CN114053298A - 一种用于抑制心肌肥大的药物及模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物模型构建技术领域，公开了一种用于抑制心肌肥大的药物及模型的构建方法，选取1日龄的白羽肉鸡60羽适应性饲养至10日龄，随机分为空白对照组、Ang II高剂量组、Ang II低剂量组、纳米硒+Ang II高剂量组、纳米硒+Ang II低剂量组。选取15日龄的白羽肉鸡鸡胚，成功提取肉鸡原代心肌细胞后，采用2.5*10^‑4mM的Ang II处理48h，得到肉鸡心肌肥大体外模型。而后采用不同浓度纳米硒与2.5*10^‑4mM的Ang II共处理细胞48h，探究纳米硒缓解肉鸡心肌肥大的作用机制。本发明能够用于研究生物源纳米硒是否能通过抑制机体自由基的产生来抑制心肌肥大。

Description

一种用于抑制心肌肥大的药物及模型的构建方法

技术领域

本发明属于动物模型构建技术领域，尤其涉及一种用于抑制心肌肥大的药物及模型的构建方法。

背景技术

目前：肉鸡肺动脉高压综合征(Pulmonary hypertension syndrome，PHS))也称肉鸡腹水综合征(Ascites syndrome in broiler，AS)，是一种多发于高海拔寒冷地区的生产性肉鸡常见的非传染性代谢性内科疾病，是影响本发明国肉鸡养殖业发展的主要疾病之一。目前，PHS的发病原因仍然没有研究清楚，但现阶段公认的发病机制为：肉鸡因为生长过快或寒冷而导致机体所需供氧量增加，而禽类肺脏的解剖结构又导致机体的供氧量不足，导致相对性缺氧，或环境供氧不足，导致机体绝对性缺氧，从而导致红细胞增多，血容量增加，血液黏度增加，红细胞变形性降低，血液在肺脏中流动受阻，导致管壁增厚、管腔变窄，从而引起肺血管重构，造成肺动脉高压，进而造成右心肥大、扩张、衰竭，导致后腔静脉压升高，门静脉压增高，损伤肝细胞血浆渗漏、产生腹水。

在目前公认的这种发病机制中，肉鸡右心肥大是腹水形成的前提，且有研究证明，体内大量自由基(ROS)的产生，是造成心肌肥大的主要原因之一。

氧化应激反应是导致心肌肥大的重要因素之一，Keap1-Nrf2/GPX1信号通路是机体重要的内源性抗氧化应激通路，该通路的激活对多种疾病都具有保护作用。Nrf2是动物机体主要转录调节因子，在稳态条件下，核转录因子-2(Nrf2)被kelch样ech相关蛋白1(Keap1)隔离在细胞质中，Keap1是一种同源二聚体蛋白，连接Nrf2和E3连接酶复合物。当暴露于外部刺激时，氧化应激系统被激活，Nrf2从Keap1和E3连接酶复合物中解离，然后转位到细胞核中。研究表明，Nrf2的激活可以保护心脏免受缺血-再灌注损伤、糖尿病心肌病和血管紧张素II(Ang II)诱导的心肌肥大。其他研究表明，Nrf2的激活与抑制了Ang II诱导的心肌细胞氧化应激有关。

硒(Se)是一种必需的膳食营养物质，也是一种对生物系统有广泛影响的微量元素，它作为组成谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性中心的重要元素，在清除ROS及其衍生物的细胞抗氧化防御机制中发挥着重要作用，并且在动物免疫、抗病性和生产力等方面占据着十分重要的位置。而且，硒还可以改善机体的营养环境，保护机体免受外源物质的有害影响，增强免疫细胞的功能，降低机体患癌症的风险。而相较于目前生产中广泛使用的有机硒、无机硒而言，纳米硒具有更高活性、更高安全性、更高抗氧化性的特点。在纳米硒和无机硒对肉鸡生产性能和组织结构的影响研究中发现，与无机硒相比，纳米硒能显著提高肉鸡的生产性能和免疫功能，维持肝脏、法氏囊和肠等组织器官正常的细胞结构。因此，纳米硒可能成为一种更适合的硒形式添加剂，既能有效的为动物机体补充硒，又能减少其局限性。

