CN106198983A - 用于卵巢癌检测的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于卵巢癌检测的试剂盒，包括：a.HE4试纸条，包括含有显色标记的HE4抗体的HE4金垫，以及含有HE4抗体的检测线和含有羊抗鼠IgG的质控线的硝酸纤维素膜，b.CA125试纸条，包括含有显色标记的CA125抗体的CA125金垫，以及含有CA125抗体检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜，c.SMRP试纸条，包括含有显色标记的SMRP抗体的SMRP金垫，以及含有SMRP抗体检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜。本发明具有操作简便、反应快速、敏感度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

Description

用于卵巢癌检测的试剂盒
[技术领域]
本发明涉及一种检测肿瘤标志物的试剂盒，具体涉及用于卵巢癌检测的试剂盒。
[背景技术]
卵巢癌发病率位于女性生殖道肿瘤第三位，仅次于宫颈癌和宫体癌，并呈逐年上升的趋势，死亡率居于第一位。卵巢癌早期临床症状不典型、客观，与卵巢良性肿瘤又很难区分，缺乏早期诊断的有效方法，往往错过最佳的诊疗时机。I期卵巢癌患者的5年生存率为90％，而晚期卵巢癌患者仅为30％。因此，如能早期检出可大大降低死亡率，延长生存时间。血清肿瘤标志物在肿瘤较小时就能被检测到，在卵巢癌的早期筛查、临床诊断、疗效评估、病情监测及预后判断等方面有较好的临床应用价值。
糖链抗原125(carbohydrateantigen125，CA125)是一种高分子量的粘蛋白型糖蛋白，分子量为200KD，最初是由Bast等人建立的Oc125单克隆抗体命名的，在上皮性卵巢癌细胞中CA125高度表达，并且能分泌到血液中。因此，血清CA125检测对卵巢恶性肿瘤特别是上皮性癌的诊断价值较高，已基本得到公认。但只有30％左右的I期患者血清中CA125(>35U/mL)上升，而且CA125在生理情况(月经期、妊娠期)和一些良性疾病(子宫内膜异位症、卵巢囊肿、伴有腹水的肝硬化)中都有可能增高。
人附睾蛋白4(humanepididymissecretoryprotein4，HE4)是一种编码含有乳清酸型4个二硫键核心域的蛋白质，又名核心表位蛋白2(WFDC2)，分子量约20-25KD，最早在人附睾上皮远端细胞中发现，并被成功克隆，是一种新的肿瘤标志物。正常情况下，HE4在人体中的表达非常低，仅在正常人的附睾、呼吸道上皮细胞及生殖道中表达，该酸性蛋白质在良性肿瘤患者及正常人血清中含量极低，而在卵巢癌中高度表达。联合检测血清中CA125和HE4可降低对良性卵巢囊肿的假阳性率，提高对卵巢癌的准确率。但两者联合检测对早期卵巢癌的敏感度只有50％左右，存在缺陷。
间皮素(MSLN)的前体蛋白是长约69kD的以糖基磷脂肽肌醇锚定在细胞膜上的糖蛋白，可以被蛋白水解酶水解成两部分，其中N端为31kD的可溶性蛋白，具有巨核细胞刺激活性，被称为巨核细胞强化因子(megakaryocyte—potentiatingfactorMPF)；而C端为长约40kD的膜结合蛋白，具有细胞黏附性，被称为MSLN。MSLN至少存在3个异构体，即异构体1、2、3，其中异构体3可溶性MSLN相关蛋白或多肽(solubleMSLNrelatedpeptide，SMRP)，是锚定于细胞表面的MSLN蛋白水解的脱落片段，可在血清中被检测到，MSLN参与了卵巢癌的细胞增殖、细胞黏附功能及抗凋亡过程。SMRP是分子量约为42～45kD的蛋白，远小于CA125蛋白(220kD)，同CA125一样释放入血液，因此理论上比CA125有更高的灵敏度，Anderson等发现在临床诊断前1年，卵巢癌患者血清中就可检测到SMRP，提示检测SMRP可能对卵巢癌的早期诊断有所帮助，与CA125和HE4肿瘤标志物联合应用可提高早期卵巢癌的检出率。
