CN203275417U

CN203275417U - 定性及定量检测人绒毛促性腺激素免疫胶体金试剂条

Info

Publication number: CN203275417U
Application number: CN 201220684873
Authority: CN
Inventors: 苏娟; 刘松琴
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2022-12-12

Abstract

定性及定量检测人绒毛促性腺激素免疫胶体金试剂条，包括底板，所述底板上依次设有样品垫、结合垫、硝酸纤维素（NC）膜和吸水垫，硝酸纤维素膜设于底层，结合垫和吸水垫叠加在其两端，样品垫叠加在结合垫远离硝酸纤维素膜的一端，其中结合垫上设有Au-MabⅡ结合物，硝酸纤维素膜上划分为检测区（T区）和控制区（C区），所述检测区临近结合垫，控制区临近吸水垫，检测区包被有MabⅠ，控制区包被有羊抗鼠IgG，该试剂条不仅能够定性，而且无需借助专业分析仪器进行定量分析。本实用新型生产工艺成熟，流程简单，成本低廉，市场前景广泛，经济效益高。

Description

定性及定量检测人绒毛促性腺激素免疫胶体金试剂条

技术领域

本实用新型涉及一种定性及定量检测人绒毛促性腺激素层析免疫试剂条。

背景技术

人绒毛膜促性腺激素(HCG)是妇女受精卵着床后由胎盘绒毛膜细胞分泌的一种糖蛋白激素，可通过血液循环进入血液和尿液。绒毛膜促性腺激素在受精后第6日开始分泌，受精后第7日，就能在孕妇血清中和尿中测出，可用于早期妊娠的诊断。至妊娠8～10周血清浓度达到高峰，约50-100kU/L，持续10日后迅速下降，中、晚妊娠时血浓度仅为高峰时的10%，持续至分娩，一般于产后1-2周消失。妊娠不同时期以及各孕妇之间血清HCG值变化大，一般非孕妇女血HCG<100IU/L，妊娠期间血清HCG水平见下表。

妊娠周数	HCG（IU/L）
		0.2～1	5～50
1～2	50～500
		2～3	100～5000
3～4	500～10000
		4～5	1000～50000
5～6	10000～100000
		6～8	15000～200000
2～3月	10000～100000

在妊娠最初3个月，HCG水平每（2.2±0.5）天约升高一倍，孕40天>5000IU/L，孕60～70天>(8～32)×104IU/L。

正常参考值：

(1)血人绒毛膜促性腺激素的正常值<10μg/L；

(2)β-HCG的正常值<3.1μg/L；

(3)非孕妇女<25IU/L。

目前，HCG的定量检测方法主要有放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、化学发光法等，但是这些检测方法对仪器及检测人员有较高要求，而且检测繁杂耗时，成本高，不利于HCG的定量检测在广大基层开展。免疫胶体金层析技术(GICA)快速诊断试纸条是20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术。近年来发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。该技术主要是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在硝酸纤维素膜上，胶体金标记试剂吸附在结合垫上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待测物和金标试剂的复合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。免疫胶体金技术的发展前景自免疫胶体金层析技术作为诊断试剂广泛应用到临床后，由于它的快速简便、准确，具有高度特异性和高敏感性，结果直观可靠，而且试剂和样品用量极少，无需仪器设备及专业分析测试人士，简化了烦琐的常规操作过程误差，是一种目前发展最快的复合型免疫层析技术。

但目前市面上传统的免疫试剂条大多数只能做到定性检测，实现定量或者半定量检测及降低检测线是目前胶体金免疫试剂条发展趋势。

实用新型内容

解决的技术问题：本实用新型的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、简单快速、成本低廉、无需借助检测仪器可定量检测HCG的免疫金试剂条。

技术方案：定性及定量检测人绒毛促性腺激素免疫胶体金试剂条，包括底板，所述底板上依次设有样品垫、结合垫、硝酸纤维素（NC）膜和吸水垫，硝酸纤维素膜设于底层，结合垫和吸水垫叠加在其两端，样品垫叠加在结合垫远离硝酸纤维素膜的一端，其中结合垫上设有Au-MabⅡ结合物，硝酸纤维素膜上划分为检测区（T区）和控制区（C区），所述检测区临近结合垫，控制区临近吸水垫，检测区包被有MabⅠ，控制区包被有羊抗鼠IgG。