目前，现有技术没有血管紧张素II(Ang II)诱导的肉鸡心肌肥大的动物模型和肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型，这为探究肉鸡心肌肥大及其引起的肉鸡PHS等疾病造成严重困难。禽类动物模型的研究相对于哺乳动物来说相对冷门，且禽类和哺乳动物的物种种属差异较大，导致无法采用哺乳动物的心肌肥大模型研究肉鸡的心肌肥大疾病。想要进行肉鸡心肌肥大的研究，模拟出新的肉鸡心肌肥大的模型是必须的。因此，通过查阅大量文献决定采用哪种药物造模、采用多大剂量造模、造模需要多少时间都需要我们进行大量预实验自行摸索，这为我们的前期工作带来了巨大困难。

与此同时，纳米硒是否可以通过抗氧化应激抑制肉鸡心肌肥大，或者可能涉及什么具体机制也尚不清楚。深入探究纳米硒在Ang II诱导的肉鸡心肌肥大和肥大心肌细胞模型中是否具有保护作用，可以为缓解和治疗心肌肥大及其后续引起的肉鸡PHS提供新的思路。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术没有血管紧张素II(AngII)诱导的肉鸡心肌肥大的动物模型和肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型。现有技术没有采用生物源纳米硒缓解或治疗Ang II诱导的肉鸡心肌肥大的案例。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于抑制心肌肥大的药物及模型的构建方法。

本发明是这样实现的，一种用于抑制心肌肥大的药物，所述用于抑制心肌肥大的药物为生物源纳米硒1mg/kg/d。

本发明的另一目的在于提供一种所述动物模型的构建方法，所述动物模型的构建方法包括：

选取1日龄的白羽肉鸡36羽适应性饲养至10日龄，随机分为空白对照组、Ang II高剂量组、Ang II低剂量组，Ang II高剂量组、Ang II低剂量组均饲喂普通鸡饲料饮自来水，同时每日肌注相应剂量Ang II，共计注射28d，得到肉鸡心肌肥大模型。

进一步，所述每日肌注相应剂量Ang II包括：Ang II高剂量组为1mg/kg/d、Ang II低剂量组0.5mg/kg/d。

本发明的另一目的在于提供一种验证所述用于抑制心肌肥大的药物的动物模型，所述验证该药物的动物模型的构建方法包括：

选取1日龄的白羽肉鸡24羽适应性饲养至10日龄，随机分为纳米硒+Ang II高剂量组、纳米硒+Ang II低剂量组。其中，纳米硒+Ang II高剂量组、纳米硒+Ang II低剂量组饲喂普通鸡饲料饮自来水，并每日饲喂1mg/kg/d的纳米硒。同时每日肌注相应剂量Ang II，共计注射28d。

进一步，所述每日肌注相应剂量Ang II包括：纳米硒+Ang II高剂量组为1mg/kg/d、纳米硒+Ang II低剂量组0.5mg/kg/d

本发明的另一目的在于提供一种所述肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型的构建方法，所述肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型的构建方法包括：

(1)选取适龄的白羽肉鸡鸡胚，制备肉鸡原代心肌细胞，采用差速贴壁法分离心肌细胞和心肌成纤维细胞；

(2)前48h，采用混合培养基进行培养，用于抑制剩余心肌成纤维细胞的生长；之后采用含有10％胎牛血清的DMEM-F12培养基进行培养，心肌细胞培养至4d左右，出现规律性搏动；

(3)消化分组，待心肌细胞成功贴壁后，可进行心肌细胞鉴定，采用加药的DMEM-F12培养基处理48h可得到肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型。

