CN108020666A

CN108020666A - 一种可同时定量检测血液中cea和ca19-9的磁性免疫层析试纸条及制备方法

Info

Publication number: CN108020666A
Application number: CN201810120525.7A
Authority: CN
Inventors: 贾力; 韩龙宇; 李书慧; 王嘉宏
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2018-02-07
Filing date: 2018-02-07
Publication date: 2018-05-11

Abstract

本发明公开了一种可同时定量检测血液中CEA和CA19‑9的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。该试纸条是在试纸条的底板上依次粘上样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水纸，且各相邻部件间互相交错重叠2mm，组装成试纸条，其中硝酸纤维素膜上预包被有CEA抗体和CA19‑9抗体的检测线和兔抗鼠IgG抗体的质控线。与现有的肿瘤标志物检测技术相比，本发明首次创造性地将磁性免疫层析技术引入到CEA和CA19‑9的联合定量检测中，实现CEA和CA19‑9微量定量分析，大大提高了检测灵敏度，在CEA和CA19‑9双阳性的基础上，可进一步判断肿瘤发生率及转移率，以提高对结肠癌的发生及转移的早期诊断率，达到即时检测及快速诊断的目的，操作简便，成本低且可广泛推广。

Description

一种可同时定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条及制备方法

技术领域

本发明涉及一种医学检测技术领域的方法，特别是涉及一种可同时定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术

癌胚抗原（CEA）是一个广谱肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在。CEA是由Phil Gold和Samuel O. Freedman于1965年首先在结肠癌血清病人体内发现的一种球蛋白，其后续在胃癌、胰腺癌、肺癌及乳腺癌病人体内发现。文献报道其在结肠癌中的阳性率约为60%。结肠癌手术患者切除后，在1-3周内血中CEA可降至正常水平。若手术切除不完全，术后CEA还持续阳性，说明病人预后较差或已发生转移，甚至有复发的可能性。良性肿瘤、炎症和退行性疾病，如结肠息肉、溃疡性结肠炎、胰腺炎和酒精性肝硬化病人CEA也有部分升高，但远远低于恶性肿瘤，一般小于20μg/L，CEA超过20μg/L时往往提示有消化道肿瘤，所以测定CEA可以作为良性与恶性肿瘤的鉴别诊断依据。在实际临床应用中，常与其他肿瘤标志物联合检测提髙诊断肿瘤的灵敏度及特异性。由于癌肿切除后血清CEA逐渐下降，当有复发时会再次增高，因此可以用来判断本病的预后或有无复发。

肿瘤相关抗原（CA19-9）是一种糖链抗原，是由腺癌细胞产生，经胸导管引流至外周血中。它是一种与结肠癌、胃癌、胰腺癌和胆囊癌等相关的肿瘤标志物，又称胃肠道相关抗原。胚胎期胎儿的胰腺、胆囊、肝、肠等组织中存在这种抗原，正常人体组织中含量很低。CA19-9是结、直肠癌和胰腺癌的标志物，血清CA19-9阳性的临界值为37kU/L。CA19-9是迄今报道的对胰腺癌敏感性最髙的标志物，阳性率可达85%-95%，肿瘤切除后CA19-9浓度会下降，再上升，则可表示复发。因此，CA19-9常作为消化道恶性肿瘤病情监测和预示复发的主要指标。在结直肠癌、胆囊癌、胆管癌、肝癌和胃癌的阳性率也很高，若同时检测CEA和CA19-9可进一步提高阳性检测率。

迄今，在临床上，多数的肿瘤标志物检测方法都是针对单一肿瘤标志物的检测，而很少有对两个或两个以上的肿瘤标志物的联合检测。目前，检测肿瘤标志物的免疫分析方法主要包括放射免疫分析法（RIA）、酶联免疫分析法（ELISA）及化学发光免疫分析法（CLIA）等。虽然这些方法都能高灵敏、髙特异性地检测目标分析物，但是它们的成本高昂、检测周期长、步骤繁琐及需要专业实验人员操作等缺点，限制了其在基层医院及在社区人群中进行肿瘤筛查或术后病情监测的应用。因此，寻找一个针对肿瘤标志物的低成本、高灵敏度及高特异性、简便、快速的即时检测（point-of-care testing, POCT）技术，同时能实现对两个或者两个以上肿瘤标志物的定性和定量检测，并且能够应用到实验室以外的基层医院、社区或者个人以及医疗资源匮乏的地区，对于提高早期肿瘤发现率及术后复发率、转移率，维护全民健康有着重要的意义。

