CN105866410A - 一种联合检测nse、cea的免疫层析检测试纸条及其制备方法和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条，采用双抗夹心法，包括背衬板和依次相互重叠地铺设在背衬板上的样品垫、结合垫、层析垫、吸水垫；结合垫上设置有第一纳米磁珠免疫探针和第二纳米磁珠免疫探针；第一纳米磁珠免疫探针包括羧基纳米磁珠和抗NSE的单克隆抗体，第二纳米磁珠免疫探针包括羧基纳米磁珠和抗CEA的单克隆抗体；层析垫上依次设置有第一检测线、第二检测线和质控线，其中质控线相比于第一检测线更靠近吸水垫；第一检测线上设置有鼠源NSE检测抗体，第二检测线上设置有鼠源CEA检测抗体；质控线上设置有羊抗鼠二抗。本发明能大大提高检测NSE、CEA的灵敏度和准确性。

Description

一种联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条及其制备方法和应用方法

技术领域

本发明涉及一种试纸条及其制备方法和应用方法，具体地涉及一种联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条及其制备方法和应用方法。

背景技术

近免疫层析技术是将免疫标记技术与层析技术结合起来的一种新型检测技术，可以利用标记物的显色特性，实现对待测物的定性、半定量、定量分析。它是以微孔滤膜为固相载体，以待测液为流动相，利用微孔滤膜的毛细作用及虹吸作用引导待测液体向前流动，同时待测液中的相关成分和固定在滤膜上的抗原或抗体发生反应，形成免疫复合物后，滞留在检测线上，通过对标记物颜色的深浅或荧光的光密度分析，从而得到直观的检测结果。

目前，大多数商业化的定点即时检测手段主要是以免疫层析试验(ICA)居多，该试验也被称之为横向测流检测(LFT)。免疫层析试验操作非常简单，结合了免疫学实验的原理与薄层色谱技术，加样后即可在规定时间内如10分钟或20分钟左右得到检测结果。免疫层析试纸条主要包括5个部分：加样区(样品垫)、标记区(结合垫)、显示区(硝酸纤维素膜)、吸水区(吸水垫)以及背衬板。样品垫可以是纤维素、玻璃纤维、人造纤维等等滤过性介质，主要目的是过滤样本中的颗粒、调节样本的pH以及结合样本中干扰随后层析反应的成分；结合垫可以是玻璃纤维、聚酯纤维或者人造纤维，主要目的是装载标记物如纳米金标记单抗、二抗等并在层析检测中稳定地释放这些标记物；硝酸纤维素膜的主要作用是固化抗原或者抗体等并提供层析检测反应的场所，在免疫层析实验中主要用接触式或非接触式点样仪在膜上线状固化抗原或抗体等形成检测线(T线)和质控线(C线)；吸水垫一般为高密度的纤维素，是层析反应的动力源，控制着层析反应中待检样品持续流动的方向；背衬则为聚苯乙烯或者其他塑料材料，用于为免疫层析试纸条的层叠结构提供刚性支持。当样品垫加入待检样品如血清、尿液等，如果待检样品中有靶分子，则与结合垫中的标记物反应形成复合物，在毛细作用下通过硝酸纤维素膜向吸收垫方向流动，并被硝酸纤维素膜上固化的相应的抗原或抗体等配体分子捕获(捕获位置分别在检测线和质控线上)而被肉眼或者与标记物对应的设备检测到。

根据免疫学反应形式的不同可以将免疫层析试纸条分为两种类型：三明治夹心检测和竞争检测。前者利用检测线上固化的捕获抗体或者抗原对分析物进行捕获固定，同时标记抗体或者抗原对分析物进行标记，由此形成夹心结构复合物，主要用于检测具有多个结合位点的较大分析物，人们熟知的早早孕自检试纸条就是利用这种技术。而竞争检测是待检分析物与检测线上固化的同等分析物竞争结合结合垫上的抗体或者其他配体标记物，结果的判定与三明治夹心检测法正好相反，主要用于检测只有单个结合位点的小分子分析物。免疫层析试纸条结果的判读主要有以下两种：一是直接肉眼观察检测线是否显色来判断待测物的有无；二是用相关仪器读取试纸条检测线上的信号强度，给出一个定量或半定量的待测物含量，其信号强度和待测物含量呈正相关关系。