目前国内外尚无用胶体金法筛查卵巢癌的市场化产品。用胶体金法联合检测HE4和CA125筛查卵巢癌的专利只有一篇，中国实用新型专利CN201520311623.0一种快速联合检测HE4和CA125的试剂盒，该专利利用快速免疫层析法，定性检测血清样本中的HE4和CA125蛋白筛查卵巢癌。此专利的缺陷是对早期卵巢癌(I期和II期)诊断的灵敏度不高，不利于提高卵巢癌患者的生存率。肿瘤标志物SMRP(可溶性间皮素相关蛋白)分子量约为42～45KD，远小于CA125蛋白(220kD)，同CA125一样释放入血液中，因此，比CA125有更高的灵敏度，且能更早的检测出卵巢癌，有利于提高卵巢癌患者的生存率，对卵巢癌筛查具有重要意义。
[发明内容]
本发明的目的在于解决现有技术中试剂盒对早期卵巢癌(I期和II期)诊断的灵敏度不高的问题。
为了实现上述目的，提供一种用于卵巢癌检测的试剂盒，包括：
a.HE4试纸条
包括含有显色标记的HE4抗体的HE4金垫，以及含有HE4抗体的检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜。
b.CA125试纸条
包括含有显色标记的CA125抗体的CA125金垫，以及含有CA125抗体的检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜。
c.SMRP试纸条
包括含有显色标记的SMRP抗体的SMRP金垫，以及含有SMRP抗体的检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜。
该试剂盒还进一步具有如下优化方案：
显色标记采用的显色标记物为以胶体金、乳胶颗粒、荧光微球、量子点、化学发光或者酶标记物及可通过肉眼或者仪器进行检测的分子或者颗粒物分别标记HE4抗体、CA125抗体和SMRP抗体。
HE4、CA125和SMRP试纸条均还包括滤血膜、样本垫、吸水纸、底板。
三条试纸条的滤血膜、金垫、样本垫、硝酸纤维素膜、吸水纸均设置于底板之上，其硝酸纤维素膜靠近检测线的一端搭接各自的金垫，金垫另一端搭接对应的样本垫，样本垫上搭接全血滤膜，硝酸纤维素膜靠近质控线一端搭接吸水纸。
还包括盒体，盒体上设有加样孔，盒体内设有三联卡槽。
HE4试纸条中，其金垫和检测线中HE4抗体的浓度由健康人群血液中HE4的浓度分布阈值确定。
CA125试纸条中，其金垫和检测线中CA125抗体的浓度由健康人群血液中CA125的浓度分布阈值确定。
SMRP试纸条中，其金垫和检测线中SMRP抗体的浓度由健康人群血液中SMRP的浓度分布阈值确定。
本发明具有操作简便、反应快速、敏感度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
[附图说明]
图1为实施例中试纸条的结构；
图2～图5为T1、T2或T3其中任意一项显色为卵巢癌阳性的显色示意图；
图6为卵巢癌阴性的显色示意图；
图7为无效测试的显色示意图；
图1中1.PVC底板，2.硝酸纤维素膜，3.金垫，4.样本垫，5.滤血膜，6.吸水纸
[具体实施方式]
以下，结合实施例和附图对于本发明做进一步的说明，实施例和附图仅用于解释说明而不用于限定本发明的保护范围。
HE4、CA125和SMRP联合检测筛查卵巢癌的检测卡(中国人群)
阈值确定
