CN110221084A - 一种快速检测he4和ca125的纳米硒试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物学免疫层析检测方法领域，具体涉及一种快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒及其制备方法。该试剂盒由样品垫、结合垫、反应垫、吸水垫和PVC底板组成；所述的反应垫上有包被有抗CA125抗体A2的检测线T1、包被有抗HE4抗体B2的检测线T2以及包被有羊抗鼠IgG的质控线C；通过观察检测线的显色反应即可实现早期卵巢癌的床旁快速筛查诊断。本发明制备的纳米硒免疫层析试剂盒具有特异性强、灵敏度高、准确性好、简便快速、所需检测样本量少、适用于卵巢癌高危人群筛查及家庭自检和床旁快速检测。

Description

一种快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒
技术领域
本发明属于生物学免疫层析检测方法领域，具体涉及一种快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒及其制备方法。
背景技术
卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，死亡率高居妇科恶性肿瘤之首，同时具有发病率高、病情发展较快、预后不佳、极易复发等特点。早期卵巢癌患者的5年生存率可达70％，但是晚期卵巢癌患者的5年生存率仅有30％。由于卵巢癌的发病隐蔽，早期症状不明显，临床上大多数患者确诊时已为晚期，错过最佳治疗时机。而导致这些情况发生的原因与缺乏简便有效的早期检测方法密切相关。目前临床上对卵巢癌的诊断主要通过实验室检查、妇科检查及影像学检查等方法，这些方法操作复杂、耗时较长，并且需要大型仪器设备辅助。与之相比，血清学肿瘤标志检测具有敏感快速、创伤性小、检测简单、成本较低、易于采集等优点，是目前临床应用最广泛的筛查肿瘤的方法之一，也可用于肿瘤患者的疗效监测、预后评估以及高危人群的筛查。
糖链抗原CA125是一种糖蛋白复合物，主要存在于卵巢组织中。正常人血液中CA125含量较低，而在上皮性卵巢癌患者中CA125高度表达，并且可以在患者血液中被检测到(Zwakman N,Journal of gynecologic oncology)。作为当前卵巢癌早期筛查的主要血清肿瘤标志物，CA125被普遍应用于卵巢癌的诊断、治疗效果的评估及复发的预测，并被视为卵巢癌临床诊断的“金标准”。但是血清CA125敏感性较低，在盆腔炎、腹膜炎、子宫内膜异位症以及其他肿瘤中也有一定的表达，容易造成假阳性。因此，血清CA125在卵巢癌临床诊断中的应用具有一定的局限性。
人附睾蛋白4(HE4)是1991年由Kirchhoff等学者发现的一种富含半胱氨酸的小分子分泌性糖蛋白，在卵巢正常组织中未见其表达，而在卵巢肿瘤组织中高度表达(Steffensen K D,Oncology letters)。目前认为HE4是一种针对早期卵巢癌检测的新型血清标记物，同时HE4也是继CA125之后第一个获得美国食品药品管理局批准的可用于监测卵巢癌复发患者的肿瘤标志物。研究表明，HE4诊断的特异性显著高于血清CA125，其水平变化与卵巢癌发展阶段具有一定的相关性，一方面可以作为疾病诊断的参考，另一方面可以作为治疗效果监测指标，在监测预后效果上，也具有重要意义。但是HE4临床诊断卵巢癌的灵敏度比血清CA125低。血清CA125和HE4检测都是检测卵巢癌的重要肿瘤标志物，单独检测一个指标时，却各有不足。因此，二者联合检测在卵巢癌临床诊断中的应用逐渐广泛，CA125联合HE4的敏感性和特异性均优于二者的单独使用，在提高检出率的同时显著降低漏诊率和误诊率，可用于卵巢癌的早期诊断、鉴别、治疗监测及预后评估(Ghasemi N，MedicalOncology)。
目前国内外在卵巢癌肿瘤标志物早期检测方面大多是通过酶联免疫法和化学发光免疫分析法来实现，利用双抗体夹心的原理联合几种标志物进行定量检测方法可以对卵巢癌肿瘤标志物定量检测，但是需要借助仪器，操作复杂，检测时间较长。市场上尚无针对卵巢癌肿瘤标志物联合检测的侧向层析试剂盒。
