CN110275028A - 一种胶体金标记的抗he4抗体试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物学免疫层析检测方法领域,具体涉及一种胶体金标记的抗HE4抗体试剂盒及其制备方法。所述的试剂盒由样品垫、结合垫、反应垫、吸水垫和PVC底板组成;所述的反应垫上有包被有鼠源抗HE4抗体的检测线T以及包被有羊抗鼠IgG的质控线C;通过观察检测线的显色反应即可实现卵巢癌的床旁快速筛查诊断。本发明制备的胶体金免疫层析试剂盒假阳性率低、灵敏快速、稳定性好、结果易判,能够满足卵巢癌标志物HE4的快速筛查需求。
Description
技术领域
本发明属于生物学免疫层析检测方法领域,具体涉及一种胶体金标记的抗HE4抗体试剂盒及其制备方法。
背景技术
卵巢癌是一种妇科常见的恶性肿瘤,其死亡率居所有妇科恶性肿瘤之首,严重危害女性健康。由于卵巢癌早期通常无明显症状且缺乏简便有效的早期诊断方法,因出现症状就诊时约70%的患者已为晚期,晚期患者的且5年生存率为20%-30%,而早期患者的5年生存率为70-90%。因此,卵巢癌的早期检出对其治疗方案的选择及改善患者预后有重要作用。
目前,临床上常用的卵巢癌早期检测方法主要有妇科检查、影像学检查和肿瘤标志物检测等。这些方法及相互配合使用时虽然能够对卵巢癌进行准确诊断,但是对设备和操作人员要求较高,提高了检测成本,同时阻碍了卵巢癌早期检测的普及和推广。肿瘤标志物的检测被广泛用于肿瘤早期筛查,糖类抗原125(carbohydrate antigen125,CA125)是卵巢癌诊断中常用的肿瘤标志物,但是其用于卵巢癌诊断时的特异性较低,易出现假阳性等问题,因而需要找到一种新的肿瘤标志物来取代它或与其实现互补。人附睾蛋白4(humanepididymis secretory protein 4,HE4)是一种仅在卵巢癌组织中高表达,在其他正常组织中不表达或低表达的新型卵巢癌标志物,其用于卵巢癌的早期诊断的特异性和灵敏度均优于CA125。HE4由卵巢癌细胞分泌,分子量为25Kda,分子量较小,所以在卵巢癌早期容易分泌到血液中。HE4具有在不同病理类型的卵巢癌中差异化表达的特点,其在子宫内膜样卵巢癌中完全表达,黏液性卵巢癌中基本不表达,而在透明细胞癌和黏液性卵巢癌中表达率均较低,但明显高于卵巢良性肿瘤组织和正常组织。HE4是早期卵巢癌诊断中特异性最高、鉴别诊断最佳的肿瘤标志物,其与CA125联合使用时,敏感性变化不大,但会进一步提升对卵巢癌诊断的特异性,更有助于卵巢癌的早期检出。HE4作为一种小分子分泌蛋白,其可以在人血液中检测到,并且其比CA125释放更早且不受女性绝经状态等因素的影响,可广泛用于卵巢癌的早期诊断、预后评估和复发监测等方面。
另外,近年研究发现HE4在乳腺癌组织中也存在高表达,这表明HE4可能是检测乳腺癌一个理想的肿瘤标志物。人附睾蛋白4(HE4)是在1991年由Kirchhoff等学者发现的一种富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白,已先后发现其在卵巢癌、肺癌等恶性肿瘤中均存在高表达且在肿瘤早期就能检测到。其表达与乳腺癌患者的淋巴结转移相关并可能是乳腺癌复发的一个预测因素,HE4在相关肿瘤血清学诊断上具有较高的灵敏度和特异性,能较好地对乳腺癌进行早期检测筛查对于乳腺癌的发生、发展、治疗及预后具有重要临床意义。
目前,HE4常通过全自动化学发光免疫分析仪和酶联免疫吸附法试剂盒等进行定量检测,但是由于此类方法需要借助大型仪器设备且价格较高,一般在医院和中心实验室进行,难以作为普通人群的快速筛查手段。侧向层析技术具有快速、经济、准确、简便等优势已被广泛用于疾病标志物等方面的及时检测和家庭自检中。胶体金是目前制备侧向层析试剂盒时最常的标记探针,其制备工艺成熟、性能稳定,生物相容性好,能与蛋白、核酸等结合,可广泛用于疾病诊断等领域的快速检测,并且已有相关成品试剂盒走进家庭。但是,由于全血或者血清样本复杂,检测相对比较困难且容易产生假阳性,目前供家庭使用的侧向层析试剂盒通常仅用于检测尿液或者唾液样本。
因此,简化血液样本的前处理步骤,降低试剂盒假阳性率则成了目前亟待解决的难题。本试剂盒利用侧向层析技术,通过对样品垫处理液的优化研制出一种操作简便,快速准确、成本经济适用于家庭自检的卵巢癌早期检测试剂盒,不仅可以简化了血液样品的处理步骤及降低假阳性率,而且对卵巢癌的早期筛查、复发监测和提高患者生存率具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于快速检测卵巢癌肿瘤标志物HE4的胶体金免疫层析试剂盒及其制备方法。所述试剂盒由PVC底板1、样品垫2、结合垫3、反应垫4和吸水垫5组成,所述样品垫2、结合垫3、反应垫4和吸水垫5依次搭接在PVC底板1上;所述的反应垫4上设置有包被有胶体金标记的鼠源抗HE4抗体的检测线41、包被有羊抗鼠IgG的质控线42。