进一步，步骤(1)中，所述适龄的白羽肉鸡鸡胚为15日龄的白羽肉鸡鸡胚。

进一步，步骤(1)中，所述制备肉鸡原代心肌细胞包括：采用胶原酶II消化法结合差速贴壁法继而添加含Brdu的培养基培养前48h制备肉鸡原代心肌细胞。

进一步，步骤(2)中，所述混合培养基包括：含10mM Brdu的DMEM-F12与10％的胎牛血清培养基。

进一步，所述消化分组包括：待肉鸡心肌细胞出现规律性搏动后，采用胰酶将细胞消化分组到到6孔板或12孔板中。

进一步，步骤(3)中，所述加药的DMEM-F12培养基为含有2.5*10^-4mM的Ang II和10％胎牛血清的DMEM-F12培养基。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明成功建立了血管紧张素II(Ang II)诱导的肉鸡心肌肥大的动物模型和肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型。在此之前，对于禽类心肌肥大问题的研究没有相应的禽类动物模型可以使用，也没有成功的禽类造模方式可以参考，使该方向科实验无法有效推进，本发明填补了业内空白，为肉鸡甚至禽类的心肌肥大模型提供了有效参考。且该模型能够用于研究生物源纳米硒是否能通过抗氧化途径来抑制心肌肥大，并且通过激活Nrf2-Keap1/GPX1信号通路来发挥该作用；能为肉鸡肺动脉高压综合征的防治提出新的思路。

附图说明

图1是本发明实施例提供的动物模型的构建方法流程图。

图2是本发明实施例提供的动物模型的构建方法原理图。

图3是本发明实施例提供的肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型的构建方法流程图。

图4是本发明实施例提供的肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型的构建原理图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于抑制心肌肥大的药物及模型的构建方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1-图2所示，本发明实施例提供的动物模型的构建方法包括：

S101，选取1日龄的白羽肉鸡60羽适应性饲养至10日龄，随机分为空白对照组、AngII高剂量组、Ang II低剂量组、纳米硒+Ang II高剂量组、纳米硒+Ang II低剂量组；低剂量为(0.5mg/kg/d)，高剂量为(1mg/kg/d)；

S102，其中，Ang II高剂量组、Ang II低剂量组均饲喂普通鸡饲料饮自来水，每日肌注相应剂量Ang II，共计注射28d，得到肉鸡心肌肥大模型。纳米硒+Ang II高剂量组、纳米硒+Ang II低剂量组饲喂普通鸡饲料饮自来水，并每日饲喂1mg/kg/d的纳米硒，同时每日肌注相应剂量Ang II，共计注射28d。

本发明实施例提供的每日肌注相应剂量Ang II包括：Ang II高剂量组为1mg/kg/d、Ang II低剂量组0.5mg/kg/d、纳米硒+Ang II高剂量组为1mg/kg/d、纳米硒+Ang II低剂量组0.5mg/kg/d

如图3-图4所示，本发明实施例提供的肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型的构建方法包括：

S201，选取15日龄的白羽肉鸡鸡胚，采用胶原酶II消化法制备肉鸡原代心肌细胞，采用差速贴壁法分离心肌细胞和心肌成纤维细胞；

S202，前48h，采用含Brdu的DMEM-F12与10％的胎牛血清培养基进行培养；之后采用普通10％血清的DMEM-F12培养基进行培养，心肌细胞培养至4d左右，出现规律性搏动；

S203，消化分组到6孔板和12孔板中，带心肌细胞成功贴壁后，进行细胞鉴定，采用2.5*10^-4mMAng II处理细胞48h后，得到肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型；

S204：纳米硒采用0.6μM、1.2μM、、2.4μM、3.6μM、5.0μM浓度梯度与2.5*10^-4mMAngII共同处理细胞48h，通过一系列测定检测纳米硒对Ang II诱导的肉鸡心肌肥大的影响。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例1：

