CN105527440A - 一种免疫层析试纸条及其制备方法与应用 - Google Patents

一种免疫层析试纸条及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、检测线、质控线、吸水垫和背衬板；结合垫装载有两种免疫荧光探针，其以量子点作为标记物，量子点分别与NSE抗体和CEA抗体偶联形成抗NSE免疫荧光探针和抗CEA免疫荧光探针；检测线有两条，一条检测线包含NSE抗体，另一条检测线包含CEA抗体。本发明还公开了该免疫层析试纸条的制备方法及其在诊断肺癌中的应用。本发明的免疫层析试纸条检测简单迅速、检测结果直观，可定性、半定量甚至定量检测，价格低廉，能够同时检测两种或两种以上的肿瘤标志物，实现量子点试纸条检测肿瘤标志物的多元检测。

Description

一种免疫层析试纸条及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及一种免疫层析试纸条及其制备方法与应用。
背景技术
对生物体内的肿瘤标志物实现高灵敏度的检测是生命科学领域研究的一项重要课题，发展一种新的灵敏度高的检测方法也成为研究者们努力的目标。血清肿瘤标志物的检测因其费用较低，简便无创，可重复检测，可定性、半定量或定量观测检测结果等优点引起了人们的关注。肿瘤标志物的产生可分为两种：一，在恶性肿瘤发生和增值的过程中，由肿瘤细胞的基因表达而合成分泌的，存在于细胞、组织或体液中，能够用一定方法来定量且能证实肿瘤存在的物质；二，由于机体对肿瘤产生反应，使体内异常产生或升高的，可以反映肿瘤存在和生长的、能够监测肿瘤治疗和预后的一类物质，它包括蛋白质、激素、多胺及癌基因产物等。这些物质在正常人的体内不存在，或者在正常人体内的水平显著低于肿瘤患者体内的水平。一般来说，一种理想的肿瘤标志物需要满足以下条件：特异性强，灵敏度高，能够对肿瘤进行定位，与肿瘤的大小或分期相关，能够对肿瘤的疗效和预后进行判断，具有相当高的预测价值等。但是目前临床上常用的肿瘤标志物没有足够高的灵敏度，且特异性不够强，因此在对恶性肿瘤进行诊断时，不能排除假阴性的结果。肺结核与肺癌具有相似的临床症状,影像学检查也极易出现误诊,尤其结核菌检查阳性的肺癌患者与肺结核患者更难以鉴别出来。研究显示在肺癌发生、发展的早期阶段,患者肺部尚未出现特征性影像学表现时,血清肿瘤标志物已呈阳性表现,但由于均为肿瘤非特异性相关抗原,仅依靠单一指标检测难以取得较高的敏感度和特异度,所以，采用多指标联合检测可明显提高肺癌的诊断率,避免误诊的发生。
小细胞肺癌是肺癌的一个未分化癌分型，在肺癌中所占的比例约20～25％。神经元特异性烯醇化酶NSE(Neuron-specificenolase)，是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶，在肺癌组织中的含量是正常肺组织中的3～35倍，是目前发现的小细胞肺癌最敏感的特异性肿瘤标志物。癌胚抗原CEA(carcino-embryonicantigen)，是一种恶性肿瘤相关抗原，在胃肠肿瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌和类癌病人中均有升高。它是一种非特异性的肿瘤标志物，但是在恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监控及疗效评价等方面仍有重要的临床价值。所以，检测人血清中的神经元特异性烯醇化酶NSE和癌胚抗原CEA是诊断肺癌，尤其是小细胞肺癌的有效措施。
目前，检测CEA和NSE的方法主要有ELISA法、放射免疫分析法和化学发光免疫分析法等。ELISA法是经典的三大标记技术之一，在检验医学邻域应用广泛，但是其操作繁琐，需要专业人士操作，需要配备必要的分析检测仪，如酶标仪；放射免疫分析法用于定量测定受检标本中的抗原，灵敏度高，特异性强，但放射性核素使用有效时间短，难以实现操作和测量的自动化；化学发光免疫分析法建立在放射免疫分析技术理论的基础上，广泛应用于生命分析、环境检测、临床检验、食品安全和工业分析等领域，但化学发光检测仪器昂贵，且国内的检测系统灵敏度和检测灵敏度都不够理想。这些不便和缺点限制了以上技术的使用。