免疫层析检测法这种检测模式由于其简便、有效、廉价等优点，在目前的定点即时检测中的市场需求依然十分旺盛，基于此检测模式的各种标记分析方式还在不断被开发并应用到如蛋白检测、核酸检测、病毒学、细菌学、抗生素等领域中。由于传统的基于纳米金的免疫层析试纸条灵敏度有限，许多研究人员开始把目光转向新的标记方式如酶法、银染增强法、化学发光法或是荧光法，希望能以此增加免疫层析检测的灵敏度。

血清神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)为小细胞肺癌的一种肿瘤标志物。其在正常人血液中的含量在12.5ng/ml以下,在肺癌组织中的含量是正常肺组织中的3～35倍，是小细胞肺癌(SCLC)敏感特异的肿瘤标志物。和非小细胞肺癌相比，NSE在小细胞肺癌病人血清中有明显的增加。癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)是一种人类胚胎抗原决定簇的酸性糖蛋白，正常成人血清中CEA含量极低，小于5ng/ml。CEA存在于多种肿瘤组织，是目前应用最广泛的肿瘤标记物之一，约有30％～70％的肺癌CEA水平明显升高，目前的研究结果显示CEA的水平与疾病预后及治疗效果密切相关。对NSE、CEA两种肺癌肿瘤标志物进行联合检测，可以进一步提高确诊肺癌的可能性。对上述两种肿瘤标志物的传统检测方法是ELISA，这种检测方法每次只能检测一种标志物，不能满足多种标志物同时检测的需要。

磁性免疫层析技术是以超顺磁性颗粒代替传统的标记物来进行免疫层析，通过检测结合在超顺磁性纳米颗粒上的目标物来提供对生物样本的定量检测数据，再利用被磁颗粒标记抗体所捕获的免疫复合物与磁信号之间的线性关系即可实现对生物样本的快速定量检测目的，此方法借助于磁强度检测仪来捕捉检测线上的磁信号强度，磁信号的捕捉不受膜厚度的影响，所有的阳性信号都能被检测，因而能大大提高检测的灵敏度和准确性。磁性免疫层析检测技术具有灵敏度高、稳定性强、线性范围宽、操作简便、快速等优点。

现有技术中存在的问题：

1、传统酶联免疫吸附试验及成熟的免疫层析检测，每次只能检测一种标志物，不能满足多种标志物同时检测的需要。

2、现有检测技术，由于只能靠目测来判断检测结果，主观性很大；所以只能实现定性检、半定量或不准确的定量检测；免疫层析的检测灵敏度也有待提高。

3、基于光电效应的定量免疫检测技术，由于只能检测硝化纤维膜表面的免疫颗粒的光线，所以很难真实反映检测线上免疫颗粒的总量，不利于定量检测的准确性。

发明内容

为了解决如上所述现有技术中的问题，本发明提供一种联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所用的免疫层析法的类型为双抗夹心法；包括背衬板和依次相互重叠地铺设在背衬板上的样品垫、结合垫、层析垫和吸水垫；结合垫上设置有第一纳米磁珠免疫探针和第二纳米磁珠免疫探针；第一纳米磁珠免疫探针包括羧基纳米磁珠和抗NSE的单克隆抗体，第二纳米磁珠免疫探针包括羧基纳米磁珠和抗CEA的单克隆抗体；层析垫上依次设置有第一检测线、第二检测线和质控线，其中质控线相比于第一检测线更靠近吸水垫；第一检测线上设置有鼠源NSE检测抗体，第二检测线上设置有鼠源CEA检测抗体；质控线上设置有羊抗鼠二抗。