所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫的叠合区宽2mm。

所述底板为表面附有不干胶的PVC底板。

所述试剂条设于下塑料卡槽内，其上设有上塑料卡盖，上塑料卡盖上开设有进样槽和可视窗口，进样槽设于样品垫的上方，可视窗口设于检测区和控制区的上方。

所述检测区设于距离结合垫1.4cm处。

所述定量检测可采取用像素软件截取控制区显色获取像素值达到。

有益效果：

(1)特异性强

这里，我们对乳腺癌抗原(CA15-3)、癌胚抗原（CEA）及甲胎蛋白(AFP)进行了特异性检测。发现，该试剂条对两者均无交叉反应。

(2)检测限达标

临床上要求含量高于25mIU/mL为阳性，低于该值为阴性，我们通过在临床上的诊断，达到了临床上的检测要求。

(3)检测方便快捷，无需专业检测仪器及专业工作人员

整个检测过程在15min内完成，非专业人士即可操作，无需特殊的实验仪器。待测样进样后，待样品液流经结合垫，并带动其上的金结合物流入NC膜上后，通过肉眼观察T区颜色，出现红色斑点即为阳性结果；反之，呈阴性；C区无红色斑点则表示试剂条无效。

(4)检测结果不仅可以进行定性分析，还可定量

定量结果无需借助专业仪器，即常用电子产品：数码相机和笔记本，处理图形获取像素值，对照所给标准曲线，得定量分析结果。

(5)生产成本低，经济效益好

本实用新型生产工艺成熟，流程简单，成本低廉，市场前景广泛，经济效益高。

附图说明

图1为试剂条结构示意图，其中图a是试剂条进样时的示意图，图b是样品溶液流至NC膜但未至T区时的示意图；图c是样品溶液流至吸水垫时的示意图；1-样品垫、2-结合垫、3-硝酸纤维素膜、4-吸水垫、5-底板、6-检测区、7-控制区。

具体实施方式

实施例1

本实用新型通过优化实验条件，一方面考虑到检测线，另一方面考虑到材料成本。即最低Au-MabⅡ（Mab toβ-HCG antigen，Shanghai Linc-Bio Science Co.,Ltd）免疫金量、最低包被MabⅠ（Mab toα-HCG antigen，Shanghai Linc-Bio Science Co.,Ltd）量且又不影响检测线显色效果，最佳包被位置的选择。对检测结果可以通过拍照获取像素值，对照所给浓度对数值—像素值曲线，获得定量结果。其步骤如下：

(1)试剂条的制备：

试剂条由玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，且相互重叠2mm有序粘于附有不干胶的PVC底板5上，组成样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素（NC）膜3和吸水垫4。

(2)胶体金、Au-MabⅡ的制备及其纯化过程

金胶的制备：采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法，具体如下：50mL的0.01%(wt，下同)氯金酸搅拌煮沸，伴随持续加热搅拌立即加入2mL1%柠檬酸三钠，2min内溶液由无色变为酒红色，继续搅拌沸腾15min后，冷却至室温，4℃避光保存。

