CN115475179A - 纳米硒在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及纳米硒在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，实验结果显示，(1)纳米硒对心肌细胞几乎无毒性，亚硒酸钠对细胞损伤较大；(2)纳米硒浓度为20μM对细胞具有显著保护作用；(3)纳米硒可显著减轻细胞损伤；(4)细胞调亡以及线粒体损伤相关因子水平显著下降；(5)纳米硒能有效缓解心肌细胞的损伤，并且减轻细胞凋亡；(6)心肌梗死标志物CK和LDH水平明显下降；(7)纳米硒靶向进入线粒体；为心肌梗死的治疗提供了新方法。

Description

纳米硒在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及纳米硒在制备治疗心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。
背景技术
目前心血管疾病是引起人群死亡的主要原因之一，急性心肌梗死发病率占心血管疾病的40％左右，临床上常用的治疗方法有溶栓、搭桥、PCI等，这些方法都有一定的效果，但均不可避免地引起缺血-再灌注损伤。缺血再灌注期间由于无氧糖酵解，细胞内累积H+，血流恢复正常后细胞内H+与细胞外Na+交换，使pH恢复正常，细胞内Na+升高激活钠钙交换器，使细胞内Na+与细胞外Ca2+交换，导致钙超载。氧化应激使线粒体通透性转换孔开放延长，导致ROS和细胞因子的产生，进而促进促炎细胞因子和趋化因子的分泌，同时中性粒细胞趋化到心肌细胞，引起血管堵塞释放更多ROS。同时心脏缺血-再灌注发生后，心肌细胞的细胞核和线粒体DNA出现广泛损伤，一方面产生大量的ROS，在有害因素刺激下，NCX1反向模式的异常激活导致胞内Ca2+浓度持续升高，形成钙超载，另一方面通过SASP、sGAS/STING、NLRP3、TNFα，NF-KB和IL-1等炎症小体活化产生大量炎症因子，这些炎症因子连同释放出的游离mtDNA可增强心肌细胞损伤，除此之外，受损细胞还可释放mtDNA到胞外，激活有TLR9表达的其它细胞，触发更大范围炎症反应，同时中性粒细胞向心肌细胞趋化引起更严重的炎症反应。
硒是人类和动物生命中必需的微量元素，硒离子是一种带负电荷的非金属离子,与带正电荷的金属离子有非常强的亲和性,可以与对人身体有害的正电荷金属离子形成金属硒蛋白复合物,最终将其排出体外。补硒能够提高机体抵抗力、免疫力以及抗氧化等，另外补硒能够减轻肝炎症状、阻断肝纤维化和预防癌症。目前，临床上使用的硒多是硒离子，以亚硒酸钠的形式给药。例如，石冰等研究了亚硒酸钠对心肌梗塞大鼠的治疗效果(参见文献石冰等.心肌梗塞大鼠缺血心肌和血浆脂质过氧化物的变化及亚硒酸钠的作用[J].陕西医学杂志,1987(12):54-55.)周玲宝等研究了亚硒酸钠对缺血性心脏功能的影响(参见文献周玲宝,杨红,张硕哉.亚硒酸钠对缺血性心脏功能的影响[J].湖北医学院学报,1986(03):214-218.)。
但无机硒有较大的毒性，且不易被吸收，不适合人和动物使用。有机硒与无机硒相比毒性降低，生物利用率提高，但仍存在作用剂量和毒性剂量比较接近，安全性和生物活性都较低的问题，现在基本被生物活性很高、又无毒的纳米硒所取代。但是，目前并没有任何文献公开，纳米硒原子可以用于治疗心肌缺血再灌注损伤。而且研究报道的亚硒酸钠用量换算为小鼠约为5mg/kg，而我们的纳米硒0.7mg/kg就有显著保护效果(参见文献范颖等.硒对家兔心肌缺血再灌注损伤膜磷脂保护作用[J].辽宁卫生职业技术学院生化教研室)。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的首要目的是提供纳米硒在制备治疗和/或预防心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。