进一步地，沿背衬板的长度方向各重叠部分的长度为0.5～2mm。

进一步地，结合垫上设置的第一纳米磁珠免疫探针与第二纳米磁珠免疫探针的浓度比值为1:1.2。

进一步地，样品垫和结合垫均采用玻璃纤维素膜，层析垫采用硝酸纤维素膜。进一步地，背衬板采用聚氯乙烯(PVC)材料。

进一步地，层析垫采用硝酸纤维素膜Millipore95；第一检测线、第二检测线和质控线两两相邻的线之间的间隔距离≥2mm；羧基纳米磁珠的粒径为<100nm。

本发明还保护一种如上所述的联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，第一纳米磁珠免疫探针和第二纳米磁珠免疫探针的制备：在2吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液中，用EDC(N-C二甲/胺-3-丙基-N-乙基碳二亚胺)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化羧基纳米磁珠表面的羧基，分离磁珠，弃上清，洗涤未反应的活化剂，然后分别加入抗NSE的单克隆抗体和抗CEA的单克隆抗体，分别制得第一纳米磁珠免疫探针和第二纳米磁珠免疫探针；

步骤二、结合垫和样品垫的制备：将玻璃纤维素膜浸泡在含有蔗糖、海藻糖、聚乙二醇辛基苯基醚-100(TritonX-100)的硼酸盐(BS)缓冲液中，润湿后，干燥获得空白结合垫，将步骤一得到的第一纳米磁珠免疫探针和第二纳米磁珠免疫探针混合后固定到空白结合垫得到结合垫；将玻璃纤维素膜浸泡在含NaCl、牛血清白蛋白(BSA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的硼酸盐吐温(BST)缓冲液中，润湿后，干燥获得样品垫；

步骤三、第一检测线、第二检测线和质控线的制备：将NSE检测抗体、CEA检测抗体和羊抗鼠二抗依次包被到硝酸纤维素膜上分别制得第一检测线、第二检测线和质控线，而带有第一检测线、第二检测线和质控线的硝酸纤维素膜即为层析垫；

步骤四、试纸条的组装：在背衬板上依次设置样品垫、结合垫、层析垫和吸水垫，各相邻垫之间相互重叠0.5～2mm，得到联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条，其中层析垫的设置方向为使得控制线相比于第一检测线更靠近吸水垫。

优选地，步骤一具体为：在pH5.5的0.01M的MES缓冲液中，用EDC、NHS活化羧基纳米磁珠表面的羧基30min；利用磁分离架分离磁珠，弃去上清后用pH9.0的0.005M的BS缓冲液洗涤未反应的活化剂，分别加入抗NSE的单克隆抗体和抗CEA的单克隆抗体，分别在36℃摇床反应3小时，再分别用含8％BSA的BS缓冲液封闭1小时，分别用磁分离架分离磁珠，分别弃上清后分别用BST清洗3遍，分别加入含0.05％吐温的BS保存液，分别制得第一纳米磁珠免疫探针和第二纳米磁珠免疫探针。

优选地，步骤二具体为：将玻璃纤维素膜浸泡在含有5％蔗糖、2％海藻糖、0.025％TritonX-100、0.02M BS缓冲液中，润湿后，28℃干燥获得空白结合垫，将步骤一得到的第一纳米磁珠免疫探针和第二纳米磁珠免疫探针混合后按照1ml/15cm的用量均匀喷涂在空白结合垫上，静置、干燥得到结合垫；将玻璃纤维素膜浸泡在含2％NaCl、0.5％BSA、0.4％PVP、0.02M BST缓冲液中，润湿后，干燥获得样品垫，结合垫和样品垫均封袋置于4℃保存备用。

