CN107765012B - 早期非小细胞肺癌筛查方法及试剂盒 - Google Patents

早期非小细胞肺癌筛查方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种早期非小细胞肺癌筛查方法及试剂盒，该方法是：采用角质素酶蛋白(YKL‑40)联合细胞角蛋白19(CYFRA21‑1)以及癌胚抗原(CEA)三联检进行早期非小细胞肺癌的筛查。通过上述方式，本发明能够提高预测早期非小细胞肺癌的准确性。

Description

早期非小细胞肺癌筛查方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及肿瘤筛查技术领域，特别是涉及一种早期非小细胞肺癌筛查方法及试剂盒。
背景技术
肺癌是我国常见的恶性肿瘤，在临床当中发现男性肺癌的患者多于女性。根据国际癌症研究机构2012年的数据显示，2012年肺癌病人数为653万，其中男性459万，女性为193万。肺癌位居全国癌症发病及死亡的首位。
肺癌的病因未完全清楚。其病因可能与吸烟、大气污染、电离辐射、职业(石棉、碑、沥青、烟尘等)有关。一般将肺癌分为非小细胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer，简写NSCLC)和小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer，简写SCLC)两大类。肺癌的检验与检测方法很多，包括：1、痰脱落细胞学检查；2、免疫学检查：例如，癌胚抗原(Carcino-EmbryonicAntigen，简写CEA)，肺癌特别是腺癌，CEA可升高，但也见于其它恶性肿瘤和非肿瘤疾病，对连续观察肿瘤的复发和判断预后具有一定价值，其它的肺癌标记物有细胞角蛋白(cytokeratins)；3、胸水检查；4、活组织检查；5、X线检查，等等。这些方法除了免疫学检查大部分不太适合早期的筛查。
值得一提的是，现有的免疫学检查非小细胞肺癌的肿瘤标记物是细胞角蛋白19(CYFRA21-1)和癌胚抗原(CEA)。癌胚抗原CEA，是一种广谱性肿瘤标志物，测定CEA可以作为良性与恶性肿瘤的鉴别辅助诊断依据。CYFRA21-1目前被认为是一种主要用于检测肺癌的肿瘤标记物，尤其对非小细胞肺癌NSCLC的辅助诊断具有重要价值。但是，CYFRA21-1阴性也不能排除存在肺癌的可能。细胞角蛋白19(CYFRA21-1)和癌胚抗原(CEA)二者联合检查也无法准确地预测早期非小细胞肺癌。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种早期非小细胞肺癌筛查方法及试剂盒，能够提高预测早期非小细胞肺癌的准确性。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种角质素酶蛋白(YKL-40)联合细胞角蛋白19(CYFRA21-1)以及癌胚抗原(CEA)在早期非小细胞肺癌筛查中的用途。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种筛查早期非小细胞肺癌的方法，所述方法包括：检测样品中YKL-40、CYFRA21-1以及CEA的含量；
若CYFRA21-1和CEA的含量分别在各自的临界值范围内，且YKL-40的含量大于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较大的非小细胞肺癌风险，
若CYFRA21-1和CEA的含量分别大于各自的临界值范围，且YKL-40的含量等于或小于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较小的非小细胞肺癌风险。
