＡＣは、間欠的な様式によって、つまり、間欠的投薬計画／治療によって、所定の投与量で投与されてよい。間欠的な投与または治療によってとは、治療を複数の期間に分断することを意味する。つまり、医薬組成物がある期間（例えば数日間）投与され、続いて、医薬組成物がある期間（例えば数日間）全く投与されない投与の中断を設けることを意味する。間欠的な治療は規則的であってよい。例えば、固定の日数もしくは週数の間治療を行い、続けて、固定の日数もしくは週数の間中断する。例としては、各週において４日間治療を行い、続いて３日間中断する繰り返し計画や、あるいは、２週間治療してその後１週間中断する繰り返し計画を含む。規則的な間欠的治療の特別な場合が、パルス状の治療、つまり、規則正しい治療と中断の継続期間を持つことである。例えば、１日おきの投与、または、２日間投与して次の２日間は中断する、等である。例えば治療に対する応答に応じて、規則的でない繰り返しや、もっと複雑な繰り返される計画を有する不規則な間欠的治療計画も考えられる。本発明の様々な例示的実施形態においては、ＮＡＣの所定の投与量が、３−５日間連続して投与された後２−４日間中断されるか、あるいは、１−３日間連続して投与された後１−２日間中断される。

一実施形態においては、おおよそ６０ｋｇの体重を参照すると、ＮＡＣ投与量は、１．２から５．４ｇ／日の間、好ましくは１．８から３．６ｇ／日の間の範囲内である。投与量は、２回またはそれ以上、好ましくは３回または４回であって、各回１もしくは２投与量（例えば錠剤）のいずれかであるような、日々の投与に分割されてよい。ここで、各投与量は、例えば０．１５−２．７ｇのＮＡＣ、あるいは、好ましくは０．６−１．２ｇのＮＡＣを含んでよい。治療は、上記の投与量をパルス状に、または間欠的に投与することを含む。例えば、１日おき、または各週３から４日間連続して投与し、それぞれ４から３日間停止する。最小の総治療継続期間は２ヶ月であり、最大継続期間は無い。その他の体重の患者、例えば体重超過または体重不足の人に対しては、それに従って日々の投与量が調節される必要がある。

本発明の一実施形態においてＩＶＦの治療用の医薬組成物は、少なくとも３ヶ月のように、少なくとも２ヶ月の期間にわたって、一日当たり２またはそれ以上の投与で投与されるべき１５０−５４００ｍｇの投与量でＮＡＣを含む。本発明の好ましい実施形態において医薬組成物は、少なくとも最大３ヶ月のように、少なくとも２ヶ月の期間にわたって、一日当たり２またはそれ以上の投与で投与されるべき２３０−３６００ｍｇの投与量でＮＡＣを含む。治療は、上記の投与量をパルス状に、または間欠的に投与することを含む。例えば、１日おき、または各週３から４日間連続して投与し、それぞれ４から３日間停止する。

ＮＡＣはまた、セレノメチオニンの形態のセレンおよび／またはメラトニンと共に投与されてよい。そのような組み合わせは、欧州特許出願１２７１００６２．６号明細書にさらに記載されている。

医薬調製物
本発明に従った医薬組成物は、薬学分野の当業者にはそれ自体が知られている態様で調製されてよい。組成物は、本発明に従った有効量のＮＡＣ、並びに、活性成分に対する賦形剤または媒体として働く適切な担体または賦形剤を含んでよい。そのような担体または賦形剤は、当該分野で知られたものである。医薬組成物は、好ましくは静脈内投与用である。錠剤、カプセル、座薬、懸濁液、シロップ、等のようなその他の形態も考えられる。本発明は、有効な投与量を得るために、ＮＡＣ調製の薬学的品質の厳密な評価を必要とする。従って、ブランドのまたは保証されたジェネリック調製物が使用されねばならない。ＮＡＣは安定な分子ではなく、その活性なチオール残基が酸素、光、およびその他の照射によって容易に酸化され得る。そうすると有効な投与量に到達しないであろう。従って調製物は、好ましくは、溶解の間に水から酸素を部分的に除去するのに役立つ炭酸水素ナトリウムとともに、溶解性の錠剤中で光から保護される。