本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、准确性强、操作简便、成本较低并适用于早期卵巢癌的床旁快速筛查诊断和家庭自检的HE4联合CA125双抗体夹心法纳米硒免疫层析试剂盒。本试剂盒制备基于抗原抗体免疫反应原理，利用双抗体夹心法。适合标记免疫球蛋白的纳米硒具有可以标记其他抗原或抗体的特点。
现有用于检测血液样本的家庭用侧向层析试剂盒存在以下缺陷：
1.纳米金成本高昂：家庭用侧向层析试剂盒目前多用的标记物是纳米金，其制备工艺和检测效果都较好，但是纳米金成本相对较高，制备过程较为复杂。
2.血液样本检测假阳性率高，灵敏性差：目前侧向层析试剂盒对于血清或者血液的检测相对困难，容易产生假阳性，尤其是双检测线的检测，灵敏度、稳定性更难控制，假阳性也更高。
本发明通过优化样品垫处理液的配方，意外地发现，采用本发明公开的样品垫处理液(磷酸盐缓冲液、蔗糖、300mM氯化钠、牛血清白蛋白和吐温)，可以显著降低血液样本检测的假阳性，明显提高检测准确率。
本发明提供的试剂盒采用侧向层析免疫法，具有简单、经济、准确、快速、特异、灵敏以及不需借助相关仪器等特点，且标记物采用的是纳米硒制备方法，相比于常见的胶体金等标记物制备更加简便、性能更加稳定、检测更加灵敏以及更经济实惠等优点。纳米硒法联合HE4以及CA125卵巢癌快速检测试剂盒的研制能够满足卵巢癌早期检测，该方法具备快速、简便、经济、准确、假阳性率更低等特点，适用于高危人群筛选，家庭自检以及床旁快速检测，对卵巢癌早期筛查和提高患者生存率具有重要意义。
参考文献：
Zwakman N,van de Laar R,Van Gorp T,et al.Perioperative)changes inserum CA125levels:a prognostic factor for disease-specific survival inpatients with ovarian cancer[J].Journal of gynecologic oncology,2016,28(1).
Steffensen K D,M,Brandslund I,et al.Identification of high-risk patients by human epididymis protein 4levels during follow-up of ovariancancer[J].Oncology letters,2016,11(6):3967-3974.
Ghasemi N,Ghobadzadeh S,Zahraei M,et al.HE4combined with CA125:favorable screening tool for ovarian cancer[J].Medical Oncology,2014,31(1):1-6.
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒及其制备方法。
所述的试剂盒由样品垫1、结合垫3、反应垫2、吸水垫4和PVC底板5组成，所述样品垫1、结合垫3、反应垫2和吸水垫4依次搭接在PVC底板上；所述的反应垫3上设置有包被有抗CA125抗体ab2的检测线T1、包被有抗HE4抗体ab2的检测线T2、包被有羊抗鼠IgG的质控线C。
所述的样品垫1经样品垫处理液处理，处理液由磷酸盐缓冲液、中性盐、蔗糖、牛血清白蛋白和吐温组成，余量为水。
所述的水可以为蒸馏水、超纯水、去离子水等常用实验用水，这是本领域技术人员可以理解的。
所述中性盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化钡、硫酸钙、硝酸钾中的一种。
优选地，所述样品垫处理液所含中性盐为氯化钠或氯化钾，浓度为300mM。
优选地，所述的样品垫处理液中的中性盐为氯化钠，浓度为300mM。
所述的纳米硒与抗HE4抗体和抗CA125抗体偶联的复合物经工作液悬浮固化于结合垫上，所述工作液由磷酸盐缓冲液、中性盐、牛血清白蛋白、糖类和吐温组成，所述中性盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化钡、硫酸钙、硝酸钾中的一种；所述糖类选自单醣、双醣或多糖中的一种。