免疫层析法(Immunochromatography Assay，简称ICA) 是目前市场上最常见的一种快速诊断技术。目前，免疫层析测定法最常用的探针标记物包括胶体金、乳胶微粒、磁性粒子及荧光纳米粒子等。其中，胶体金是目前市场上使用最为广泛的标记材料，并且商品化的胶体金试纸条己经涉足很多领域的快速检测，如孕早期HCG的检测、致病微生物含量及农兽药残留的检测等。胶体金虽制备简单、可快速标记蛋白、可见性好，但稳定性差，与蛋白结合力弱。同时，对于胶体金等标记物构建的免疫层析系统，其定量检测由于光学仪器、自吸收、光散射和自身干扰等因素的影响，无法反应最真实的检测结果，影响检测的灵敏度。

免疫磁珠作为一种新型检测探针，近年来己经被应用于免疫层析检测系统中。磁性免疫层析（Mgnetic Immuno-Chromatographic Test, MICT）的检测原理为：免疫磁珠与待检测液中靶物质特异性结合，随液体层析并被捕获在硝酸纤维素膜上，形成肉眼可见的红棕色条带，还可以通过磁信号检测仪检测硝酸纤维素膜检测区域全层所捕获的夹心复合物在磁场中的磁性强度，从而实现定量检测待测物质的浓度。与依靠光学检测仪的免疫层析系统相比，该检测系统不仅可以检测到全层，而且所用磁性纳米材料只有在外加磁场的环境下才会具有磁性，可操作性强，且不易受生物材料等的干扰，其磁信号可以在较长时间内保持稳定，可能具有更高的灵敏度及更好的稳定性和可重复性。

本发明以磁性纳米微球为标记物质，在继承了传统免疫层析法（如胶体金，乳胶颗粒等）简便快速，单人操作的优点的基础上，提高了检测的准确度和灵敏度，解决了免疫层析只能定性、定量难的缺点，且检测时间较短，因此，本发明以快速、简便、实用、高特异性及高灵敏度的方法实现了对血液中二种癌抗原（CEA和CA19-9）的同时定量检测,显著提高了癌症检测的精确性，即在CEA和CA19-9双阳性的基础上，可进一步判断肿瘤发生率及转移率，以提高对结肠癌的发生及转移的早期诊断率，具有较好的临床应用意义。与现有技术相比，本发明的快速、简便、实用、高特异性及高灵敏度的双癌抗原同时检测法显著提高了癌症检测的精确性。

本发明代表了当今POCT技术发展的方向和潮流，发展迅速，现已成为替代传统免疫层析检测技术的首选。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可同时定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条及制备方法。本发明将以超顺磁性纳米颗粒制备的免疫磁珠作为检测探针与免疫层析检测技术相结合，实现了对CEA和CA19-9的快速、定量检测。

为实现上述发明目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种可同时定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸及底板，所述的结合垫装载有两种免疫磁珠，所述免疫磁珠是以磁珠为标记物，所述磁珠分别与CEA抗体和CA19-9抗体偶联形成抗CEA免疫磁珠和抗CA19-9免疫磁珠；所述的硝酸纤维素膜上包被有两条检测线和一条质控线，一条检测线是包被CEA抗体，另一条检测线是包被CA19-9抗体，质控线包被有兔抗鼠IgG抗体。

更进一步的，该试纸条是在底板上依次粘贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，两两之间相互交错重叠2mm。