优选的，所述的纳米硒由PEG、SDS、维生素C和亚硒酸制备得到。
优选的，所述的纳米硒通过维生素C还愿法法制备：使用PEG为底物，将亚硒酸、维生素C、模板剂在水中反应，混匀之后得到清澈透亮，稳定，粒径均一的纳米硒，所述模板剂为十二烷基硫酸钠。
优选的，聚乙二醇的质量浓度为0.1％-1％，十二烷基硫酸钠的浓度为0.001-0.01mol/L。
本发明的第二目的是提供纳米硒在制备治疗和/或预防心肌缺血再灌注引起心肌梗死药物中的应用。
本发明的第三目的是提供纳米硒在制备治疗和/或预防心肌缺血再灌注引起心肌细胞损伤药物中的应用。
本发明的第四目的是提供纳米硒在制备抗心肌细胞凋亡和/或抗心肌细胞凋亡相关疾病药物中的应用。
本发明的第五目的是提供纳米硒在制备治疗和/或预防心肌缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡药物中的应用。
本发明的第六目的是提供纳米硒在制备治疗和/或预防线粒体损伤相关疾病药物中的应用。
本发明的第七目的是提供纳米硒在制备治疗和/或预防心肌缺血再灌注引起的线粒体损伤药物中的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供纳米硒在制备治疗和/或预防心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，实验结果显示，(1)纳米硒浓度为20μM对细胞具有显著保护作用。(2)纳米硒可显著减轻细胞损伤。(3)Western blot和RT-PCR检测细胞调亡以及线粒体损伤相关因子水平，如BAX、Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP-1等损伤相关因子水平显著下降，线粒体损伤相关因子如COXII、VADC-1和ND1水平都显著下降。(4)纳米硒能有效缓解心肌细胞的损伤，并且减轻细胞凋亡。(5)取血清做生化检测可见心肌梗死标志物CK和LDH水平明显下降。(6)使用Coumarin-6将纳米硒进行标记，探究其在细胞内亚细胞器定位，结果可见，纳米硒在细胞的重要细胞器，如线粒体和溶酶体处都有吸收，其中线粒体共定位更高，表明我们制备的纳米硒靶向进入线粒体。纳米硒无毒，生物利用率高，能够通过屏障胃肠道中恶劣的环境来增加营养物质的稳定性，同时可靶向线粒体减轻心肌缺血再灌注损伤，从而解决心肌梗死治疗成本较高以及遗留一些后遗症的问题，并且为心肌梗死的治疗提供了新方法。
附图说明
图1用动态光散射仪和透射电子显微镜对纳米硒表征图(A)动态光散射仪检测纳米硒和Coumrain-6偶联之后外观、粒径以及电位；(B)透射电镜检测纳米硒和Coumarin-6偶联之后大小和直径。
图2为动物模型示意图；
图3纳米硒在动物I40min/R24h模型中给药之后心脏TTC-Evans Blue双染、HE染色、免疫组化染色结果图
(A)小鼠I40min/R24h模型中用纳米硒治疗后心脏TTC-Evans Blue双染；(B)心脏HE染色；(C)Cleave-Caspase3免疫组化染色结果；(D)8-OHdG免疫组化染色结果。
图4纳米硒在动物I40min/R24h模型中给药后血清生化CK和LDH检测结果图(A)CK检测结果图；(B)LDH检测结果图。
图5CCK-8检测亚硒酸钠和纳米硒对心肌细胞的毒性结果图