其中，所述样品为血液样品。
其中，所述临界值范围为正常人的含量范围或良性肿瘤及炎性病人的含量范围。
为解决上述技术问题，本发明采用的又一个技术方案是：提供一种角质素酶蛋白(YKL-40)、细胞角蛋白19(CYFRA21-1)以及癌胚抗原(CEA)联合检测体外诊断试剂盒，所述体外诊断试剂盒包括：包被在第一层析材料上的标记的抗YKL-40第一抗体，标记的抗CYFRA21-1第一抗体以及标记的抗CEA第一抗体；包被在第二层析材料上的未标记的抗YKL-40第二抗体，未标记的抗CYFRA21-1第二抗体以及未标记的抗CEA第二抗体。
其中，所述标记的抗YKL-40第一抗体，标记的抗CYFRA21-1第一抗体以及标记的抗CEA第一抗体是采用量子点或荧光微球进行标记的。
其中，所述体外诊断试剂盒用于早期非小细胞肺癌的筛查。
为解决上述技术问题，本发明采用的又一个技术方案是：提供一种用于早期非小细胞肺癌筛查的角质素酶蛋白(YKL-40)试剂盒，所述角质素酶蛋白(YKL-40)试剂盒与CYFRA21-1试剂盒、CEA试剂盒联合使用。
本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明采用角质素酶蛋白(YKL-40)联合细胞角蛋白19(CYFRA21-1)以及癌胚抗原(CEA)三联检进行早期非小细胞肺癌的筛查。由于角质素酶蛋白(YKL-40)的灵敏度比细胞角蛋白19(CYFRA21-1)以及癌胚抗原(CEA)都高，通过这种方式，能够提高预测早期非小细胞肺癌的准确性。
附图说明
图1是临床样品中YKL-40含量的实验数据分析示意图；
图2是临床样品中CYFRA21-1含量的实验数据分析示意图；
图3是临床样品中CEA含量的实验数据分析示意图；
图4a至4c是临床样品中健康人群的血样的临床数据；
图5是临床样品中良性肿瘤及炎性病人的血样的临床数据；
图6a至6c是临床样品中非小细胞肺癌病人的血样的临床数据。
具体实施方式
在详细介绍本发明之前，先介绍一下肺癌的症状以及现有的检测肺癌的方法及局限性。
肺癌的症状包括：咳嗽在中心型肺癌较早出现，常以阵发性、刺激性干咳为首发症状，无痰或仅有少量的白色泡沫状粘液痰。咯血，间断或持续性痰中带血，肺癌一般少有引起大咯血。如病变累及胸膜或胸壁则可出现持续、固定而剧烈的胸痛。中心型肺癌引起气道阻塞时可有胸闷、气促。晚期时，随着对气管、支气管的压迫，呼吸困难可能很严重，发热，多继发于支气管、肺部感染。全身症状可有消瘦、乏力、食欲减退和体重减轻体征，早期可无阳性体征。肿瘤增大时可有气管移位。阻塞支气管可出现肺不张体征。部分阻塞支气管时，2％的患者可有限局性喘鸣音。除肺内体征外，如肿瘤压迫上腔静脉，而出现颈部、胸部浅表静脉怒张。可有颈部锁骨上或腋窝淋巴结肿大及杵状指(趾)。神经系统表现如喉返神经受压，出现声带麻痹、声音嘶哑。影响交感神经出现Horner氏征，异位内分泌综合征如Cushing综合征，男性乳房肥大等。肺癌转移，可出现相应器官损害的体征。其他常见的肺外表现，如增生性骨关节病、皮肌炎、黑棘皮症和神经肌病等。实际情况是，病人出现上述症状时都已经处于晚期，耽误治疗的良机。
目前肺癌的检验包括：
1、痰脱落细胞学检查：取材方便，方法简单，应用广泛，应多次送检提高阳性率。
2、免疫学检查：癌胚抗原(Carcino-Embryonic Antigen，简写CEA)，肺癌特别是腺癌，CEA可升高，但也见于其它恶性肿瘤和非肿瘤疾病，对连续观察肿瘤的复发和判断预后具有一定价值，其它的肺癌标记物有细胞角蛋白(cytokeratins)。
3、胸水检查：癌性胸水多呈血性，胸水量较多，可找肿瘤细胞。