优选地，步骤三具体为：用pH7.4的PBS缓冲液分别将NSE检测抗体、CEA检测抗体稀释到2mg/ml，羊抗鼠二抗稀释到1mg/ml；然后用Bio Dot喷膜机在硝酸纤维素膜上分别包被稀释后的NSE检测抗体、稀释后的CEA检测抗体和稀释后的羊抗鼠二抗，分别制得第一检测线、第二检测线和质控线，各线之间间隔距离2-3.5mm，而带有第一检测线、第二检测线和质控线的硝酸纤维素膜即为层析垫。

优选地，步骤四具体为：在背衬板上依次设置样品垫、结合垫、层析垫和吸水垫，各相邻垫之间相互重叠1～1.5mm，其中层析垫的设置方向为使得控制线相比于第一检测线更靠近吸水垫；然后用自动切膜机将背衬板及其上设置的样品垫、结合垫、层析垫和吸水垫进行切割成宽度2.5-4mm的长条，将长条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存，长条即为联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条。

本发明还保护一种如上所述的联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的应用方法，包括以下步骤：

步骤一，将待测样本加到联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的样品垫上，通过层析作用待测样本会从样品垫出发依次经过联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的结合垫、联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的层析垫和联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的吸水垫；

步骤二，待待测样本进入吸水垫后，用磁强度检测仪分别检测分析层析垫上的第一检测线和层析垫上的第二检测线的磁信号强度和层析垫上的控制线的磁信号强度，实现对NSE和/或CEA的定量检测。

本发明的有益效果是：

1、本发明不仅保留了传统免疫层析检测试纸条操作简便、结构简单、低成本的优点，还首次采用免疫层析方法联合检测人机体血清/血浆中的肺癌标记物NSE和CEA，利用双检测线同时对NSE、CEA进行联合定量检测，有效提高肺癌的筛查及诊断。

2、本发明所涉及的检测试纸条，是利用纳米磁珠作为标记物，通过抗原抗体特异性结合反应富集在检测线上，再利用磁强度检测仪探测检测线上的磁信号强度，得到定量检测结果。与胶体金试纸条相比，此方法不受膜厚度的影响，所有的阳性信号都能被检测，结果数字化定量，可信程度高，因而能大大提高检测的灵敏度和准确性。

3.在试纸条的样品垫和结合垫上添加适量的亲水聚合物和封闭试剂，保证在试纸条层析过程中，固定在结合垫上的免疫磁珠纳米探针能快速完全释放，在硝酸纤维素膜上有较快的层析速度，而且不与硝酸纤维素膜发生非特异性吸附。

附图说明

图1是本发明所涉及的联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的结构示意图。

图2和3是本发明所涉及的联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的检测原理示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供一种联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条，如图1所示，包括样品垫1、结合垫2、层析垫7、吸水垫3和背衬板8，所用的免疫层析法的类型为双抗夹心法，样品垫1、结合垫2、层析垫7、吸水垫3依次相互重叠0.5～2mm粘贴在背衬板8上；结合垫2上设置有第一纳米磁珠免疫探针和第二纳米磁珠免疫探针。所述第一纳米磁珠免疫探针包括羧基纳米磁珠和抗NSE的单克隆抗体，所述第二纳米磁珠免疫探针包括羧基纳米磁珠和抗CEA的单克隆抗体。层析垫7上上依次设置有第一检测线6、第二检测线5和质控线4。第一检测线6上设置有鼠源NSE检测抗体，第二检测线5上设置有鼠源CEA检测抗体；质控线4上设置有羊抗鼠IgG，是一种羊抗鼠二抗。