图6纳米硒对心肌细胞氧化损伤保护结果图(A)纳米硒能够减少H2O2对H9C2细胞损伤，降低H9C2细胞的凋亡；(B)纳米硒能够减少H2O2对NRVM细胞损伤，降低NRVM细胞的凋亡。
图7心肌细胞经过H2O2刺激后，使用纳米硒治疗的线粒体膜电位和ROS结果图(A)纳米硒降低H2O2刺激之后心肌细胞ROS的产生；(B)纳米硒稳定H2O2刺激之后心肌细胞线粒体膜电位，减少细胞凋亡
图8氧化损伤模型中纳米硒给药之后细胞调亡及线粒体损伤相关因子水平变化结果图(A)代表性Western blot条带；(B)C-PARP-1/PARP-1统计学结果；(C)Bcl-2/β-Actin统计学结果；(D)C-Caspase3/Caspase3统计学结果；(E)BAX/β-Actin统计学结果。
图9氧化损伤模型中纳米硒给药之后细胞调亡及线粒体损伤相关因子基因水平变化结果图(A)Bcl-2 RT-PCR实验结果；(B)BAX RT-PCR实验结果；(C)COX II RT-PCR实验结果；(D)VDAC-1RT-PCR实验结果；(E)ND1 RT-PCR实验结果。
图10纳米硒在细胞内细胞器定位结果图(A)线粒体和溶酶体共定位检测；(B)心肌细胞摄取纳米硒实验结果；(C)荧光显微镜检测Coumarin-6偶联纳米硒实时进入线粒体内结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的实施方式作进一步说明。
以下实施例中，动物实验中纳米硒浓度为0.08M，细胞实验中纳米硒浓度为0.04M。聚乙二醇为PEG-20000。
应当说明的是，本发明使用的纳米硒为纳米硒原子。
实施例1纳米硒的制备
本实施例的纳米硒(以0.04M为例)采用以下步骤进行制备：
1)纳米硒的制备：取17mL超纯水置于50mL的小烧杯中，加入0.1g PEG，室温搅拌15min后加入1mL浓度为0.1mol/L的十二烷基硫酸钠溶液，搅拌20min后加入1mL浓度为0.32mol/L的维生素C溶液，室温搅拌20min后加入1mL浓度为0.04mol/L的亚硒酸溶液，室温搅拌20min，即得纳米硒；
2)0.08M纳米硒制备，需将维生素C浓度和亚硒酸浓度提升一倍，步骤与1)相同；
3)Coumarin-6偶联纳米硒的制备，称取200μg Coumarin-6在加入维生素C之前加入，室温搅拌20min，其余步骤与1)相同；
本实施例制备得到的纳米硒靶向线粒体减轻心肌缺血再灌注损伤的研究，所制备的纳米硒以及Coumarin-6偶联的纳米硒表征，如图1所示，图1A用动态光散射检测纳米硒和Coumrain-6偶联之后外观、粒径以及电位，可见偶联前后纳米硒外观清澈透明，电位无明显变化，粒径增大表明Coumarin-6与纳米硒已稳定结合，图1B透射电镜检测纳米硒和Coumarin-6偶联之后大小和直径，偶联前后均为粒径均一的圆形且偶联后直径增大，表明偶联成功且制备的纳米硒稳定；粒径增大说明Coumarin-6与纳米硒已稳定结合。
进行动物实验时，用高压过后的双蒸水将纳米硒进行稀释，所得浓度为0.7mg/kg，动物实验所使用的硒浓度为0.08M，细胞实验所使用的硒浓度为0.04M。
实施例2纳米硒对缺血性再灌注损伤动物的治疗效果
(1)实验过程
将C57小鼠主动脉进行结扎建造心肌缺血模型，在结扎35min时，尾静脉注射0.7mg/kg(0.08M)纳米硒，结扎40min后进行再灌注，待24h后取小鼠心脏和血清进行后续实验，所构建的动物模型如图2所示。
将模型24h后取得C57小鼠心脏进行TTC和Evans Blue双染检测梗死面积，心脏经4％多聚甲醛固定之后，进行一系列脱水、石蜡包埋、切片、复水，小鼠HE染色检测纳米硒对心肌细胞的保护作用，免疫组化检测凋亡标志物Cleaved-Caspase3和线粒体DNA损伤标志物8-OHdG表达水平。