4、活组织检查：其是诊断肺癌的重要方法，通过活检可做出病理学诊断，确定肺癌及病理类型；其中包括肺癌转移的浅表淋巴结的活检穿刺或手术，胸壁针刺肺活检，经纤维支气管镜支气管粘膜和肺活检，开胸肺活检，纵隔镜检查和活检。
5、纤维支气管镜检查：可直接观察支气管内病变，看到肿物及管壁浸润；通过支气管镜可做活组织检查，细胞刷或生理盐水冲洗，提供细胞学、病理学检查的标本。
6、X线检查：
(一)胸部X片：肺癌的诊断中占有十分重要的地位，通过X线检查可初部确定病变的部位、范围和性质。
1、中心型肺癌：(1)限局性肺气肿，为肺癌的早期表现，吸气相投照胸片较易显示。(2)阻塞性肺炎：它是中心型肺癌的重要表现。其特点为：在同一部位反复发生；经抗生素治疗可以吸收，但很少完全吸收；阻塞性肺炎常常合并肺膨胀不全。(3)阻塞性肺不张，尤其与肺门肿块及肿大淋巴结一起形成“S”征象，有诊断意义。(4)肺门肿块：肿瘤侵犯周围肺组织，侵及肺门淋巴结，共同在肺门区形成肿块。
2、周边型肺癌：多呈孤立的类球形病灶，大多数为单发。早期病变密度较低、边缘模糊，可有细小毛刺影，有的病变呈分叶状或有脐样切迹。病变可形成空洞，壁厚，内壁凹凸不平空洞多偏心，可有突出于腔内的结节病变，可伴有肺门、纵隔淋巴结转移、淋巴结肿大。
(二)断层摄影：能层次地显示病变及肿大淋巴结的轮廓及大小。能显示气管、支气管阻塞的征象。可见支气管壁不规则地增厚，管腔狭窄、中断或管腔内肿物，或可见典型的鼠尾状、漏斗状、平直或杯状中断。
(三)电子计算机体层X线扫描(CT)：对发现密度较低及处于隐蔽部位如心脏旁、脊柱旁的肿瘤有定一价值，对隐性肺癌可帮助寻找肿瘤部位。
非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)是肺癌最常见的组织学类型，它是一种异质性肿瘤，可进一步分为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。在接诊的肺癌病人中，非小细胞肺癌约占肺癌总数的80-85％。肺鳞癌是一种显示角化和细胞间桥的恶性上皮肿瘤，约占肺癌的40％；肺腺癌是具有腺样分化或有癌细胞产生粘液产物的恶性肿瘤，其生长方式可分为腺泡状、乳头状、细支气管肺泡状、伴有粘液的实行腺癌和伴有混合亚型的腺癌，肺腺癌占肺癌的20-30％；大细胞肺癌亦称为未分化大细胞肺癌，是一种缺乏小细胞肺癌、腺癌或鳞癌细胞分化特点的未分化恶性上皮细胞肿瘤，此型肺癌约占肺癌的15％。非小细胞肺癌分裂较慢，扩散转移相对较晚。
根据各种影像学结果进行综合分析而得出的临床症状表现是诊断肺癌的有效依据，但只有以病理组织学或细胞学为依据的诊断，才能对该病最终确诊。若不是该证据的诊断是无法视为确诊的。辅助影像诊断方法包括(1)X线检查：目前仍然是发现、诊断肺癌和提供治疗参考的重要基本方法，常用的X线检查方法包括X线胸部透视、胸部正侧位片、体层照片。(2)CT检查：胸部CT检查目前已成为估计肺癌胸内侵犯程度及范围的常规方法，尤其在肺癌的分期上，更有其无可替代的作用。其他部位包括脑、肝、肾上腺的CT检查，主要的目的是排除肺癌相关部位的远处转移，一般是在临床怀疑转移时才进行检查。(3)MRI检查：胸部MRI检查的最大特点是较CT更容易鉴别实质性肿块与血管的关系，而且能显示气管支气管和血管的受压、移位与阻塞。(4)PET-CT检查：该检查价格较高，主要用于排除纵隔淋巴结和远处转移。非小分子肺癌的组织学或细胞学检查：非小分子肺癌的确诊必须有组织学或细胞学依据，细胞学检查是目前诊断肺癌的重要方法之一，也是目前最简单、方便的诊断方法。根据标本来源不同可以分为痰细胞学检查、胸腔积液癌细胞学检查、经皮细针肺穿刺细胞学检查、锁骨上增大淋巴结或皮下结节的穿刺涂片细胞学检查。临床医生可根据不同患者的情况做选择。非小细胞癌的分期比较复杂，它主要根据三个指标(TNM)：(1)肿瘤本身大小、位置，是否侵犯周边组织(Tumor T)，分为T1、T2、T3以及T4；(2)淋巴结转移远近(NodeN)，分为N0、N1、N2以及N3；(3)远处器官转移(Metastasis M)，分为M0和M1。
