CN104768614B - N-乙酰基-l-半胱氨酸在制备治疗体外受精药物中的用途 - Google Patents

N-乙酰基-l-半胱氨酸在制备治疗体外受精药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在人或哺乳动物患者中NAC在IVF的新用途。此外，提供了NAC在IVF中的有效给药方案。

Description

N-乙酰基-L-半胱氨酸在制备治疗体外受精药物中的用途
技术领域
本发明涉及N-乙酰基-L-半胱氨酸在体外受精的新用途。
背景技术
体外受精(IVF)为卵子在体外被精子受精的过程。当其它辅助生殖技术的方法失败后体外IVF是不育的主要治疗方法。所述过程涉及监测妇女的排卵过程、从所述妇女卵巢内移出一个或多个卵子以及在实验室内的流动介质中让精子使所述卵子受精。当监测女性的自然周期以收集自然选择的卵子 (卵)以用于受精时，其被称为自然周期IVF。然后将受精卵子(受精卵)转移至患者子宫，以预期建立成功的怀孕。首次成功出生的“试管婴儿”，Louise Brown，发生于1978。Louise Brown作为自然周期IVF的结果出生。生理学家RobertG.Edwards开发了该治疗，其在2010年被授予生理学或医学的诺贝尔奖。(S K Kalra等人Fertility and Sterility Vol 95，no 6p1888-1889.In vitro fertilization andadverse Childhood outcomes:what we know,where we are going,and how we willget there.A glimpse into what lies behind and beckons ahead.B Almog etal.Fertility and Sterility Vol 94,No 6p 2026-2028. Promoting implantation bylocal injury to the endometrium)。
尽管在过去25年辅助生殖技术有显著进步，但即使是最先进的治疗如 IVF/胚胎植入(IVF/ET)的总体有效性也相对较低，平均为每治疗周期约 20-30％的活出生率(Nyboe-Andersen等人，Hum Reprod.2009；24(6):1267-87)。
胚胎植入为影响治疗结果的独立因素。成功胚胎植入的决定因素涉及胚胎质量、子宫接受性和子宫内环境的质量(Cavagna and Mantese，Placenta. 2003；24Suppl B:S39-47)。
子宫收缩构成子宫接受性的最基本成分。子宫收缩活动在胚胎植入中起重要作用。过度子宫收缩可减少IVF周期中的植入率，因为收缩活动可将胚胎从子宫排出(Fanchin等人Hum Reprod，1998；13:1968-74)。迄今为止，胚胎植入之前减少子宫收缩的治疗策略如使用β激动剂或非甾体抗炎药还没有显示出提供足够的益处；Moon等人，Fertil Steril2004；82:816-20；Tsirigotis 等人Human Reproduction and Embryology，2000年6月25-28日；Bologna， Italy:)。
治疗周期诱导雌二醇浓度大量增加，其在卵巢刺激结束时为约10–20 nmol/l，而相比之下，自然周期排卵之前为少于2nmol/l。预期超生理浓度的雌二醇诱导缩宫素的局部(子宫内膜)产生、缩宫素受体形成、和PGF2a的间接形成/释放，其实际上类似于分娩前状态。而且，分娩过程中子宫收缩的诱导和保持都涉及缩宫素和加压素。
已表明与自然周期中排卵前的情形相比，当在胚胎植入之前测量时， IVF周期中的子宫收缩活动增加到约6倍。子宫收缩在人生殖中起重要作用，且在快速和定向的精子运输和高的子宫底部(fundal)胚胎植入中有效涉及。
在IVF/ET治疗中，卵子收集后观察到子宫收缩逐渐减少，在胚泡移植 (卵子收集5–6天后)时达到几乎休眠状态(Fanchin等人，Fertil Steril 2001；75: 1136-40)。认为这种收缩活动的减少进一步增强胚泡移植达到的更高植入率。然而，大多数胚胎仍然在受精后第2或3天移植，在显著的子宫收缩活动期间。
预期胚胎植入过程本身增加局部缩宫素和前列腺素的释放。对阴道或子宫颈任何另外的操作，如使用挟钩，提供了对缩宫素/前列腺素释放额外的刺激(Dorn等人，1999)，其伴有子宫收缩的增加。Mansour等人证实，在多于一半的具有用亚甲基蓝染料的模拟胚胎植入的患者中，观察到在该过程后染料运输至阴道(Mansour等人，Hum Reprod 1994；9:1257-9)。还证实少于 50％的转移的胚胎在转移1小时后保留在子宫中，且约15％胚胎在胚胎植入后可在阴道中发现(Poindexter等人Fertil Steril，1986；46:262-7)。