如图2和3所示，上述试纸条的检测原理是：采用双抗夹心法。当待测样品加样到样品垫后，由于层析作用待测样品随层析液向吸水垫方向前进。若待测样品中含有NSE则会在结合垫处被第一纳米磁珠免疫探针(因为其包含抗NSE的单克隆抗体)捕获，并一同向吸水垫方向前进。当前进到第一检测线时，由于此处包被有鼠源NSE检测抗体(该抗体是另一种抗体，不同于第一纳米磁珠免疫探针中的抗NSE的单克隆抗体)，因此将捕获结合有NSE的第一纳米磁珠免疫探针。而未结合NSE的第一纳米磁珠免疫探针则继续向吸水垫方向前进，在质控线处被包被了羊抗鼠IgG所捕获。

若待测样品中含有CEA则会在结合垫处被第二纳米磁珠免疫探针(因为其包含抗CEA的单克隆抗体)捕获，并一同向吸水垫方向前进。当前进到第二检测线时，由于此处包被有鼠源CEA检测抗体(该抗体是另一种抗体，不同于第二纳米磁珠免疫探针中的抗CEA的单克隆抗体)，因此将捕获结合有CEA的第二纳米磁珠免疫探针。而未结合CEA的第二纳米磁珠免疫探针则继续向吸水垫方向前进，在质控线处被包被了羊抗鼠IgG所捕获。

.如果样品中存在两种待测物(NSE和CEA)，两条检测线就都产生磁信号(T1和T2)、质控线出现磁信号条带，判定为双阳性结果；如果样品中只存在一种待测物(NSE或CEA)，两条检测线中就只有与待测物对应的那一条产生磁信号(T1或T2)、质控线出现磁信号条带，判定为单个阳性结果和单个阴性结果；如果被检样品中没有NSE、CEA，则两条检测线处均不出现磁信号条带，只在质控线处出现磁信号条带，判定为阴性结果；如果质控线不出现磁信号条带，则试纸条判定为无效。

层析结束待结果稳定后，借助于磁强度检测仪(Magnetic Assay Reader，MagnaBioSciences LLC)对检测线和质控线进行磁强度分析。随着待测液中待测物浓度由零逐渐升高时，抗原、抗体在标记区反应后，被捕获在检测线上的免疫复合物逐渐增多，信号数值增大。根据此现象，检测显示区质控线、第一检测线和第二检测线的信号强度，并将检测线和质控线的信号强度比值(T/C)及其所对应的抗原浓度作Log函数变换，以变换后的浓度值作X轴，以变换后的T/C作Y轴，绘制标准曲线图，得出T/C与浓度对应的二次函数公式。根据该公式可以准确的计算出待测液中待测物的浓度范围及准确数值。实验结果证实，该方法具有很高的检测灵敏度，对NSE、CEA的实际最低检测限值(LOD)分别为：0.7ng/ml，0.5ng/ml。而根据标准曲线计算出来的理论检测限值会更低。

本发明所述的待检物可以是基于抗原抗体反应的任何一种或两种。

实施例1：基于磁性纳米粒子的肺癌标志物NSE和CEA的联合检测试剂条的制备

步骤一：第一纳米磁珠免疫探针和第二纳米磁珠免疫探针的制备

分别取2mg粒径为80nm的羧基磁珠置于500ul活化缓冲液中(MES，pH＝5.5，0.01M)，先后加入EDC、NHS各5mg，活化30分钟后；利用磁分离架分离磁珠，弃去上清后用偶联缓冲液(BS，0.005M，pH＝9.0)洗涤未反应的活化剂。之后分别加入适量NSE、CEA的标记抗体，分别在36℃摇床反应3小时，分别再用封闭液(含8％BSA的BS缓冲液)封闭1小时，分别用磁分离架分离磁珠，分别弃上清后用BST清洗3遍，分别用保存液(含0.05％吐温的BS液)保存后即得第一纳米磁珠免疫探针和第二纳米磁珠免疫探针。