上述方法中，除了免疫学检查外，均不适合作为早期非小细胞肺癌检测的方法。
本发明采用角质素酶蛋白(YKL-40)联合细胞角蛋白19(CYFRA21-1)以及癌胚抗原(CEA)三联检进行早期非小细胞肺癌的筛查。由于角质素酶蛋白(YKL-40)的灵敏度比细胞角蛋白19(CYFRA21-1)以及癌胚抗原(CEA)高，通过这种方式，能够提高预测早期非小细胞肺癌的准确性。
下面结合附图和实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供一种角质素酶蛋白(YKL-40)联合细胞角蛋白19(CYFRA21-1)以及癌胚抗原(CEA)在早期非小细胞肺癌筛查中的用途。
癌胚抗原简称CEA，是一种广谱性肿瘤标志物，由于最早在红肠癌和胎儿肠组织中发现而得名。癌胚抗原主要分布于人体内胚叶起源的消化系统癌及正常胚胎的消化管组织内，少量分布于正常人的血清中，可以反映人体多种肿瘤的位置。CEA最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。为消化道肿瘤的辅助诊断指标。正常值≤5ng/ml。CEA升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、小细胞肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。癌胚抗原的意义就在于其能反映出多种肿瘤的存在，可用于对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计，但其特异性不强，灵敏度不高，对肿瘤早期辅助诊断作用不明显。癌胚抗原是由正常的胚胎组织生成的，人体内癌胚抗原的含量会随着时间的推移而逐渐减少甚至消失。CEA升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、小细胞肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。但吸烟、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特异性结肠炎等疾病，15％～53％的病人血清CEA也会升高，所以CEA不是恶性肿瘤的特异性标志，在辅助诊断上只有辅助价值。此外，血清CEA水平与大肠癌的分期有明确关系，越晚期的病变，CEA浓度越高。97％的健康成人血清CEA浓度在2.5ng/mI以下。原发性结肠癌患者CEA增高占45－80％。除原发性结肠癌以外，腺胰癌、胆管癌、胃癌、食道癌、腺癌、肺癌、乳腺癌和泌尿系统的肿瘤阳性率也很高，一般在50－70％。良性肿瘤、炎症和退行性疾病，如结肠息肉、溃疡性结肠炎、胰腺炎和酒精性肝硬变病人CEA也有部分升高，但远远低于恶性肿瘤，一般小于20μg/L，CEA超过20ng/ml时往往提示有消化道肿瘤。所以测定CEA可以作为良性与恶性肿瘤的鉴别诊断依据。