考虑到以上内容，已表明胚胎植入时子宫收缩活动且尤其是子宫底部 (fundo-cervical)收缩可能将胚胎从子宫排出。Fanchin等人Human Reprod 1998；13:1968-74已估算出约30％的进行胚胎植入的患者具有显著的子宫收缩。在该组中，IVF/ET治疗的成功率不到具有‘沉默’子宫的患者人群的三分之一(16％对比53％的临床怀孕)。该差异不依赖评估中观察到的子宫收缩方向。这可暗示胚胎植入时增加收缩的药理学抑制可能为潜在治疗的引人注目的靶点。
被PGF2a/缩宫素系统的干扰和可能的子宫内膜灌注的改善可能为子宫收缩会减少和改善子宫接受性的一个机理。
体外受精–胚胎植入(IVF-ET)的有效性通常为在每治疗周期不超过30％(NyboeAndersen A，Gianaroli L，Felberbaum R，de Mouzon J，Nygren K. Assistedreproductive technology in Europe，2001.Results generated from Europeanregisters by ESHRE.Hum Reprod 2005；20:1158–76)，且在大于36岁的女性中进一步降低。(Stolwijk A,Wetzels A,Braat D.Cumulative probability of achieving anongoing pregnancy after in-vitro fertilization and intracytoplasmic sperminjection according to a woman’s age,subfertility diagnosis and primary orsecondary subfertility.Hum Reprod 2000；15:203–9)。
良好的胚胎质量和最佳子宫内环境是ET和整体IVF-ET过程成功的基本决定因素。促成植入的理想的子宫内条件包括合适的子宫内膜状况，足够的子宫内膜灌注和没有过度子宫收缩。特别是，增加的子宫收缩活动可将胚胎从子宫排出。(Mansour R,Aboulghar MA,Serour GI,Amin YM.Dummy embryo transfer using methylene blue dye.Hum Reprod1994；9:1257–9) (Poindexter A,Thompson D,Gibbons W.Residual embryos in failedembryo transfer.Fertil Steril 1986；46:262–7)。
植入和受孕率与子宫收缩和前列腺素合成(PG合成)的频率呈负相关。 ET时高子宫收缩活动(每分钟5次或更多的收缩)在约三分之一的患者中发现，且这些女性临床受孕率在每周期达到13％，相反较低子宫活性(每分钟3 次或更少的收缩)的女性成功怀孕为53％(Fanchin R,Righini C,Olivennes F, Taylor S,de Ziegler D,Frydman R.Uterinecontractions at the time of embryo transfer alter pregnancy rates after in-vitro fertilization.Hum Reprod 1998；13:1968–74)。而且，ET导管刺激子宫颈很可能诱导额外的PG合成和收缩反应且进一步降低成功胚胎植入的几率(Lesny P,Killick S,Tetlow R, Robinson J,Maguiness S.Embryo transfer—can we learn anything newfrom the observation of junctional zone contractions？Hum Reprod 1998；13:1540–6)。
然而，子宫收缩活动，其为子宫接受性的一个重要的构成，目前不是 ET接受者中的具体诊断或治疗的主题。孕酮补充，即使作用于子宫接受性时改善子宫内膜状况和减少子宫收缩，也没有显示出对IVF-ET后受孕的益处。(Fanchin R,Righini C,de Ziegler D,Olivennes F,Ledee N,Frydman R. Effects of vaginal progesterone administrationon uterine contractility at the time of embryo transfer.Fertil Steril 2001；75:1136–40)。