ＮＡＣの高い経口投与量は腹痛を引き起こしかねないことが観察されてきた。経口投与の場合にこれを克服するための選択肢は、胃の中でのＮＡＣの放出／溶解性を妨げるのに適した胃の保護剤と一緒の調製物中でＮＡＣを提供することである。そのような調製物はこの分野ではよく知られており、本発明にも使用され得る。例えば、胃液に対して抵抗力があり、胃を通過した後、腸の中でのみ薬剤を放出することのできる錠剤コーティングが使用され得る。通常使用される調製物は、セルロース誘導体、メタクリル酸アミノエステル共重合体のようなポリマーを含む。このコーティングは、胃を通り過ぎた後でｐＨが増加することに呼応して膨潤または溶解化し薬剤を放出するｐＨ感受性ポリマーを使用することによって、胃の酸性環境下で錠剤の中心部が分解されることを防ぐ。

別の選択肢は、一度に血流に入るＮＡＣの投与量を低くすることである。毎日３回またはそれ以上の回数ＮＡＣを投与することは、患者にとって達成することが困難となり得る。にもかかわらず、ほとんど一定のＮＡＣの血清濃度を達成するためには、繰り返される投与が望ましいことであり得る。これらの問題を克服するために、例えば、朝と夜のように、１日１回または２回の投与が患者にとって扱い易いであろう。１つの選択肢は、徐放性剤（持続放出性、あるいは制御放出性とも呼ばれる）としてＮＡＣを提供することである。血流へのＮＡＣの拡散および取り込みの速度を低減できることにより、そのような調製物は、より長い間隔でより多くの投与量の投与を可能にする。その後、投与量は、例えば１日２回の投薬計画の場合には、１２＋１２時間に及ぶ長い時間をかけて少量ずつ血中に分配される。徐放性に関する多くの様々な技術や調製物がこの分野で長い間知られており、本発明にも適用され得る。そのような技術においては、例えば、投与された場所では体液中で不溶性または難溶性のコーティングあるいは基質中に、活性物質が封入されている。

徐放性と胃の保護剤の効果を組み合わせた調製物も可能であり、本発明において使用されてもよい。

ヒトにおける例
ＩＶＦ治療に関連した投与
胚移植前のＮＡＣの臨床適用のまさに最初のケースが、最近文書に記録された。総数８個の良好な品質の胚が関与する５回の胚移植を以前に受けた４２歳の患者に対して、５０ｍｇ／ｋｇの濃度でＮＡＣが投与された。胚移植の直前に、超音波によって、増大した子宮収縮活動の存在が確認された。５０ｍｇ／ｋｇ体重のＮＡＣが、６０分間にわたる静脈への点滴で投与された。６０分間にわたる５０ｍｇ／ｋｇ体重のＮＡＣの投与の終了から６０分経って、胚移植が実行された。点滴を接続する前および胚移植の直前の両方において、経膣サジタルスキャン記録が実行された。これにより、３分間当り１０回の収縮から３分間当り５回の収縮へと子宮収縮が減少し、且つ、それらの振幅の明らかな減少を記録したことが確認できた。治療の成功は、健康な娘の出産によって確認された。

