CN103582815A

CN103582815A - 用于卵巢癌的生物标志物组、诊断方法和测试试剂盒

Info

Publication number: CN103582815A
Application number: CN201280010293.0A
Authority: CN
Inventors: 格雷格·P·贝尔滕肖; 平·F·叶; 帕塔·塞莎亚
Original assignee: Vermillion Inc
Current assignee: Aspira Womens Health Inc
Priority date: 2011-02-24
Filing date: 2012-02-14
Publication date: 2014-02-12
Also published as: CA2828119A1; GB201316222D0; WO2012115820A2; US20150031561A1; DE112012000990B4; EP2678682A2; WO2012115820A3; GB2503148A; AU2012220896B2; EP2678682A4; KR20140024860A; AU2012220896A1; DE112012000990T5

Abstract

本发明提供了用于预测卵巢癌的存在、亚型和分期的方法，以及用于评估癌症治疗的治疗效力和确定对象是否潜在地正在发生癌症的方法。本发明还提供了相关的测试试剂盒、计算机和分析系统以及软件和诊断模型。

Description

用于卵巢癌的生物标志物组、诊断方法和测试试剂盒

相关申请

本申请要求在2011年2月24日提交的美国临时申请序列号61/463,870的利益，其全部内容通过引用并入本文。

政府支持的声明

本申请的主题包括得到美国国家癌症研究所名为“Improvement of aPromising MAP for Ovarian Cancer”的SBIR Award No.HHSN261200800045C支持的工作。

技术领域

本发明提供了用于预测和诊断卵巢癌特别是上皮性卵巢癌的方法，并且还提供了相关的分析试剂、诊断模型、测试试剂盒和临床报告。

背景技术

美国癌症学会估计，美国在2007年卵巢癌侵袭了22,430名女性并且夺去了15,280名女性的性命。然而，卵巢癌并不是单一疾病，实际上有多于30种类型和亚型的卵巢恶性肿瘤，每一种具有其自己的病理学和临床行为。因此，大多数专家根据形成它们的细胞种类将卵巢癌分为主要的三类：由沿着或覆盖卵巢的细胞产生的上皮性肿瘤；来源于卵巢中将会形成卵子的细胞的生殖细胞肿瘤；和由将卵巢结合在一起并产生雌性激素的结缔组织细胞(connective cell)开始的性索-间质(sex cord-stromal)细胞肿瘤。

常见的上皮性肿瘤开始于卵巢的表面上皮并且在美国占全部卵巢癌的约90％(以下的百分比反映出美国这些癌症的流行性)。它们进一步划分为多种亚型——包括浆液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤、粘液性肿瘤和透明细胞肿瘤——可进一步再细分为良性或恶性肿瘤。浆液性肿瘤是卵巢癌最普遍的形式。它们占据常见上皮性肿瘤的40％。这些浆液性肿瘤有约50％是恶性的，33％是良性的，17％是交界性肿瘤(borderline malignancy)。浆液性肿瘤最经常在40至60岁的女性中发生。

子宫内膜样肿瘤占常见上皮性肿瘤的约20％。在约20％的个体中，这些癌症与子宫内膜癌(子宫内层的癌症)有关。在5％的病例中，它们还与子宫内膜异位(盆腔中子宫内膜(子宫内层组织)的异常现象)有关。这些肿瘤的大多数(约80％)是恶性的，并且其余部分(约20％)通常是交界性肿瘤。子宫内膜样肿瘤主要在50至70岁的女性中发生。

透明细胞肿瘤占常见上皮性肿瘤的约6％。几乎所有的这些肿瘤都是恶性的。所有透明细胞肿瘤中大约一半与子宫内膜异位有关。患透明细胞肿瘤的大多数患者在40至80岁。

粘液性肿瘤构成所有常见上皮性肿瘤的约1％。这些肿瘤的大多数(约80％)是良性的，15％是交界性肿瘤，仅5％是恶性的。粘液性肿瘤最经常在30至50岁的女性中出现。

迄今为止，卵巢癌是最致死的妇科癌症，占所有妇科癌症死亡的多于55％。但是，卵巢癌也是其中最好治疗的——如果其在早期被发现的话。当卵巢癌在早期被发现并进行适当治疗时，5年存活率为93％。参见例如Luce等，“Early Diagnosis Key to Epithelial Ovarian Cancer Detection，”The Nurse Practitioner，2003年12月第41页。关于卵巢癌的大量背景信息可在互联网上容易地得到，例如由美国癌症学会提供的癌症参考信息的“Overview：Ovarian Cancer”和NCCN Clinical Practice Guidelines inOncology TM Ovarian Cancer V.1.2007。

卵巢癌诊断目前的现实是大多数病例(所有卵巢癌病例的81％)未在最早期被发现。这是因为早期卵巢癌的诊断非常困难。其症状在此时可能还未出现或者注意不到。或者，症状(例如胃气胀(bloating)、消化不良、腹泻、便秘等)可能是模糊的并且与许多常见的不严重病症有关。最重要地，没有用于早期检测的有效测试。用于早期并准确检测卵巢癌的有效工具是关键的未被满足的医学需要。

妇科肿瘤学领域中迫切需要的是最小侵入性的(优选基于血清的)用于评估和预测卵巢癌存在的临床测试，其基于有力的生物标志物集合和从大且多样的样品集合鉴定的样品特征，以及在卵巢癌多个分期高度准确地预测、诊断和监测卵巢癌的方法和相关计算机系统及软件工具。

发明内容

本发明一般性地涉及癌症生物标志物，并且特别地涉及与卵巢癌相关的生物标志物。本发明提供了通过测量某些生物标志物来预测、评价诊断和监测癌症特别是卵巢癌的方法，并且还提供了评价与卵巢癌有关的生物标志物表达水平的试剂集合或阵列。优选的生物标志物集合提供了对象中卵巢癌的可检测分子标识。本发明提供了用于卵巢癌的预测性或诊断性测试，特别是用于上皮性卵巢癌，并且更特别地用于早期卵巢癌(即I期、II期或I期和II期一起)。

在一个方面中，本公开内容一般性地涉及预测对象卵巢癌状态的方法，其包括以下步骤：在得自于对象的生物流体样品中测量CA-125和HE4的水平并且测量选自下列的一种或更多种生物标志物的水平：IL-2受体α(IL-2Rα)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、C反应蛋白(CRP)、YKL-40、细胞纤连蛋白(cFib)、丝氨酸蛋白酶8(prostasin)、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)、IL-8、IL-6、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)、凝集素样氧化LDL受体1(LOX-1)、神经毡蛋白1、TNFR2和MPIF-1；以及使测量结果与卵巢癌状态相关联。

在另一个方面中，本公开内容涉及试剂盒，其包含一组各自与CA-125和HE4以及选自下列的一种或更多种生物标志物选择性结合的亲和试剂：白细胞介素-2受体α(IL-2受体α)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、C反应蛋白(CRP)、YKL-40、细胞纤连蛋白(cFib)、癌抗原72-4(CA-72-4)、丝氨酸蛋白酶8(prostasin)、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)、IL-8、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、IL-6、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)、凝集素样氧化LDL受体1(LOX-1)、神经毡蛋白1、TNFR2和MPIF-1；以及一组各自包含CA-125和HE4以及选自下列的一种或更多生物标志物的容器：白细胞介素-2受体α(IL-2受体α)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、C反应蛋白(CRP)、YKI-40、细胞纤连蛋白(cFib)、癌抗原72-4(CA-72-4)、丝氨酸蛋白酶8(prostasin)、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)、IL-8、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、IL-6、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)、凝集素样氧化LDL受体1(LOX-1)、神经毡蛋白1、TNFR2和MPIF-1。

在又一个方面中，本发明涉及一组纯化肽，其包含CA-125和HE4以及选自下列的一种或更多生物标志物：白细胞介素-2受体α(IL-2受体α)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、C反应蛋白(CRP)、YKL-40、细胞纤连蛋白(cFib)、癌抗原72-4(CA-72-4)、丝氨酸蛋白酶8(prostasin)、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)、IL-8、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、IL-6、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)、凝集素样氧化LDL受体1(LOX-1)、神经毡蛋白1、TNFR2和MPIF-1。

