CN103529207A - 多种肿瘤标志物快速定量联合检测装置 - Google Patents
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Abstract
一种检测多种肿瘤标志物快速定量联合检测装置,其特征在于装置由3-8种相互独立的肿瘤标志物检测试纸如AFP、CEA、PSA、CA125、CA153、CA199、CA242、NSE,3-8联专用卡壳和内置了相应标准曲线和判定方法的免疫层结果析判读记录仪组成。这些试纸可以根据特定的需要组合成3联、4联或至8联的检测装置。免疫层析结果判读记录仪内置了对8种试纸的标准曲线和判定方法,用于对检测结果的定量判定,并且对判定方法能对不同的检测结果的组合进行各种肿瘤发生情况的预测。检测时在15-20分钟内完成。具有联合检测、操作简便、反应快速、结果准确、适合现场检测等优点,适合临床对更为准确、简便检测的需要。
Description
技术领域
本发明专利是涉及医学临床诊断技术领域,特别是涉及一种以免疫胶体金快速检测方法制备的多种肿瘤标志物快速定量联合检测装置。
背景技术
肿瘤细胞产生和释放的某种物质,常以抗原、酶、激素等代谢产物的形式存在于肿瘤细胞内或宿主体液中,根据其生化或免疫特性可以识别或诊断肿瘤。肿瘤标记物在临床上主要用于对原发肿瘤的发现、肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断肿瘤治疗效果的观察和评价以及肿瘤复发和预后的预测等。
目前常见的肿瘤标志物有:
1、甲胎蛋白
1)原发肝癌。AFP可早于影像学6-12月出现异常,为肝癌的早期诊断提供重要依据,建议肝硬化患者定期复查AFP。
2)病毒性肝炎、肝硬化绝大部分AFP<400ng/ml。
3)内胚层癌、畸胎瘤、睾丸癌、卵巢癌、胃癌等伴肝转移者AFP可升高。
4)妇女妊娠3个月后,AFP开始升高,7-8个月时达高峰,一般在400ng/ml以下,分娩后3周恢复正常。妊娠期AFP异常升高,要排除胎儿神经管缺损、畸形可能。
2、癌胚抗原
1)CEA升高主要见于结/直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫及子宫颈癌、泌尿系肿瘤等,其他恶性肿瘤也有不同程度的阳性率。
2)肝硬化、肝炎、肺气肿、肠道憩室、直肠息肉、结肠炎等良性病CEA可升高。
3)癌症越晚期,CEA越高,阳性率越高;腺癌敏感,其次是鳞癌和低分化癌,分化程度越高阳性率越高。
4)正常人吸烟者CEA升高。
5)癌症病人的胸、腹水、消化液、分泌物中的CEA常升高。
3、前列腺特异抗原
PSA是目前广泛应用于前列腺癌的肿瘤标志物。
1)前列腺癌血清PSA升高,阳性率在50%-80%。
2)前列腺增生、前列腺炎、肾脏和泌尿生殖系统的疾病也可见血清PSA升高;良性前列腺增生血清中游离PSA的比例是显著增高的。
3)PSA水平随年龄的增加而增加,一般以每年0.04ug/L的速度递增。
4)PSA水平与前列腺的体积有关,但两者并不具有相关性。
5)有关前列腺损伤的各种检查均可引起PSA的明显升高。
4、糖类抗原125
1)卵巢癌血清CA125升高,阳性率61.4%;治疗有效CA125下降;复发CA125升高先于症状;CA125是判断疗效和复发的良好指标。
2)其他非卵巢恶性肿瘤也有一定的阳性率:如宫颈癌、宫体癌、子宫内膜癌43%,胰腺癌50%,肺癌41%,胃癌47%,结/直肠癌34%,乳腺癌40%。