一种制备如上所述的可同时定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条的方法，包括以下步骤：

1）将磁珠经过预处理后，分别与CEA抗体和CA19-9抗体偶联，制备得到抗CEA免疫磁珠和抗CA19-9免疫磁珠；

2）将样品垫用样品垫处理液浸泡，将结合垫用结合垫处理液浸泡，烘干；

3）将步骤1）得到的抗CEA免疫磁珠和抗CA19-9免疫磁珠喷涂在步骤2）处理过的结合垫上，烘干；

4）在硝酸纤维素膜上包被两条检测线和一条质控线，其中一条检测线包被有CEA抗体，另一条检测线包被有CA19-9抗体，质控线包被有兔抗鼠IgG抗体；

5）将步骤2）所述的样品垫、步骤3）所述的结合垫和步骤4）所述的硝酸纤维素膜以及吸水纸，相邻部件之间互相部分重叠，组装得到所述磁性免疫层析试纸条。

步骤1）中，所用的磁珠是100-300nm的羧基修饰的超顺磁性纳米磁珠。

步骤（1）具体为：使用含0.05wt% 吐温20（Tween 20）的pH 5.0，0.01M的四吗啉乙磺酸（MES）溶液洗涤磁珠，加入EDC和NHS活化，EDC、NHS与磁珠的摩尔比为2:2:1~5:5:1，室温反应1小时；活化结束后，使用含0.05wt% Tween 20的pH 9.0，0.005M的BS溶液洗涤磁珠，分别加入CEA抗体、CA19-9抗体，室温反应4h，然后用含0.05wt% Tween 20及1wt% BSA的pH9.0，0.005M的BS溶液37℃封闭30小时；封闭结束后，用含0.05wt% Tween 20、0.05wt% 叠氮化钠（NaN₃）及1wt% BSA的pH 9.0，0.005M的BS溶液重新分散磁珠，4℃保存备用。

步骤2）所述的样品垫处理液配方为：

0.005M硼酸-硼砂（BS）缓冲液（pH 7.4-9.0）：2wt% 氯化钠（NaCl）、2wt% 曲拉通X-100（TritonX-100）、0.5wt%牛血清白蛋白（BSA）及0.5wt%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。

步骤2）所述的结合垫处理液配方为：

0.005M硼酸-硼砂（BS）缓冲液（pH 7.4-9.0）：5wt%-10wt% 蔗糖、2wt% 海藻糖、0.05wt%曲拉通X-100（TritonX-100）。

步骤3）中，免疫磁珠的喷涂方法为：将制备好的抗CEA免疫磁珠和抗CA19-9免疫磁珠以1:1的质量比分别使用定量喷膜装置或微量移液器以30μl/cm的量均匀涂于处理好的结合垫上，然后置于25-37℃烘箱中干燥后加入干燥剂封存备用。

步骤4）包括以下步骤：使用抗体稀释液分别将CEA抗体、CA19-9抗体和兔抗鼠多克隆IgG抗体的浓度调整至0.5-2 mg/ml，然后将三者用划膜仪以1μl/cm的量将上述CEA抗体、CA19-9抗体和IgG抗体以0.4cm-1cm的间隔均匀一致地喷印于硝酸纤维素膜上，分别作为检测线T1，检测线T2和质控线，晾干后加入干燥剂封存备用。

优选的，步骤4）具体为：使用抗体稀释液（含有1wt%-2wt%蔗糖的0.01M，pH7.2-pH7.6的磷酸盐缓冲液）将CEA抗体和CA19-9抗体分别稀释为1.5mg/ml，将IgG抗体稀释为0.5mg/ml，使用划膜仪以1μl/cm的量将三者以0.4cm的间隔均匀一致地喷印于硝酸纤维素膜上，室温晾干，加入干燥剂封存，4℃保存备用。

所述的抗体稀释液是含有1wt%-2wt%蔗糖的0.01M，pH 7.2-pH 7.6的磷酸盐缓冲液。

利用本发明的试纸条对血液中CEA和CA19-9进行检测，在CEA和CA19-9双阳性的基础上，进一步判断肿瘤发生率及转移率，以提高对结肠癌的发生及转移的早期确诊率。在该检测试纸条中，将CEA抗体和CA19-9抗体分别共价偶联于超顺磁性纳米颗粒上，将与CEA抗体和CA19-9抗体的各自配对抗体分别包被于硝酸纤维素膜上作为检测线，将兔抗鼠IgG抗体包被于硝酸纤维素膜上作为质控线，按照常规免疫层析法的方法进行标本的检测，再利用磁信号检测仪进行检测。本方法结合了磁性纳米和免疫层析法的现有优点，既能实现标本中的微量待检物的检测，又大大缩短检测时间；即可实现单人份的检测，也可以进行批量标本检测；既能定性分析，又能利用磁信号检测仪的检测即时得到定量结果。该试纸条制备工艺简单，操作性强，省时省力，方便实用。

与现有的快速检测试纸条相比较，本发明具有以下优点：

1）通过对试纸条的改进，首次创造性地将磁性免疫层析技术引入CEA和CA19-9的联合检测中，结合磁信号检测仪，可同时实现对CEA和CA19-9的单人份定量检测，具有快速、简便、实用、高特异性及高灵敏度的特点，显著提高了癌症检测的精确性，即在CEA和CA19-9双阳性的基础上，可进一步判断肿瘤发生率及转移率，以提高对结肠癌的发生及转移的早期诊断率，具有较好的临床应用意义；