在本文所述公开内容的以上方面或任何其他方面之任一方面的多个实施方案中，所述方法包括测量癌抗原72-4(CA-72-4)的水平。在另一个实施方案中，卵巢癌状态是存在卵巢癌。在另一些实施方案中，卵巢癌是I期卵巢癌。在又一个实施方案中，卵巢癌是II期卵巢癌。在再一些实施方案中，卵巢癌是III期卵巢癌。在另一个实施方案中，卵巢癌是IV期卵巢癌。在另一些实施方案中，卵巢癌是I、II、III或IV期卵巢癌。在又一些实施方案中，所述方法还包括基于所述状态来安排对象的治疗。在另一个实施方案中，安排对象的治疗选自进行更多的测试、进行外科手术和不采取进一步的行动。在另一个实施方案中，所述方法包括在进行对象安排后测量得自于对象的生物流体样品中CA-125和HE4的水平并且测量选自下列的一种或更多种生物标志物的水平：白细胞介素-2受体α(IL-2受体α)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、C反应蛋白(CRP)、YKL-40、细胞纤连蛋白(cFib)、癌抗原72-4(CA-72-4)、丝氨酸蛋白酶8(prostasin)、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)、IL-8、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、IL-6、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)、凝集素样氧化LDL受体1(LOX-1)、神经毡蛋白1、TNFR2和MPIF-1；使测量结果与卵巢癌状态相关联；以及确定对象安排是否导致卵巢癌状态改变。在另一些实施方案中，测量选自检测生物标志物是否存在，对生物标志物的量进行定量和对生物标志物的类型进行定性。在某些实施方案中，所述生物标志物通过免疫测定来测量。在另一些实施方案中，所述关联通过软件分类算法来进行。在又一个实施方案中，样品选自血液、血清和血浆。在一些实施方案中，所述亲和试剂是抗体。在另一个实施方案中，所述试剂盒还包含使用亲和试剂来测量对象样品中生物标志物水平的书面说明。在又一个实施方案中，所述试剂盒包含使用试剂盒以确定对象卵巢癌状态的书面说明。在某些实施方案中，一种或更多种所述肽具有可检测标记。

在本发明的一个优选实施方案中，提供了一种预测对象卵巢癌状态的方法，其包括以下步骤：确定来自所述对象的生物流体样品中CA-125和HE4的浓度和所述对象的年龄(统称为“生物标志物”)；以及评价所述生物标志物，其中与未患卵巢癌的对照组患者相比，生物标志物的水平或评价的改变预示了对象患有卵巢癌。在一个更优选的实施方案中，前述方法还包括评价绝经后或非绝经后对象的对象绝经状态，以及来自所述对象的生物流体样品中CA15-3和CA72-4的浓度。

在本发明的另一些实施方案中，多种另外的生物标志物与前述生物标志物一起被评价。这些生物标志物包括：血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素2受体α(IL-2受体α)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)、触珠蛋白、铁蛋白(FRTN)、丝氨酸蛋白酶8(prostasin)、白细胞介素8(IL-8)、乳腺丝抑蛋白(Maspin)、骨桥蛋白、血清淀粉样P组分(SAP)、血小板源生长因子BB(PDGF-BB)和B细胞激活因子(BAFF)。任选地，还评价了某些另外的生物标志物：钙防卫蛋白、血管性血友病因子(vWF)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、C反应蛋白(CRP)、白细胞介素6(IL-6)、瘦素(1eptin)、甲状腺素运载蛋白(TTR)、癌胚抗原(CEA)、胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)和甲状腺素结合球蛋白(TBG)。

在一些优选实施方案中，所述评价通过选自以下的方法进行：逻辑斯蒂(logistic)回归、查找表、决策树、支持向量机、聚类分析、邻域分析、遗传算法、贝叶斯和非贝叶斯方法等。另外，所述样品优选地选自提取自患者的流体和组织，包括血液、血清、血浆、淋巴、脑脊液、腹水、尿和组织活检。

在另一些优选实施方案中，本发明的方法还包括提供卵巢癌预测的书面报告或电子报告的步骤，并且任选地，所述报告包括关于对象中卵巢癌存在与否或其可能性或者对象卵巢癌的等级化风险(任选地通过癌症分期)的预测。

另一些优选实施方案提供了这样的方法，其中a)当所述方法的灵敏度高于约95％时，其灵敏度和特异性总和大于约150％；或b)当所述方法的特异性高于约95％时，其灵敏度和特异性总和大于约170％；以及c)通过分析包含至少约50个癌症样品和150个良性样品的样品集合来支持灵敏度和特异性的前述总和。

提供试剂集合、测试试剂盒以及多分析物(multianalyte)和ELISA组和试剂盒来完成前述方法。

用于本发明方法的另一些生物标志物包括以下物质，其可确定为以上所附权利要求1至4所述方法中一种或更多种另外的标志物：前列腺酸性磷酸酶(PAP)、表皮生长因子受体(EGFR)、组织蛋白酶D、YKL-40、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、血管内皮生长因子D(VEGF-D)、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)、间皮素(MSLN)、分拣蛋白、细胞纤连蛋白(cFib)、护骨蛋白(OPG)、EN-RAGE、CD40抗原(CD40)、凝集素样氧化LDL受体1(LOX-1)、神经毡蛋白1、胎球蛋白A、抵抗素、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、过氧化物氧还蛋白4(Prx-IV)、磷酸丝氨酸氨基转移酶(PSAT)、α-1-微球蛋白(AlMicro)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、三叶因子3(TFF3)、补体因子H、丛生蛋白(CLU)、醛糖还原酶、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、双调蛋白(AR)、巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)、FASLG受体(FAS)、血管内皮生长因子受体1(VEGFR-1)、基质金属蛋白酶1(MMP-1)、单核细胞趋化蛋白2(MCP-2)和血管内皮生长因子B(VEGF-B)。

在本发明的又一些实施方案中，确定并评价了以下生物标志物中的任三种或更多种：HE4、CA-125、IL-2受体α、AAT、CRP、YKL-40、纤连蛋白和CA-72-4。

在本发明的另一些实施方案中，确定并评价了以下生物标志物(任选地包括HE4)的水平，在一些情况下确定年龄：CA-125、CA72-4、VEGF-B、乳腺丝抑蛋白、VEGF-D和YKL-40；CA-125、CA72-4、VEGF-B、乳腺丝抑蛋白、VEGF-D、YKL-40、OSP、年龄和CRP；CA-125、CA72-4、VEGF-B、乳腺丝抑蛋白和OSP；CA-125、CA72-4、VEGF-B、乳腺丝抑蛋白、YKL-40和年龄；CA-125、乳腺丝抑蛋白和年龄；CA-125、CA72-4、VEGF-B、乳腺丝抑蛋白、OSP和年龄；CA-125、VEGF-B和年龄。

在本发明的又一些实施方案中，确定并评价了以下生物标志物(任选地包括HE4)的水平：HE4、癌抗原125(CA-125)、癌抗原72-4(CA-72-4)、癌抗原15-3(CA-15-3)、年龄、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)、白细胞介素-2受体α(IL-2受体α)；HE4、癌抗原125(CA-125)和YKL-40任选地还包括年龄；HE4、癌抗原72-4(CA-72-4)、癌抗原15-3(CA-15-3)、年龄、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)和白细胞介素-2受体α(IL-2受体α)；CA-125、CA-72-4、丝氨酸蛋白酶8(prostasin)、CA-15-3、年龄、IL-2受体α、IL-8，任选地还包括HE4；以及CA-125、CA-72-4、丝氨酸蛋白酶8(prostasin)、CA-15-3、年龄、IL-2受体α、IL-8、FRTN.VEGF、骨桥蛋白、乳腺丝抑蛋白和触珠蛋白，任选地还包括年龄。

更具体地，预测性测试以及相关方法和产品还提供了关于卵巢癌进展分期(即：I期、II期、III期和IV期以及无法容易地分类为III期或IV期的反映出相对晚期肿瘤的晚期)的有用临床信息。总之，本发明还涉及生物流体(优选血清和血浆)中某些标志物组的相对表达水平与对象卵巢癌状态之间新发现的相关性。

在一个实施方案中，本发明提供了试剂集合以测量取自于患者的流体样品(例如血液、血清、血浆、淋巴、脑脊液、腹水或尿)中生物标志物组或集合的表达水平。在另一个实施方案中，所述试剂是包含评价这些生物标志物组表达水平的试剂的多分析物组测定。

在本发明的一些实施方案中，对象的样品由组织样品(例如组织活检)或由原代细胞培养物或培养流体制备。在另一个实施方案中，生物标志物的表达在多肽水平上确定。相关的实施方案将免疫测定、酶联免疫吸附测定和多重免疫测定用于该目的。

优选的生物标志物组选自以下分子及其可测量片段的集合：(a)肌红蛋白、CRP(C反应蛋白)、FGF碱性蛋白和CA19-9；(b)丙型肝炎NS4、核糖体P抗体和CRP；(c)CA19-9、TGFα、EN-RAGE、EGF和HSP90α抗体、(d)EN-RAGE、EGF、CA125、纤维蛋白原、载脂蛋白CIII、EGF、霍乱毒素和CA19-9；(e)蛋白酶3(cANCA)抗体、纤维蛋白原、CA125、EGF、CD40、TSH、瘦素、CA19-9和淋巴细胞趋化因子；(f)CA125、EGFR、CRP、IL-18、载脂蛋白CIII、肌腱蛋白C和载脂蛋白A1；(g)CA125、β2微球蛋白、CRP、铁蛋白、TIMP-1、肌酸激酶MB和IL-8；(h)CA125、EGFR、IL-10、触珠蛋白、CRP、胰岛素、TIMP-1、铁蛋白、α2巨球蛋白、瘦素、IL-8、CTGF、EN-RAGE、淋巴细胞趋化因子、TNF-α、IGF-1、TNF RII、血管性血友病因子和MDC；(i)CA-125、CRP、EGF-R、CA-19-9、Apo-A1、Apo-CIII、IL-6、IL-18、MIP-1a、肌腱蛋白C和肌红蛋白；(j)CA-125、CRP、EGF-R、CA-19-9、Apo-A1、Apo-CIII、IL-6、MIP-1a、肌腱蛋白C和肌红蛋白；和(k)表II和表III中所示生物标志物组中的任意种。