中国健康人群总体HE4参考值为105.10pmol/L，CA125参考值为35u/ml，SMRP参考值为1.5nmol/L。根据上述阈值制备HE4、CA125和SMRP联合检测卡的工艺如下：
1主要材料
1.1鼠抗人HE4抗体A1、A2，鼠抗人CA125抗体B1、B2，鼠抗人SMRP抗体C1、C2(A1:名称HE4Monoclonal Antibody,货号M3028,厂家华信行；A2:名称HE4Monoclonal Antibody,货号M3026,厂家华信行；B1:名称CA125Monoclonal Antibody,货号M4462,厂家华信行；B2:名称CA125Monoclonal Antibody,货号M4461厂家华信行；C1:名称Anti-Mesothelinantibody,货号ab53285,厂家abcam；C2:名称Anti-Mesothelinantibody,货号ab99474,厂家abcam)，经过转染小鼠表达纯化获得，分别用于标记和检测；羊抗鼠IgG抗体：sigma公司产品，用于硝酸纤维素膜质控线或者质控斑点包被；硝酸纤维素膜：MILLIPORE公司产品；JY-Q01全血滤膜(用3mg/ml兔抗人RBC处理)、金垫、样本垫、吸水纸、PVC底板和三联卡壳：上海杰一生物技术有限公司
2方法
2.1HE4抗体A1、CA125抗体B1和SMRP抗体C1的标记以胶体金、乳胶颗粒、荧光微球、量子点、化学发光或者酶标记物及可通过肉眼或者仪器进行检测的分子或者颗粒物分别标记A1、B1和C1；以不同浓度的PEG、BSA及其他有封闭效果的蛋白或者高分子聚合物分别对标记物进行封闭；标记结束后以10000rpm离心，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲液(0.01MPBS+5％BSA+5％蔗糖)稀释至原溶液体积的1/10；然后用喷金划膜仪XYZ3050(BIODOT公司)将处理好的标记溶液按2ul/cm分别喷涂在无纺布或者玻璃纤维或者聚酯膜上制成HE4金垫、CA125金垫和SMRP金垫，25℃真空干燥3小时将标记物固相化。
2.2HE4抗体A2、CA125抗体B2和SMRP抗体C2的包被用磷酸盐缓冲液(0.01MPBS+5％蔗糖)将A2、B2、C2和羊抗鼠IgG抗体分别稀释至1mg/ml，然后用喷金划膜仪XYZ3050(BIODOT公司)把A2(检测线T1)和羊抗鼠IgG抗体(质控线C)喷在硝酸纤维素膜组成HE4膜，把B2(检测线T2)和羊抗鼠IgG抗体(质控线C)喷在硝酸纤维素膜组成CA125膜，把C2(检测线T3)和羊抗鼠IgG抗体(质控线C)喷在硝酸纤维素膜组成SMRP膜，包被完后将HE4膜、CA125膜和SMRP膜在温度37℃，相对湿度在＜25％的干燥间干燥12小时将包被物进行固相化。
2.3HE4试纸条组装(图1)在相对湿度＜25％的工作室内将已包被的HE4膜(2)放置在PVC底板(1)中部粘贴，在HE4膜T1线一侧搭接HE4金垫(3)(搭接HE4膜2mm)，在HE4金垫另一侧搭接粘贴上样本垫(4)(搭接HE4金垫1/5)，在样本垫上搭接全血滤膜(5)(搭接样本垫4/5)；在HE4膜C线一侧搭接吸水纸(6)(搭接HE4膜2mm)；然后用斩切机将粘贴好的PVC板切成一定宽带的试纸条(2-5mm)，再装入三联卡的HE4卡槽内。
2.4CA125试纸条组装(图1)在相对湿度＜25％的工作室内将已包被的CA125膜(2)放置在PVC底板(1)中部粘贴，在CA125膜T1线一侧搭接CA125金垫(3)(搭接CA125膜2mm)，在CA125金垫另一侧搭接粘贴上样本垫(4)(搭接CA125金垫1/5)，在样本垫上搭接全血滤膜(5)(搭接样本垫4/5)；在CA125膜C线一侧搭接吸水纸(6)(搭接CA125膜2mm)；然后用斩切机将粘贴好的PVC板切成一定宽带的试纸条(2-5mm)，再装入三联卡的CA125卡槽内。