3)其他非恶性肿瘤,也有不同程度的升高,但阳性率较低:如子宫内膜异位症、盆腔炎、卵巢囊肿、胰腺炎、肝炎、肝硬化等。
4)在许多良性和恶性胸、腹水中发现CA125升高。
5)早期妊娠,也有CA125升高。
5、糖类抗原153
1)乳腺癌患者CA153升高,乳腺癌初期的敏感性60%,乳腺癌晚期的敏感性80%。
2)其他恶性肿瘤也有一定的阳性率:如:肺癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、原发性肝癌等。
3)肝脏、胃肠道、肺、乳腺、卵巢等非恶性肿瘤性疾病,阳性率一般<10%。
6、糖类抗原199
1)胰腺癌、胆囊癌、胆管壶腹癌,CA199明显升高,尤其胰腺癌晚期的阳性率可达75%,是重要的辅助诊断指标,但早期诊断价值不大。
2)胃癌的阳性率50%,结/直肠癌的阳性率60%,肝癌的阳性率65%。
3)其他恶性肿瘤也有一定的阳性率:如:乳腺癌、卵巢癌、肺癌等。
4)某些消化道炎症CA19-9也有不同程度的升高,如:急性胰腺炎、胆囊炎、胆汁淤积性胆管炎、肝炎、肝硬化等。
7、糖类抗原CA242
CA242是一种唾液酸化的鞘糖脂类抗原,几乎总是和CA50一起表达,但两者受不同的单克隆抗体识别。在临床上均被用于消化道恶性肿瘤尤其是胰腺癌、结直肠癌的诊断,与CA19-9、CA50相比,新一代的CA242在胰腺癌、胆囊癌和消化道癌中的灵敏度、特异性更高(CA50、CA19-9易受肝功能以及胆汁郁积的影响,在良性阻塞性黄疸以及肝实质性损害记疾病时常出现假阳性)。[3]主要相关肿瘤:胰腺癌、胃、结肠癌。
其它相关肿瘤:肝癌、食管癌、肺癌。
其他影响因素:良性胃肠疾病如胰腺癌、肝炎、肝硬化患者会有所升高。
8、神经元特异性烯醇化酶NSE
主要相关肿瘤:小细胞肺癌。
其它相关肿瘤:肺腺癌、大细胞肺癌、神经系统癌。
肿瘤标志物检测目前已普遍应用于临床。然而由于单个肿瘤标志物的灵敏度和特异性都不是太高,所以需要联合检测或结合临床其它指标进行判定,才能具有更为明确的意义。对于检测一些组织器官的肿瘤,临床上一般推荐以下的联合检测方法:
肝:AFP+CEA
结、直肠、胆道:CEA+CA199
胰:CEA+CA199+CA242
胃:CEA+CA199+CA724
食道:CEA+SCC
肺:NSE+CYFRA21-1+CEA+CA125
乳腺:CA153+CEA+CA125
卵巢:CA125+β-HCG+CEA
宫颈:CEA+CA724+SCC+
子宫:CEA+β-HCG+SCC
肾:CEA+β2-MG
前列腺:FPSA+TPSA+PAP
目前临床上在进行肿瘤检测时往往检测多个指标。这些指标常用ELISA、化学发光、荧光等方法进行单独检测,再综合判定。目前还没有运用胶体金方法联合定量检测多个指标的试剂出现。
发明内容
本发明目的是提供一种多种肿瘤标志物快速定量联合检测装置,用来检测血清、血浆和全血样本中的3-8种常见肿瘤标志物。具有操作简便、反应快速、结果准确、可信、适合现场检测等优点。发明内容如下:
一种多种肿瘤标志物快速定量联合检测装置,其特征在于装置由3-8种相互独立的肿瘤标志物检测试纸如AFP、CEA、PSA、CA125、CA153、CA199、CA242、NSE,3-8联专用卡壳和内置了相应标准曲线和判定方法的免疫层析结果判读记录仪组成。这些试纸可以根据特定的需要组合成3联、4联或至8联的检测装置。