在另一个实施方案中，测量这些生物标志物的试剂可测量在生化过程上游或下游发现的其他分子物质，或者测量这些生物标志物和分子物质的片段。在一些情况下，相同试剂可准确地测量生物标志物及其片段。

本发明的另一个实施方案涉及测量生物标志物及相关分子和片段的结合分子(或结合试剂)。考虑的结合分子包括抗体(单克隆抗体和多克隆抗体)、适配体等。

另一些实施方案包括这样的结合试剂，其以测试试剂盒形式提供，任选地与进行生物标志物评价以预测对象中卵巢癌可能性的书面说明一起。

在其另一些实施方案中，本发明提供了基于检测或测量来自对象的试样或生物样品中前述生物标志物的水平来预测对象中卵巢癌可能性的方法。如本说明书所述，与未患卵巢癌的对照组患者相比，这些生物标志物表达水平(特别是其相对表达水平)的改变是患者中卵巢癌的预示。

在其另一些方面中，预测的卵巢癌类型是浆液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤、粘液性肿瘤和透明细胞肿瘤。并且，预测卵巢癌包括预测疾病的具体分期，例如I期(IA、IB或IC)、II期、III期和IV期肿瘤。

在又一些实施方案中，本发明涉及为医师建立生物标志物相对水平的报告和通过邮寄、传真、邮箱等传输这样的报告。在一个实施方案中，通过互联网传输包含生物标志物评价的报告的数据流。在另一个实施方案中，所述报告包括关于对象中卵巢癌存在与否或对象卵巢癌的等级化风险(任选地通过癌症的亚型或分期)的预测。

根据本发明的另一个方面，出于诊断目的将生物标志物表达水平的前述评价与其他诊断程序进行组合，所述其他诊断程序例如胃肠道评价、胸部x射线、HE4测试、CA-125测试、全血计数、超声或腹部/盆腔计算机化断层成像、血液化学特征谱分析(blood chemistry profile)和肝功能测试。

本发明的又一些实施方案涉及评价提取自具有卵巢癌症状或具有卵巢癌高风险的对象的样品。另一些实施方案涉及无卵巢癌症状的对象。具有症状的对象具有以下现象的一种或更多种：盆腔肿块、腹水、腹部膨胀、一般性腹部不适和/或疼痛(气体、消化不良、压力、肿胀、胃气胀、腹部绞痛)、恶心、腹泻、便秘或尿频、食欲不振、甚至少食后的饱腹感、原因不明的体重增加或减轻和阴道异常出血。可将生物标志物的水平与这些症状的发现进行组合用于诊断卵巢癌。

本发明的一些实施方案对于确定卵巢癌存在是高度准确的。“高度准确的”意指灵敏度和特异性各自准确度为至少约85％或更高，更优选至少约90％或92％以及最优选至少约95％或97％。本发明的一些实施方案还包括这样的方法，其灵敏度为至少约85％、90％或95％并且特异性为至少约55％、65％、75％、85％或90％或更高。另一些实施方案包括这样的方法，其特异性为至少约85％、90％或95％并且灵敏度为至少约55％、65％、75％、85％或90％或更高。

与具有卵巢癌症状但是未患卵巢癌的对照组患者相比，本发明的一些实施方案确定了针对具有卵巢癌症状并且患有卵巢癌的对象群体的相关灵敏度和特异性。在另一个实施方案中，与卵巢癌风险增加但是未患卵巢癌的对照组患者相比，确定了针对卵巢癌风险增加并且患有卵巢癌的对象群体灵敏度和特异性。并且在另一个实施方案中，与无卵巢癌症状但是未患卵巢癌的对照组患者相比，确定了针对无卵巢癌症状并且患有卵巢癌的对象群体的灵敏度和特异性。

在另一些方面中，通过采用统计方法评价了生物标志物的水平，例如知识发现引擎(KDE^TM)、回归分析、判别分析、分类树分析、随机森林、

、支持向量机、One R、kNN和启发式朴素贝叶斯分析(heuristic naive Bayes analysis)、神经网络及其变体。

在另一个实施方案中，提供了基于生物标志物表达水平的预测或诊断模型。所述模型可以是软件代码、计算机可读格式的形式或书面说明的形式，用于评价生物标志物的相对表达。

在更广泛的诊断背景下，患者的医师可利用生物标志物评价的报告，来对给定患者患卵巢癌的风险进行相对更全面的评估。在进行这种评估时，医师将考虑患者的临床表现，包括症状例如可疑的盆腔肿块和/或腹水、腹部膨胀和在没有另一种明显的恶性肿瘤来源的情况下的其他症状。有症状患者的一般实验室检查目前包括GI评价(如果临床有指示的话)、胸部x射线、CA-125测试、CBC、超声或腹部/盆腔CT(如果临床有指示的话)、化学特征谱分析以及LFT，并且可包括连同遗传标志物测试(例如BRCA-1和BRCA-2)一起的家族史评价。(一般地参见NCCN ClinicalPractice Guidelines in Oncology^TM for Ovarian Cancer，V.I.2007.)

本发明提供了新的且重要的额外信息来源，其协助医师对患者患卵巢癌的风险进行分级并计划接下来待采取的诊断步骤。本发明类似地还可用于评估无症状高风险患者中的卵巢癌风险，以及对于一般群体用作筛查工具。考虑本发明的方法可被临床医师用作其它预测性和诊断性指示剂的全面评估的一部分。

本发明还提供了评估现有化学治疗剂和候选化学治疗剂以及其他类型癌症治疗的治疗效力的方法。如本领域技术人员将理解的，在治疗之前的患者中取得和在治疗后再次取得或任选地在治疗期间的进展阶段中取得的试样中，如上所述确定了生物标志物组的相对表达水平或生物标志物特征谱。相对于非癌症表达水平特征谱(或相对于更接近于非癌症的表达特征谱)或相对于稳定无变化的相对生物标志物表达水平特征谱，这些生物标志物相对表达的改变被解释为治疗有效。本领域技术人员将容易地理解，这种表达水平特征谱可对于癌症或癌前病症、恶性肿瘤前病症具有诊断意义或者可简单地得到这样的诊断特征谱，原因是生物标志物的相对比较之以往更像与癌症相关特征谱。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于确定患者是否潜在地正在发生癌症的方法。在随时间取自患者的试样中确定生物标志物表达的相对水平，从而将指向癌症特征谱的生物标志物表达特征谱改变解释为朝发生癌症进展。

患者分析一完成就可将样品的生物标志物表达水平以电子形式储存并在将来取回以进行这种比较。

本发明还提供了为卵巢癌提供高度准确测试的方法、软件产品、计算机系统和网络以及相关仪器。

本说明书所述标志物的组合提供了用于在卵巢癌进展不同分期中预测卵巢癌存在或检测卵巢癌的敏感、特异且准确的方法。所述样品的评价也可与患者的恶性肿瘤前或临床前病症的存在具有相关性。因此，考虑所公开方法可用于预测或检测样品中卵巢癌的存在，提取自患者的样品中卵巢癌的不存在，卵巢癌的阶段，卵巢癌的等级，卵巢癌的良性或恶性，卵巢癌的转移可能性，与卵巢癌有关的赘生物的组织学类型，癌症的无痛性或攻击性，以及与预防、诊断、表征和治疗患者卵巢癌有关的卵巢癌的其他特征。

还考虑所公开方法还可用于评估一种或更多种测试剂抑制卵巢癌的效力，评估卵巢癌疗法的效力，监测卵巢癌的进展，选择抑制卵巢癌的药剂或疗法，监测受卵巢癌折磨的患者的治疗，监测患者中卵巢癌的抑制，以及通过评价暴露后测试动物的生物标志物来评估测试化合物的致癌潜力。