优选地，所述工作液中的糖类为蔗糖和海藻糖。
优选地，所述工作液中的中性盐浓度为150-500mM。
优选地，所述的处理液和工作液的磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为7.2。
本发明所述的快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)纳米硒的制备
取16mL超纯水置于50mL小烧杯中，加入1mL的2mol/L的PEG，室温搅拌20min，分散均匀，得PEG溶液；将1mL的0.1mol/L的SDS溶于PEG溶液中，室温搅拌20min，分散均匀，得模板溶液；将1mL的0.04mol/L的亚硒酸溶于模板溶液中，室温搅拌20min，分散均匀，得亚硒酸溶液；将1mL的0.32mol/L的维生素C溶于亚硒酸模板溶液中，室温搅拌20min，分散均匀，即得纳米硒；
(2)抗体标记
取1mL步骤(1)制备得到的纳米硒，加入10μL浓度为1mol/L的碳酸钾溶液，调节体系的pH值为7.5；再加入2μL的2mg/mL的Anti-HE4-Ab1，室温混合30min，使Anti-HE4-Ab1充分的结合到纳米硒粒子上，完成Anti-HE4-Ab1的标记；取1mL步骤(1)制备得到的纳米硒，加入12μL浓度为1mol/L的碳酸钾溶液，调节体系的pH值为8.0；再加入3μL的2mg/mL的Anti-CA125-Ab1，室温混合30min，使Anti-CA125-Ab1充分的结合到纳米硒粒子上，完成Anti-CA125-Ab1的标记；
(3)封闭
向步骤(2)中纳米硒标记的Anti-CA125-Ab1和纳米硒标记的Anti-HE4-Ab1中加入BSA溶液，控制BSA的质量终浓度为1％，室温混匀30min，以封闭纳米硒纳米粒子上的裸露位点；
(4)重悬
封闭后的纳米硒标记抗体在10000rpm下离心10min，弃去上清，沉淀用120μL的工作液重悬；
所述工作液由磷酸盐缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖和Tween-20组成，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH为7.2；氯化钠浓度为150mM，牛血清白蛋白质量终浓度为2％，蔗糖质量终浓度为3％，海藻糖质量终浓度为3％，Tween-20体积终浓度为0.1％；磷酸盐缓冲液中，Na2HPO4·12H2O质量含量为0.26％，NaH2PO4·2H2O质量含量为0.044％；
(5)样品垫的制备
把GF-08玻璃纤维膜裁剪成220mm×100mm，浸泡在样品垫处理液中5min，然后在40℃的鼓风干燥箱中干燥12h，取出即得样品垫，放入自封袋中备用；
样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖和Tween-20组成，其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为7.2，氯化钠浓度为300mM，牛血清白蛋白的体积终浓度为10％，Tween-20的体积终浓度为0.05％，蔗糖的质量浓度为7％，磷酸盐缓冲液中Na2HPO4·12H2O的质量含量为0.26％，NaH2PO4·2H2O的质量含量为0.044％；
(6)结合垫的制备
将步骤(2)纳米硒标记的Anti-HE4-Ab1和Anti-CA125-Ab1分别均匀的铺在GF-06玻璃纤维膜上，所述玻璃纤维膜为2.8mm×75mm，硒标抗体的体积用量为120μL，然后在40℃的鼓风干燥箱中干燥3h，使标记抗体的纳米硒粒子固化在玻璃纤维膜上即得结合垫，取出放入自封袋，加入干燥剂，密封保存；
(7)反应垫的制备
将硝酸纤维素膜裁剪成25mm×100mm的规格，贴在PVC板上，然后用0.01mol/L，pH7.2的PBS把Anti-CA125-Ab2稀释至浓度为2mg/mL，作为T1检测线包被原；把Anti-HE4-Ab2稀释至浓度为1mg/mL，作为T2检测线包被原；把羊抗鼠IgG稀释为2mg/mL，作为质控线C包被原；用喷金划膜仪以1μL/cm划膜，置于40℃鼓风干燥箱干燥3h即得反应垫，取出放入自封袋，备用；
(8)试剂盒组装