HE染色：苏木素染细胞核2min(视情况而定)，1％盐酸酒精1s(可不加)，流水冲洗，伊红染细胞质20-30s，二甲苯固定5min，晾干后加中性树胶封片，拍照。
免疫组化：在复水之后，组化笔圈组织，用3％H2O2室温避光反应20min，PBS洗三次，5min/次。抗原修复，枸橼酸盐pH6.0，高火3min，计时15min，每隔2min，中高火20s，直到15min结束，室温冷却大概1h，PBS洗3次，5min/次。5％BSA(sigma)封闭，室温30min(0.2gBSA+4mlPBS)，孵育一抗(用5BSA稀释)过夜4℃。PBS洗三次，5min/次，后续用SABC试剂盒，二抗(根据一抗选择G-M/G-R)室温1h，PBS洗三次，5min/次，加SABC室温30min，PBS洗3次，5min/次，加DAB(1mlA加一滴B)显色，染苏木素(DAB染35s，ddH2O洗，苏木素45s，时间需要摸索)，染完用二甲苯固定，晾干后封片。
C57小鼠心肌缺血再灌注损伤模型的血清用小动物生化检测仪检测CK和LDH水平，血清样本用生理盐水稀释1：3-5。
(2)实验结果
图3为纳米硒在动物I40min/R24h模型中给药之后心脏TTC-Evans Blue双染、HE染色和免疫组化结果图，图3A小鼠心脏TTC-Evans Blue双染表明与对照组相比纳米硒能够显著减轻心肌细胞的梗死面积，图3B心脏HE染色结果表明纳米硒可以显著降低心肌细胞的损伤或死亡，图3C免疫组化检测凋亡标志物Cleaved-Caspase3和mtDNA损伤标志物8-OHdG染色结果显示对照组相比纳米硒能够显著减轻mtDNA损伤，抑制心肌细胞死亡)；图4为纳米硒在动物I40min/R24h模型中给药后血清生化CK和LDH检测结果图，图4A小鼠I40min/R24h模型中经治疗后纳米硒组CK与对照组相比显著下降，图4B小鼠I40min/R24h模型中经治疗后纳米硒组LDH与对照组相比显著下降。
实施例3细胞实验
(1)实验过程
首先我们使用心肌细胞H9C2检测亚硒酸钠和纳米硒对细胞的损伤作用。先将心肌细胞按2000-5000/孔铺到96孔板中，24h后在细胞状态好的情况下，设立对照组，并进行不同浓度的亚硒酸钠和纳米硒刺激，24h后每孔100μl培养基加入10μl CCK-8，37℃孵育2-4h后在450nm处测吸光度。
使用心肌细胞H9C2及新生大鼠心肌细胞(出生3天之内的老鼠)探索纳米硒对心肌细胞氧化损伤的保护作用。先将心肌细胞按2000-5000/孔铺到96孔板中，24h后在细胞状态好的情况下，设立对照组，并进行不同浓度的H2O2刺激，同时将不同浓度的纳米硒与细胞共孵育，24h后每孔100μl培养基加入10μl CCK-8，37℃孵育2-4h后在450nm处测吸光度，最终确定H2O2最佳刺激浓度为500μM，最佳给药浓度为20μM，以下细胞实验中默认所用浓度都为此。
将心肌细胞以适当的浓度接种在24孔板(加入爬片)或共聚焦皿中，24后在细胞状态良好的情况下设立对照组，单刺激组，刺激加给药组，37℃孵育24h之后进行荧光染色。将细胞用1*PBS清洗之后，加入4％多聚甲醛固定15min，用1*PBS清洗3次，加入荧光染料。
1)JC-1检测：配制JC-1染色工作液，一般6孔板每孔需要JC-1染色工作液的量为1ml，其他皿以此类推，取适量JC-1，按照每50μl JC-1加入8ml超纯水的比例稀释JC-1，剧烈震荡充分溶解并混匀JC-1，然后再加入2ml JC-1染色缓冲液(5×)，混匀后即为JC-1染色工作液，注意避光操作，弃去旧的培养基，用PBS洗一遍，加入适量新的细胞培养基，加入适量JC-1染色工作液，充分混匀，将细胞培养基放入37℃培养箱中，孵育20min，配制JC-1染色缓冲液，按每1ml JC-1染色缓冲液(5×)加入4ml蒸馏水的比例，配置适量的JC-1染色缓冲液(1×)，并放置于冰上，孵育结束后，弃去上清，用JC-1染色缓冲液(1×)洗两遍加入适量的细胞培养基，用共聚焦显微镜避光检测；