1、在体实验

本发明是基于研究防治肉鸡肺动脉高压综合征这个疾病开展的，根据目前公认的肉鸡肺动脉高压综合征的发病机制来看，肉鸡心肌肥大是肉鸡肺动脉高压综合征发病的前提，因此成功造出肉鸡心肌肥大模型是让研究得以继续进行的先决条件。在哺乳动物的心肌肥大研究中，有通过手术结扎动脉、异丙肾上腺素、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、胰岛素(Ins)、血管紧张素II(Ang II)等方法制造心肌肥大模型。由于肉鸡样本较多，且对麻醉敏感性低操作难度大等原因，手术结扎动脉法并不适用；而Ang II相对于其他药物而言，是最经典的用于模拟心肌肥大的药物，且其主要是通过机体内的肾素-血管紧张素系统发挥效用，哺乳动物和禽类的肾素-血管紧张素系统的生理作用在众多研究中表明是十分相似的，因此本发明采用Ang II来模拟肉鸡心肌肥大的模型。有研究表明ROS的生成和增多是肉鸡心肌肥大的主要原因之一，且ROS的生成和增多也与Ang II诱导的心肌肥大有密不可分的关系。而硒元素作为谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性中心的重要组成部分，它参与了机体的重要抗氧化过程，GSX-PX可以催化谷胱甘肽(GSH)清除ROS的反应。与此同时，纳米硒相较于目前生产中常用于饲料添加的酵母硒、无机硒来说，具有更高的氧化活性、更高的安全性、更高抗氧化性等特点。

2、离体实验

在体实验是为了证明纳米硒确有防治肉鸡心肌肥大的作用，而离体实验是为了研究纳米硒减缓肉鸡心肌肥大的分子机制。本发明采用15日龄的白羽肉鸡鸡胚作为实验对象，提取肉鸡鸡胚心尖制备原代肉鸡心肌细胞。待肉鸡心肌细胞贴壁约4日，大部分心肌细胞聚集成簇并开始规律性搏动后，可以将心肌细胞消化分组进行后续实验。后续按2.5*10^-4mM的Ang II处理原代心肌细胞48h，并采用不同浓度纳米硒与Ang II共同作用细胞48h，探究其对Ang II诱导的心肌肥大细胞的影响。后续本发明还会进行ROS测定、线粒体膜电位测定、心肌细胞表面积测定、肌酸激酶2(CK2)和乳酸脱氢酶(LDH)测定、荧光定量PCR、Westernblot等实验，进一步研究纳米硒减缓心肌肥大的分子机制。

3、研究对象(试验材料)、研究方法(试验方法)与技术路线

3.1研究对象(试验材料)

3.1.1在体实验

1日龄白羽肉鸡60只，Ang II(广东翁江化学试剂有限公司)、纳米硒(微生物还原法制备)、注射器、饲料(实验室留存)等。

3.1.2离体实验

15日龄白羽肉鸡鸡胚60枚，Ang II(广东翁江化学试剂有限公司)、BHA、纳米硒(自己制备)、DMEM-F12培养基(gbico)、CCK8(李记生物)、胎牛血清(gbico)、PBS(hyclone)等

3.1.3微生物还原法制备纳米硒

蜡样芽孢杆菌A3(李家奎老师课题组惠赠)、LB肉汤、DAB、HBr、甲苯、氢氧化钠、浓盐酸、EDTA-2Na、等。

3.2研究方法(试验方法)

3.2.1在体实验

选取1日龄的白羽肉鸡60羽适应性饲养至10日龄，随机分为上述7组，空白对照组、Ang II高剂量组、Ang II低剂量组饲喂普通鸡饲料饮自来水，Ang II高剂量组、Ang II低剂量组每日肌注相应剂量Ang II，Ang II高剂量组为1mg/kg/d、Ang II低剂量组0.5mg/kg/d，共计注射28d，造肉鸡心肌肥大模型。纳米硒+Ang II高剂量组相对于Ang II高剂量组，唯一不同是每日饲喂1mg/kg剂量的纳米硒，纳米硒+Ang II低剂量组同上。28日之后，称量体重、颈静脉采血、取心脏称重，将心室肌部分存于4％多聚甲醛保存，部分裂解提蛋白，部分裂解提RNA，-80℃保存。