免疫层析技术八十年代初发展起来的一种新型快速免疫分析技术，它利用标记物的显色特性及层析法的分离技术定性、半定量或定量地检测待测物。目前，免疫层析技术主要采用胶体金试条进行样品检测，现已经广泛应用于医学检测、食品质量监测、毒品检测和环境监测等领域。不足之处是胶体金试条只能定性检测样品，且灵敏度低，亦不能实现样品的多元检测。随着生物医学检测技术的发展，标记材料的不断更新，研究人员也在不断改进免疫层析技术，使其向着高灵敏度、定量和多元检测的方向发展，并且有望成为病原体、恶性肿瘤以及心血管疾病等早期筛查的诊断技术。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种免疫层析试纸条及其制备方法与应用，具体的技术方案如下：
本发明提供了一种免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、检测线、质控线、吸水垫和背衬板，结合垫装载有两种免疫荧光探针，免疫荧光探针以量子点作为标记物，量子点分别与NSE抗体和CEA抗体偶联形成抗NSE免疫荧光探针和抗CEA免疫荧光探针；检测线有两条，一条检测线包含NSE抗体，另一条检测线包含CEA抗体。样品垫为玻璃纤维，主要目的是过滤样本例如血清、尿液等中的颗粒、调节样本的pH以及结合样本中干扰随后层析反应的成分；结合垫为玻璃纤维，主要目的是装载荧光探针并在层析检测中将其稳定释放；硝酸纤维素膜的主要作用是固化抗体并提供层析检测反应的场所，本发明采用接触式点样仪在膜上线状固化抗体形成检测线(T1、T2线)和质控线(C线)；吸水垫为高密度的纤维素，为层析作用提供动力并控制着反应中待检样品的流动方向；背衬为聚苯乙烯材料，为免疫层析试纸条的层叠结构提供刚性支持。
进一步地，抗NSE免疫荧光探针中的抗体为鼠抗NSE单克隆抗体L1C00502，抗CEA免疫荧光探针中的抗体为鼠抗CEA单克隆抗体L1C00202。
进一步地，检测线中的NSE抗体为鼠抗NSE单克隆抗体L1C00503，检测线中的CEA抗体为鼠抗CEA单克隆抗体L1C00205。
本发明还提供了一种免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将量子点分别与NSE抗体和CEA抗体偶联，制备得到抗NSE免疫荧光探针和抗CEA免疫荧光探针；
步骤二：用样品垫处理液浸泡样品垫(例如30分钟)，用结合垫处理液浸泡结合垫(例如30分钟)，烘箱烘干，然后用步骤一中得到的抗NSE免疫荧光探针和抗CEA免疫荧光探针喷涂在结合垫上，烘干(例如37℃下)。
步骤三：在硝酸纤维素膜上设置两条检测线和一条质控线，其中一条检测线包被有NSE抗体，另一条检测线包被有CEA抗体，质控线包被有羊抗鼠二抗；
步骤四：在背衬板上依次粘贴步骤二中经处理的样品垫、结合垫，和步骤三中的硝酸纤维素膜，以及吸水垫；相邻垫之间相互部分重叠，组装得到免疫层析试纸条。
进一步地，上述步骤一中，羧基化的量子点与NSE抗体和CEA抗体通过羧基、氨基的反应进行偶联；具体来说，是用EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化量子点表面的羧基，活化后的量子点与抗体上的氨基结合形成免疫量子点，再用牛血清蛋白封闭量子点上未结合的羧基，得到量子点免疫荧光探针；NSE抗体为鼠抗NSE单克隆抗体L1C00502，CEA抗体为鼠抗CEA单克隆抗体L1C00202。
进一步地，上述步骤二中，样品垫处理液的组分包括硼酸、四硼酸钠、氯化钠、牛血清蛋白、吐温-20和去离子水；结合垫处理液的组分包括硼酸、四硼酸钠、蔗糖、海藻糖、吐温-20和去离子水。这些处理液能够保证在试纸条层析过程中，固定在结合垫上的免疫荧光探针能快速完全释放，有效地发挥捕获抗原的作用且不与硝酸纤维素膜发生非特异性吸附，并在检测线上显示所有的阳性信号。
进一步地，上述步骤三中，NSE抗体为鼠抗NSE单克隆抗体L1C00503，CEA抗体为鼠抗CEA单克隆抗体L1C00205。
进一步地，上述步骤四中，相邻垫之间相互重叠1-2毫米；将组装完成后的免疫层析试纸条切割为所需的宽度，例如3毫米，与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。
本发明还公开了上述免疫层析试纸条在诊断肺癌中的应用，尤其是在小细胞肺癌诊断中的应用。