2）通过磁信号检测系统的引进，可实现对肿瘤标志物的微量检测，使得试纸条的灵敏度比传统的免疫层析技术提高了100倍；

3）本发明操作简便，适合大规模生产，定量检测所需的设备也已上市，因此，该磁性免疫层析试纸条可广泛应用于医院、体检等大批量使用单位、一些基层诊所等小批量、单人份的单位以及医疗资源匮乏的地区使用；本发明对于结肠癌、胰腺癌、胃癌及胆管癌等病人血液中肿瘤标志物CEA和CA19-9水平的定量检测有着积极的意义。

附图说明

图1：本发明的免疫层析试纸条的结构示意图；①为底板，②为样品垫，③为结合垫，④为偶联CEA抗体的磁珠，⑤为偶联CA19-9抗体的磁珠，⑥为硝酸纤维素膜，⑦为预包被有CEA抗体检测线T1，⑧为预包被有CA19-9抗体检测线T2，⑨为质控线C，⑩为吸水纸。

具体实施方式

为进一步说明本发明磁性免疫层析可同时、定量检测血液中CEA和CA19-9的试纸条及制备方法，特举以下的实施例进行说明，该实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明。

本发明所述的可同时、定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条如图1所示，该试纸条是在底板①上相互交错重叠2mm依次粘贴上硝酸纤维素膜⑥、结合有免疫磁珠的结合垫③、样品垫②、吸水纸⑩组装成试纸条，结合垫③上的免疫磁珠包含有偶联CEA抗体的磁珠④和偶联CA19-9抗体的磁珠⑤，硝酸纤维素膜⑥上预包被有CEA抗体检测线T1⑦、CA19-9抗体检测线T2⑧和质控线C⑨。

在具体实施例中，所采用的CEA配对抗体和CA19-9配对抗体均为单克隆抗体技术制备的单抗。利用双抗体夹心检测CEA和CA19-9抗原的原理检测标本，当待测标本中含有CEA、CA19-9抗原时，抗原分别会先和结合垫上的偶联CEA抗体的磁珠、偶联CA19-9抗体的磁珠结合，随着层析的进行，结合物向前移动到达CA19-9抗体检测线T2处，CA19-9抗原会再次和包被抗体结合形成双抗体夹心复合物而聚集在T2处，结合物向前移动到达CEA抗体检测线T1处，CEA抗原会再次和包被抗体结合形成双抗体夹心复合物而聚集在T1处，另外，未结合的偶联CEA抗体和CA19-9抗体的磁珠会继续前行，到达质控线C处时，会和兔抗鼠IgG抗体结合，故在C处同样会出现磁珠聚集。整个反应在30分钟内可进行完全，一般反应20分钟后即可置于磁信号检测仪中检测，T1、T2及C线都会有相应的磁信号值。然后，将检测值带入拟合曲线中计算可得出定量结果。

本发明所述的可同时、定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条的制备方法见以下实例。

实施例1

可同时定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条的制备方法

本实施例的试纸条的制备方法包括以下步骤：

A、免疫磁珠的制备：

2-吗啉乙磺酸（MES）活化缓冲液的配制：0.01M pH5.5（pH5.0-6.0均适用）的MES缓冲液为活化缓冲液，加入Tween-20，终浓度为0.05wt%，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置4℃保存备用，有效期为两周。

硼酸-硼砂（BS）偶联缓冲液的配制：用0.05M硼砂和0.2M硼酸以4:1（v:v）比例配制0.2M pH9.0的BS缓冲液，用超纯水稀释至0.005M，加入Tween-20，终浓度为0.05%，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置4℃保存备用，有效期为两周。

硼酸-硼砂（BS）封闭缓冲液的配制：用0.05M硼砂和0.2M硼酸以4:1（v:v）比例配制0.2M pH9.0的BS缓冲液，用超纯水稀释至0.005M，加入BSA、Tween-20，终浓度为1wt%、0.05wt%，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置4℃保存备用，有效期为一周。

硼酸-硼砂（BS）保存缓冲液的配制：用0.05M硼砂和0.2M硼酸以4:1（v:v）比例配制0.2M pH9.0的BS缓冲液，用超纯水稀释至0.005M，加入BSA、Tween-20、NaN₃，终浓度为1wt%、0.05wt%、0.05wt%，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置4℃保存备用，有效期为一周。