将结合垫贴在反应垫的前端，压反应垫1mm，再将样品垫贴在结合垫的前端，压住结合垫2mm，最后将180mm×100mm吸水纸的前端贴在反应垫的后端，压反应垫2mm，另一端贴在PVC板的末端，即完成试纸条的组装，将组装好的试纸条放入切条机中，切成4mm宽的试纸条，放入卡壳中，可得HE4联合CA125快速检测试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种样品垫处理液，所述样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、蔗糖、300mM氯化钠、牛血清白蛋白和吐温组成。
本发明所述试剂盒的检测方法为：将人全血或血清样本及样本处理液(PBS+Tween-20)滴加到样品垫位置各1滴，样本将结合垫上的纳米硒与抗体复合物复溶，依靠毛细作用朝吸水垫方向层析，当层析到检测线及质控线后，会根据样本中是否含有目的物而分别显色。
本发明的有益效果是：①纳米硒的制备成本低，经济实惠；②HE4联合CA125双抗体夹心法对卵巢癌的筛查快速灵敏，准确率高；③能够提高检测结果的灵敏度，增强检测结果的特异性，可以消除检测过程中出现的假阳性，检测结果更准确；④需要检测的样本量小，适用于卵巢癌高危人群筛查及家庭自检和床旁快速检测。
附图说明
图1本发明的试剂盒的结构示意图；
图2本发明的试剂盒的检测结果判定图；
图3实施例1的试剂盒的灵敏度试验检测结果图；
图4实施例1的试剂盒的特异性试验检测结果图；
图5实施例1的试剂盒的稳定性试验检测结果图。
图6本发明试剂盒与常规方法制备试剂盒假阳性对比实验结果
具体实施方式
实施例一 快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒的制备
本发明试剂盒使用的Anti-HE4-Ab1、Anti-HE4-Ab2、Anti-CA125-Ab1和Anti-CA125-Ab2购自MEDIX公司，货号依次为4501、4503、4601、4602。
Anti-HE4-Ab1、Anti-HE4-Ab2分别为针对HE4不同抗原表位的单抗；
Anti-CA125-Ab1、Anti-CA125-Ab2分别为针对CA125不同抗原表位的单抗。
(1)纳米硒的制备
取16mL超纯水置于50mL小烧杯中，加入1mL的2mol/L的PEG，室温搅拌20min，分散均匀，得PEG溶液；将1mL的0.1mol/L的SDS溶于PEG溶液中，室温搅拌20min，分散均匀，得模板溶液；将1mL的0.04mol/L的亚硒酸溶于模板溶液中，室温搅拌20min，分散均匀，得亚硒酸溶液；将1mL的0.32mol/L的维生素C溶于亚硒酸模板溶液中，室温搅拌20min，分散均匀，即得纳米硒；
(2)抗体标记
取1mL步骤(1)制备得到的纳米硒，加入10μL浓度为1mol/L的碳酸钾溶液，调节体系的pH值为7.5；再加入2μL的2mg/mL的Anti-HE4-Ab1，室温混合30min，使Anti-HE4-Ab1充分的结合到纳米硒粒子上，完成Anti-HE4-Ab1的标记；取1mL步骤(1)制备得到的纳米硒，加入12μL浓度为1mol/L的碳酸钾溶液，调节体系的pH值为8.0；再加入3μL的2mg/mL的Anti-CA125-Ab1，室温混合30min，使Anti-CA125-Ab1充分的结合到纳米硒粒子上，完成Anti-CA125-Ab1的标记；
(3)封闭
向步骤(2)中纳米硒标记的Anti-CA125-Ab1和纳米硒标记的Anti-HE4-Ab1中加入牛血清白蛋白溶液，控制牛血清白蛋白的质量终浓度为1％，室温混匀30min；
(4)重悬
封闭后的纳米硒标记抗体在10000rpm下离心10min，弃去上清，沉淀用120μL的工作液重悬；
所述工作液由磷酸盐缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖和Tween-20组成，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH为7.2；氯化钠浓度为150mM，牛血清白蛋白质量终浓度为2％，蔗糖质量终浓度为3％，海藻糖质量终浓度为3％，Tween-20体积终浓度为0.1％；磷酸盐缓冲液中，Na2HPO4·12H2O质量含量为0.26％，NaH2PO4·2H2O质量含量为0.044％；