パルス型投与
以下は、１５人の患者に対してＮＡＣのパルス型投与を与えた結果であり、そのうち８人が妊娠した。

これに従うと、ＮＡＣは、以下のスケジュールに従って３ヶ月またはそれ以上にわたり、経口で患者達に投与された。６００ｍｇ、１日３回、１週間のうち３日間連続。この手順を採用したことは、以下の考察に基づいたものであった。（１）１．８ｍｇという毎日の総ＮＡＣ投与量は、実質的に副作用が無く、他の臨床的適応に対して既に考慮されていた（K. R. Atkuri, J. J. Mantovani, L. A. Herzenberg, and L. A. Herzenberg, "N-acetylcysteine-a safe antidote for cysteine/glutathione deficiency," Current Opinion in Pharmacology, vol. 7, no. 4, pp. 355-359, 2007）。（２）総投与量を３回に分割することは、患者達にとって簡単であり、既知のＮＡＣ薬物動態学（L. Pendyala and P. J. Creaven, "Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of N-acetylcysteine, a potential chemopreventive agent during a phase I trial," Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention, vol. 4, no. 3, pp. 245-251, 1995）と関連して、ほとんど一定の薬剤の血漿レベルを与える。（３）４日間の薬剤無しの間隔は、長期にわたる治療の間に観察されるＮＡＣ血漿レベルの報告される減少を制限するのに役立つウオッシュアウト期間を提供する。

結果

本発明と関連して使用されるべき調製物
一実施形態において本発明は、ＩＶＦ治療に関連して、１−３日間にわたる１日１回の５０−１５０ｍｇ／ｋｇ体重の間のＮＡＣの静脈投与用に、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）を含む医薬組成物を提供する。

１つの態様は、１−３日間にわたる１５０ｍｇ／ｋｇの投与量での使用に向けた、ＮＡＣを含む医薬組成物である。

別の態様は、ＩＶＦ治療と同一の日のみの使用に向けた、ＮＡＣを含む医薬組成物である。

本発明のさらに別の実施形態において組成物は、おおよそ３０−４５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で経口で投与されるべきＮＡＣを含む。

ＮＡＣがセレンおよび／またはメラトニンと組み合わされた場合、ＮＡＣは、５−４５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される。セレンはセレノメチオニンの形態であって、０．４−１．２μｇ／ｋｇ／日の投与量での投与用であり、メラトニンは０．０２−０．０８ｍｇ／ｋｇ／日の投与量での投与用である。医療用製品は、一実施形態においては、ＮＡＣ、セレノメチオニンの形態でのセレン、およびメラトニンを含む医薬組成物である。

また、３ヶ月の期間に及ぶ、パルス型または間欠型であって、投与される日のＮ−アセチル−Ｌ−システインの投与量が２０から９０ｍｇ／ｋｇ／日の間である経口投与は、ＩＶＦの成功に対して有益な効果を与えるだろう。その場合、組成物は、３ヶ月またはそれ以上にわたる連続的な投与用、または、３−５日間連続し、続いて２−４日間中断する投与用である。別の実施形態においては、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを含む医薬組成物は、１−３日間連続し、続いて１−２日中断する投与用である。

本明細書に記載される複数の例に従うと、１５人の患者達は、ＩＶＦでの使用に向けたＮ−アセチル−Ｌ−システインのパルス型投与によって、３ヶ月またはそれ以上の間、３日間連続し、続いて４日間の中断の間に、１日３回、６００ｍｇの投与量で経口で処置された。

以下のようなその他の可能な投与計画は、欧州特許第２３０５２３８号明細書に記載されている。

一実施形態においては、上記の使用に向けてＮ−アセチル−Ｌ−システインを含む医薬組成物は、投与される日において、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの投与量が３０から６０ｍｇ／ｋｇ／日の間であるような投与用の組成物である。別の実施形態においては、医薬組成物は、投与される日において、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの投与量が３０から４５ｍｇ／ｋｇ／日の間での投与用である。

一実施形態において本発明は、上記の使用に向けてＮ−アセチル−Ｌ−システインを含む医薬組成物を提供する。ここで、医薬組成物は光から保護されている。別の実施形態においては、医薬組成物は水溶性の錠剤である。さらに別の実施形態においては、医薬組成物は炭酸水素ナトリウムを含む。一実施形態においては、医薬組成物は徐放性剤および／または胃の保護用の調製物である。

１つの態様において本発明は、ＩＶＦに関連する哺乳類の治療方法を提供する。これは、ＩＶＦ治療に関連して、１−３日間、１日１回、５０−１５０ｍｇ／ｋｇ体重の間のＮＡＣとなるよう、哺乳類に対し、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）を含む医薬組成物を静脈内投与することを含む。