评估吡罗昔康(环氧合酶抑制剂)和利托君(β2-肾上腺素受体激动剂)有效性的研究已显示对受孕率的积极作用。(Moon H,Park S,Lee J,Kim K,Joo B.Treatment withpiroxicam before embryo transfer increases the pregnancy rate after in vitrofertilization and embryo transfer.Fertil Steril 2004；82:816–20； Tsirigotis M,Pelekanos M,Gilhespie S,Gregorakis S,Pistofidis G.Ritodrine use during theperi-implantation period reduces uterine contractility and improvesimplantation and pregnancy rates post-implantation。在European Society ofHuman Reproduction and Embryology的第16界年会上提供；2000年6月 25–28日；Bologna,Italy)。上述药物由于安全性问题没能进入常规临床使用。
最近，Moraloglu等人(Treatment with oxytocin antagonists before embryotransfer may increase implantation rates after IVF.Reproductive biomedicineonline 09/2010；21(3):338-43)报告了一个随机、安慰剂控制的实验，总静脉内输注剂量为37.5mg阿托西班(缩宫素拮抗剂)，其在160名患者中胚胎植入之前且直到胚胎植入2小时之后输注。该作者注意到植入率和临床受孕率二者显著的改善。每个移植胚胎的植入率为20.4％对比12.6％，且每周期的临床受孕率为46.7％对比28.9％(阿托西班对比安慰剂)。在研究组中观察到更少的早期流产(16.7％对比24.4％，阿托西班对比安慰剂)。
N-乙酰基-L-半胱氨酸(本文称为NAC)是一种公知的药物，其主要在对乙酰氨基酚中毒的治疗中用作溶粘蛋白剂。近年来，其也公认具有其他有益性质，例如作为抗炎和抗增殖药物，且已建议用于治疗多种不同病症和症状，除了子宫内膜异位，还有精神分裂症、糖尿病和癌症。
迄今，NAC还没被考虑作为生育力治疗的药物，尽管其已被用于口服治疗子宫内膜异位，如EP 2305238所述。在该研究中没有关于怀孕的结论。相反，当治疗子宫内膜异位时没有预期可发生任何怀孕。尽管之前没有公开，当分析数据时本发明者注意到，有一个口服NAC治疗子宫内膜异位的人具有成功的体外受精治疗。而且两个之前的IVF实验失败了，且导致流产。这是本发明者为何开始研究NAC是否可用于治疗IVF方面的原因之一。
事实上，在小鼠中，证实了NAC支持胚胎植入。在动物模型中，当小鼠给予缩宫素时胚胎植入率降低。在缩宫素治疗的小鼠中NAC剂量依赖性恢复植入率，其提供了证据表明在胚胎植入中涉及缩宫素。
现有技术
描述NAC治疗癌症的分子作用的背景技术包括:T.Parasassi等人Cell Death andDifferentiation(2005),Vol.12,No.10,1285-1296页；E.K. Krasnowska等人FreeRadicals Biology and Medicine 2008,45(11):1566-72；A. C.Gustafsson等人BMCCancer(2005),5:75。NAC治疗子宫内膜异位描述于 Pittaluga等人More than anantioxidant:N-acetyl-L-Cysteine in a murine model of endometriosis.Fertil&Steril 2010；94(7):2905-8。而且，C.H.Kim等人 (Abstracts of the 22nd AnnualMeeting of the ESHRE，Prague，Czech Republic， 2006年六月18-21日，P-463)描述了用N-乙酰基-半胱氨酸治疗以改善胰岛素敏感性。包含N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)本身或N-乙酰基-L-半胱氨酸与 (ii)硒代蛋氨酸形式的硒和/或(iii)褪黑素和/或其生理可接受的盐的组合的制剂描述于EP 12710062.6。该制剂也可用于治疗IVF。
发明目的
从有IVF一开始，体外受精治疗的临床结果不良就一直是个问题。因IVF的花费高且治疗通常在每治疗周期仅给出20-30％的活出生率，所以测试了许多不同的治疗以得到更高百分比的活出生率。现在出乎意料地发现优选在体外受精治疗之前几天给予NAC得到更高百分比的活出生率。而且，在许多早先的体外受精治疗未成功的情况下，预先给药NAC与新的体外受精治疗相结合导致了活出生率。
据本发明者所知，本申请权利要求所限定的NAC治疗在体外受精(IVF) 中的临床结果在现有技术中尚未确定，且对于治疗IVF或将NAC用于治疗与IVF相关的适应症也没有提出一个有效的给药方案。