附图说明

图1是示出研究对象的人口统计学资料的表格。

图2是示出在研究中测定的生物标志物的表格。

图3是示出前20种标志物之受试者工作特征(ROC)曲线分析的曲线下面积(AUC)值的表格。

图4是列出曲线下面积(AUC)值在统计学上大于0.5而鉴定的信息性生物标志物的列表。

图5是示出对于曲线下面积值大于0.800的9种最有信息性之生物标志物的受试者工作特征曲线的一组图。

图6是示出对于曲线下面积值大于0.800的9种最有信息性之生物标志物，按照国际妇产科联合会(FIGO)卵巢癌分期的血清水平分布的一组图。

图7是示出对于曲线下面积值大于0.800的9种最有信息性之生物标志物，按照卵巢癌分期亚型的血清水平分布的一组图。

图8是曲线下面积值大于0.600的生物标志物的相关性矩阵。

图9是列出聚类A至D中标志物身份的表格。

图10是示出聚类A中标志物的相关性数据的表格。

图11是示出聚类B中标志物的相关性数据的表格。

图12是示出聚类C中标志物的相关性数据的表格。

图13是示出聚类D中标志物的相关性数据的表格。

图14是示出使用九种最有信息性之标志物和OVA1生物标志物的逻辑斯蒂回归模型的重要特异性阈值时灵敏度的表格。

图15是示出使用九种最有信息性之标志物和OVA1生物标志物的逻辑斯蒂回归模型的重要灵敏度阈值时特异性的表格。

图16是示出按绝经状态分类的前20种标志物之受试者工作特征(ROC)曲线分析的曲线下面积(AUC)值的表格。

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域技术人员普遍理解的意思相同。以下参考文献为本领域技术人员提供了用于本发明的多个术语的一般定义：Singleton等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology(第2版.1994)；The CambridgeDictionary of Science and Technology(Walker编，1988)；The Glossary ofGenetics，第5版.，R.Rieger等(编)，Springer Verlag(1991)和Hale &Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。除非另有说明，否则以下术语具有属于它们的意思。

“生物标志物组”指本文所述生物标志物组中的一种。优选的生物标志物组包含CA-125和HE4以及选自下列的一种或更多种生物标志物：白细胞介素-2受体α(IL-2受体α)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、C反应蛋白(CRP)、YKL-40、细胞纤连蛋白(cFib)、癌抗原72-4、丝氨酸蛋白酶8(prostasin)、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)、IL-8、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、IL-6、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)、凝集素样氧化LDL受体1(LOX-1)、神经毡蛋白1、TNFR2和MPIF-1。

“洗脱液”或“洗涤液”指用于影响或改变分析物对亲和试剂之吸附性和/或从试剂中移除未结合物质的试剂，通常是溶液。洗脱液的洗脱特征可取决于例如pH、离子强度、疏水性、离液(chaotropism)程度、洗涤剂强度和温度。

“分析物”指样品中期望检测的任意组分。该术语可指样品中的单个组分或多个组分。

“分子结合伴侣”和“特异性结合伴侣”指表现出特异性结合的分子对，通常是生物分子对。分子结合伴侣包括但不限于，受体与配体、抗体与抗原、生物素与亲和素以及生物素与链霉亲和素。

“监测”指记录连续变化参数的改变。

本发明上下文中的“标志物”指与取自对照对象(例如具有阴性诊断或不可检出癌症的个体、正常或健康对象)的对应样品相比，在取自患有人癌症之患者的样品中差异存在的多肽(具有特别的表观分子量)。术语“生物标志物”与术语“标志物”可互换使用。

术语“测量”意指这样的方法，其包括检测样品中标志物存在与否、对样品中标志物的量进行定量和/或对生物标志物的类型进行定性。测量可通过本领域已知方法和本文进一步描述的那些方法(包括但不限于SELDI和免疫测定)来完成。任何合适的方法可用于检测和测量本文所述标志物的一种或更多种。这些方法包括但不限于质谱分析(例如，激光解吸/离子化质谱分析)、荧光(例如，夹心法免疫测定)、表面等离子体共振、椭圆光度法和原子力显微镜。

短语“差异存在”指与对照对象相比取自患人癌症之患者的样品中存在的标志物的量和/或频率有差异。而且，标志物可以是多肽，与对照对象的样品相比其在人癌症患者的样品中检测为较高频率或较低频率。标志物可以在量、频率或两者上差异存在。

如果一个样品中多肽的量与另一个样品中多肽的量具有统计学显著差异，则多肽在两个样品之间差异存在。例如，如果多肽存在与多肽在另一种样品中存在相比多出至少约120％、至少约130％、至少约150％、至少约180％、至少约200％、至少约300％、至少约500％、至少约700％、至少约900％或至少约1000％，或者如果在一个样品中可检测并且在另一个中检测不到，则多肽在两个样品之间差异存在。

作为替代地或另外，如果卵巢癌患者样品中检测到多肽的频率统计学上显著地高于或低于对照样品，则多肽在两个样品集合之间差异存在。例如，如果在一个样品集合中观察到的频率与另一个样品集合相比高或低至少约120％、至少约130％、至少约150％、至少约180％、至少约200％、至少约300％、至少约500％、至少约700％、至少约900％或至少约1000％，则多肽在两个样品集合之间差异存在。

“诊断”意指鉴定病症(即，卵巢癌)的存在或性质。诊断方法在其灵敏度和特异性上有不同。诊断测定的“灵敏度”是测试为阳性的患病个体的百分比(“真阳性”的百分比)。测定没有检测到的患病个体是“假阴性”。未患病并且在测定中测试为阴性的对象称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”是1减去假阳性率，其中“假阳性”率定义为测试为阳性的没有患病的那些的比例。当一种具体的诊断方法没有提供病症的决定性诊断时，如果所述方法提供了有助于诊断的阳性指示则它也是合格的。

标志物的“测试量”指测试样品中存在的标志物的量。测试量可以是绝对量(例如，μg/ml)或相对量(例如，信号的相对强度)。

标志物的“诊断量”指与卵巢癌诊断相一致的对象样品中标志物的量。诊断量可以是绝对量(例如，μg/ml)或相对量(例如，信号的相对强度)。

标志物的“对照量”可以是与标志物测试量相比的任意量或量范围。例如，标志物的对照量可以是未患卵巢癌的个体中标志物的量。对照量可以是绝对量(例如，μg/ml)或相对量(例如，信号的相对强度)。

“抗体”指基本上由一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽配体，其特异性结合并识别表位(例如，抗原)。已知的免疫球蛋白基因包括κ和λ轻链恒定区基因，α、γ、δ、ε和μ重链恒定区基因，以及多种免疫球蛋白可变区基因。抗体例如作为完整免疫球蛋白或作为通过多种肽酶消化所产生的已被很好表征的多个片段存在。这包括，例如Fab’和F(ab)’₂片段。本文使用的术语“抗体”还包括通过使用重组DNA方法修饰整个抗体或从头合成的那些抗体所产生的抗体片段。它还包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。抗体的“Fc”部分指包含一个或更多个重链恒定区结构域(CH₁、CH₂和CH₃)但不包含重链可变区的免疫球蛋白重链部分。

本文使用的术语“样品”意指可与患者特异性相关并且由其可确定、计算或推测关于患者的具体信息的材料。样品可以由来自患者的生物材料的全部或一部分构成。样品也可以是以允许在提供关于患者之信息的样品上进行测试的方式接触患者的材料。样品还可以是接触不是患者材料的另一种材料但是允许之后测试第一材料以确定关于患者之信息的材料。样品可接触除患者之外的生物材料来源，前提是无论如何本领域技术人员都可由样品确定关于患者的信息。还应理解，不是样品的外来材料或信息可用于最终使患者与样品相关联。对于一个非限制性实例，双盲测试需要图表或数据库以使样品与患者匹配。

本文使用的术语“体液”意指得自于患者并且稠度基本上是流体的材料，但是可以具有与其相关的固体或颗粒物质。体液还可包含不是来自患者的材料或部分。例如，体液可用水稀释，或可包含防腐剂，例如EDTA。体液的非限制性实例血液、血清、浆膜液、血浆、淋巴、尿、脑脊液、唾液、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、乳汁、眼泪和腹水(例如与非实体瘤相关的那些)。另外的实例包括胸膜、心包、腹膜、腹部和其他体腔等的流体。生物流体可还包括与对象或生物来源(例如，细胞和器官培养基，包括细胞或器官条件培养基)相接触的液体溶液、灌洗液(lavage fluid)等。

“安排对象治疗”指临床医师或医师在确定卵巢癌状态后的行为。例如，如果本发明方法的结果不确定或者有必须确定状态的原因，则医师可进行更多的测试。或者，如果状态表明外科手术是适当的，则医师可安排患者进行外科手术。同样地，如果状态是负面的(例如晚期卵巢癌)或如果状态是急性的，则可批准没有进一步的行动。此外，如果结果示出治疗是成功的，则不需要进一步的安排。