別の態様は、ＩＶＦ治療と同一の日のみにおけるＮＡＣの静脈投与を含む方法である。上記の実施形態によれば、以下の構成もまた開示される。
（項目１）
Ｎ−アセチル−Ｌ−システインをそれ自体で含む、または、少なくとも（ｉｉ）セレノメチオニンの形態のセレン、（ｉｉｉ）メラトニン、および、生理学的に許容されるそれらの塩の少なくとも一つと共に含む医薬組成物を投与する段階を備える、ＩＶＦに関連した哺乳類の治療方法。
（項目２）
上記哺乳類に対し、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを含む医薬組成物を、５０から１５０ｍｇ／ｋｇ／日の間のＮ−アセチル−Ｌ−システインの投与量で１−３日間にわたり静脈内投与する段階を備える、項目１に記載の哺乳類の治療方法。
（項目３）
哺乳類に対し、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを含む医薬組成物を、３０から４５ｍｇ／ｋｇ／日の間のＮ−アセチル−Ｌ−システイン投与量で１−３日間にわたり経口で投与する段階を備える、ＩＶＦに関連した哺乳類の治療方法。
（項目４）
ＩＶＦ治療に先立って、３ヶ月またはそれ以上の期間にわたり、哺乳類に対し、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを含む医薬組成物を、６００ｍｇの投与量で３日間連続して経口で投与し、続いて４日間治療無しとする、経口で投与する段階を備える、哺乳類の治療方法。
（項目５）
上記医薬組成物は、５０ｍｇ／ｋｇの投与量で１日に投与される、項目２に記載の方法。
（項目６）
上記医薬組成物は、ＩＶＦ治療が実行される日の朝に投与される、項目５に記載の方法。

別の態様は、ＩＶＦ治療と同一の日のみにおけるＮＡＣの静脈投与を含む方法である。

Claims

Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）をそれ自体で含み、または、少なくとも（ｉｉ）セレノメチオニンの形態のセレン、（ｉｉｉ）メラトニン、および、生理学的に許容されるそれらの塩の少なくとも一つと共に含み、哺乳類の雌の体外受精（ＩＶＦ）治療において使用される医薬組成物であって、
１−３日間にわたり、５０−１５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量のＮＡＣが１日１回静脈内投与されるように、または、３０−４５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量のＮＡＣが１日１回経口で投与されるように、あるいは、総継続期間３ヶ月またはそれ以上にわたり、６００ｍｇのＮＡＣが１週間のうち３日間連続で１日３回経口で投与され、続いて４日間薬剤投与されないように、ＩＶＦ治療に先立って用いられる、
医薬組成物。
１−３日間にわたり、５０−１５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で１日１回静脈内に投与されるように、または、３０−４５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で１日１回経口で投与されるように用いられる、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを含み哺乳類のＩＶＦ治療において使用される請求項１に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物は、ＩＶＦ治療に関連して、１−３日間にわたり、１日１回、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの投与量が５０−１５０ｍｇ／ｋｇ体重の間である静脈投与用である、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを含み哺乳類のＩＶＦにおいて使用される請求項１に記載の医薬組成物。
３ヶ月またはそれ以上にわたり、６００ｍｇの投与量のＮ−アセチル−Ｌ−システインが１週間のうち３日間連続で経口で投与され、続いて４日間薬剤投与されないように、ＩＶＦ治療に先立って用いられる、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを含み哺乳類のＩＶＦにおいて使用される請求項１に記載の医薬組成物。
１−３日間にわたる経口投与用の投与量が３０−４５ｍｇ／ｋｇであるように用いられる、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを含む請求項１に記載の医薬組成物。
ＩＶＦ治療と同じ日に投与されるように用いられる、５０ｍｇ／ｋｇの投与量のＮ−アセチル−Ｌ−システインを含む請求項１に記載の医薬組成物。
ＩＶＦ治療の１時間前に投与されるように用いられる、請求項６に記載の医薬組成物。