因此本发明的一个大体目标在于提供解决上述问题的方案，即提供含 N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)的药物组合物用于治疗在人和哺乳动物中的 IVF和与IVF相关的适应症。
发明内容
根据本发明，将包含N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)的药物组合物用于静脉内和/或口服给药。该制剂包含N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)本身或其与(ii) 硒代蛋氨酸形式的硒和/或(iii)褪黑素和/或其生理可接受的盐的组合。
包含NAC本身的制剂含有70-150mg/kg体重的NAC，每天一次给药保持1-3天，且与体外受精治疗相关联。还可仅给药一次，即在IVF实施当天给药。在该情况下在IVF之前约1小时给药。
实施例
胚胎毒性
初步测试了NAC胚胎毒性的最终出现。为验证NAC的胚胎毒性，使用了两种胚胎毒性试验–兔胚胎生物测定和人精子运动性生物测定(参见 Pierzynski等人，2007a)。两者在浓度高达治疗血药浓度50倍时都没有检测到NAC的胚胎毒性作用。显示NAC不影响1-细胞兔胚胎的存活，且不减少孵化的兔胚泡的百分比。对人精子的测试也没有显示出不利的影响。
毒性测试-人精子运动性生物测定
人精子运动性的评估在取自具有良好精液参数(包括精子运动性和速度) 的3个健康供体的新鲜样品上进行。使用人精子制备介质上的迁移或“向上游动”以选择有活力的精子。选择后，将各精子样品分成3等分，转移至埃彭道夫管。除了一个对照试管，两个试管以100和1,000nM的浓度添加NAC。试管在5％CO2环境中，以恒定温度和湿度条件培养24小时。精子运动性使用相差显微镜以400倍放大倍数在暴露于NAC 1小时和24小时后评估。以2分钟的固定时间间隔进行评估。通过36次测量评估9个样品的精子运动性和速度(每个样品在1和24小时2次测量)。
在人精子运动性生物测定评估中，当与对照比较时没有检测到NAC对人精子运动性或速度的作用。然而，实验的持续时间影响运动性，检测为精子的活性和速度逐渐降低。这种降低在对照和NAC处理的组中都观察到，在组间没有差异。没有发现时间和浓度之间的相互作用，因此在浓度为100 和1,000的2组中时间的作用没有显著不同。
体外
在植入过程中整联蛋白以高度调节的方式在母-胎界面表达。然而，整联蛋白-介导的胚胎附着至子宫内膜的过程中细胞外基质(ECM)配体的重要性并未完全理解。因此，纤连蛋白在大鼠子宫和胚泡中的分布在植入时进行研究。纤连蛋白在子宫腔上皮细胞中不存在，但在滋养层细胞和内细胞群中强烈表达，表明从胚泡分泌的纤连蛋白可能为母胎界面表达的整联蛋白的可能的桥联配体。使用Arg-Gly-Asp(RGD)肽以阻断整联蛋白上的RGD识别位点，且检查了对大鼠胚泡向Ishikawa细胞附着的作用。当胚泡或Ishikawa 细胞用RGD-阻断肽预培养时，存在显著的胚泡附着的减少。因此，胚胎向子宫内膜成功的附着需要子宫内膜和胚泡两者上的整联蛋白与ECM配体的 RGD序列(如纤连蛋白)的相互作用。用RGD肽预处理胚泡和Ishikawa细胞二者还抑制胚泡附着，但并不完全抑制，表明不包含RGD序列的ECM桥联配体也在胚胎附着中涉及(Kaneko Y,Murphy CR,Day ML.Extracellular matrixproteins secreted from both the endometrium and the embryo are required forattachment:A study using a co-culture model of rat blastocysts and Ishikawacells.J Morphol.2013；274(1):63-72)。
实验1
进行本实验以阐明NAC处理是否影响连接(粘连)蛋白质，包括整联蛋白/纤连蛋白。
细胞粘着测试.7μg/ml人纤连蛋白(Sigma Aldrich Chem Co)在37℃用 2％牛血清白蛋白(BSA)浸渍30分钟且用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次。然后在37℃将Jurkat细胞接种在孔上保持2小时；然后，吸出未附着的细胞，将孔用PBS淋洗。附着细胞用2％甲醛固定过夜且用曙红Y染色30分钟。然后通过添加1％冰醋酸和50％乙醇的混合物提取曙红Y，吸光度在540nm 测量。
整联蛋白α-4(VLA-4)表达.VLA-4抗原表达通过间接免疫荧光使用单克隆抗-VLA-4(克隆HP1/7)和流式细胞术在Jurkat细胞上检查。细胞染色根据标准方案进行，且流式细胞术分析通过使用FACS-Calibur细胞计数器 (Becton Dickinson)进行。
关于图1的结果