术语“分期”或“癌症分期”旨在意指基于患者中癌的大小、侵袭性、进展、转移等的卵巢癌的分类。卵巢癌的分期是明确定义的。I期指其中癌仍局限在卵巢(或两个卵巢)中的卵巢癌。具体地，IA期癌症在一个卵巢中形成，并且肿瘤限制在卵巢内侧。在卵巢外表面上没有癌。实验室检查来自腹部和盆腔的洗涤液没有发现任何癌细胞。IB期癌症已在两个卵巢中形成而在其外表面上没有任何肿瘤。实验室检查来自腹部和盆腔的洗涤液没有发现任何癌细胞。IC期癌症存在于一个或两个卵巢中，并且存在以下现象之一或更多个：至少一个卵巢外表面上存在癌；在囊性肿瘤(充满流体的肿瘤)的情况下，囊(肿瘤的外壁)已破裂(爆炸)；或实验室检查在来自腹部的流体或洗涤液中发现癌细胞。

II期癌症在一个或两个卵巢中并且涉及了盆腔中的其他器官(例如子宫、输卵管、膀胱、乙状结肠或直肠)。具体地，IIA期癌症已扩散至或实际上已入侵子宫或输卵管或两者。实验室检查来自腹部的流体没有发现任何癌细胞。IIB期癌症已扩散至其他附近的盆腔器官，例如膀胱、乙状结肠或直肠。实验检查来自腹部的流体没有发现任何癌细胞。IIC期癌症已扩散至如IIA和IIB期的盆腔器官，并且实验室检查来自腹部的洗涤液发现了癌细胞的证据。

III期癌症涉及1个或两个卵巢，并且存在以下现象的一种或两种：(1)癌症已扩散到盆腔之外到达腹部衬里；(2)癌症已扩散至淋巴结。如果在分期手术中，外科医师可看见涉及一个卵巢或两个卵巢的癌症，但是在腹部没有明显看到癌(可在不使用显微镜的情况下看见)并且癌症没有扩散至淋巴结，则癌症是IIIA期。然而，当在显微镜下进行活检检查时，在上腹部的衬里中发现了癌症的微小沉积。IIIB期癌症在一个或两个卵巢中，并且在腹部存在癌症的沉积物，其大到足以被外科医师看见，但是横向小于2cm(约3/4英寸)。癌症未扩散至淋巴结。对于IIIC期的癌症，癌症在一个或两个卵巢中，并且存在以下现象的一个或两个：癌症已扩散至淋巴结和/或在腹部看见横向大于2cm(约3/4英寸)的癌症沉积物。

IV期癌症是卵巢癌的最晚期。癌症在一个或两个卵巢中。已发生了远距离转移(癌症扩散至肝脏、肺、或位于腹膜腔外的其他器官内)。在胸膜液(来自肺周围的腔)中发现卵巢癌细胞也是IV期疾病的证据。

本文使用的术语“复发性卵巢癌”旨在意指在治疗完成后疾病恢复原状(复发)。

生物标志物

“CA-125’’意指与NCBI登录号NP_078966.2或AAL65133具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。CA-125的示例性序列是：

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14461 agllgvitcl icgvlvttrr rkkegeynvq qqcpgyyqsh ldledlq

“HE4”意指与NCBI登录号AA052683或CAA44869具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。HE4的示例性序列是：

1 mpacrlgpla aalllslllf gftlvsgtga ektgvcpelq adqnctqecvsdsecadnlk

61 ccsagcatfc slpndkegsc pqvninfpql glcrdqcqvd sqcpgqmkccrngcgkvscv

121 tpnf

“IL-2受体α(IL-2Rα)”意指与NCBI登录号CAK26553或NP_000408具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。IL-2Rα的示例性序列是：

1 mdsyllmwgl ltfimvpgcq aelcdddppe iphatfkama ykegtmlnceckrgfrriks

61 gslymlctgn sshsswdnqc qctssatrnt tkqvtpqpee qkerkttemqspmqpvdqas

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241 vavagcvfll isvlllsglt wqrrqrksrr ti

“α-1-抗胰蛋白酶(AAT)”意指与NCBI登录号AAB59495或CAJ15161具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。ATT的示例性序列是：

1 mpssvswgil llaglcclvp vslaedpqgd aaqktdtshh dqdhptfnkitpnlaefafs

61 lyrqlahqsn stniffspvs iatafamlsl gtkadthdei leglnfnlteipeaqihegf

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301 enedrrsasl hlpklsitgt ydlksvlgql gitkvfsnga dlsgvteeaplklskavhka

361 vltidekgte aagamfleai pmsippevkf nkpfvflmie qntksplfmgkvvnptqk

“C反应蛋白(CRP)”意指与NCBI登录号CAA39671或P02741具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。CRP的示例性序列是：

1 mekllcflvl tslshafgqt dmsrkafvfp kesdtsyvsl kapltkplkaftvclhfyte

61 lsstrgtvfs rmpprdktmr ffifwskdig ysftvggsei lfevpevtvapvhictswes

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181 dfvlspdein tiylggpfsp nvlnwralky evqgevftkp qlwp

“YKL-40”也称为“几丁质酶3样蛋白”，意指与NCBI登录号P36222或NP_001267具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。YKL-40的示例性序列是：

1 mgvkasqtgf vvlvllqccs ayklvcyyts wsqyregdgs cfpdaldrflcthiiysfan

61 isndhidtwe wndvtlygml ntlknrnpnl ktllsvggwn fgsqrfskiasntqsrrtfi

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301 dflrgatvhr ilgqqvpyat kgnqwvgydd qesvkskvqy lkdrqlagamvwaldlddfq

361 gsfcgqdlrf pltnaikdal aat

“细胞纤连蛋白(cFib)”意指与NCBI登录号P02751具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。cFib的示例性序列是：

1 mlrgpgpgll llavqclgta vpstgasksk rqaqqmvqpq spvavsqskpgcydngkhyq

61 inqqwertyl gnalvctcyg gsrgfncesk peaeetcfdk ytgntyrvgdtyerpkdsmi

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361 vlpftyngrt fyscttegrq dghlwcstts nyeqdqkysf ctdhtvlvqtrggnsngalc

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“癌抗原72-4(CA-72-4)”，也称为“TAG-72”，意指由单克隆抗体B72.3识别的糖蛋白生物标志物。

“丝氨酸蛋白酶8(prostasin)”意指与NCBI登录号AAB19071或AAC41759具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。丝氨酸蛋白酶8(prostasin)的示例性序列是：

1 maqkgvlgpg qlgavailly lgllrsgtga egaeapcgva pqaritggssavagqwpwqv

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“金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)”意指与NCBI登录号NP_003245或P01033具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。TIMP-1的示例性序列是：

1 mapfeplasg illllwliap sractcvpph pqtafcnsdl virakfvgtpevnqttlyqr

61 yeikmtkmyk gfqalgdaad irfvytpame svcgyfhrsh nrseefliagklqdgllhit

121 tcsfvapwns lslaqrrgft ktytvgceec tvfpclsipc klqsgthclwtdqllqgsek

181 gfqsrhlacl prepglctwq slrsqia

“白细胞介素8(IL-8)”意指与NCBI登录号P10145或AAHl3615具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。IL-8的示例性序列是：

1 mtsklavall aaflisaalc egavlprsak elrcqcikty skpfhpkfikelrviesgph

61 canteiivkl sdgrelcldp kenwvqrvve kflkraens

“基质金属蛋白酶7(MMP-7)”意指与NCBI登录号P09237或NP_002414具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。MMP-7的示例性序列是：

1 mrltvlcavc llpgslalpl pqeaggmsel qweqaqdylk rfylydsetknansleaklk

61 emqkffglpi tgmlnsrvie imqkprcgvp dvaeyslfpn spkwtskvvtyrivsytrdl

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181 apgtglggda hfdederwtd gsslginfly aathelghsl gmghssdpnavmyptygngd

241 pqnfklsqdd ikgiqklygk rsnsrkk

“白细胞介素6(IL-6)”意指与NCBI登录号P05231、NP_000591或AAHl5511具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。IL-6的示例性序列是：

1 mnsfstsafg pvafslglll vlpaafpapv ppgedskdva aphrqpltsseridkqiryi

61 ldgisalrke tcnksnmces skealaennl nlpkmaekdg cfqsgfneetclvkiitgll

121 efevyleylq nrfesseeqa ravqmstkvl iqflqkkakn ldaittpdpttnaslltklq

181 aqnqwlqdmt thlilrsfke flqsslralr qm

“血管内皮生长因子B(VEGF-B)”意指与NCBI登录号P49765、AAC50721或AAB06274具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。VEGF．B的示例性序列是：

1 mspllrrlll aallqlapaq apvsqpdapg hqrkvvswid vytratcqprevvvpltVel

61 mgtvakqlvp scvtvqrcgg ccpddglecv ptgqhqvrmq ilmirypssqlgemsleehs

121 qcecrpkkkd savkpdraat phhrpqprsv pgwdsapgap spadithptpapgpsahaap

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“钙防卫蛋白”意指与NCBI登录号AAB33355、AAB25118或P06702具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。钙防卫蛋白的示例性序列是：