2)ROS检测：用无血清的培养基按1：1000比例稀释DCFH-DA，使其终浓度为10μmol/L，注意稀释时需要避光，去除旧的细胞培养基，用无血清的细胞培养基洗一遍，再加入1ml稀释好的DCFH-DA，37℃孵育20min，用无血清的细胞培养基洗三遍，将皿放在冰上，避光检测；
3)用荧光显微镜检测纳米硒在细胞内亚细胞器的定位，将心肌细胞按适当浓度铺在24孔板中(含爬片)，将偶联Coumarin-6的纳米硒加入24孔板中避光37℃孵育1h，将上清弃去，用1*PBS清洗1次，加4％多聚甲醛固定15min，用1*PBS清洗3次，用荧光染料染细胞器(ER、Mito、Lyso)，室温避光染DAPI，10min，再用1*PBS清洗3次，5min/次，之后上机检测。
1)溶酶体(LysoTrackerTMRed)：将1mM母液稀释至工作浓度50-75nM，将细胞置于24孔板中，加入工作液，37℃孵育30min-2h；
2)线粒体(MitoTrackerTMR Red)：将1mM母液配置成浓度为100-500nM的工作液，在培养基中加入工作液，37℃孵育15-45min。
将心肌细胞接种于大皿/中皿中，37℃孵育24h后在心肌细胞状态良好的情况下，设立对照组，单刺激组，刺激加给药组，24h后将细胞收集到1.5ml EP管中，加入RAPI和蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂(50：1)，冰上裂解30min，4℃离心机离心，12000，5min，收取上清做BCA蛋白定量将不同组蛋白浓度定为一致之后，用Western blot检测凋亡损伤相关因子。同时收取细胞提取RNA进行反转录之后用RT-PCR检测细胞调亡以及线粒体损伤相关因子水平。
(2)实验结果
图5为CCK-8检测亚硒酸钠和纳米硒对心肌细胞损伤的影响，结果表明亚硒酸钠为10μM时细胞已经死亡过半，而纳米硒100μM时对细胞毒性也很小，由此可见，纳米硒对细胞毒性很小，几乎无毒性。
图6为CCK-8检测纳米硒对心肌细胞氧化损伤保护结果图，图6A表明纳米硒能够减少H2O2对原代心肌细胞NRVM细胞损伤，降低NRVM细胞凋亡，图6B表明纳米硒能够减少H2O2对H9C2心肌细胞损伤，降低H9C2细胞凋亡；图7为心肌细胞氧化损伤模型中，使用纳米硒孵育后线粒体膜电位(JC-1)、活性氧(ROS)结果图，图7A结果表明，与对照组相比，纳米硒可以清除心肌细胞ROS，从而减少心肌细胞死亡，图7B表明与对照组相比，纳米硒可以维持氧化损伤模型中心肌细胞线粒体膜电位，减少细胞凋亡；图8为Western blot检测心肌细胞损伤给药之后细胞损伤结果图，图A中纳米硒组C-Parp-1、Bax和C-Caspase3水平与H2O2组相比显著下降，表明纳米硒能降低凋亡相关因子的表达，从而减少心肌细胞凋亡；图9在心肌细胞进行损伤给药之后，经RT-PCR检测细胞调亡以及线粒体损伤相关因子水平结果图；图10用Coumarin-6将纳米硒进行标记，探究其在细胞内的细胞器定位结果图，图10A荧光检测Coumarin-6偶联纳米硒在线粒体和溶酶体的定位情况，结果可见，纳米硒能够在线粒体和溶酶体处被吸收，图10B：用多功能酶标仪检测随时间变化心肌细胞对Coumarin-6偶联纳米硒的摄取率，结果表明，6h时纳米硒在心肌细胞内已达到最大摄取值，图10C荧光检测随时间变化Coumarin-6偶联纳米硒进入线粒体内情况，结果可见，随时间变化纳米硒在线粒体积累逐渐增高，6h时达高峰。