优选地,所述样品垫2经样品垫处理液处理,所述的样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、糖类、牛血清白蛋白、中性盐和表面活性剂组成,余量为水。
所述的水可以为蒸馏水、超纯水、去离子水等常用实验用水,这是本领域技术人员可以理解的。
优选地,所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH为6.0-9.0;所述的糖类为蔗糖,所述的中性盐为氯化钠;所述的表面活性剂选自吐温、Triton X-100、PVP、表面活性剂S7和表面活性剂S9中的一种。
优选地,所述的表面活性剂为吐温或Triton X-100,所述的吐温或Triton X-100质量终浓度为0.1%-2.5%。
优选地,所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH为7.2,磷酸盐缓冲液中Na2HPO4·12H2O的质量含量为0.26%,NaH2PO4·2H2O的质量含量为0.044%;蔗糖质量终浓度为3%,所述的牛血清白蛋白的体积终浓度为2%,所述的氯化钠浓度为300mM,所述的样品垫处理液中所含的表面活性剂为吐温,质量终浓度为0.5%。
优选地,所述的胶体金与抗HE4抗体偶联的复合物经重悬液悬浮固化于结合垫3上,所述重悬液由磷酸盐缓冲液、惰性蛋白、糖类和吐温组成。
优选地,所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH为6.0-9.0;所述惰性蛋白选自牛血清白蛋白、酪蛋白和鸡卵清白蛋白中的一种;所述糖类选自单糖、双糖或多糖中的一种。
优选地,所述的磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L,pH为7.2;所述的惰性蛋白为牛血清白蛋白,质量终浓度为0.1%-4%;所述糖类为蔗糖和海藻糖;所述的吐温质量终浓度为2%。
优选地,所述的磷酸盐缓冲液中,Na2HPO4·12H2O质量含量为0.26%,NaH2PO4·2H2O质量含量为0.044%;所述的牛血清白蛋白质量终浓度为1.5%,所述糖类为质量终浓度为3%蔗糖和质量终浓度为3%海藻糖。
本发明所述快速检测HE4的胶体金试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
(1)胶体金的制备
取80mL超纯水于一干净锥形瓶中并放入洁净转子,置于可加热型磁力搅拌器上加热至有气泡均匀冒出时,迅速加入1mL 1%氯金酸溶液,加热至沸腾后立即加入1mL 1.5%柠檬酸三钠,此时锥形瓶中溶液的颜色由灰黑色转变为酒红色,继续加热7min,取下锥形瓶,室温自然冷却后用容量瓶定容至100mL,密封备用。
(2)抗体标记
取1mL步骤(1)制备得到的胶体金,加入浓度为0.1mol/L的碳酸钾溶液,调节溶液的pH值为7.5;再加入3μL的2mg/mL的Anti-HE4-Ab1,室温混合30min,使Anti-HE4-Ab1充分的结合到胶体金粒子上,完成Anti-HE4-Ab1的标记;
(3)封闭
向步骤(2)中胶体金标记的Anti-HE4-Ab1中加入牛血清白蛋白溶液,控制牛血清白蛋白的质量终浓度为1.5%,室温混匀30min以封闭胶体金粒子上的裸露位点;
(4)重悬
封闭后的胶体金标记抗体在10000rpm下离心10min,弃去上清,沉淀用120μL的重悬液重悬;所述重悬液由磷酸盐缓冲液、牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖和吐温组成,其中磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L,pH为7.2;牛血清白蛋白质量终浓度为1.5%,蔗糖质量终浓度为3%,海藻糖质量终浓度为3%,吐温的质量终浓度为2%;磷酸盐缓冲液中,Na2HPO4·12H2O质量含量为0.26%,NaH2PO4·2H2O质量含量为0.044%;
(5)样品垫的制备