所述的检测装置,其特征在于每种肿瘤标志物检测试剂试纸由含有胶体金标记抗体的胶体金垫、包被有配对抗体(T线)和抗鼠IgG(C线)的NC膜、样品垫、吸样垫和塑料底板组成。每个试纸的宽度为3-5mm,长度为7-8cm。样品垫、胶体金垫、NC膜和吸样垫从塑料底板一端依次排列至另一端。
所述的检测装置,其特征在于专用卡壳包含上盖和下盖两个部分,内部可平行放置3-8条检测试纸,卡壳可根据需要设计成3联、4联或至8联。卡壳上盖的下部对应样品垫部分设置了样品孔和稀释液孔,用于加入样本和稀释液,卡壳上盖的中间部分应对试纸NC膜中部设置了视窗口,用于观察NC膜上的C、T线,判定结果。
所述的检测装置,其特征在于所述NC膜是一种由硝酸纤维素构成的多孔结构的膜,孔径为8-12um。稀释液垫为玻璃纤维膜或无纺布,吸样垫为吸水滤纸。
所述的检测装置,其特征在于每种肿瘤标志物试纸单独制备,包被有配对抗体的NC膜制备过程为:以合适盐缓冲液将单个的肿瘤标志物抗体配制成合适的浓度,在喷膜仪在NC膜上以1.0-1.5ul/cm的参数进行划线,包被T线,同时在NC膜上部包被2mg/ml的抗鼠IgG作为C线,干燥备用。胶体金垫的制备过程为:取100ml胶体金液放在烧杯内,用0.2M K2CO3调至合适的pH值,再加入适量的配对标记用单个肿瘤标志物抗体,室温搅拌30min,封闭,12000rpm离心30分钟,弃上清,用工作液复溶至40ml,然后用喷金机分别均匀地喷涂在胶体金垫上,干燥备用。
所述的检测装置,其特征在检测卡装配方法为:在相对湿度小于40%的条件下,取塑料底板,将已包被NC膜粘贴在底板的中部,在NC膜T线一侧粘贴胶体金垫,在胶体金垫另一侧粘贴样品垫;在NC膜C线一侧粘贴吸样垫;各粘贴组分接口相互叠压1-2mm,粘贴好的大板切成3-5mm宽的试纸条。然后将3-8种试纸条按特定的顺序分别放置于卡壳下盖的槽中,然后盖上上盖,压紧,完成装配。
所述的检测装置,其特征在于免疫层析结果判读记录仪是一种光学检测系统,内置了对8种试纸的标准曲线和判定方法,用于对检测结果的定量判定,并且对判定方法能对不同的检测结果的组合进行各种肿瘤发生情况的预测。
所述的检测装置,其特征在于检测方法为各个单个试纸的检测方法相同:检测时将10-20ul的被检样本如血清、血浆、全血加入到样本孔中,然后在稀释液孔中加入100ul样品稀释液,在15-20分钟内,用免疫层析结果判读记录仪对检测结果进行判定。
本发明的有益效果是:提供一种多种肿瘤标志物快速定量联合检测装置,用来检测血清、血浆和全血样本中的3-8种常见肿瘤标志物,并对结果进行综合判定。具有操作简便、反应快速、结果准确、可信、适合现场检测等优点。
附图说明:
图1是检测试纸结构图
图2是3联专用卡壳结构图
具体实施方式
实施例:AFP/CEA/PSA三种肿瘤标志物快速定量联合检测装置制备
1主要材料
1.1生物原料AFP、CEA和PSA配对抗体,从相关公司购买;鼠抗人IgG抗体,羊抗鼠IgG:自制;氯金酸:Sigma公司产品;NC膜:美国Millipore公司产品;水解酪蛋白,聚乙二醇PEG20000:Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。
1.2临床样本由公司在相关医院获得,共120份,其中确诊为各类肿瘤的病人血清样本60份,AFP检测值从200-1000ng/mL,CEA检测值从20-200ng/mL。PSA检测值从10-60ng/mL,正常人血清样本60份,检测值均低于相应的参考值。
1.3三联卡壳:由本公司设计,相关公司按要求生产、提供。
1.4免疫层析结果结判读记录仪:型号:NS3001,天津中新科炬生物制药有限公司产品。