综上所述，本发明提供纳米硒在制备治疗和/或预防心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，实验结果显示，(1)纳米硒浓度为20μM对细胞具有显著保护作用。(2)纳米硒可显著减轻细胞损伤。(3)Western blot和RT-PCR检测细胞调亡以及线粒体损伤相关因子水平，如BAX、Cleaved-Caspase3和Cleaved-PARP-1等损伤相关因子水平显著下降，线粒体损伤相关因子如COX2、VADC-1和ND1水平都显著下降。(4)纳米硒能有效缓解心肌细胞的损伤，并且减轻细胞凋亡。(5)取血清做生化检测可见心肌梗死标志物CK和LDH水平明显下降。(6)使用Coumarin-6将纳米硒进行标记，探究其在细胞内亚细胞器定位，结果可见，纳米硒在细胞的重要细胞器，如线粒体和溶酶体处都有吸收，其中线粒体共定位更高，表明我们制备的纳米硒靶向进入线粒体。(7)在动物水平上，通过TTC-Evans Blue双染结果可见，纳米硒能够减轻心肌细胞的梗死面积，HE染色结果表明纳米硒可以降低心肌细胞的损伤或死亡。同时，纳米硒无毒，生物利用率高，能够通过屏障胃肠道中恶劣的环境来增加营养物质的稳定性，同时可靶向线粒体减轻心肌缺血再灌注损伤，从而解决心肌梗死治疗成本较高以及遗留一些后遗症的问题，并且为心肌梗死的治疗提供了新思路。

Claims (10)

1.纳米硒在制备治疗和/或预防心肌缺血再灌注损伤药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的纳米硒由PEG、SDS、维生素C和亚硒酸制备得到。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的纳米硒通过维生素C还原法制备：使用PEG为底物，将亚硒酸、维生素C、模板剂在水中反应，混匀得到纳米硒，所述模板剂为十二烷基硫酸钠。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，聚乙二醇的质量浓度为0.1％-1％，十二烷基硫酸钠的浓度为0.001-0.01mol/L。
5.纳米硒在制备治疗和/或预防心肌缺血再灌注引起心肌梗死药物中的应用。
6.纳米硒在制备治疗和/或预防心肌缺血再灌注引起心肌细胞损伤药物中的应用。
7.纳米硒在制备抗心肌细胞凋亡和/或抗心肌细胞凋亡相关疾病药物中的应用。
8.纳米硒在制备治疗和/或预防心肌缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡药物中的应用。
9.纳米硒在制备治疗和/或预防线粒体损伤相关疾病药物中的应用。
10.纳米硒在制备治疗和/或预防心肌缺血再灌注引起的线粒体损伤药物中的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109444435A (zh) * 2019-01-03 2019-03-08 河南大学 一种快速检测he4和ca125的纳米硒试剂盒
CN114053298A (zh) * 2021-11-19 2022-02-18 华中农业大学 一种用于抑制心肌肥大的药物及模型的构建方法

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Title
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