NAC增加Jurkat细胞在纤连蛋白上的附着。附着测试通过使用对照或 NAC(5mM保持2h)-处理的Jurkat细胞进行。用曙红Y染色后将细胞拍照。 NAC处理后将细胞与抗-VLA-4抗体孵育，抑制了附着。细胞粘附然后通过如下定量：用曙红Y染色附着至连接蛋白-涂覆的板的细胞且读出微板读数器的吸光度。如图1所示，NAC预处理增加细胞粘附接近35％，该作用通过抗-VLA-4消除。
将细胞溶解且曙红Y和吸光度在540nm定量。无抗体由黑色条表示；抗-VLA-4(10ng/ml)由灰色条表示；且抗-VLA-4(10μg/ml)由白色条表示。数据为平均值+/-SE(n＝3)。*，P小于0.01vs.对照。从图1可以得出NAC处理增加粘附(连接蛋白分子)。
实验2
进行本实验以阐明NAC处理是否影响整联蛋白和纤连蛋白基因表达，其通过使用Affymetrix GeneChip平台进行基因表达分析。
正常人表皮角质形成细胞的基于微阵列的基因表达分析在添加NAC后 1和12小时进行，与未处理(即相同时间点的对照样品)比较。GeneChip分析所得的数据使用RNA分析方法处理且将样品归一化至它们相应的对照。各时间点的过滤基于两个标准进行(p-值<0.1和>1.5倍上调或>0.5下调)。标记和杂交一式两份进行。
在NAC处理整联蛋白α2后1小时，我们发现上调。在12小时，发现纤连蛋白上调。这些结果表明通过相继上调整联蛋白和纤连蛋白，NAC处理导致增加的粘附，且一些作用在处理后1小时已能观察到。
实验3
在小鼠中，证实NAC支持胚胎植入。在动物模型，当对小鼠给予缩宫素时胚胎植入率降低。在缩宫素处理的小鼠中NAC剂量依赖性恢复植入，其提供证据表明在胚胎植入中牵涉缩宫素。
为验证NAC的胚胎毒性，使用两种胚胎毒性技术–兔胚胎生物测定和人精子运动性生物测定。两者在浓度高达治疗血药浓度50倍时都没有检测到NAC的胚胎毒性作用。显示NAC不影响1-细胞兔胚胎的存活，且不减少孵化的兔胚泡的百分比。对人精子的测试也没有显示出不利的影响。
实验4
动物模型显示NAC降低子宫收缩
实验设计
动物在22℃饲养，每笼3只，且随意进食。使用发情期的未交配Wistar 大鼠(200–280g)的分离子宫，其通过检查每日阴道涂片而确定。
试剂
将鱼精蛋白硫酸盐(PS)和NAC溶于纯净水。
分离的器官浴槽研究
所有大鼠通过颈脱位法处死。切除子宫角，小心清洁且垂直安置于10ml 体积的器官浴槽中，该浴槽包含De Jalon’s溶液(NaCl 154mM，KCl 5.6mM， CaCl2×2H2O 0.41mM，NaHCO 25.9mM和葡萄糖2.8mM)，在1g张力下，用95％氧气和5％二氧化碳在37℃充气。平衡期(45min)后，当子宫显示稳定收缩(自发或钙离子诱导的)时，添加吲哚美辛(1μg/ml)，然后PS。10分钟后，添加增加浓度的PS直到观察到收缩全部停止。
以与器官浴槽和转换器等容积的方式记录子宫肌层张力。
数据分析和统计程序
对于对照、未处理和收缩条件，治疗对子宫收缩的作用计算为百分比。各数据值表示为平均值±SEM。各组之间的差异通过双因素ANOVA分析。 EC50值使用单因素ANOVA比较。
结果
PS引起自发活动子宫的剂量依赖性松弛。NAC预处理(1μg/ml)增加 PS-诱导的松弛。PS还引起钙离子诱导的子宫收缩的剂量依赖性松弛。NAC 预处理调节子宫收缩的PS-诱导的松弛且改变PS-诱导的松弛的曲线。
分析PS-处理的子宫的EC50值。关于使用的收缩类型和使用的治疗，发现EC50值的显著差异。自发活动子宫的EC50低于钙离子诱导的子宫。用吲哚美辛(1μg/ml)预处理的自发活动子宫的EC50值显著低于所得的其它两个EC50值。然而，当与PS-处理的子宫相比，用吲哚美辛预处理的钙离子诱导的活动子宫呈现更高的EC50值。
发明详述
NAC概述
N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)为众所周知的低分子量药物，具有以下化学式
NAC的特征主要涉及其巯基，其使之在三肽谷胱甘肽(GSH)作用的大多数生物化学途径中是有效的，所述三肽谷胱甘肽(GSH)以相对高浓度存在于人组织中，甚至高于10mM。半胱氨酸是组成GSH的三个氨基酸之一，故 NAC被认为是具有去乙酰基半胱氨酸的GSH前体。NAC曾经并且目前仍然广泛地用作溶粘蛋白剂，其作用方式通常归因于粘液蛋白中的敏感的半胱氨酸二硫桥键的氧化还原裂解。实际上NAC参与复杂的巯基氧化还原循环，其中有若干种酶的作用。事实上，具有极为重要生理学意义的是二硫化物形成和裂解的循环，这是一种调节蛋白活性和细胞信号传导的普遍机理。酶，例如蛋白酪氨酸磷酸酶和酪氨酸激酶，例如在控制细胞周期、细胞增殖和分化中起着关键的作用，且许多这些酶通过其半胱氨酸的氧化还原状态而调节。
总之，尽管详细的作用机理尚未最终确定，NAC似乎在GSH作用的所有生物化学途径中都发生作用。由GSH作用调节活性的酶和蛋白，其活性调节是直接进行或通过一系列信号转导途径进行的若干过程。在该图中， NAC既可与GSH的作用相当，或者甚至可能比GSH更有效。