Au-MabⅡ制备过程：首先要确定最佳标记pH值，通过加入0.1M K₂CO₃溶液，达到调节金胶的pH值，每个PB管中加入200μL的上述制备好的金胶，再分别加入0、5、10、20、30、50μL的0.1M K₂CO₃摇匀，每个PB管均加入3μL2mg/mL MabⅡ(过量)，室温下涡旋混合标记20min。一方面，可以通过比较各管颜色，颜色最接近金胶原液的优选，可粗略得出最佳标记pH值；另一方面，通过比较各管紫外吸收峰位置，与金胶原液吸收峰位置最接近的即为最优选。发现，当加入5μL时，标记效果最优。因为金纳米粒子会堵坏pH计，不能直接测量调节过pH值的金胶，可以用精密pH试纸测量，这里，我们先离心该金胶，取上清液，测上清液的pH值，得pH9.60。然后配置该pH值下的缓冲液，即10mM硼酸盐缓冲液，作为Au-MabⅡ纯化过程中金标复溶液的缓冲液。其次要确定在此pH值条件下，最低的MabⅡ标记量。同pH值确定过程，即各管加入200μL最优pH值金胶，分别加入1、2、3、4、5、6μL的MabⅡ（500μg/mL），标记20min，加入20μL的NaCl(10%)后，可以通过比较各管颜色，最接近金胶原液且标记量最低即为最优选；也可以通过紫外光谱分析，峰值位置最接近金胶原液且标记量最低的即为最优选。发现，当加入4μL以上时，标记已完全，即选择最低标记量4μL。实际标记过程中，为了使标记完全，过量20%标记。

Au-MabⅡ纯化过程：上述优化后所得金胶结合物，加入5%牛血清蛋白(BSA)(pH9.60的10mM硼酸盐缓冲液配置)，使其在总溶液中浓度为1%，封闭30min，封闭非特异性活性位点。离心分离(132000g，15℃，15min)该结合物，弃去上清液。加入同体积金标复溶液(10%蔗糖、0.9%氯化钠、1%BSA的pH9.60的10mM硼酸盐缓冲液配)，使免疫金均匀再分散，同样步骤离心分离重复3次，以除去溶液中游离的MabⅡ。根据所需免疫金（Au-MabⅡ）的OD₅₂₀=1.0、0.5和0.25要求，确定最后一次加入金标复溶液的体积，即加入原体积的1/10、1/5和2/5的金标复溶液。

(3)样品缓冲液的优化

样品缓冲液的优化是考虑到样品缓冲液带动免疫金结合物在试剂条的流动速度。流速过快，夹心免疫反应不完全；流速过慢，一方面，大大延长检测时间，另一方面，免疫金会在NC膜滞留下较深的暗红色背景，影响观测结果判断。这里，我们通过改变表面活性剂Tween20的加入量，控制流速；但是发现加入Tween20时，会产生轻微的假阳性。庆幸的是，通过加入氯化钠可以消除假阳性，氯化钠加入量并非越多越好，加入过多会使流速变慢，延长检测时间。

这里，综合考虑检测时间和夹心免疫反应效率，我们优化了表面活性剂的加入量。通过优化发现Tween-20的量为0.1%，过低，检测时间长且NC膜上有暗红色免疫金滞留；过高，则夹心免疫反应效率低，检测区显色不明显。此条件下，NaCl最低的加入量为1%，过低，有假阳性；过高，检测时间长且伴随有免疫金在NC膜上有滞留，影响观测。

(4)NC膜上包被MabⅠ位置的选择

考虑到抗原抗体结合反应的效率，我们优化了MabⅠ包被位置。包被位置分别选择了距离结合垫位置0.5、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8cm。结合垫上喷免疫金稍过量，当检测样品浓度为5ng/mL时，包被位置选择为0.5、0.8、1.0、1.2、1.4cm的五个试剂条，检测区颜色逐渐加深；而包被位置在1.4、1.6、1.8cm的这三个试剂条的T区颜色不再加深。说明，当包被位置选择在1.4cm时，抗原抗体反应已基本完全。因此，包被MabⅠ位置选择在距离结合垫1.4cm处。

(5)结合垫喷免疫金密度和NC膜上包被MabⅠ浓度的优化

这里我们需要在保证不影响T区显色效果的同时，控制原材料成本最低。即喷金密度、包被MabⅠ浓度越低越优。这里，我们分别选择三种结合垫喷金密度，OD₅₂₀=1.0、0.5和0.25的免疫金2.5μL，NC膜T区包被MabⅠ浓度1.0、0.5和0.25mg/mL0.5μL，控制区均包被羊抗鼠IgG（Shanghai Jieyi Biotechnology Co.,Ltd）1mg/mL0.5μL。对于相同浓度的待测样，T区显色情况与结合垫的喷金密度及NC膜上T区包被抗体浓度有关。当待检测样浓度从1～800ng/mL递增，可以绘制出9条浓度对数值-T区像素值曲线。发现，当只要是低包被浓度和低喷金密度时，T区获得的显色像素值显示，被检测浓度范围窄；高包被浓度和高喷金密度时，检测范围明显增大，但同时原材料成本增加；中包被浓度和中喷金密度时，对于同浓度的检测样，T区的显色像素值与高浓度的相当。显然，我们选择2.5μL的5倍浓缩免疫金的喷金密度，0.5mg/mL的包被MabⅠ。