抗CEA免疫磁珠的制备：使用含0.05wt% Tween-20的0.01M（pH5.0-6.0均适用）pH5.5的MES缓冲液洗涤磁珠，EDC和NHS的加入量均为磁珠羧基化程度摩尔量的2倍，室温反应1-2小时，使用含0.05wt% Tween-20的0.005M pH9.0的BS缓冲液洗涤磁珠充分洗涤磁珠后，以20-40 μg anti-CEA-mAb/mg磁珠的量加入适量anti-CEA-mAb，室温反应4-6小时，使用含0.05wt% Tween-20、1wt% BSA的0.005M pH9.0的BS缓冲液洗涤磁珠充分洗涤磁珠后，37℃封闭30分钟，最后，使用含0.05wt% Tween-20、1wt% BSA、0.05wt% NaN₃的0.005MpH9.0的BS缓冲液重悬磁珠，4℃保存备用。

抗CA19-9免疫磁珠的制备：使用含0.05wt% Tween-20的0.01M（pH5.0-6.0均适用）pH5.5的MES缓冲液洗涤磁珠，EDC和NHS的加入量均为磁珠羧基化程度摩尔量的2倍，室温反应1-2小时，使用含0.05wt% Tween-20的0.005M pH9.0的BS缓冲液洗涤磁珠充分洗涤磁珠后，以20-40 μg anti-CA19-9-mAb/mg磁珠的量加入适量anti-CA19-9-mAb，室温反应4-6小时，使用含0.05wt% Tween-20、1wt% BSA的0.005M pH9.0的BS缓冲液洗涤磁珠充分洗涤磁珠后，37℃封闭30分钟，最后，使用含0.05wt% Tween-20、1wt% BSA、0.05% NaN₃的0.005MpH9.0的BS缓冲液重悬磁珠，4℃保存备用。

B、硝酸纤维素膜包被抗体的制备：

抗体稀释液的配制：0.01M，pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液为包被缓冲液，加入蔗糖，终浓度为1wt%，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后置4℃保存备用，有效期为一周。

硝酸纤维素膜包被抗体的制备：使用含1wt%蔗糖的0.01M pH7.4的PBS缓冲液将CEA抗体稀释为1.5mg/ml，将CA19-9抗体稀释为1.5mg/ml，将兔抗鼠IgG抗体稀释为0.5mg/ml，使用划膜仪以1μl/cm的量将三者以0.4cm的间隔均匀一致地喷印于2.5cm宽硝酸纤维素膜上，室温晾干，加入干燥剂封存，4℃保存备用。

C、样品垫的处理：

将15mm长样品垫放于样品垫处理液中浸透2小时，之后于25℃-37℃烘箱中烘干12h。

样品垫处理液是含2wt% NaCl、2wt% TritonX-100、0.5wt% BSA及0.5wt% PVP的0.005M pH 9.0 的BS缓冲液。

D、结合垫的处理

将10mm长样品垫放于样品垫处理液中浸透2小时，之后于30℃烘箱中烘干12h。

结合垫处理液是含5wt%蔗糖、2wt%海藻糖、0.05wt% TritonX-100的0.005M pH9.0的BS缓冲液。

E、结合垫的制备

将制备好的抗CEA免疫磁珠和抗CA19-9免疫磁珠以1:1的比例，1.5mg/ml，12μl的量使用微量移液器分别以30μl/cm的量均匀涂于处理好的结合垫上，然后置于30℃烘箱中干燥后加入干燥剂封存备用。

F、试纸条的组装及切割

将硝酸纤维素膜（长25mm）、结合垫（长10mm）、样品垫（长15mm）和吸水纸（长25mm）依次粘贴上在背衬板上，并且相邻垫子间互相交错重叠2mm，组装好后用自动切割机切割成宽3mm的成品试纸条，装入检测卡槽，装入铝箔袋加入干燥剂密封保存，备用。