细胞角蛋白(cytokeratins)，是形成上皮细胞的结构蛋白之一中间丝的亚单位。根据其分子量和双向电泳中等电点的不同，可以分为20种不同类型。它们被分为两个亚群：Ⅰ类(酸性蛋白)，Ⅱ类(碱性蛋白)。细胞角蛋白是由Ⅰ类和Ⅱ类角蛋白组成的异聚合体。细胞角蛋白19(CYK-19)是一分子量约40，000Da的Ⅰ类角蛋白(酸性蛋白)，是角蛋白家族中最小的成员。CYK-19广泛分布在正常组织表面，如层状或鳞状上皮中。在恶性上皮细胞中，激活的蛋白酶加速了细胞的降解，使得大量细胞角蛋白片段释放入血，其可溶性片段可与两株单克隆抗体KS19.1和BM19.21特异性结合，故称为CYFRA21-1。主要存在于肺癌、食道癌等上皮起源的肿瘤细胞的胞浆中，肺腺癌、肺鳞癌均有CYFRA21-1的表达，当细胞发生癌变时，由于肿瘤细胞的坏死溶解而使CYFRA21-1释放使血中含量增高，且能反映病情的预后和治疗疗效。CYFRA21-1分子量约30，000Da。在恶性肺癌组织中，CYFRA21-1含量丰富，尤其是在肺鳞癌中有高表达。肺炎、肺结核、支气管炎、支气管哮喘、肺气肿等疾病一般不引起CYFRA21-1升高。良性肝病、肾衰竭可引起轻微升高，但很少超过10ng/ml。CYFRA21-1的血清水平与年龄、性别、吸烟与否和妊娠等无关。
CYFRA21-1目前被认为是一种主要用于检测肺癌的肿瘤标记物，尤其对非小细胞肺癌(NSCLC)的辅助诊断具有重要价值。如果肺部存在不清晰的环形阴影，同时血清CYFRA21-1浓度>30ng/ml，原发性支气管肺癌的可能性非常高。CYFRA21-1阴性也不能排除存在肺癌的可能。CYFRA21-1对各型肺癌诊断的敏感性依次为：鳞癌>腺癌>大细胞癌>小细胞癌。为了提高非小细胞肺癌的早期筛查和准确辅助诊断，科学家们一直在寻找新的辅助诊断方法。
研究结果表明角质酶素YKL-40是炎症因子，同时又是肿瘤标记物，从炎症到癌变的过程中，它在血液中的含量会随着病情的程度而增加。的确，仅仅使用角质酶素作为标记物，它是不足以准确定位的，而且心血管疾病和糖尿病也会导致血液中角质酶素升高。但当它与其他癌症标记物一同检测时，就能更有效地帮助临床预警癌症，这是因为从炎症到癌症，它在血液中含量会显著增加。
本申请的发明人研究发现角质素酶YKL-40是炎症因子，同时又是肿瘤标记物，从炎症到癌变的过程中，它在血液中的含量会随着病情的程度而增加。仅仅使用角质素酶作为标记物，它是不足以准确定位的，而且心血管疾病和糖尿病也会导致血液中角质素酶升高。但当它与其他癌症标记物一同检测时，就能更有效地帮助临床预警癌症，这是因为从炎症到癌症，它在血液中含量会显著增加。
为了准确定位非小细胞肺癌，本申请的发明人提出一种三联检测法，就是在非小细胞肺癌辅助诊断的标记物细胞角蛋白19(CYFRA21-1)以及癌胚抗原(CEA)基础上，再增加角质素酶蛋白(YKL-40)的检测。
请参见图1至图3，检测临床247例血样，这些血样包括健康人群的血样(105例)、良性肿瘤及炎性病人的血样(26例)、非小细胞肺癌病人的血样(116例)，图1是检测病人血样中的YKL-40，横坐标表示三种不同血样对应的人群，纵坐标表示YKL-40的含量，单位是ng/ml，图2是检测病人血样中的CYFRA21-1，横坐标表示三种不同血样对应的人群，纵坐标表示CYFRA21-1的含量，单位是ng/ml，图3是检测病人血样中的CEA，横坐标表示三种不同血样对应的人群，纵坐标表示CEA的含量，单位是ng/ml。
从图1中可以看出，健康人群、良性肿瘤及炎性病人中YKL-40含量与非小细胞肺癌病人中YKL-40含量之间的差异非常明显，非小细胞肺癌病人中YKL-40含量显著高于健康人群、良性肿瘤及炎性病人中YKL-40含量，通过检测YKL-40含量，可以将健康人群、良性肿瘤及炎性病人与非小细胞肺癌病人区分开来。从图2可以看出，健康人群、良性肿瘤及炎性病人中CYFRA21-1含量与非小细胞肺癌病人中CYFRA21-1含量之间的差异不明显，且存在重叠区域，特别是非小细胞肺癌病人中CYFRA21-1含量与良性肿瘤及炎性病人中CYFRA21-1含量几乎难以区别开来，通过检测CYFRA21-1含量，不能完全将健康人群、良性肿瘤及炎性病人与非小细胞肺癌病人区分开来。从图3可以看出，健康人群、良性肿瘤及炎性病人中CEA含量与非小细胞肺癌病人中CEA含量之间存在差异，但是也存在重叠区域，特别是非小细胞肺癌早期病人中CEA含量与良性肿瘤及炎性病人中CEA含量几乎难以区别开来，通过检测CEA含量，不能完全将健康人群、良性肿瘤及炎性病人与非小细胞肺癌病人区分开来。