步骤二：结合垫和样品垫的制备

1.将玻璃纤维素膜浸泡在含有5％蔗糖、2％海藻糖、0.025％TritonX-100、0.02MBS缓冲液中1小时润湿后，28℃干燥1小时即得空白结合垫。

2.将步骤一所得的两种纳米磁珠免疫探针按一定比例(其最佳固化比例是浓度比NSE免疫标记抗体:CEA免疫标记抗体＝1:1.2)混合后，按照1ml/15cm的用量均匀喷涂在空白结合垫上，静置20分钟后，置于28℃恒温干燥箱干燥1小时，得到结合垫。将结合垫封袋置于4℃保存备用。

3.将玻璃纤维素膜浸泡在含有2％NaCl、0.5％BSA、0.4％PVP、0.02M BST缓冲液中1小时润湿后，37℃干燥1小时，得到样品垫。将样品垫封袋置于4℃保存备用。

步骤三：第一检测线、第二检测线和质控线的制备

1.硝酸纤维素膜选自商品化的Millipore95。

2.用pH7.4的PBS缓冲液分别将NSE检测抗体、CEA检测抗体稀释到2mg/ml，羊抗鼠IgG稀释到1mg/ml。

3.用Bio Dot喷膜机在硝酸纤维素膜上分别包被NSE检测抗体、CEA检测抗体制备出第一检测线、第二检测线，包被羊抗鼠IgG制备出质控线。各线之间间隔距离约3mm，线条宽度约0.8mm。喷膜完成后放在37℃恒温干燥箱干燥30分钟。如此得到的带有第一检测线、第二检测线和质控线的硝酸纤维素膜即为层析垫。将层析垫封袋置于4℃保存备用

步骤四：试纸条的组装

在背衬板上依次粘贴所得样品垫、结合垫、层析垫、吸水垫，各相邻垫之间相互重叠约1.5mm。试纸条组装完成后，用自动切膜机将完成组装的试纸条进行切割，宽度约3mm，将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所用的免疫层析法的类型为双抗夹心法；包括背衬板和依次相互重叠地铺设在所述背衬板上的样品垫、结合垫、层析垫和吸水垫；所述结合垫上设置有第一纳米磁珠免疫探针和第二纳米磁珠免疫探针；所述第一纳米磁珠免疫探针包括羧基纳米磁珠和抗NSE的单克隆抗体，所述第二纳米磁珠免疫探针包括羧基纳米磁珠和抗CEA的单克隆抗体；所述层析垫上依次设置有第一检测线、第二检测线和质控线，其中所述质控线相比于所述第一检测线更靠近所述吸水垫；所述第一检测线上设置有鼠源NSE检测抗体，所述第二检测线上设置有鼠源CEA检测抗体；所述质控线上设置有羊抗鼠二抗。

2.如权利要求1所述的联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述结合垫上设置的所述第一纳米磁珠免疫探针与所述第二纳米磁珠免疫探针的浓度比值为1:1.2。

3.如权利要求1所述的联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述样品垫和所述结合垫均采用玻璃纤维素膜，所述层析垫采用硝酸纤维素膜。

4.如权利要求3所述的联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述层析垫采用硝酸纤维素膜Millipore95；所述第一检测线、所述第二检测线和所述质控线两两相邻的线之间的间隔距离≥2mm；所述羧基纳米磁珠的粒径为<100nm。

5.一种如权利要求1所述的联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，第一纳米磁珠免疫探针和第二纳米磁珠免疫探针的制备：在MES缓冲液中，用EDC、NHS活化羧基纳米磁珠表面的羧基，分离磁珠，弃上清，洗涤未反应的活化剂，然后分别加入抗NSE的单克隆抗体和抗CEA的单克隆抗体，分别制得第一纳米磁珠免疫探针和第二纳米磁珠免疫探针；

步骤二、结合垫和样品垫的制备：将玻璃纤维素膜浸泡在含有蔗糖、海藻糖、TritonX-100的BS缓冲液中，润湿后，干燥获得空白结合垫，将步骤一得到的所述第一纳米磁珠免疫探针和所述第二纳米磁珠免疫探针混合后固定到所述空白结合垫得到结合垫；将玻璃纤维素膜浸泡在含NaCl、BSA、PVP的BST缓冲液中，润湿后，干燥获得样品垫；