2.5SMRP试纸条组装(图1)在相对湿度＜25％的工作室内将已包被的SMRP膜(2)放置在PVC底板(1)中部粘贴，在SMRP膜T1线一侧搭接SMRP金垫(3)(搭接SMRP膜2mm)，在SMRP金垫另一侧搭接粘贴上样本垫(4)(搭接SMRP金垫1/5)，在样本垫上搭接全血滤膜(5)(搭接样本垫4/5)；在SMRP膜C线一侧搭接吸水纸(6)(搭接SMRP膜2mm)；然后用斩切机将粘贴好的PVC板切成一定宽带的试纸条(2-5mm)，再装入三联卡的SMRP卡槽内。
3检测
步骤1，将试剂盒和待测样本取出，平衡至室温；
步骤2，打开密封的铝箔袋，将检测卡取出平放在实验台上；
步骤3，用滴管或者移液器取2-3滴或者60-90ul样本滴加在加样孔(S)；
步骤4，10-15分钟后判读。
当样本中HE4、CA125和SMRP蛋白浓度超过阈值时，检测线T1、T2和T3均显色，则为卵巢癌阳性；当样本中的HE4、CA125和SMRP蛋白浓度没超过阈值时，检测线T1、T2和T3均不显色，则为卵巢癌阴性。
4结果
4.1卵巢癌阳性：T1、T2或T3其中任意一项显色为卵巢癌阳性(如图2、图3、图4、图5)
4.2卵巢癌阴性：T1、T2和T3均不显色为卵巢癌阴性(如图6)
4.3无效结果：质控区(C)内未出现红色条带。表明不正确的操作过程或试剂已变质损坏(如图7)
利用HE4、CA125和SMRP联合检测卡检测血清，与卵巢癌的符合率如下表：

Claims (8)

1.一种用于卵巢癌检测的试剂盒，其特征在于包括：
a.HE4试纸条
包括含有显色标记的HE4抗体的HE4金垫，以及含有HE4抗体的检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜。
b.CA125试纸条
包括含有显色标记的CA125抗体的CA125金垫，以及含有CA125抗体的检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜。
c.SMRP试纸条
包括含有显色标记的SMRP抗体的SMRP金垫，以及含有SMRP抗体的检测线和含有羊抗鼠IgG质控线的硝酸纤维素膜。
2.如权利要求1所述的用于卵巢癌检测的试剂盒，其特征在于显色标记采用的显色标记物为以胶体金、乳胶颗粒、荧光微球、量子点、化学发光或者酶标记物及可通过肉眼或者仪器进行检测的分子或者颗粒物分别标记HE4抗体、CA125抗体和SMRP抗体。
3.如权利要求1所述的用于卵巢癌检测的试剂盒，其特征在于HE4、CA125和SMRP试纸条均还包括滤血膜、样本垫、吸水纸、底板。
4.如权利要求3所述的一种卵巢癌三联检测试剂盒，其特征在于三条试纸条的滤血膜、金垫、样本垫、硝酸纤维素膜、吸水纸均设置于底板之上，其硝酸纤维素膜靠近检测线的一端搭接各自的金垫，金垫另一端搭接对应的样本垫，样本垫上搭接全血滤膜，硝酸纤维素膜靠近质控线一端搭接吸水纸。
5.如权利要求1所述的用于卵巢癌检测的试剂盒，其特征在于还包括盒体，盒体上设有加样孔，盒体内设有三联卡槽。
6.如权利要求1所述的用于卵巢癌检测的试剂盒，其特征在于在HE4试纸条中，其金垫和检测线中HE4抗体的浓度由健康人群血液中HE4的浓度分布阈值确定。
7.如权利要求1所述的用于卵巢癌检测的试剂盒，其特征在于CA125试纸条中，其金垫和检测线中CA125抗体的浓度由健康人群血液中CA125的浓度分布阈值确定。
8.如权利要求1所述的用于卵巢癌检测的试剂盒，其特征在于SMRP试纸条中，其金垫和检测线中SMRP抗体的浓度由健康人群血液中SMRP的浓度分布阈值确定。
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