因此，结合图1至图3，可以看到，YKL-40的灵敏度显然高于CYFRA21-1和CEA。而且，在正常对照组中，有22例血样的CEA都超出正常范围，有19例血样的CYFRA21-1超出正常范围，但它们血样中的YKL-40都在正常范围，经过进一步排查，最后证明是假阳性；在健康人群中有5例血样的YKL-40都超出正常范围，但CEA和CYFRA21-1却在正常范围之内，经过进一步排查是假阳性，该个体或许患有某些炎症相关的疾病未被诊断，需进一步排查。因此，本申请YKL-40联合CEA和CYFRA21-1的三联检测法，确实优于原先的CEA单一标志物或CEA和CYFRA21-1二联检测法。对于检测结果显示二个标志物水平升高，需引起注意，需进一步排查。
本发明还提供一种筛查早期非小细胞肺癌的方法，该方法包括：
A、检测样品中YKL-40、CYFRA21-1以及CEA的含量；
B、若CYFRA21-1和CEA的含量分别在各自的临界值范围内，且YKL-40的含量大于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较大的非小细胞肺癌风险，若CYFRA21-1和CEA的含量分别大于各自的临界值范围，且YKL-40的含量等于或小于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较小的非小细胞肺癌风险。
其中，该样品为血液样品，例如：血清、血浆、全血等。
其中，临界值范围为正常人的含量范围或良性肿瘤及炎性病人的含量范围。
在上述初期的实验数据中已经发现，加入YKL-40成为三联检测以后，有以下二项较为显著的优点：第一，当CEA和CYFRA21-1指标还处于临界值范围时(Borderline Risk，临界值范围的含量，还不足以定位阳性时)，但是如果同时伴有YKL-40的显著增高，有助于定性为阳性。这样，使非小细胞肺癌的早期辅助诊断阳性率，增加到更高的比例。在116例检测病例中，对于这一点得到了进一步的印证。第二，目前临床上使用的CEA和CYFRA21-1检测法的假阳性率还是比较高。而从本申请的实验数据中分析，当CEA和CYFRA21-1的检测出现异常增高时，而YKL-40并没有出现显著增高，癌症病变的几率就会减少很多。因此，加入YKL-40成为三联检测以后，可以帮助减低假阳性率。
在本发明实施方式中，非小细胞肺癌是经过X光和其它CT扫描等辅助诊断方法确定肿瘤的位置后，经病理学检查与其他类型的肺癌相鉴别并确诊。
由于非小细胞肺癌分期方法复杂，所收集的样本并未明确分期，根据癌细胞不同程度转移到胸腔，属于中晚期。本发明实施方式总共收集了116例临床非小细胞病人血清样本，105例正常人群血清样本(即没有肺部疾病的人群，也没有发现其它疾病的人群)，26例阳性肺囊肿，或哮喘与肺纤维化病人血清样本，但没有肺癌，具体的临床数据请参见图4至图6。