本发明的原理是：待测液(含相应抗原)滴加在样品垫(加样区)后，在毛细作用下由样品垫(加样区)向吸水垫(吸水区)方向层析，当层析到结合垫(标记区)时，待测液中的抗原与相应的免疫荧光探针结合形成抗原-免疫荧光探针复合物，在通过硝酸纤维素膜(显示区)时，抗原-免疫荧光探针复合物被包被在检测线上的对应抗体捕获，未形成复合物的免疫荧光探针则被质控线上的二抗捕获。待测液中抗原浓度越高，被检测线捕获的复合物的数量越多，检测线的荧光强度越强。但当抗原浓度超过检测线的捕获能力时，检测线上的抗体已全部与复合物结合，检测线的荧光强度则不会随浓度升高而变强；当待测物中抗原浓度过低时，即便抗原被检测线捕获，其荧光强度仍然不能被肉眼或检测设备检测到；当待测物中抗原浓度在试纸条的检测范围内时，检测线上的荧光强度可由相应检测设备检测到，并由标准曲线定量得出待测物中抗原的浓度。
本发明所提供的检测试纸条，是利用量子点作为标记物，通过抗原抗体特异性结合反应富集在检测区域，然后再通过荧光检测设备，实现定量检测。同时，可在同一试纸条上检测两种或两种以上的肿瘤标志物，实现量子点免疫层析试纸条对肿瘤标志物的多元定量检测，大大简化了操作步骤，检测快速，操作简单无需专业人士，降低了检测成本，提高了肿瘤检测的准确性。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明一个较佳实施例中的免疫层析试纸条的示意图；其中1、样品2、样品垫3、结合垫4、硝酸纤维素膜5、检测线T16、检测线T27、质控线8、吸水垫9、背衬板。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对发明做进一步的描述。
基于量子点的肺癌标志物NSE和CEA的联合检测试纸条的制备：
步骤一：量子点免疫荧光探针的制备
将0.5毫升量子点置于0.5毫升MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)溶液(0.01mol,pH6.0)中，混合均匀。再在混合液中加入EDC和NHS，室温下反应30分钟后离心，得到表面羧基活化后的量子点，将其分别与NSE单克隆抗体(鼠抗NSE单克隆抗体L1C00502)和CEA单克隆抗体(鼠抗CEA单克隆抗体L1C00202)置于1×PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.4)中，17℃下反应3小时后离心，再加入含有1.5％BSA的1×PBS缓冲液(pH7.4)封闭量子点上未反应的羧基，反应1小时后即得到抗NSE免疫荧光探针和抗CEA免疫荧光探针。
上述反应中：量子点与EDC摩尔配比为1:2000～5000，EDC与NHS的摩尔配比为2:1，量子点与标记抗体摩尔配比为1:5～10。
步骤二：样品垫2和结合垫3的制备
用样品垫处理液和结合垫处理液分别浸泡样品垫2和结合垫3并于37℃烘干，然后用上述抗NSE免疫荧光探针和抗CEA免疫荧光探针喷涂在结合垫3上并于37℃烘干，得到样品垫2和结合垫3。
上述样品垫处理液是硼酸、四硼酸钠、氯化钠、牛血清蛋白、吐温-20(聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯)的混合溶液；结合垫处理液是硼酸、四硼酸钠、蔗糖、海藻糖、吐温-20的混合溶液。
步骤三：硝酸纤维素膜4的选取及抗体的固定
硝酸纤维素膜选自商品化的Millipore135，孔径为8微米。
用含有2％蔗糖的PBS缓冲液分别将NSE抗体(鼠抗NSE单克隆抗体L1C00503)、CEA抗体(鼠抗CEA单克隆抗体L1C00205)稀释至2毫克/毫升，将羊抗鼠IgG稀释至1毫克/毫升。用BioDot喷膜机在硝酸纤维素膜4上分别包被上述三种溶液制备出检测线T15、检测线T26及质控线7。检测线5、6上分别喷膜CEA抗体和NSE抗体或者检测线5、6上分别喷膜NSE抗体和CEA抗体，质控线7上喷膜羊抗鼠IgG，喷膜完成后放在37℃恒温干燥箱干燥1小时，封袋置于4℃保存备用。
步骤四：试纸条的组装
在背衬板9上依次粘贴样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫8，相邻垫之间相互重叠约1-2毫米，组装完成后，用自动切膜机将试纸条切割为3毫米宽度，将切割好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。