步骤三、第一检测线、第二检测线和质控线的制备：将NSE检测抗体、CEA检测抗体和羊抗鼠二抗依次包被到硝酸纤维素膜上分别制得第一检测线、第二检测线和质控线，而带有所述第一检测线、所述第二检测线和所述质控线的硝酸纤维素膜即为层析垫；

步骤四、试纸条的组装：在背衬板上依次设置所述样品垫、所述结合垫、所述层析垫和吸水垫，各相邻垫之间相互重叠0.5～2mm，得到联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条，其中所述层析垫的设置方向为使得所述控制线相比于所述第一检测线更靠近所述吸水垫。

6.如权利要求5所述的联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤一具体为：在pH5.5的0.01M的MES缓冲液中，用EDC、NHS活化羧基纳米磁珠表面的羧基30min；利用磁分离架分离磁珠，弃去上清后用pH9.0的0.005M的BS缓冲液洗涤未反应的活化剂，分别加入抗NSE的单克隆抗体和抗CEA的单克隆抗体，分别在36℃摇床反应3小时，再分别用含8％BSA的BS缓冲液封闭1小时，分别用磁分离架分离磁珠，分别弃上清后分别用BST清洗3遍，分别加入含0.05％吐温的BS保存液，分别制得第一纳米磁珠免疫探针和第二纳米磁珠免疫探针。

7.如权利要求5所述的联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤二具体为：将玻璃纤维素膜浸泡在含有5％蔗糖、2％海藻糖、0.025％TritonX-100、0.02M BS缓冲液中，润湿后，28℃干燥获得空白结合垫，将步骤一得到的所述第一纳米磁珠免疫探针和所述第二纳米磁珠免疫探针混合后按照1ml/15cm的用量均匀喷涂在所述空白结合垫上，静置、干燥得到结合垫；将玻璃纤维素膜浸泡在含2％NaCl、0.5％BSA、0.4％PVP、0.02M BST缓冲液中，润湿后，干燥获得样品垫，所述结合垫和所述样品垫均封袋置于4℃保存备用。

8.如权利要求5所述的联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤三具体为：用pH7.4的PBS缓冲液分别将NSE检测抗体、CEA检测抗体稀释到2mg/ml，羊抗鼠二抗稀释到1mg/ml；然后用Bio Dot喷膜机在硝酸纤维素膜上分别包被稀释后的NSE检测抗体、稀释后的CEA检测抗体和稀释后的羊抗鼠二抗，分别制得第一检测线、第二检测线和质控线，各线之间间隔距离2-3.5mm，而带有所述第一检测线、所述第二检测线和所述质控线的硝酸纤维素膜即为层析垫。

9.如权利要求5所述的联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤四具体为：在背衬板上依次设置所述样品垫、所述结合垫、所述层析垫和吸水垫，各相邻垫之间相互重叠1～1.5mm，其中所述层析垫的设置方向为使得所述控制线相比于所述第一检测线更靠近所述吸水垫；然后用自动切膜机将所述背衬板及其上设置的所述样品垫、所述结合垫、所述层析垫和所述吸水垫进行切割成宽度2.5-4mm的长条，将所述长条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存，所述长条即为联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条。

10.一种如权利要求1所述的联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，将待测样本加到所述联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的样品垫上，通过层析作用所述待测样本会从所述样品垫出发依次经过所述联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的结合垫、所述联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的层析垫和所述联合检测NSE、CEA的免疫层析检测试纸条的吸水垫；

步骤二，待所述待测样本进入所述吸水垫后，用磁强度检测仪分别检测分析所述层析垫上的第一检测线和所述层析垫上的第二检测线的磁信号强度和所述层析垫上的控制线的磁信号强度，实现对NSE和/或CEA的定量检测。