CYFRA21-1，CEA和YKL-40的检测试剂由深圳海格德生物科技公司提供。在CYFRA21-1的检测中，临界值(Cutoff)定为3.5，在103例正常人群样本中，有19例的样本超过临界值，假阳性率为18.1％。在26例良性肿瘤或炎症病人中病例中，有14例超过临界值，假阳性率为53.8％。在116例非小细胞肺癌病人中26例低于临界值，漏检率也达到22.41％，因此CYFRA21-1辅助诊断非小细胞肺癌的检测率低于80％，敏感性很低，特异性也低，假阳性达到30％以上。在CEA的检测中，临界值(Cutoff)定为3.5，在105例正常人群样本中，有22例的样本超过临界值，假阳性率为20.95％。在26例良性肿瘤或炎症病人中病例中，有6例超过临界值，假阳性率为23.08％。在116例非小细胞肺癌病人中23例低于临界值，漏检率也达到20.69％，因此CEA辅助诊断非小细胞肺癌的检测率低于80％，敏感性很低，特异性也低假阳性达到20％以上。在YKL-40的检测中，临界值(Cutoff)定为100，在105例正常人群样本中，有11例的样本超过临界值，在26例良性肿瘤例有21例超过临界值，假阳性率达80％，但是众所周知，YKL-40是一个炎症因子，分泌到血液的量会随炎症程度而增加，因此当YKL-40水平增加，而增加幅度不大于300，可以判定病人有其它炎症，需进一步确诊。但是，如果将正常人群和炎症病人作为对照组，将cutoff水平定为200，这样可以将YKL-40的假阳性排除，这样假阳性率低于3％。在116例非小细胞肺癌病人中，有7率低于临界值200。但是如果结合CYFRA21-1和CEA值对照YKL-40没有升高的病人，CYFRA21-1和CEA水平都很高，可以认为病人得肺癌的可能性还是很大，需进一步排查。因此，CYFRA21-1，CEA和YKL-40联和检测，辅助诊断非小细胞肺癌比单一CYFRA21-1或CEA，或CYFRA21-1与CEA二联检筛查具有明显优势。
目前临床上使用的CYFRA21-1或CEA检测法的假阳性率还是比较高。而从本申请的实验数据中分析，当CYFRA21-1或CEA的检测出现异常增高时，而YKL-40并没有出现显著增高，癌症病变的几率就会减少很多。因此，加入YKL-40成为三联检测以后，可以帮助减低假阳性率。在这次116例病人血样检测中，也再次证实了这一优点的存在：在正常对照组中，有21例血样的CYFRA21-1和22例血样的CEA超出正常范围，但它们血样中的YKL-40都在正常范围，因此如用单一CYFRA21-1或单一CEA标志物法定性为阳性的，经本申请的三联检测可以定为阴性。因此，加入了YKL-40的三联检测法，确实优于原先的CYFRA21-1或CEA单一标志物的检测法。如果将正常人群加上炎症病人组做为对照组，三联检测的优势将更为明显。
目前在临床上，进行肺癌(或其他所有癌症)的确切诊断，仍然还是以病理学方法为主。而目前临床上使用的所有血样检测，包括本申请提供的三联检测法，都是对临床医生起到辅助性诊断作用，主要起到初期筛选性或预警性的作用。按照本申请的方法，检测结果为阳性的，不等于绝对的肺癌阳性。但是血液检测阳性的病例，与阴性病例比较，在肺癌的发病几率上说，要大出十倍乃至数十倍以上，足以让临床医生提高警觉，并给予病人进一步的必要检查。不少呼吸科医生反映，目前各种费用昂贵的检查(例如壁针刺肺活检，经纤维支气管镜支气管粘膜和肺活检，开胸肺活检，纵隔镜检查和活检，CT scan，MRI，或新型的超声波)，不可能大规模用于初期疾病筛选。因此对于不容易做出早期辅助诊断的非小细胞肺癌，尤其需要有一项快速，简便，费用低，敏感度高，而结果相对可靠的初选辅助诊断方法。而本申请的方法以及产品正好满足这样的一种临床需求。
本发明还提供一种角质素酶蛋白(YKL-40)、细胞角蛋白19(CYFRA21-1)以及癌胚抗原(CEA)联合检测体外诊断试剂盒，该体外诊断试剂盒包括：
包被在第一层析材料上的标记的抗YKL-40第一抗体，标记的抗CYFRA21-1第一抗体以及标记的抗CEA第一抗体；