GSH例如通常结合于对乙酰氨基酚形成的活性代谢物，且有助于其解毒。当对乙酰氨基酚剂量过大时，GSH却被消耗，且对乙酰氨基酚代谢物开始与细胞蛋白反应，最终导致细胞死亡。在对乙酰氨基酚中毒后对暴发性肝功能衰竭的治疗中，NAC在对乙酰氨基酚代谢物的解毒过程中代替GSH 起作用。NAC被认为实际上不存在不利的副作用，这也通过在对乙酰氨基酚中毒的治疗中用高剂量NAC进行评估(对体重70kg的个体而言，约40g/ 天)而得以证实。
与胃中可降解的三肽GSH相反，更简单的NAC分子自由地扩散入几乎所有组织和细胞中。NAC药代动力学研究测定在约1小时内到达的血浆峰浓度，其半衰期为约三小时。6至12小时发生完全清除。
NAC作为抗增殖分化剂
本发明者最近发现N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)对于上皮来源的癌细胞具有显著的抗增殖作用(Cell Death and Differentiation 2005，12(10): 1285-1296)。
NAC用于终止两种腺癌细胞系和原发正常角质化细胞的增殖和诱导其分化，上述两者均为上皮来源。在这些系统中，所述分化由形态学、生物化学和经基因表达分析来表征(所述基因表达分析公开于BMC Cancer 2005， 5:75中)。
癌症研究中，NAC的抗增殖作用与细胞死亡或毒性无关，但却是由于生理学分化途径的激活而产生，所述激活可视为使细胞功能对来源组织正常化。
除了增殖减少，经NAC治疗的癌细胞的形态也有所变化。在体外，活性增殖中的上皮细胞显示出不规则的形态(间质形态)且通常形成多个细胞层。相反，当细胞经历分化过程时，为了达到其最终靶组织的结构和功能，它们停止增殖，它们的形态规则地变为多角形，各个细胞有时较厚，且它们形成单层的相邻细胞。该过程伴随细胞-细胞和细胞-基质接合的增加，这与从增殖间质转变为粘着性、活动性降低和分化的表型相符合。
总之，将NAC补充至癌细胞之后检测到一系列复杂的代谢变化，其全都集中于使不受控制的增殖终止以及诱导其终末分化。应注意，NAC治疗诱导细胞-细胞和细胞-基质粘着复合物的大量增加。不受控制的增殖可视为这样的情形：细胞失去接触抑制及其对于分化信号的响应能力。进入分化途径的细胞显示细胞间接合复合物的大量增加，且该进程通常也指示为接触抑制。若干证据表明，细胞进入分化终点的信号来源于细胞-细胞复合物本身的成分。这些接合也是细胞间信号传播的一个途径。
给药方案
从对于NAC治疗腺癌细胞系和原发正常角质化细胞的研究(Cell Death andDifferentiation 2005，12(10)：1285-1296)中得出结论，有效剂量的NAC 对于抗增殖-分化作用的诱导情况各异，并且依赖于细胞的类型。因此来源的组织即指示了对于增殖的完全阻滞的观察所需的有效NAC浓度，且必须由各组织所确定。此外，NAC的剂量也与细胞恶性相关。详言之，正常细胞仅需要较低的剂量以停止增殖和开始分化，而具有特征性预后不良的肿瘤细胞则需要更高的NAC浓度。
出于本发明的目的，基于以下标准来研发用于治疗哺乳动物(包括人)的 IVF的NAC的给药方案：
1)NAC的每日剂量，其与目前的其他临床治疗相一致，且被认为没有不利的副作用；
2)在关于延长治疗后NAC血浆水平降低的报道(Pendyala L，Creaven PJ.CancerEpidemiol Biomarkers Prev.1995；4:245-51)的情况下，在为期两个月或更长的治疗中每周中止治疗约半周，被认为具有最佳的生物学响应。
本发明的包含NAC的用于治疗IVF的组合物，根据一个实施方案以大约50至150mg/kg/天的剂量静脉内给药。其下限已表明对IVF有效，其上限已知事实上不具有副作用。
在本发明另一实施方案中，本发明的组合物包含以大约30-45mg/kg/天的剂量口服给药的NAC。已表明其中的低剂量令人惊讶地对于子宫内膜异位的治疗有效，且还对IVF有效。
在一个实施方案中，所述口服组合物给药的时间周期为两个月或两个月以上，或优选三个月或三个月以上。为抵消延长治疗后NAC血浆水平的降低，NAC可以以间歇模式中进行处方的剂量(即间歇式剂量治疗方案/疗法) 给药。间歇式给药或治疗是指治疗周期性地中断，即所述药物组合物给药一定的时间周期(例如数天)，然后中断给药(其中药物组合物不予给药一定的时间周期，例如数天)。间歇式治疗可以是规则的，例如治疗固定的天数或周数，然后中断固定的天数或周数。其实例包括重复的以下方案：每周治疗4 天然后中断3天、或治疗2周然后中断1周。规则的间歇式治疗的一个特例是脉冲式治疗，即具有规则的治疗和中断时间，例如每隔一天给药或给药2 天然后中断2天等。不规则重复的或具有更复杂的重复的方案的不规则间歇式治疗方案也是可能的，例如取决于对治疗的响应。在本发明的不同示例性实施方案中，将所述进行处方的剂量的NAC连续给药3-5天然后中断2-4天，或连续给药1-3天然后中断1-2天。