1 mtckmsqler nietiintfh qysvklghpd tlnqgefkel vrkdlqnflkkenknekvie

61 himedldtna dkqlsfeefi mlmarltwas hekmhegdeg pghhhkpglg egtp

“胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)”意指与NCBI登录号AAA03246或AAA36048具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。IGFBP-2的示例性序列是：

1 mlprvgcpal plppppllpl lpllllllga sgggggarae vlfrcppctperlaacgppp

61 vappaavaav aggarmpcae lvrepgcgcc svcarlegea cgvytprcgqglrcyphpgs

121 elplqalvmg egtcekrrda eygaspeqva dngddhsegg lvenhvdstmnmlggggsag

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241 istmrlpder gplehlyslh ipncdkhgly nlkqckmsln gqrgecwcvnpntgkliqga

301 ptirgdpech lfyneqqear gvhtqrmq

“凝集素样氧化LDL受体1(LOX-1)”意指与NCBI登录号P78380或NP_002534具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。LOX-1的示例性序列是：

1 mtfddlkiqt vkdqpdeksn gkkakglqfl yspwwclaaa tlgvlclglvvtimvlgmql

61 sqvsdlltqe qanlthqkkk legqisarqq aeeasqesen elkemietlarklnekskeq

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241 gtcayiqrga vyaencilaa fsicqkkanl raq

“神经毡蛋白1”意指与NCBI登录号AAP80144、AAP78927、AAG41895或ABY87548具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。神经毡蛋白1的示例性序列是：

1 merglpllca vlalvlapag afrndkcgdt ikiespgylt spgyphsyhpsekcewliqa

61 pdpyqrimin fnphfdledr dckydyvevf dgenenghfr gkfcgkiapppvvssgpflf

121 ikfvsdyeth gagfsiryei fkrgpecsqn yttpsgviks pgfpekypnslectyivfap

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“TNFR2”意指与NCBI登录号P20333或NP_001057具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。TNFR2的示例性序列是：

1 mapvavwaal avglelwaaa halpaqvaft pyapepgstc rlreyydqtaqmccskcspg

61 qhakvfctkt sdtvcdsced stytqlwnwv peclscgsrc ssdqvetqactreqnrictc

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361 arastgssds spgghgtqvn vtcivnvcss sdhssqcssq asstmgdtdsspsespkdeq

421 vpfskeecaf rsqletpetl lgsteekplp lgvpdagmkp s

“MPIF-1”意指与NCBI登录号AABSll34或P55773具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。MPIF-1的示例性序列是：

1 mkvsvaalsc lmlvtalgsq arvtkdaete fmmsklplen pvlldrfhatsadccisytp

61 rsipcslles yfetnsecsk pgvifltkkg rrfcanpsdk qvqvcmrmlkldtriktrkn

发明详述

通过分析人血清中多种分子物质的分析物水平来鉴定生物标志物组及相关方法和产品，所述人血清抽取自患有不同分期和亚型卵巢癌的对象，患有非癌症妇科疾病的对象和正常对象。以下描述的免疫测定由我们在Rules-Based Medicine of Austin，TX的同行使用他们的多分析物特征谱分析(Multi-Analyte Profile，MAP)

平台进行。

当优选样品是血清时，考虑适当样品可源自任何生物来源或样品，例如组织、提取物、细胞培养物(包括细胞(例如肿瘤细胞)、细胞裂解物)和生理流体(例如全血、血浆、血清、唾液、乳管灌洗液、晶状体流体、脑脊液、汗、尿、乳汁、腹水、滑液、腹膜液等)。所述样品可得自于动物，优选哺乳动物，更优选灵长目动物，并且最优选人，其使用的物种特异性结合剂与以下人样品分析环境中讨论的那些相同。还考虑这些技术和标志物组可用于评价啮齿动物和其他动物(包括转基因动物)中的药物疗法，其与人体治疗学和兽医治疗学开发有关。

所述样品可在使用前通过常规技术进行处理，例如由血液制备血浆，稀释粘性流体等。样品处理的方法可包括过滤、蒸馏、萃取、浓缩、使干扰组分失活、添加离液剂、添加试剂等。可分离核酸(包括沉默RNA、调节RNA和干扰RNA)并且对于以下描述的分析物其表达水平也用于本发明的方法。

样品和分析平台

分析以产生以下所讨论的大部分数据的血清样品集合包括150个卵巢癌样品和150个非卵巢癌样品。所述卵巢癌样品进一步包括以下上皮性卵巢癌亚型：浆液性(64)、透明细胞(22)、子宫内膜样(35)、粘液性(15)、混合性(即由多于一种亚型组成)(14)。所述卵巢癌样品分期的分布为：I期(41)、II期(23)、III期(68)、IV期(12)和未知分期(6)。

所述非卵巢癌样品集合包括以下卵巢病症：良性(104)、正常卵巢(29)和“低恶性潜能/交界性(3)。所述样品集合还包括来自患其他癌症：宫颈癌(7)、子宫内膜癌(6)和子宫癌(1)的患者的血清。

本发明生物标志物抗原多肽特异性的抗体容易作为单克隆抗体或多克隆抗血清产生，或者可以作为使用本领域公知方法设计成具有期望性质的基因工程改造免疫球蛋白(Ig)产生。例如，通过举例说明但不限于此，抗体可包括重组IgG，具有免疫球蛋白源序列或“人源化”抗体的嵌合融合蛋白(参见例如美国专利No.5,693,762；5,585,089；4,816,567；5,225,539；5,530,101；以及其中所引用的参考文献)，其全部可用于根据本文所述方法检测人生物标志物多肽。这样的抗体可如本文提供的进行制备，包括通过用以下所述的生物标志物多肽进行免疫。例如，如本文所提供的，公开了编码生物标志物的核酸序列，使得本领域技术人员可常规地制备这些多肽用作免疫原。

术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、其片段(例如F(ab′)₂和Fab片段)、以及天然结合伴侣或重组产生的结合伴侣，它们是特异性结合生物标志物多肽的分子。如果抗体结合HE4a多肽的K_a大于或等于约10^-4M，优选大于或等于约10^-5M，更优选大于或等于约10，并且更更优选大于或等于约10^-7M，则抗体定义为“免疫特异性”或特异性结合。使用常规技术可容易地确定结合伴侣^-6M或抗体的亲和力，例如Scatchard等，Ann.N.Y.Acad.Sci.51：660(1949)所描述的那些技术。可使用用于鉴定和得到与其他蛋白质或多肽特异性相互作用之蛋白质的多种已知方法中任意种(例如酵母双杂交筛选系统，例如美国专利No.5,283,173和美国专利No.5,468,614等中描述的系统)来确定作为生物标志物多肽之结合伴侣的其他蛋白质。本文所述方法还包括使用生物标志物多肽和基于生物标志物多肽氨基酸序列的肽来制备与生物标志物多肽特异性结合的结合伴侣和抗体。

抗体一般可通过本领域普通技术人员已知的多种技术中的任意种来制备(参见例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，1988)。在一种这样的技术中，首先将包含生物标志物多肽的免疫原(例如在其表面具有生物标志物多肽的细胞或分离的生物标志物多肽)注射到合适动物(例如，小鼠、大鼠、兔子、绵羊和山羊)中，优选地根据预定计划表加入一次或更多次加强免疫；并且对动物进行定期取血。然后可通过例如使用与合适固体支持物偶联之多肽的亲和色谱从抗血清中纯化特异于生物标志物多肽的多克隆抗体。

可制备特异于生物标志物多肽的单克隆抗体或其变体，例如使用Kohle和Milstein(1976Eur. J.Immunol.6：511-519)的技术并对其进行改进。简言之，这些方法包括制备能够产生具有期望特异性(即，与目的间皮素多肽具有反应性)之抗体的永生化细胞系。这些细胞系可例如由得自于如上所述进行免疫的动物的脾细胞产生。然后脾细胞通过例如与骨髓瘤细胞融合伴侣(优选与免疫动物同基因的一种)融合进行永生化。例如，可使用膜融合促进剂(例如聚乙二醇)或非离子洗涤剂使脾细胞与骨髓瘤细胞结合几分钟，然后以低密度铺板到支持杂交细胞而不支持骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上。优选的选择技术使用HAT(次黄嘌呤、氨蝶呤、胸苷)选择。在足够的时间(通常约1至2周)后，观察杂交体的集落。选择单个集落并测试其针对多肽的结合活性。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤。本文所述方法考虑产生与生物标志物多肽特异性结合之单克隆抗体的杂交瘤。

可从生长中的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。此外，可采用多种技术来增加产率，例如将杂交瘤细胞系注入合适脊椎动物宿主(例如小鼠或其他合适宿主)的腹腔内。然后可从腹水或血液中收获单克隆抗体。污染物可通过常规技术从抗体中移除，例如色谱、凝胶过滤、沉淀和萃取。例如，抗体可使用标准技术在固定的蛋白G或蛋白A上通过色谱进行纯化。