2方法
2.1抗体胶体金标记采用氯金酸-柠檬酸三钠法制备直径为40±5nm的胶体金溶液,取胶体金溶液,分别用0.2M K2CO3将溶液调到pH7.5,然后将胶体金缓慢搅拌,按每ml溶液加入5ug将AFP标记抗体加入到溶液中,继续搅拌30分钟,再加入到终浓度为0.5%的PEG2000和0.5%的水解酪蛋白进行封闭,标记结束后以12000g离心,弃上清,沉淀按60%原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中(pH8.0,含水解酪蛋白,羊血清,蔗糖和表面活性剂)。然后将标记胶体金溶液用喷膜机喷在胶体金垫上,在温度20-25℃,相对湿度在<30%的干燥间干燥3-4小时,制成胶体金垫。CEA和PSA抗体标记方法和AFP一致,只是加入的抗体为分别为CEA和PSA抗体。
2.2NC膜包被用0.01M pH7.4PBS将配对的FABP抗体配制成1.0mg/mL,羊抗鼠IgG分别稀释成2mg/ml,然后用喷膜仪在NC膜上按1.2ul/cm进行分别划线包被,包被完成后将NC膜在在温度20-25℃,相对湿度在<30%的干燥间干燥3-5小时。CEA和PSA抗体包被方法和AFP一致,只是配制的为CEA和PSA抗体。
2.3在相对湿度小于40%的条件下,取塑料底板,将已包被NC膜粘贴在底板的中部,在NC膜T线一侧粘贴胶体金垫,在胶体金垫另一侧粘贴样品垫;在NC膜C线一侧粘贴吸样垫;各粘贴组分接口相互叠压1-2mm,粘贴好的大板切成3-5mm宽的试纸条。然后将三种试纸条分别放置于卡壳下盖的槽中,然后盖上上盖,压紧,完成装配。
2.4内置标准曲线曲线和参数设置确定好试纸工艺参数后,分别用0,20,50、100、250,500ng/mL的AFP标准品对试剂进行测定,不同浓度的标准品显示出不同强度色带,用免疫层析判读记录仪将相应强度的色带数字化后,计算出标准曲线,并输入免疫层析结果判读记录仪中,完成AFP标准曲线参数设置;分别用0,5,10,20、50、100、200ng/mL的CEA标准品对试剂进行测定,用免疫层析判读记录仪将相应强度的色带数字化后,计算出标准曲线,并输入免疫层析结果判读记录仪中,完成CEA标准曲线参数设置;类似的方法完成PSA标准曲线参数设置。将AFP的Cutoff值设为20ng/mL,CEA的Cutoff值设为5ng/mL,PSA的Cutoff值设为4ng/mL。对于同一样本,弱3项检测均为阴性,对肿瘤的判定结果为阴性,1项检测指标为阳性,对肿瘤的判定结果为可疑,若2及以上项检测指标为阳性,对肿瘤的判定结果为阳性,完成结果判定参数设置,并输入免疫层析结果判读记录仪中。
2.5检测方法1)将检测试剂及样本平衡至室温,取出试纸卡,平放;2)分别精确吸取10μl血清、血浆或20ul全血样本,加入到3个样本孔中,立即分别在下部的稀释液孔中加入100μL样本稀释液(0.01M PBS),15-20分钟内用免疫层析结果判读记录定量判定结果;3)设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测,仪器将显示分别出AFP、CEA、PSA样品浓度的定量测定结果;以及对肿瘤的综合测试结果。
2.7临床样本检测试剂制备完成后,按检测方法对所有临床样本进行检测,并分析检测结果。
3结果