在一个实施方案中，参照大约60kg的体重，NAC剂量的范围为1.2至 5.4g/天，优选1.8至3.6g/天。所述剂量可分为两份或多份，优选三份或四份，每天各给药一份或两份的剂量(例如丸剂)，其中各剂量可包含例如0.15-2.7g 的NAC或优选0.6-1.2g的NAC。所述治疗包括脉冲式或间歇式给药上述剂量，例如每隔一天给药，或每周连续给药三至四天，并分别中止四至三天。所述治疗的最小总持续时间为两个月，而无最大持续时间。对于其他体重(例如偏重或偏轻)的患者，每日剂量需要相应地调节。
在本发明的一个实施方案中，所述治疗IVF的、剂量为150-5400mg的 NAC的药物组合物每天两次或三次给药，周期为至少2个月，例如至少3 个月。在本发明优选的实施方案中，所述包含230-3600mg剂量的NAC的药物组合物每天两次或更多次给药，周期为至少2个月，例如最大至少3个月。所述治疗包括脉冲式或间歇式给药上述剂量，例如每隔一天给药，或每周连续给药三至四天，并分别中止四至三天。
NAC也可与硒代蛋氨酸形式的硒和/或褪黑素一起给药。该组合进一步描述于EP12710062.6。
药物制剂
本发明的药物组合物可以以药物领域技术人员本身已知的方式制备。所述组合物可包含根据本发明的有效量的NAC，以及作为活性成分的媒介物或介质的适当的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂是本领域已知的。所述药物组合物优选用于静脉内给药。其他形式，例如片剂、胶囊、栓剂、混悬液、糖浆等也是可能的。本发明需要严格地评估NAC制剂中的药物品质，以得到有效剂量。因此，需要使用品牌或经认证的通用制剂。NAC并非稳定分子，其具有活性的巯基残基可容易地被氧气、光和其他辐射氧化，使得不能达到有效剂量。因此该制剂优选避光保存，其为可溶性片剂，并且含有在溶解过程中帮助从水中部分除去氧的碳酸氢钠。
已观察到高口服剂量的NAC可引起腹部疼痛。为克服口服给药时的这一缺点，一个选项是在具有胃保护的制剂中提供NAC，其适于防止NAC在胃中释放/溶解。所述制剂是本领域公知的，且可用于本发明中。例如，可使用耐胃液且允许所述药物在通过胃之后仅在肠中释放的片剂包衣。常用制剂包括聚合物，例如纤维素衍生物、甲基丙烯酸氨基酯共聚物。所述包衣通过使用对pH敏感的聚合物防止该片剂核芯在胃酸性环境中分解(其在通过胃之后由于对pH增加的响应而膨胀或溶解，从而释放所述药物)。
另一选项是降低NAC一次进入血流的剂量。每天给药NAC三次或三次以上，这对于患者而言可能是难以完成的。然而，可能需要重复给药以达到几乎恒定的NAC血清浓度。为克服这些问题，对患者而言更容易操作的是每天一次或两次给药，例如在早晨和晚上给药。一个选项是在缓释制剂(也作持续释放或控释制剂)中提供NAC。由于能够减小NAC扩散和摄取进入血流的速率，所述制剂使较长间隔的较大剂量给药成为可能。然后该剂量在长时间内小量地分配到血液中，例如在每天两次的给药方案中经12+12小时。很多不同缓释技术和制剂是本领域已知的，且可应用于本发明中。在所述技术中该活性物质例如包在包衣或基质中，所述包衣或基质在给药位置的体液中是不溶的或可溶性低的。
具有缓释和胃保护的组合作用的制剂也是可能的，且可用于本发明中。
人的实施例
与体外受精治疗关联的给药
最近记录了胚胎植入之前临床应用NAC的第一个案例。NAC以50 mg/kg的浓度向42岁患者给药，该患者之前已进行5次胚胎植入，涉及总共8个良好质量的胚胎。紧接胚胎植入之前，通过超声证实增加的子宫收缩活动的存在。以50mg/kg体重静脉内输注NAC保持60分钟。胚胎植入在 60分钟的以50mg/kg体重给药NAC结束时开始进行60分钟。在连接输注之前和紧接胚胎植入之前，进行经阴道的纵向扫描记录。由此可证实子宫收缩从每3分钟10次收缩降低至每3分钟5次收缩，且记录了它们幅度上明显的降低。成功治疗通过健康女儿的分娩而证实。
脉冲给药
以下为向15名患者脉冲给药NAC的结果，其中8名怀孕。
据此，根据以下方案向患者口服给药NAC3个月或更久：600mg每天三次，一周连续三天。该过程的采用是基于以下考虑：(1)1.8mg的每日总 NAC剂量实际上没有副作用且已考虑了其它临床适应症[K.R.Atkuri,J.J. Mantovani,L.A.Herzenberg,andL.A.Herzenberg,“N-acetylcysteine-a safe antidote for cysteine/glutathionedeficiency,”Current Opinion in Pharmacology, vol.7,no.4,pp.355–359,2007.]；(2)参考已知的NAC药代动力学，将总剂量分为3份对于患者是简单的[L.Pendyala andP.J.Creaven,“Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of N-acetylcysteine,a potential chemopreventive agent during a phase I trial,”Cancer EpidemiologyBiomarkers and Prevention, vol.4,no.3,pp.245–251,1995.]，其获得了一个几乎恒定的药物血浆水平；(3) 该4天的不给药区间提供了一个清除期，其可用于限制所报告的延长治疗过程中观察到的NAC血浆水平的降低。