3.2.2离体实验

选取15日龄的白羽肉鸡鸡胚，采用胶原酶II消化法制备肉鸡原代心肌细胞，采用差速贴壁法分离心肌细胞和心肌成纤维细胞，前48h，采用含Brdu的DMEM-f12+10％胎牛血清培养基培养，抑制心肌成纤维细胞生长。之后更换为普通10％血清的DMEM-F12培养基，心肌细胞培养至4d左右，会出现规律性搏动，此时开始消化分组到6孔板或和2孔板中，待心肌细胞成功贴壁后，可进行细胞鉴定及后续实验。采用2.5*10^-4mM的Ang II处理心肌细胞48h，得到肉鸡心肌细胞肥大模型，测定心肌细胞的表面积、CCK8、总蛋白含量、线粒体膜电位、ROS、CK2、LDH测定等。纳米硒采用0.6μM、1.2μM、、2.4μM、3.6μM、5.0μM浓度梯度与2.5*10^-4mM Ang II共同处理细胞48h，之后进行心肌细胞的表面积、CCK8、总蛋白含量、线粒体膜电位、ROS、CK2、LDH的测定。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于抑制心肌肥大的药物，其特征在于，所述用于抑制心肌肥大的药物为生物源纳米硒。

2.一种验证如权利要求1所述用于抑制心肌肥大的药物的动物模型和肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型。

3.一种如权利要求2所述动物模型的构建方法，其特征在于，所述动物模型的构建方法包括：

选取1日龄的白羽肉鸡36羽适应性饲养至10日龄，随机分为空白对照组、Ang II高剂量组、Ang II低剂量组，Ang II高剂量组、Ang II低剂量组均饲喂普通鸡饲料饮自来水，同时每日肌注相应剂量Ang II，共计注射28d。

4.如权利要求3所述动物模型的构建方法，其特征在于，所述每日肌注相应剂量Ang II包括：Ang II高剂量组为1mg/kg/d、Ang II低剂量组0.5mg/kg/d。

5.一种如权利要求2所述肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型的构建方法，其特征在于，所述肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型的构建方法包括：

(1)选取适龄的白羽肉鸡鸡胚，制备肉鸡原代心肌细胞，采用差速贴壁法分离心肌细胞和心肌成纤维细胞；

(2)前48h，采用混合培养基进行培养，用于抑制剩余心肌成纤维细胞的生长；之后采用含有10％胎牛血清的DMEM-F12培养基进行培养，心肌细胞培养至4d左右，出现规律性搏动；

(3)消化分组，待心肌细胞成功贴壁后，可进行心肌细胞鉴定，采用加药的DMEM-F12培养基处理48h可得到肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型。

6.如权利要求5所述肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述适龄的白羽肉鸡鸡胚为15日龄的白羽肉鸡鸡胚。

7.如权利要求5所述肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述制备肉鸡原代心肌细胞包括：采用胶原酶II消化法结合差速贴壁法和采用混合培养基培养前48h制备肉鸡原代心肌细胞。

8.如权利要求5所述肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合培养基包括：含10mM Brdu的DMEM-F12与10％的胎牛血清培养基。

9.如权利要求5所述肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述加药的DMEM-F12培养基为含有2.5*10^-4mM的Ang II和10％胎牛血清的培养基。

10.如权利要求5所述肉鸡原代心肌细胞肥大的体外模型的构建方法，其特征在于，所述消化分组包括：待肉鸡心肌细胞出现规律性搏动后，采用胰酶将细胞消化分组到到6孔板或12孔板中。

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