把GF-06玻璃纤维膜裁剪成220mm×100mm,浸泡在样品垫处理液中15min,然后在37℃的鼓风干燥箱中干燥12h,取出即得样品垫,放入密封袋中备用;样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、蔗糖、氯化钠、牛血清白蛋白和吐温组成,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH为7.2,氯化钠的浓度为300mM,牛血清白蛋白的体积终浓度为2%,吐温的体积终浓度为0.05%,磷酸盐缓冲液中Na2HPO4·12H2O的质量含量为0.26%,NaH2PO4·2H2O的质量含量为0.044%;
(6)结合垫的制备
将步骤(2)胶体金标记的Anti-HE4-Ab1均匀的铺在GF-06玻璃纤维膜上,干燥,使标记抗体的胶体金粒子固化在玻璃纤维膜上即得结合垫,取出放入密封袋,加入干燥剂,密封保存;
(7)反应垫的制备
将硝酸纤维素膜贴在PVC板上,然后用0.01mol/L,pH为7.2的PBS把Anti-HE4-Ab2稀释至浓度为2mg/mL,作为检测线包被原;把羊抗鼠IgG稀释为1mg/mL,作为质控线C包被原;用喷金划膜仪以1μL/cm划膜,置于37℃鼓风干燥6h即得反应垫,取出放入密封袋,备用;
(8)试剂盒组装
将结合垫贴在反应垫的前端,压反应垫1mm,再将样品垫贴在结合垫的前端,压住结合垫2mm,最后将180mm×100mm吸水纸的前端贴在反应垫的后端,压反应垫2mm,另一端贴在PVC板的末端,即完成试纸条的组装,将组装好的试纸条放入切条机中,切成4mm宽的试纸条,放入卡壳中,可得HE4快速检测试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种样品垫处理液,所述样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、牛血清白蛋白、300mM的氯化钠和吐温组成,余量为水,所述的水可以为蒸馏水、超纯水、去离子水等常用实验用水,这是本领域技术人员可以理解的。
本发明所述试剂盒的检测方法为:将人全血或血清样本及样本处理液(PBS+Tween-20)滴加到样品垫位置各1滴,样本将结合垫上的胶体金与抗体复合物复溶,依靠毛细作用朝吸水垫方向层析,当层析到检测线及质控线后,会根据样本中是否含有目的物而显色。
本发明的有益效果是:胶体金作为侧向层析试剂盒标记探制备工艺成熟、性能稳定;能够增强检测结果的特异性,消除检测过程中出现的假阳性,检测结果更准确;需要检测的样本量小,适用于广大女性的卵巢癌筛查及家庭自检和床旁快速检测。
附图说明
图1为本发明的试剂盒的结构示意图;
图2为本发明的试剂盒的检测结果判定指导图;
图3为实施例1的试剂盒的灵敏度试验检测结果图;
图4为实施例1的试剂盒与常规试剂盒假阳性对比试验检测结果图;
具体实施方式
以下将通过具体实施方式对本发明进行阐述,但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
本发明试剂盒使用的Anti-HE4-Ab1、Anti-HE4-Ab2购自MEDIX公司,货号依次为100589、100608。
实施例一、快速检测HE4的胶体金试剂盒的制备
Anti-HE4-Ab1、Anti-HE4-Ab2分别为针对HE4不同抗原表位的单抗。
(1)胶体金的制备
取80mL超纯水于一干净锥形瓶中并放入洁净转子,置于可加热型磁力搅拌器上加热至有气泡均匀冒出时,迅速加入1mL 1%氯金酸溶液,加热至沸腾后立即加入1mL 1.5%柠檬酸三钠,此时锥形瓶中溶液的颜色由灰黑色转变为酒红色,继续加热7min,取下锥形瓶,室温自然冷却后用容量瓶定容至100mL,密封备用。
(2)抗体标记
取1mL步骤(1)制备得到的胶体金,加入浓度为0.1mol/L的碳酸钾溶液,调节溶液的pH值为7.5;再加入3μL的2mg/mL的Anti-HE4-Ab1,室温混合30min,使Anti-HE4-Ab1充分的结合到胶体金粒子上,完成Anti-HE4-Ab1的标记;
(3)封闭
向步骤(2)中胶体金标记的Anti-HE4-Ab1中加入牛血清白蛋白溶液,控制牛血清白蛋白的质量终浓度为1.5%,室温混匀30min以封闭胶体金粒子上的裸露位点;
(4)重悬