综合以上优化条件，在最优条件下，进样浓度在1～800ng/mL时，检测结束后，对T区形成的红色斑点拍照，并在像素软件中处理所得照片，获取各浓度下T区的像素值，这样就可以绘制出了浓度对数值-像素值标准曲线。对于未知浓度的待测样，可以通过先对检测区拍照获取像素值，再回到标准曲线上，从而得知了样品浓度，即达到定量检测目的。

(6)免疫试剂条检测效果及定量检测标准曲线绘制

递增待测样浓度，从右至左浓度分别是：0、1、3、5、8、10、50、100、150、200、250、300、325、350、375、400、450、500、600和800ng/mL，试剂条T区显色逐渐增强，当到达一定检测浓度颜色不再加深。对T区显色做像素分析，得知：当检测浓度在10～600ng/mL呈良好的线性关系。当检测浓度大于600ng/mL，T区颜色不再发生变化，达到了检测上限。

(7)免疫试剂条在实际血清的临床检测分析

这里我们从南京市妇幼保健院抽取了12个血清HCG样品，其真实浓度和我们诊断结果如下表：

从上表可知：我们的试剂条符合临床检测要求(低于25mU/mL为阴性)。

实施例2

定性及定量检测人绒毛促性腺激素免疫胶体金试剂条，包括底板5，所述底板上依次设有样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4，硝酸纤维素膜设于底层，结合垫和吸水垫叠加在其两端，样品垫叠加在结合垫远离硝酸纤维素膜的一端，其中结合垫上设有Au-MabⅡ结合物，硝酸纤维素膜上划分为检测区6和控制区7，所述检测区临近结合垫，控制区临近吸水垫，检测区包被有MabⅠ，控制区包被有羊抗鼠IgG。所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫的叠合区宽2mm。所述底板为表面附有不干胶的PVC底板。所述试剂条设于下塑料卡槽内，其上设有上塑料卡盖，上塑料卡盖上开设有进样槽和可视窗口，进样槽设于样品垫的上方，可视窗口设于检测区和控制区的上方。所述检测区设于距离结合垫1.4cm处。

Claims

1.定性及定量检测人绒毛促性腺激素免疫胶体金试剂条，包括底板（5），其特征在于所述底板上依次设有样品垫（1）、结合垫（2）、硝酸纤维素膜（3）和吸水垫（4），硝酸纤维素膜设于底层，结合垫和吸水垫叠加在其两端，样品垫叠加在结合垫远离硝酸纤维素膜的一端，其中结合垫上设有Au-MabⅡ结合物，硝酸纤维素膜上划分为检测区（6）和控制区（7），所述检测区临近结合垫，控制区临近吸水垫，检测区包被有MabⅠ，控制区包被有羊抗鼠IgG。

2.根据权利要求1所述的定性及定量检测人绒毛促性腺激素免疫胶体金试剂条，其特征在于所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫的叠合区宽2mm。

3.根据权利要求1所述的定性及定量检测人绒毛促性腺激素免疫胶体金试剂条，其特征在于所述底板为表面附有不干胶的PVC底板。

4.根据权利要求1所述的定性及定量检测人绒毛促性腺激素免疫胶体金试剂条，其特征在于所述试剂条设于下塑料卡槽内，其上设有上塑料卡盖，上塑料卡盖上开设有进样槽和可视窗口，进样槽设于样品垫的上方，可视窗口设于检测区和控制区的上方。

5.根据权利要求1所述的定性及定量检测人绒毛促性腺激素免疫胶体金试剂条，其特征在于所述检测区设于距离结合垫1.4cm处。