1L重悬液的配置方法：取600ml的蒸馏水，按照磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH为7.2；牛血清白蛋白质量终浓度为1.5％，蔗糖质量终浓度为3％，海藻糖质量终浓度为3％，吐温的质量终浓度为2％；准确称取各组分，加入蒸馏水中搅拌均匀，倒入1L的容量瓶中，用蒸馏水定容，备用。
(5)样品垫的制备
把GF-08玻璃纤维膜裁剪成220mm×100mm，浸泡在样品垫处理液中5min，然后在40℃的鼓风干燥箱中干燥12h，取出即得样品垫，放入自封袋中备用；
样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、蔗糖、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖和Tween-20组成，其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为7.2，氯化钠浓度为300mM，牛血清白蛋白的体积终浓度为10％，Tween-20的体积终浓度为0.05％，蔗糖的质量浓度为7％，磷酸盐缓冲液中Na2HPO4·12H2O的质量含量为0.26％，NaH2PO4·2H2O的质量含量为0.044％；
1L样品垫处理液的配置方法：取600ml的蒸馏水，按照磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为7.2，氯化钠浓度为300mM，牛血清白蛋白的体积终浓度为10％，Tween-20的体积终浓度为0.05％，蔗糖的质量浓度为7％，准确称取各组分，加入蒸馏水中搅拌均匀，倒入1L的容量瓶中，用蒸馏水定容，备用。
(6)结合垫的制备
将步骤(2)纳米硒标记的Anti-HE4-Ab1和Anti-CA125-Ab1分别均匀的铺在GF-06玻璃纤维膜上，所述玻璃纤维膜为2.8mm×75mm，硒标抗体的体积用量为120μL，然后在40℃的鼓风干燥箱中干燥3h，使标记抗体的纳米硒粒子固化在玻璃纤维膜上即得结合垫，取出放入自封袋，加入干燥剂，密封保存；(7)反应垫的制备
将硝酸纤维素膜裁剪成25mm×100mm的规格，贴在PVC板上，然后用0.01mol/L，pH7.2的PBS把Anti-CA125-Ab2稀释至浓度为2mg/mL，作为T1检测线包被原；把Anti-HE4-Ab2稀释至浓度为1mg/mL，作为T2检测线包被原；把羊抗鼠IgG稀释为2mg/mL，作为质控线C包被原；用喷金划膜仪以1μL/cm划膜，置于40℃鼓风干燥箱干燥3h即得反应垫，取出放入自封袋，备用；
(8)试剂盒组装
将结合垫贴在反应垫的前端，压反应垫1mm，再将样品垫贴在结合垫的前端，压住结合垫2mm，最后将180mm×100mm吸水纸的前端贴在反应垫的后端，压反应垫2mm，另一端贴在PVC板的末端，即完成试纸条的组装，将组装好的试纸条放入切条机中，切成4mm宽的试纸条，放入卡壳中，可得HE4联合CA125快速检测试剂盒。
实施例二 快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒的检测结果判定
1.检测方法：
将人全血或血清样本及样本处理液(PBS+Tween-20)滴加到本发明实施例1制备的试剂盒的样品垫位置各1滴，样本将结合垫上的纳米硒与抗体复合物复溶，依靠毛细作用朝吸水垫方向层析，当层析到检测线及质控线后，会根据样本中是否含有目的物而分别显色。
2.结果判定：
当质控线C、检测线T1和检测线T2均显色时，则被检测样品中含有灵敏度以上的HE4和糖链抗原CA125，如图2中1所示；当质控线C和检测线T1显色，而检测线T2不显色时，说明被检样品中含有灵敏度以上的CA125，但不含或含有灵敏度以下的HE4，如图2中2所示；当质控线C和检测线T2显色，而检测线T1不显色时，说明被检样品中含有灵敏度以上的HE4，但不含或含有灵敏度以下的CA125，如图2中3所示；当质控线C显色，检测线T1和检测线T2不显色时，说明被检样品中不含或含有灵敏度以下的CA125和HE4，如图2中4所示；当质控线C不显色，无论检测线T1和检测线T2显色与否，检测效果均无效，如图2中5-8所示。