本发明利用免疫层析检测方法快速便捷的优点，来检测灵敏度及特异度均较高的肺癌标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)和癌胚抗原(CEA)。在该检测方法中，检测原理为双抗夹心法，利用羧基化的量子点作为标记物，将量子点与抗NSE、CEA单克隆抗体通过羧基、氨基反应特异性的结合在一起，制备成免疫荧光探针，用来捕获样品1中的CEA和NSE。同时，在试纸条的硝酸纤维素膜4上包被另一株NSE和CEA的单克隆抗体，进而捕获层析反应过程中已经结合了NSE和CEA的量子点免疫荧光探针。而未结合的量子点免疫荧光探针，继续向吸水垫8方向上层析，在质控线7和羊抗鼠二抗发生免疫反应，并且滞留下来。层析结束待结果稳定后，借助于荧光定量检测设备对检测线和质控线进行荧光光密度分析。并根据具有系列浓度梯度的NSE和CEA标准品检测所得到的标准曲线，来得到样本中待测物质的浓度。利用本发明中免疫层析试纸条对肺癌标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)和癌胚抗原(CEA)的定性定量检测，可将其应用于肺癌的诊断，尤其是小细胞肺癌的诊断。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化；因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、检测线、质控线、吸水垫和背衬板，其特征在于，所述结合垫装载有两种免疫荧光探针，所述免疫荧光探针以量子点作为标记物，所述量子点分别与NSE抗体和CEA抗体偶联形成抗NSE免疫荧光探针和抗CEA免疫荧光探针；所述检测线有两条，一条检测线包含NSE抗体，另一条检测线包含CEA抗体。
2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述抗NSE免疫荧光探针中的抗体为鼠抗NSE单克隆抗体L1C00502，所述抗CEA免疫荧光探针中的抗体为鼠抗CEA单克隆抗体L1C00202。
3.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述检测线中的所述NSE抗体为鼠抗NSE单克隆抗体L1C00503，所述检测线中的所述CEA抗体为鼠抗CEA单克隆抗体L1C00205。
4.一种免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
步骤一：将量子点分别与NSE抗体和CEA抗体偶联，制备得到抗NSE免疫荧光探针和抗CEA免疫荧光探针；
步骤二：用样品垫处理液浸泡样品垫，用结合垫处理液浸泡结合垫，烘干，然后用步骤一中得到的所述抗NSE免疫荧光探针和抗CEA免疫荧光探针喷涂在所述结合垫上，烘干；
步骤三：在硝酸纤维素膜上设置两条检测线和一条质控线，其中一条检测线包被有NSE抗体，另一条检测线包被有CEA抗体，所述质控线包被有羊抗鼠二抗；
步骤四：在背衬板上依次粘贴步骤二中经处理的所述样品垫、所述结合垫，和步骤三中的所述硝酸纤维素膜，以及吸水垫；相邻垫之间相互部分重叠，组装得到所述免疫层析试纸条。
5.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，羧基化的所述量子点与所述NSE抗体和所述CEA抗体通过羧基、氨基的反应进行偶联；所述NSE抗体为鼠抗NSE单克隆抗体L1C00502，所述CEA抗体为鼠抗CEA单克隆抗体L1C00202。
6.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，所述样品垫处理液的组分包括硼酸、四硼酸钠、氯化钠、牛血清蛋白、吐温-20和去离子水；所述结合垫处理液的组分包括硼酸、四硼酸钠、蔗糖、海藻糖、吐温-20和去离子水。
7.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，所述NSE抗体为鼠抗NSE单克隆抗体L1C00503，所述CEA抗体为鼠抗CEA单克隆抗体L1C00205。
8.根据权利要求4所述的免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，相邻垫之间相互重叠1-2毫米；将组装完成后的所述免疫层析试纸条切割为需要的宽度，与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。
9.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条在诊断肺癌中的应用。
10.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条在诊断小细胞肺癌中的应用。
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