封闭后的胶体金标记抗体在10000rpm下离心10min,弃去上清,沉淀用120μL的重悬液重悬;所述重悬液由磷酸盐缓冲液、牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖和吐温组成,其中磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L,pH为7.2;牛血清白蛋白质量终浓度为1.5%,蔗糖质量终浓度为3%,海藻糖质量终浓度为3%,吐温的质量终浓度为2%;磷酸盐缓冲液中,Na2HPO4·12H2O质量含量为0.26%,NaH2PO4·2H2O质量含量为0.044%;
1L重悬液的配置方法:取600ml的蒸馏水,按照磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L,pH为7.2;牛血清白蛋白质量终浓度为1.5%,蔗糖质量终浓度为3%,海藻糖质量终浓度为3%,吐温的质量终浓度为2%;准确称取各组分,加入蒸馏水中搅拌均匀,倒入1L的容量瓶中,用蒸馏水定容,备用。
(5)样品垫的制备
把GF-06玻璃纤维膜裁剪成220mm×100mm,浸泡在样品垫处理液中15min,然后在37℃的鼓风干燥箱中干燥12h,取出即得样品垫,放入密封袋中备用;样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、蔗糖、氯化钠、牛血清白蛋白和吐温组成,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH为7.2,所述蔗糖的质量终浓度为3%,氯化钠的浓度为300mM,牛血清白蛋白的体积终浓度为2%,吐温的体积终浓度为0.5%,磷酸盐缓冲液中Na2HPO4·12H2O的质量含量为0.26%,NaH2PO4·2H2O的质量含量为0.044%,余量为水。
1L样品垫处理液的配置方法:取600ml的蒸馏水,按照磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH为7.2,蔗糖的质量终浓度为3%,氯化钠的浓度为300mM,牛血清白蛋白的体积终浓度为2%,吐温的体积终浓度为0.5%,准确称取各组分,加入蒸馏水中搅拌均匀,倒入1L的容量瓶中,用蒸馏水定容,备用。
(6)结合垫的制备
将步骤(2)胶体金标记的Anti-HE4-Ab1均匀的铺在GF-06玻璃纤维膜上,干燥,使标记抗体的胶体金粒子固化在玻璃纤维膜上即得结合垫,取出放入密封袋,加入干燥剂,密封保存;
(7)反应垫的制备
将硝酸纤维素膜贴在PVC板上,然后用0.01mol/L,pH为7.2的PBS把Anti-HE4-Ab2稀释至浓度为2mg/mL,作为检测线包被原;把羊抗鼠IgG稀释为1mg/mL,作为质控线C包被原;用喷金划膜仪以1μL/cm划膜,置于37℃鼓风干燥6h即得反应垫,取出放入密封袋,备用;
(8)试剂盒组装
将结合垫贴在反应垫的前端,压反应垫1mm,再将样品垫贴在结合垫的前端,压住结合垫2mm,最后将180mm×100mm吸水纸的前端贴在反应垫的后端,压反应垫2mm,另一端贴在PVC板的末端,即完成试纸条的组装,将组装好的试纸条放入切条机中,切成4mm宽的试纸条,放入卡壳中,可得HE4快速检测试剂盒。
实施例二、胶体金标记的抗HE4抗体试剂盒的结果判定方法
HE4快速检测试剂盒的结果评判方法如图2所示,当C质控带1和T检测带2均显色时,则被检测样品中含有灵敏度以上的HE4(对应图2中3);当C质控带1显色,而T检测带2不显色时,说明被检样品中不含或含有灵敏度以下的HE4(对应图2中4);如C质控带1不显色,无论T检测带2显色与否,则检测效果无效(对应图2中5)。
HE4胶体金快速检测试剂盒的性能检测实验:
1.灵敏度检测
将HE4标准品用阴性人血清分别稀释成浓度为400pmol/L、200pmol/L、100pmol/L和50pmol/L的标准溶液,阴性为不加HE4标准品的阴性血清;然后将80μL不同浓度的标准溶液分别滴加入组装好的胶体金检测卡中,观察并记录结果。双抗体夹心法HE4胶体金试剂盒阴性结果为检测线T不显色,质控线C显色,阳性结果为检测线T和质控线C均显色;检出阳性结果的最低标准液浓度即为该试剂盒的灵敏度,即本试剂盒的灵敏度为100pmol/L,检测结果如图3所示。
2.假阳性对比实验