包被在第二层析材料上的未标记的抗YKL-40第二抗体，未标记的抗CYFRA21-1第二抗体以及未标记的抗CEA第二抗体。
很显然，上述三联检的体外诊断试剂是采用层析法原理的。通过上述三联检的体外诊断试剂，可以检测样本中的YKL-40、CYFRA21-1和CEA。
其中，该标记的抗YKL-40第一抗体，标记的抗CYFRA21-1第一抗体以及标记的抗CEA第一抗体是采用量子点或荧光微球进行标记的。当然，也可以采用胶体金进行标记。
其中，该体外诊断试剂盒用于早期非小细胞肺癌的筛查。
量子点(Quantum Dots)是由半导体材料，如硒化镉CdSe，组成的纳米颗粒，当量子点被一种普通光激发之后，可以释放出比普通荧光素强达数十倍的荧光，且有激发光谱宽、发射光谱窄的特点。发射光谱还可根据半导体材料的不同与纳米颗粒大小的不同而进行变动调节，且发射光的稳定性高，不会被淬灭。正是由于量子点荧光的这些优点，用量子点纳米颗粒标记的抗体，可比普通荧光素标记的抗体发光强度提升数百倍，从而使试剂的信号敏感度达到与化学发光的水平相当。
该试剂盒的开发技术路线大致分为以下几步：
筛选或自行研发检测肿瘤标志物的单克隆抗体；
抗体和量子点纳米颗粒或荧光微球偶联条件的确定和优化；
免疫层析法检测肿瘤标志物的条件确定和优化；
检测肿瘤标志物试剂盒的性能技术参数的确定和优化；
检测试剂盒的中试和大量生产条件和工艺的确定和优化；
试剂盒配套的荧光检测仪器的研发生产。
试剂盒开发的工艺流程采用以下几个步骤：配制包被和标记用的工作液体、抗体和量子点纳米颗粒或荧光微球偶联、制备荧光垫、制备样品垫、包被抗体到NC膜、干燥、试剂条的组装等。
本发明还提供一种用于早期非小细胞肺癌筛查的角质素酶蛋白(YKL-40)试剂盒，该角质素酶蛋白(YKL-40)试剂盒与CYFRA21-1试剂盒、CEA试剂盒联合使用。
例如，用于早期非小细胞肺癌筛查的角质素酶蛋白(YKL-40)酶联(ELISA)试剂盒。
总结来说，本申请的方法以及产品具有以下明显的优点：
(1)通过检测YKL-40在血液中的含量，可以明确划分正常人、炎症病人、癌症病人，在癌症情况下，它的水平随着病情发展而递增。
(2)CYFRA21-1、CEA和YKL-40联检，可以弥补CYFRA21-1、CEA二联检的不足，非小细胞肺癌的早期辅助诊断的灵敏度和特异度明显提高。
(3)早期辅助诊断非小细胞肺癌的价值远高于目前临床上常用的检测方法，具有广阔的应用前景，填此领域的空白。
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (1)

1.检测多肿瘤标志物的试剂在制备早期非小细胞肺癌筛查的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：
检测YKL-40含量的试剂、检测CYFRA21-1含量的试剂和检测CEA含量的试剂；
检测样品中YKL-40、CYFRA21-1以及CEA的含量；
若CYFRA21-1和CEA的含量分别在各自的临界值范围内，且YKL-40的含量大于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较大的非小细胞肺癌风险，
若CYFRA21-1和CEA的含量分别大于各自的临界值范围，且YKL-40的含量等于或小于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较小的非小细胞肺癌风险；
所述临界值范围为正常人的含量范围、良性肿瘤及炎性病人的含量范围；
所述样品为血液样品。
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