实施例三 灵敏度检测
本实施例对实施例1中试剂盒的灵敏度进行检测。将HE4和CA125标准品用阴性血清分别稀释成浓度为100ng/mL+250U/mL、10ng/mL+100U/mL、2.5ng/mL+35U/mL，0.25ng/mL+3.5U/mL的标准溶液，阴性为不加HE4和CA125标准品的阴性血清。将80μL不同浓度的标准溶液分别加入试剂盒中，阴性结果为T检测线不显色，C质控线显色，阳性结果为T检测线和C质控线均显色，检出阳性结果的最低标准液浓度即为该试剂盒的灵敏度，具体检测结果如图3所示。
图3中，1为阴性血清检测结果，显示为阴性，2-5的浓度分别为标准品溶液的检测结果。由图可知，以双抗体夹心法制备的HE4联合CA125纳米硒早期检测试剂盒的灵敏度分别HE4为2.5ng/mL(即100pmol/L)，CA125为35U/mL，达到中国健康女性卵巢癌诊断总体参考值。
实施例四 特异性检测
本实施例对实施例1中试剂盒的特异性进行检测。用阴性血清分别配制250U/mL的CA125标准溶液和10ng/mL的HE4标准品溶液用于试剂盒的特异性检测。将80μL的上述样品溶液滴加入试剂盒中，具体检测结果如图4所示。
图4中，1为阴性血清的检测结果，显示为阴性；2为CA125标准品溶液的检测结果，显示为阳性；3为HE4标准溶液的检测结果，显示为阳性；4为CA125和HE4混合标准溶液的检测结果，显示为阳性。实验结果表明，Anti-CA125-Ab与Anti-HE4-Ab两者之间不存在交叉反应，实施例所制得的试剂盒的特异性良好。
实施例五 稳定性检测
本实施例对实施例1中试剂盒的稳定性进行检测。将同一批次的试剂盒在40℃保存两周后，将HE4和CA125标准品用阴性血清分别稀释成浓度为100ng/mL+250U/mL、10ng/mL+100U/mL、2.5ng/mL+35U/mL，0.25ng/mL+3.5U/mL的标准溶液，阴性为不加HE4和CA125标准品的阴性血清，进行检测，结果如图5所示。
图5中，1为阴性血清的检测结果，显示为阴性，2-5的浓度分别为100ng/mL+250U/mL、10ng/mL+100U/mL、2.5ng/mL+35U/mL，0.25ng/mL+3.5U/mL标准品溶液的检测结果。由图5可知，该试剂盒的显色正常，灵敏度仍然能够达到2.5ng/mL+35U/mL的标准，证明其稳定性良好。
实施例六 本发明试剂盒与常规方法制备试剂盒假阳性对比实验结果
本实施例对本发明试剂盒与常规方法制备试剂盒检测血液样品过程中产生的假阳性结果进行了评价实验本实施例评价的试剂盒分别为本实施例1公开的试剂盒和采用常规方法制备的检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒。
普通试剂盒与实施例1公开的试剂盒制备方法的区别在于，样品垫处理液的配方不同，其他制备步骤均相同：
本发明实施例1公开的样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、牛血清白蛋白、蔗糖和Tween-20组成，其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为7.2，氯化钠浓度为300mM，牛血清白蛋白的体积终浓度为10％，Tween-20的体积终浓度为0.05％，蔗糖的质量浓度为7％，磷酸盐缓冲液中Na2HPO4·12H2O的质量含量为0.26％，NaH2PO4·2H2O的质量含量为0.044％；
普通试剂盒采用的样品垫处理液的配方为：由磷酸盐缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、蔗糖和Tween-20组成，其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为7.2，氯化钠浓度为150mM，牛血清白蛋白的体积终浓度为10％，Tween-20的体积终浓度为0.05％，蔗糖的质量浓度为7％，磷酸盐缓冲液中Na2HPO4·12H2O的质量含量为0.26％，NaH2PO4·2H2O的质量含量为0.044％。％