在某些实施方案中，可优选使用抗体的抗原结合片段。这样的片段包括Fab片段，其可使用标准技术(例如，通过用木瓜蛋白酶消化产生Fab和Fc片段)进行制备。Fab与Fc片段可使用标准技术通过亲和色谱(例如，在固定的蛋白A柱上)进行分离。这样的技术为本领域所公知，参见例如Weir，D.M.，Handbook of Experimental Immunology，1986，Blackwell Scientific，Boston。

对预先选择的抗原具有特异性结合亲和力的多功能融合蛋白在本领域是已知的，其依赖于由与编码多种效应蛋白之序列在框内连接之DNA序列编码的免疫球蛋白V区结构域，例如，如EP-B1-0318554、美国专利No.5,132,405、美国专利No.5,091,513和美国专利No.5,476,786所公开的。这样的效应蛋白包括可用于通过本领域技术人员所熟知的多种技术中任意种来检测融合蛋白结合的多肽结构域，所述技术包括但不限于，生物素模拟序列(参见，例如Luo等，1998J.Biotechnol.65：225及其中引用的参考文献)、用可检测标记部分直接共价修饰、与特异性标记报告分子非共价结合、酶促修饰可检测底物或在固相支持物上固定化(共价或非共价)。

用于本文所述方法的单链抗体可通过方法例如噬菌体展示产生和选择(参见，例如美国专利No.5,223,409；Schlebusch等，1997Hybridoma16：47；及其中引用的参考文献)。简言之，在该方法中，将DNA序列插入到丝状噬菌体(例如M13)的基因III或基因VIII基因中。已开发了具有多克隆位点的多种载体用于插入(McLafferty等，Gene128：29-36,1993；Scott和Smith，Science249：386-390,1990；Smith和Scott，MethodsEnzymol.217：228-257,1993)。所插入的DNA序列可随机产生或者可以是用于与生物标志物多肽结合的已知结合结构域的变体。使用该方法可容易地产生单链抗体。一般来说，插入物编码6至20个氨基酸。由插入序列编码的肽在噬菌体表面上展示。表达用于生物标志物多肽的结合结构域的噬菌体通过与固定化生物标志物多肽(例如，使用本领域公知的方法和本文所公开的核酸编码序列制备的重组多肽)结合来选择。未结合的噬菌体通过洗涤(通常是包含10mM Tris，1mM EDTA，并且不含盐或含低盐浓度)洗涤移除。结合的噬菌体用例如含盐缓冲液洗脱。逐步增加NaCI浓度直至所有的噬菌体被洗脱。通常，以较高亲和力结合的噬菌体将通过较高盐浓度释放。所洗脱的噬菌体在细菌宿主中繁殖。可进行更多轮的选择以选择以高亲和力结合的一些噬菌体。然后确定结合噬菌体中插入物的DNA序列。知道结合肽的预测氨基酸序列后，可通过重组方法或通过合成制备在本文中用作特异于生物标志物多肽之抗体的足够的肽。当抗体作为融合蛋白产生时使用重组方法。肽也可作为串联排列的两条或更多条类似或不类似的肽产生，以使亲和力或结合最大化。

为了检测与生物标志物多肽特异性抗体反应的抗原决定簇，检测剂通常是可如本文所述制备的抗体。对于使用抗体来检测样品中的多肽，本领域普通技术人员知道多种测定形式，包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、免疫荧光测定、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散和其他技术。参见，例如Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；Weir，D.M.，Handbook of Experimental Immunology，1986，Blackwell Scientific，Boston。例如，测定可以以Western印迹形式进行，其中使来自生物样品的蛋白质制备物经过凝胶电泳，转移至合适的膜并使其与抗体反应。然后如本领域公知的和以下描述的，使用合适的检测试剂检测膜上抗体的存在。

在另一个实施方案中，测定包括使用固定在固体支持物上的抗体结合目标生物标志物多肽并且将其从样品的剩余部分中移除。然后可使用与不同的生物标志物多肽抗原决定簇(例如，包含可检测报告部分的试剂)反应的第二抗体来检测结合的生物标志物多肽。或者，可利用竞争性测定，其中用可检测报告部分标记生物标志物多肽，并且在将固定化抗体与样品孵育之后允许其与固定化生物标志物多肽特异性抗体结合。样品中组分抑制标记多肽与抗体结合的程度指示了样品与固定化抗体之反应性，并因此指示了样品中生物标志物多肽的水平。

固体支持物可以是本领域普通技术人员已知的可与抗体连接的任何材料，例如微滴定板中的测试孔、硝化纤维素滤膜或其他合适的膜。或者，所述固体支持物可以是珠或盘，例如玻璃、纤维玻璃、乳胶或塑料(例如聚苯乙烯或聚氯乙烯)。抗体可使用本领域技术人员已知的多种技术(在专利和科学文献中详尽描述)固定在固体支持物中。

在某些优选实施方案中，用于检测样品中生物标志物抗原多肽的测定是双抗体夹心法测定(two-antibody sandwich assay)。该测定可通过以下方法进行：首先使已固定在固体支持物(通常是微滴定板的孔)上的生物标志物多肽特异性抗体与生物样品相接触，使得样品中天然的且具有与抗体反应之抗原决定簇的可溶性分子与固定化抗体结合(例如，在室温下30分钟的孵育时间一般是足够的)以形成抗原-抗体复合物或免疫复合物。然后将样品中的未结合成分从固定化免疫复合物中移除。接着，添加对生物标志物抗原多肽具有特异性的第二抗体，其中第二抗体的抗原结合位点不竞争性抑制固定化第一抗体的抗原结合位点与生物标志物多肽结合。可如本文提供的对第二抗体进行可检测标记，使得其可被直接检测。或者，第二抗体可通过使用可检测标记次级(或“二期”)抗-抗体，或者通过使用本文提供的特异性检测试剂进行间接检测。本文所述方法不限于任何具体的检测方法，原因是熟悉免疫测定的那些人应理解，在双抗体夹心法免疫测定中有许多用于免疫检测具体抗原(例如，间皮素多肽)的试剂和配置。

在使用上述双抗体夹心法测定的本文所述方法的某些实施方案中，对生物质抗原多肽具有特异性的第一固定化抗体是多克隆抗体，并且对生物标志物抗原多肽具有特异性的第二抗体是多克隆抗体。可通过本文所述方法使用非竞争性生物标志物抗体的任意组合。包括单克隆抗体、多克隆抗体及其组合。在本文所述方法的另一些实施方案中，对生物标志物抗原多肽具有特异性的第一固定化抗体是单克隆抗体，并且对生物标志物抗原多肽具有特异性的第二抗体是多克隆抗体。在本文所述方法的又一些实施方案中，对生物标志物抗原多肽具有特异性的第一固定化抗体是多克隆抗体，并且对生物标志物抗原多肽具有特异性的第二抗体是单克隆抗体。在本文所述方法的另一些高度优选的实施方案中，对生物标志物抗原多肽具有特异性的第一固定化抗体是单克隆抗体，并且对生物标志物抗原多肽具有特异性的第二抗体是单克隆抗体。在本文所述方法的另一些优选实施方案中，对生物标志物抗原多肽具有特异性的第一固定化抗体和/或对生物标志物抗原多肽具有特异性的第二抗体可以是本领域已知和本文所提及的抗体种类中的任一种，例如，通过举例说明而并非限制，Fab片段、F(ab′)₂片段、免疫球蛋白V区融合蛋白或单链抗体。本领域技术人员应理解，本文所述方法包括将其他抗体形式、片段、衍生物等用于本文所述并要求保护的方法。

在某些特别优选的实施方案中，所述第二抗体可包含可检测的报告部分或标记，例如酶、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团或生物素等。根据本文所述方法可使用任何报告部分或标记，只要其信号与洗涤后支持物上剩余的抗体量直接相关或成比例。然后使用适用于特定可检测报告部分或标记的方法确定仍然与固体支持物结合的第二抗体的量。对于放射性基团，闪烁计数或自动射线照相法一般是适当的，可使用多种偶联技术来制备抗体-酶缀合物(参见例如Scouten，W.H.，Methods in Enzymology135：30-65，1987以供参考)。光谱法可用于检测染料(包括例如酶反应的比色产品)、发光基团和荧光基团。生物素可使用与不同报告基团(通常是放射性基团或荧光基团或酶)偶联的亲和素或链霉亲和素来检测。酶报告基团一般可通过添加底物(一般维持特定时间段)，然后通过反应产物的光谱分析、光谱光度分析或其他分析来检测。使用公知技术，标准品和标准品添加可用于确定样品中抗原的水平。