普通试剂盒与实施例1公开的试剂盒制备方法的区别在于,样品垫处理液的配方不同,其他制备步骤均相同:本发明实施例1公开的样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、蔗糖、氯化钠、牛血清白蛋白和吐温组成,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH为7.2,所述蔗糖的质量终浓度为3%,氯化钠的浓度为300mM,牛血清白蛋白的体积终浓度为2%,吐温的体积终浓度为0.05%,磷酸盐缓冲液中Na2HPO4·12H2O的质量含量为0.26%,NaH2PO4·2H2O的质量含量为0.044%;普通试剂盒的样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、牛血清白蛋白、氯化钠、蔗糖和Tween-20组成,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH为7.2,氯化钠浓度为150mM,牛血清白蛋白的体积终浓度为10%,Tween-20的体积终浓度为0.05%,蔗糖的质量浓度为7%,磷酸盐缓冲液中Na2HPO4·12H2O的质量含量为0.26%,NaH2PO4·2H2O的质量含量为0.044%。
首先,将80μl的HE4阴性血清和80μl加入HE4标准品(终浓度为200pmol/L)的血清分别加入到普通试剂盒进行检测,检测结果见图4中的1和2;其次,取同样处理方法的两种血清样本分别滴加到本发明实施例1制得的试剂盒中进行检测,结果见图4中的3和4。
图4结果显示,1为普通试剂盒针对HE4阴性血清的检测结果,显示为HE4的假阳性,说明采用普通样品垫处理液处理的试剂盒,对HE4阴性血液的检测会出现假阳性结果,造成正常人群的误诊;2为普通试剂盒加入添加有HE4的血清的检测结果,检测线T和质控线C显色良好,说明加入高浓度HE4时普通试剂盒的灵敏度及显色效果不受影响。3为本发明实施例1的试剂盒的加入同样的HE4阴性血清的检测结果,显示为HE4阴性,说明在试剂盒制备过程中,试剂盒样品垫经过本发明公开的样品垫处理液处理后,能够明显消除HE4阴性血清(正常人血液呈HE4阴性)检测时出现的HE4假阳性的问题,极大地降低了误诊率;4为实施例1试剂盒加入高浓度HE4的检测结果,检测线T和质控线C显色良好,说明本发明实施例1试剂盒的灵敏度及显色效果不受影响。
结论:以双抗体夹心法制备的人附睾蛋白4(HE4)胶体金早期快速检测试剂盒的灵敏度为100pmol/L,满足HE4的临床检测需求,采用本发明的制备方法制备的HE4胶体金早期检测试剂盒检测假阳性率低,降低了普通方法制备的试剂盒的误诊率。该试剂盒灵敏度高、检测速度快、操作简便、携带容易、无需特殊设备、成本低廉、无需专业培训、结果清晰易辨、适合于床旁检测和家庭自检。
Claims (10)
1.一种快速检测HE4的试剂盒,所述的试剂盒由PVC底板1、样品垫2、结合垫3、反应垫4和吸水垫5组成,所述样品垫2、结合垫3、反应垫4和吸水垫5依次搭接在PVC底板1上,其特征在于:所述的反应垫4上设置有包被有胶体金标记的抗HE4抗体的检测线41、包被有羊抗鼠IgG的质控线42。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的样品垫1经样品垫处理液处理,所述的样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、糖类、牛血清白蛋白、中性盐和表面活性剂组成,余量为水。
3.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH为6.0-9.0;所述处理液中的糖类为蔗糖;所述的牛血清白蛋白的体积终浓度为2%;所述的中性盐为氯化钠;所述的表面活性剂选自吐温、Triton X-100、PVP、表面活性剂S7和表面活性剂S9中的一种。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述的表面活性剂为吐温或Triton X-100,所述的吐温或Triton X-100质量终浓度为0.1%-2.5%。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒,其特征在于,所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH为7.2,磷酸盐缓冲液中Na2HPO4·12H2O的质量含量为0.26%,NaH2PO4·2H2O的质量含量为0.044%;所述蔗糖的质量终浓度为3%,所述的氯化钠浓度为300mM,所述的样品垫处理液中所含的表面活性剂为吐温,质量终浓度为0.5%。