结果
NAC治疗后几个月
本发明使用的制剂
在一个实施方案中，本发明提供包含N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)的药物组合物以用于静脉内给药50-150mg/kg体重的NAC，每天一次保持1-3 天，且连同体外受精治疗一起。
一方面为包含NAC的药物组合物，用于以150mg/kg的剂量给药1-3 天。
另一方面为包含NAC的药物组合物，用于仅在体外受精治疗的同一天给药。
在本发明另一实施方案中，该组合物包含的NAC待口服给药剂量为约 30-45mg/kg/天。
当NAC与硒和/或褪黑素组合时，NAC以5-45mg/kg/天的剂量给药；硒为硒代蛋氨酸的形式，以0.4-1.2μg/kg/天的剂量给药；且褪黑素以0.02-0.08 mg/kg/天的剂量给药。在一个实施方案中该药品为包含NAC、硒代蛋氨酸形式的硒和褪黑素的药物组合物。
而且，脉冲或间歇的口服给药，保持三个月的时间段，在给药当天其剂量为20至90mg/kg/天的N-乙酰基-L-半胱氨酸，这将会对IVF的成功具有有益效果。在该情况下，该组合物用于连续给药三个月或更长时间，或连续 3-5天然后中断2-4天。在另一实施方案中，包含N-乙酰基-L-半胱氨酸的药物组合物用于连续给药1-3天，然后中断1-2天。
根据说明书描述的实施例，将15名患者通过口服脉冲给药用于IVF的 N-乙酰基-L-半胱氨酸来治疗，剂量为600mg，每天三次，连续三天给药然后中断4天，持续3个月或更久。
其它可能的给药方案如以下描述于EP 2305238。
在一个实施方案中，具有上述用途的包含N-乙酰基-L-半胱氨酸的药物组合物，其中该组合物在给药当天用于以30至60mg/kg/天的N-乙酰基-L- 半胱氨酸剂量给药。在另一实施方案中，该药物组合物在给药当天用于以30至45mg/kg/天的N-乙酰基-L-半胱氨酸剂量给药。
在一个实施方案中，本发明提供用于以上用途的包含N-乙酰基-L-半胱氨酸的药物组合物，其中该药物组合物避光保存。在另一实施方案中，该药物组合物为水溶性片剂。在另一实施方案中，该药物组合物包含碳酸氢钠。在一个实施方案中，该药物组合物为缓释制剂和/或胃保护制剂。
在一方面，本发明提供与IVF关联的治疗哺乳动物的方法，包括；连同体外受精治疗一起，对所述哺乳动物静脉内给药包含N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)的药物组合物，NAC剂量为50-150mg/kg体重，每天一次保持1-3 天。
一方面为一种方法，包括静脉内给药剂量为150mg/kg的NAC保持1-3 天。
另一方面为一种方法，包括仅在体外受精治疗的同一天静脉内给药 NAC。

Claims (7)

1.包含N-乙酰基-L-半胱氨酸本身的药物组合物在制备用于与体外受精关联的治疗雌性哺乳动物的药物中的用途，其中所述药物支持胚胎植入。
2.根据权利要求1的用途，其中所述药物组合物还包含：(ii)硒代蛋氨酸形式的硒和/或(iii)褪黑素和/或其生理可接受的盐。
3.根据权利要求1或2的用途，包括向所述哺乳动物静脉内给药包含N-乙酰基-L-半胱氨酸的药物组合物，其中N-乙酰基-L-半胱氨酸的剂量为50至150mg/kg/天，保持1-3天。
4.包含N-乙酰基-L-半胱氨酸的药物组合物在制备用于与体外受精关联的治疗雌性哺乳动物的药物中的用途，包括向所述哺乳动物口服给药包含N-乙酰基-L-半胱氨酸的药物组合物，其中N-乙酰基-L-半胱氨酸的剂量为30至45mg/kg/天，保持1-3天，其中所述药物支持胚胎植入。
5.包含N-乙酰基-L-半胱氨酸的药物组合物在制备用于体外受精治疗之前治疗雌性哺乳动物的药物中的用途，包括向所述哺乳动物口服给药包含N-乙酰基-L-半胱氨酸的药物组合物，其中口服给药剂量为600mg，连续给药三天随后4天不给药，持续三个月或更长时间，其中所述药物支持胚胎植入。
6.根据权利要求3的用途，其中所述药物组合物以50mg/kg的剂量给药1天。
7.根据权利要求6的用途，其中所述药物组合物在进行体外受精治疗当天的早上给药。
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