首先，分别用阴性血清用于两种试剂盒的检测，其次，用阴性血清配制的浓度为250U/mL的CA125标准溶液和浓度为10ng/mL的HE4标准溶液用于本发明实施例1的试剂盒的检测。将80μL的上述样品溶液滴加入试剂盒中进行检测，具体检测结果如图6所示。
图6结果显示，1为普通试剂盒针对阴性血清的检测结果，显示为CA125的假阳性和HE4阴性，说明采用普通样品垫处理液处理的试剂盒，对正常血液的检测会出现CA125假阳性结果，导致正常人群的误诊；2为普通试剂盒的阳性检测结果，可以明显看出T1、T2检测线和C质控线显色良好；3为本实施例1的试剂盒的正常血液的检测结果，显示为CA125和HE4的检测阴性，说明在试剂盒制备过程中，试剂盒样品垫经过本发明公开的样品垫处理液处理后，能够明显消除正常人群血液出现的CA125检测假阳性的问题，极大地降低了误诊率；4为实施例1试剂盒的检测结果，T1、T2检测线和C质控线显色良好，说明本发明实施例1试剂盒的灵敏度及显色效果不受影响。
结论：以双抗体夹心法制备的人附睾分泌蛋白4(HE4)联合糖链抗原(CA125)纳米硒早期检测试剂盒的灵敏度为2.5ng/mL+35U/mL(即100pmol/L+35U/mL)，达到并优于中国健康女性卵巢癌诊断总体参考值，起到极好的警示作用且特异性、稳定性都较好。纳米硒标记抗体使用量较少，更加节省原材料的使用，降低了成本；纳米硒试剂盒的灵敏度优于纳米金。
且采用本发明的制备方法制备的人附睾分泌蛋白4(HE4)联合糖链抗原(CA125)纳米硒早期检测试剂盒检测假阳性率低，降低了普通方法制备的试剂盒的误诊率。
所述的试剂盒特异性强、灵敏度高、假阳性率低、检测速度快、操作简便、携带容易、无需特殊设备、成本低廉、无需专业培训、结果清晰易辨、适合于床旁检测和家庭自检。

Claims (10)

1.一种快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒，所述的试剂盒由样品垫(1)、结合垫(3)、反应垫(2)、吸水垫(4)和PVC底板(5)组成，所述样品垫(1)、结合垫(3)、反应垫(2)和吸水垫(4)依次搭接在PVC底板(5)上，其特征在于：
所述的反应垫(2)上设置有包被有抗CA125抗体的检测线T1、包被有抗HE4抗体的检测线T2、包被有羊抗鼠IgG的质控线C。
2.如权利要求1所述的一种快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒，其特征在于所述的样品垫(1)经样品垫处理液处理，样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、蔗糖、中性盐、牛血清白蛋白和吐温组成。
3.如权利要求2所述的一种快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒，其特征在于所述的中性盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化钡、硫酸钙、硝酸钾中的一种。
4.如权利要求3所述的一种快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒，其特征在于，所述样品垫处理液所含中性盐为氯化钠或氯化钾，浓度为300mM。
5.如权利要求4所述的纳米硒试剂盒，其特征在于，所述的样品垫处理液中的中性盐为氯化钠，浓度为300mM。
6.如权利要求1所述的一种快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒，其特征在于所述的纳米硒与抗HE4抗体和抗CA125抗体偶联的复合物经工作液悬浮固化于结合垫(3)上，所述工作液由磷酸盐缓冲液、中性盐、牛血清白蛋白、糖类和吐温组成，所述中性盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化钡、硫酸钙、硝酸钾中的一种；所述糖类选自单醣、双醣或多糖中的一种。
7.如权利要求6所述的纳米硒试剂盒，其特征在于，所述工作液中的糖类为蔗糖和海藻糖，所述的处理液和工作液的磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为7.2。