实施例2

除了免疫磁珠的制备步骤中：EDC和NHS的加入量均为均为磁珠羧基化程度摩尔量的5倍,其它步骤同实施例 1。

实施例3

除了结合垫制备步骤中，所用结合垫处理液中蔗糖的含量为10wt%，其它步骤同实施例1。

应用实施例1

本发明的检测卡的使用方法

1. 加样

从包装盒中取出单人份的检测卡，撕开铝箔包装袋，将其置于平整桌面，用微量移液器吸取70μl血清标本加入检测卡的加样孔内，等待反应进行20分钟。

2. 检测

将检测卡插入磁性免疫色谱分析仪的插卡口中，运行仪器，仪器会自动读取检测卡的条形码信息，进行检测并即时显示测量结果。

本发明的检测卡检测临床标本的结果

表1 110份临床标本CEA抗原与CA19-9抗原实测值与酶联免疫法测值的比较

表2 两种方法对CEA的检测结果对比分析

表3 两种方法对CA19-9的检测结果对比分析

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种可同时定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸及底板，其特征在于：所述的结合垫装载有两种免疫磁珠，所述免疫磁珠是以磁珠为标记物，所述磁珠分别与CEA抗体和CA19-9抗体偶联形成抗CEA免疫磁珠和抗CA19-9免疫磁珠；所述的硝酸纤维素膜上包被有两条检测线和一条质控线，一条检测线是包被CEA抗体，另一条检测线是包被CA19-9抗体，质控线包被有兔抗鼠IgG抗体。

2.根据权利要求1所述的可同时定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条，其特征在于：该试纸条是在底板上依次粘贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，两两之间相互交错重叠2mm。

3.一种制备如权利要求1所述的可同时定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条的方法，其特征在于：包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备可同时定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条的方法，其特征在于：步骤1）中，所用的磁珠是100-300nm的羧基修饰的超顺磁性纳米磁珠。

5.根据权利要求3所述的制备可同时定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条的方法，其特征在于：步骤1）中，所述的磁珠预处理为：使用含0.05wt% 吐温20的pH5.0，0.01M的四吗啉乙磺酸溶液洗涤，加入EDC和NHS活化，EDC、NHS与磁珠的摩尔比为2:2:1~ 5:5:1，室温反应1小时；活化结束后，使用含0.05wt% Tween 20的pH 9.0，0.005M的BS溶液洗涤磁珠；磁珠与抗体的结合具体为：以20-40 μg抗体/mg磁珠的量分别加入CEA抗体、CA19-9抗体，室温反应4-6小时，然后用含0.05wt% Tween 20及1wt% BSA的pH 9.0，0.005M的BS溶液37℃封闭30小时，封闭结束后，用含0.05wt% Tween 20、0.05wt%叠氮化钠及1wt%BSA的pH 9.0，0.005M的BS溶液重新分散磁珠，4℃保存备用。

6.根据权利要求3所述的制备可同时定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条的方法，其特征在于：步骤2）中所述的样品垫处理液是含2wt% NaCl、2wt% TritonX-100、0.5wt% BSA及0.5wt% PVP的0.005M，pH 7.4 -pH 9.0的BS缓冲液；所述的结合垫处理液是含5wt%-10wt%蔗糖、2wt%海藻糖、0.05wt% TritonX-100的0.005M，pH 7.4 -pH 9.0的BS缓冲液。

7.根据权利要求3所述的制备可同时定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条的方法，其特征在于：步骤3）具体为：将制备好的抗CEA免疫磁珠和抗CA19-9免疫磁珠以1:1的质量比分别使用定量喷膜装置或微量移液器以30μl/cm的量均匀涂于处理好的结合垫上，然后置于25-37℃烘箱中干燥后加入干燥剂封存备用。

8.根据权利要求3所述的制备可同时定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条的方法，其特征在于：步骤4）具体为：使用抗体稀释液分别将CEA抗体、CA19-9抗体和兔抗鼠多克隆IgG抗体的浓度调整至0.5-2 mg/ml，然后将三者用划膜仪以1μl/cm的量将上述CEA抗体、CA19-9抗体和IgG抗体以0.4cm-1cm的间隔均匀一致地喷印于硝酸纤维素膜上，分别作为检测线T1，检测线T2和质控线，晾干后加入干燥剂封存备用。

9.根据权利要求8所述的制备可同时定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条的方法，其特征在于：步骤4）具体为：使用抗体稀释液分别将CEA抗体、CA19-9抗体和兔抗鼠多克隆IgG抗体的浓度调整至1.5mg/ml、1.5mg/ml和0.5mg/ml，然后将三者用划膜仪以1μl/cm的量将上述CEA抗体、CA19-9抗体和IgG抗体以0.4cm的间隔均匀一致地喷印于硝酸纤维素膜上，分别作为检测线T1，检测线T2和质控线，晾干后加入干燥剂封存备用。

10.根据权利要求8所述的制备可同时定量检测血液中CEA和CA19-9的磁性免疫层析试纸条的方法，其特征在于：所述的抗体稀释液是含有1wt%-2wt%蔗糖的0.01M，pH 7.2-pH7.6的磷酸盐缓冲液。