6.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述的胶体金与抗HE4抗体偶联的复合物经重悬液悬浮固化于结合垫3上,所述重悬液由磷酸盐缓冲液、惰性蛋白、糖类和吐温组成,所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH为6.0-9.0;所述惰性蛋白选自牛血清白蛋白、酪蛋白和鸡卵清白蛋白中的一种;所述糖类选自单糖、双糖或多糖中的一种。
7.如权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述的磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L,pH为7.2;所述惰性蛋白为牛血清白蛋白,质量终浓度为0.1%-4%;所述糖类为蔗糖和海藻糖;所述的吐温质量终浓度为2%。
8.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述的磷酸盐缓冲液中,Na2HPO4·12H2O的质量含量为0.26%,NaH2PO4·2H2O的质量含量为0.044%;所述的牛血清白蛋白质量终浓度为1.5%,所述糖类为质量终浓度为3%蔗糖和质量终浓度为3%海藻糖。
9.一种如权利要求1所述的快速检测HE4的试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)胶体金的制备
取超纯水于锥形瓶中并放入洁净转子,加热至有气泡均匀冒出时,加入1mL1%氯金酸溶液,加热至沸腾后立即加入1mL1.5%柠檬酸三钠,此时锥形瓶中溶液的颜色由灰黑色转变为酒红色,继续加热7min,取下锥形瓶,室温冷却,定容至100mL,密封备用;
(2)抗体标记
取1mL步骤(1)制备得到的胶体金,加入10μL浓度为0.1mol/L的碳酸钾溶液,调节体系的pH值为8.0;再加入3μL的2mg/mL的Anti-HE4-Ab1,室温混合;
(3)封闭
向步骤(2)中胶体金标记的Anti-HE4-Ab1中加入牛血清白蛋白溶液,控制牛血清白蛋白的质量终浓度为1%,室温混匀30min;
(4)重悬
封闭后的胶体金标记抗体离心,弃去上清,沉淀用重悬液重悬;所述重悬液由磷酸盐缓冲液、牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖和吐温组成,余量为水,其中磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L,pH为7.2;牛血清白蛋白质量终浓度为1.5%,蔗糖质量终浓度为3%,海藻糖质量终浓度为3%,吐温的质量终浓度为2%;磷酸盐缓冲液中,Na2HPO4·12H2O质量含量为0.26%,NaH2PO4·2H2O质量含量为0.044%;
(5)制备样品垫
把GF-06玻璃纤维膜裁剪成220mm×100mm,浸泡在样品垫处理液中,干燥,取出即得样品垫,放入自封袋中备用;样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、蔗糖、氯化钠、牛血清白蛋白和吐温组成,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L,pH为7.2,蔗糖质量终浓度为3%,氯化钠浓度为300mM,牛血清白蛋白的体积终浓度为2%,吐温的质量终浓度为0.5%,磷酸盐缓冲液中Na2HPO4·12H2O的质量含量为0.26%,NaH2PO4·2H2O的质量含量为0.044%,余量为水;
(6)制备结合垫
将步骤(2)胶体金标记的Anti-HE4-Ab1均匀的铺在GF-06玻璃纤维膜上,干燥,使标记抗体的胶体金粒子固化在玻璃纤维膜上即得结合垫,取出放入密封袋,加入干燥剂,密封保存;
(7)制备反应垫
将硝酸纤维素膜贴在PVC板上,然后用0.01mol/L,pH为7.2的PBS把Anti-HE4-Ab2稀释至浓度为2mg/mL,作为检测线包被原;把羊抗鼠IgG稀释为1mg/mL,作为质控线C包被原;用喷金划膜仪以1μL/cm划膜,置于37℃鼓风干燥6h即得反应垫,取出放入密封袋,备用;
(8)试剂盒组装
将结合垫贴在反应垫的前端,再将样品垫贴在结合垫的前端,最后将吸水纸的前端贴在反应垫的后端,另一端贴在PVC板的末端,即完成试剂盒的组装,可得HE4快速检测试剂盒。
10.一种样品垫处理液,其特征在于,所述的样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、蔗糖、300mM氯化钠、牛血清白蛋白和吐温组成。
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