8.如权利要求6所述的一种快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒，其特征在于，所述中性盐浓度为150-500mM。
9.一种快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)纳米硒的制备
取超纯水，加入PEG，搅拌，得PEG溶液；将SDS溶于PEG溶液中，搅拌，得模板溶液；将亚硒酸溶于模板溶液中，搅拌，得亚硒酸溶液；将维生素C溶于亚硒酸模板溶液中，搅拌，即得纳米硒；
(2)抗体标记
取1mL步骤(1)制备得到的纳米硒，加入10μL浓度为1mol/L的碳酸钾溶液，调节体系的pH值为7.5；再加入2μL的2mg/mL的Anti-HE4-Ab1，室温混合30min，使Anti-HE4-Ab1充分的结合到纳米硒粒子上，完成Anti-HE4-Ab1的标记；
取1mL步骤(1)制备得到的纳米硒，加入12μL浓度为1mol/L的碳酸钾溶液，调节体系的pH值为8.0；再加入3μL的2mg/mL的Anti-CA125-Ab1，室温混合30min，使Anti-CA125-Ab1充分的结合到纳米硒粒子上，完成Anti-CA125-Ab1的标记；
(3)封闭
向步骤(2)中纳米硒标记的Anti-CA125-Ab1和纳米硒标记的Anti-HE4-Ab1中加入牛血清白蛋白溶液，控制牛血清白蛋白的质量终浓度为1％，室温混匀30min；
(4)重悬
封闭后的纳米硒标记抗体在10000rpm下离心10min，弃去上清，沉淀用120μL的工作液重悬；
所述工作液由磷酸盐缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖和Tween-20组成，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH为7.2；氯化钠浓度为150mM，牛血清白蛋白质量终浓度为2％，蔗糖质量终浓度为3％，海藻糖质量终浓度为3％，Tween-20体积终浓度为0.1％；磷酸盐缓冲液中，Na2HPO4·12H2O质量含量为0.26％，NaH2PO4·2H2O质量含量为0.044％；
(5)样品垫的制备
把GF-08玻璃纤维膜裁剪成220mm×100mm，浸泡在样品垫处理液中5min，然后在40℃的鼓风干燥箱中干燥12h，取出即得样品垫，放入自封袋中备用；
样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖和Tween-20组成，其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为7.2，氯化钠浓度为300mM，牛血清白蛋白的体积终浓度为10％，Tween-20的体积终浓度为0.05％，蔗糖的质量浓度为7％，磷酸盐缓冲液中Na2HPO4·12H2O的质量含量为0.26％，NaH2PO4·2H2O的质量含量为0.044％；
(6)结合垫的制备
将步骤(2)纳米硒标记的Anti-HE4-Ab1和Anti-CA125-Ab1分别均匀的铺在GF-06玻璃纤维膜上，干燥，使标记抗体的纳米硒粒子固化在玻璃纤维膜上即得结合垫，取出放入自封袋，加入干燥剂，密封保存；
(7)反应垫的制备
将硝酸纤维素膜贴在PVC板上，然后用0.01mol/L，pH7.2的PBS把Anti-CA125-Ab2稀释至浓度为2mg/mL，作为T1检测线包被原；把Anti-HE4-Ab2稀释至浓度为1mg/mL，作为T2检测线包被原；把羊抗鼠IgG稀释为2mg/mL，作为质控线C包被原；用喷金划膜仪以1μL/cm划膜，置于40℃鼓风干燥3h即得反应垫，取出放入自封袋，备用；
(8)试剂盒组装
将结合垫贴在反应垫的前端，再将样品垫贴在结合垫的前端，最后将吸水纸的前端贴在反应垫的后端，另一端贴在PVC板的末端，即完成试纸条的组装，可得HE4联合CA125快速检测试剂盒。
10.一种样品垫处理液，其特征在于，所述样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、蔗糖、300mM氯化钠、牛血清白蛋白和吐温组成。
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