临床样本检测对120份临床样本进行检测,两种检测均为阳性的为30例,均为阴性的为57例,和临床相比,阳性、阴性预期值均为100%。另外33例为可疑结果。综合结果的一致率为72.5%。,和单个阳性检测相比,综合判定的结果准确性更高。和定值的量进行定量分析,相关系数r均大于0.95,不一致的检测离群值<3%,t检验P>0.05,定量检测效果较好。通过以上结果可以判定检测装置的性能良好,具有操作简便、反应快速、结果准确、可信、适合现场检测等优点,特别其良好的综合阳性、阴性预期值适合临床对更为准确、简便检测的需要。
Claims (8)
1.一种多种肿瘤标志物快速定量联合检测装置,其特征在于装置由3-8种相互独立的肿瘤标志物检测试纸如AFP、CEA、PSA、CA125、CA153、CA199、CA242、NSE,3-8联专用卡壳和内置了相应标准曲线和判定方法的免疫层析结果判读记录仪组成。这些试纸可以根据特定的需要组合成3联、4联或至8联的检测装置。
2.根据权利要求1所述的检测装置,其特征在于每种肿瘤标志物检测试剂试纸由含有胶体金标记抗体的胶体金垫、包被有配对抗体(T线)和抗鼠IgG(C线)的NC膜、样品垫、吸样垫和塑料底板组成。每个试纸的宽度为3-5mm,长度为7-8cm。样品垫、胶体金垫、NC膜和吸样垫从塑料底板一端依次排列至另一端。
3.根据权利要求1所述的检测装置,其特征在于专用卡壳包含上盖和下盖两个部分,内部可平行放置3-8条检测试纸,卡壳可根据需要设计成3联、4联或至8联。卡壳上盖的下部对应样品垫部分设置了样品孔和稀释液孔,用于加入样本和稀释液,卡壳上盖的中间部分应对试纸NC膜中部设置了视窗口,用于观察NC膜上的C、T线,判定结果。
4.根据权利要求1和2所述的检测装置,其特征在于所述NC膜是一种由硝酸纤维素构成的多孔结构的膜,孔径为8-12um。稀释液垫为玻璃纤维膜或无纺布,吸样垫为吸水滤纸。
5.根据权利要求1和2所述的检测装置,其特征在于每种肿瘤标志物试纸单独制备,包被有配对抗体的NC膜制备过程为:以合适盐缓冲液将单个的肿瘤标志物抗体配制成合适的浓度,在喷膜仪在NC膜上以1.0-1.5ul/cm的参数进行划线,包被T线,同时在NC膜上部包被2mg/ml的抗鼠IgG作为C线,干燥备用。胶体金垫的制备过程为:取100ml胶体金液放在烧杯内,用0.2M K2CO3调至合适的pH值,再加入适量的配对标记用单个肿瘤标志物抗体,室温搅拌30min,封闭,12000rpm离心30分钟,弃上清,用工作液复溶至40ml,然后用喷金机分别均匀地喷涂在胶体金垫上,干燥备用。
6.根据权利要求1所述的检测装置,其特征在检测卡装配方法为:在相对湿度小于40%的条件下,取塑料底板,将已包被NC膜粘贴在底板的中部,在NC膜T线一侧粘贴胶体金垫,在胶体金垫另一侧粘贴样品垫;在NC膜C线一侧粘贴吸样垫;各粘贴组分接口相互叠压1-2mm,粘贴好的大板切成3-5mm宽的试纸条。然后将3-8种试纸条按特定的顺序分别放置于卡壳下盖的槽中,然后盖上上盖,压紧,完成装配。
7.根据权利要求1所述的检测装置,其特征在于免疫层析结果判读记录仪是一种光学检测系统,内置了对8种试纸的标准曲线和判定方法,用于对检测结果的定量判定,并且对判定方法能对不同的检测结果的组合进行各种肿瘤发生情况的预测。
8.根据权利要求1所述的检测装置,其特征在于检测方法为各个单个试纸的检测方法相同:检测时将10-20ul的被检样本如血清、血浆、全血加入到样本孔中,然后在稀释液孔中加入100ul样品稀释液,在15-20分钟内,用免疫层析结果判读记录仪对检测结果进行判定。
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