在另一个实施方案中，本文所述方法包括使用本文所提供的生物标志物抗原多肽通过检测来自生物来源或对象的生物样品中免疫特异性反应抗体来筛选恶性病症的存在。根据这个实施方案，对生物标志物抗原多肽(或其片段或变体，包括本文所提供的截短的生物标志物抗原多肽)进行可检测标记并使其与生物样品相接触，以检测样品中与生物标志物抗原多肽结合的天然可溶形式的抗体。例如，生物标志物抗原多肽可根据公知方法通过使用本文所公开的序列经生物合成进行标记，所述公知方法例如在体外翻译期间合并可容易检测的(例如，放射性标记)氨基酸，或者通过使用其他可检测报告部分(例如，以上所述的那些)。不希望受理论束缚，本文所述方法的这个实施方案考虑某些生物标志物多肽(例如，本文所公开的生物标志物融合多肽)可提供具有特定免疫原性并因此产生特异性的可检测抗体的肽。例如，根据该理论，某些生物标志物融合多肽可表现为引起急性免疫应答的“非自体”抗原，而缺少融合结合域的生物标志物多肽可被免疫系统识别为更多组装的“自体”抗原，其不容易引起体液介导免疫或细胞介导免疫。

本说明书中所讨论的样品中的分析物水平使用高通量多分析物免疫测定平台进行测量。优选的平台是由Austin，TX的Rules-Based Medicine，Inc.开发的

系统。其在公司网站上并且也在例如公开(例如2007年1月4日公开的Chandler等，“Methods and kits for the diagnosis ofacute coronary syndrome，美国专利申请2007/0003981；和2005年10月6日公开的Spain等的相关申请，“Universal Shotgun Assay，”美国专利申请2005/0221363)中进行了描述。该平台之前在Lokshin(2007)中进行了描述并且所产生的数据被用于卵巢癌生物标志物的其他分析中。然而，可使用任何免疫测定平台或系统。

简言之，为了描述优选的分析物测量系统，MAP平台包括有内部用两种光谱不同的荧光团染色的聚苯乙烯微球。通过使用精确比例的荧光团，产生了由具有特异性光谱位置的100组不同微球集合组成的阵列。每个微球集合可展示不同表面反应物。因为微球集合可通过其光谱位置进行区分，所以可将它们进行组合，从而允许在单一反应容器中同时测量多至100种不同分析物。与报告分子偶联的第三荧光团对在微球表面发生的生物分子相互作用进行定量。随着微球在

分析器中经过两个单独的激光器时，它们在快速流动流体流中被各个进行询问。高速数字信号处理基于微球的光谱位置对其进行分类并以数秒/样品为单位定量表面上的反应。

在另一个实施方案中，免疫测定可用于检测并分析样品中的标志物。所述方法包括：(a)提供与标志物特异性结合的抗体；(b)使样品与所述抗体相接触；以及(c)检测所述样品中所述抗体与所述标志物结合的复合物的存在。

免疫测定是使用抗体来特异性结合抗原(例如，标志物)的测定。免疫测定的特征在于使用特定抗体的特异性结合性质来分离、靶向和/或定量抗原。短语与抗体“特异性(或选择性)结合”或“与......特异性(或选择性)免疫反应”在涉及蛋白质或肽时指确定在蛋白质和其他生物制剂的异源群体中蛋白质存在的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，所指定的抗体与特定蛋白质结合是背景的至少两倍并且与样品中的其他蛋白质基本上不以显著地量结合。在这种条件下与抗体的特异性结合可需要出于其对特定蛋白质特异性而被选择的抗体。例如，可选择针对来自特定物种(例如大鼠、小鼠或人)的标志物的多克隆抗体以仅得到与所述标志物进行特异性免疫反应而不与其他蛋白质(除所述标志物的多态性变体和等位基因之外)进行特异性免疫反应的那些多克隆抗体。该选择可通过减去与来自其他物种的标志物分子交叉反应的抗体来实现。

使用纯化的标志物或其核酸序列，可利用本领域已知的任何合适方法制备与标志物特异性结合的抗体。参见，例如Coligan，Current Protocols inImmunology(1991)；Harlow&Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(1988)；Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(第2版，1986)和Kohler&Milstein，Nature256：495-497(1975)。这样的技术包括但不限于，通过从噬茵体或类似载体的重组抗体文库中选择抗体的抗体制备，以及通过对兔子或小鼠进行免疫的多克隆抗体和单克隆抗体制备(参见，例如Huse等，Science246：1275-1281(1989)；Ward等，Nature341：544-546(1989))。通常，特异性或选择性反应是背景信号或噪音的至少两倍，并且更通常是背景的多于10倍至100倍。

一般来说，可将得自于对象的样品可与特异性结合标志物的抗体相接触。任选地，在使抗体与样品相接触之前，可将抗体固定于固体支持物以有助于复合物的洗涤和后续分离。固体支持物的实例包括玻璃或塑料，例如微滴定板、棍、珠子或微珠的形式。抗体也可与探针底物或以上所述的

阵列连接。样品优选是取自对象的生物流体样品。生物流体样品的实例包括血液、血清、血浆、乳头溢液、尿、眼泪、唾液等。在一个优选实施方案中，生物流体包括血清。在使样品与抗体相接触之前可使用合适洗脱剂稀释样品。

在将样品与抗体孵育之后，洗涤混合物，可检测所形成的抗体-标志物复合物。这可通过将经洗涤的混合物与检测试剂一起孵育来完成。该检测试剂可以是，例如标记有可检测标记的第二抗体。示例性可检测标记包括磁珠(例如DYNABEADS^TM)、荧光染料、放射性标记、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和常用于ELISA的其他酶)和比色标记(例如胶体金或有色玻璃或塑料珠)。或者，样品中的标志物可使用间接测定进行检测，其中，例如，使用第二标记抗体检测结合的标志物特异性抗体，和/或在竞争性测定或抑制测定中进行检测，其中，例如将与标志物不同表位结合的单克隆抗体与混合物同时孵育。

用于测量抗体-标志物复合物的量或其存在的方法包括例如检测荧光、发光、化学发光、吸光度、反射比、透光率、双折射或折射率(例如，表面等离子体共振、椭圆光度法、共振镜面法、光栅耦合器波导法或干涉法)。光学方法包括显微镜检查(共聚焦和非共聚焦)、成像法和非成像法。电化学方法包括伏安法和电流分析法。射频法包括多极共振波谱法。用于进行这些测定的方法在本领域中是容易知道的。有用的测定包括例如酶免疫测定(EIA)，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、Western印迹测定或狭缝印记测定(slot blot assay)。这些方法在例如Methods in Cell Biology：Antibodies in Cell Biology，第37卷(Asai编.1993)；Basic and Clinical Immunology(Stites&Terr编，第7版.1991)和Harlow&Lan(见上文)中也进行了描述。

在整个测定中，在试剂每次组合后可需要孵育和/或洗涤步骤。孵育步骤可以为约5秒至几小时，优选约5分钟至约24小时不等。然而，孵育时间取决于测定形式、标志物、溶液体积、浓度等。通常测定在环境温度下进行，但是它们可在一定范围的温度中(例如10℃至40℃)进行。

免疫测定可用于确定样品中标志物存在与否以及样品中标志物的量。抗体-标志物复合物的量可通过与标准品相比来确定。标准品可以是例如已知化合物或样品中已知存在另一种蛋白质。如以上提到的，标志物的测试量不需要以绝对单位测量，只要测量单位可与对照进行比较即可。

用于检测样品中这些标志物的方法有许多应用。例如，可测量一种或更多种标志物以有助于人癌症诊断或预后。在另一个实例中，用于检测标志物的方法可用于监测对象对癌症治疗的响应。在另一个实例中，用于检测标志物的方法可用于测定和鉴定在体内或体外调节这些标志物表达的化合物。在一个优选实例中，所述生物标志物用于区分肿瘤进展的不同分期，从而有助于确定适当的治疗和肿瘤转移的程度。

测量生物标志物的另一种方法包括使用在珠子上合成的组合配体文库，如2008年7月28日提交的标题为“Methods for Reducing the range inConcentrations of Analyte Species in a Sample”的USSN：11/495,842(其通过引用并入本文)所述。

本领域技术人员认识到，各种各样的分析技术可用于确定样品中如本说明书所述和要求保护的生物标志物的水平。本领域技术人员可用的另一些类型的结合试剂可用于测量样品中指定分析物的水平。例如，在科学文献中可容易地确定适合于评价给定分析物水平的多种结合剂或结合试剂。一般来说，适当的结合剂与分析物特异性结合，换言之，它以可检测水平与分析物反应但是不与其他或无关分析物可检测地反应(或以有限交叉反应性反应)。考虑适当的结合剂包括多克隆抗体和单克隆抗体、适配体、RNA分子等。光谱测定法还可用于测量分析物的水平，包括免疫荧光、质谱分析、核磁共振和光学光谱法。根据使用的结合剂，如本领域技术人员所已知的，样品在分析之前可例如通过稀释、纯化、变性、消化、片段化等进行加工。另外，也可确定例如肿瘤细胞或淋巴细胞中的基因表达。

还考虑所鉴定的生物标志物可具有用于免疫测定的多个表位和/或用于其他类型结合剂的结合位点。因此，考虑所鉴定生物标志物的肽片段或其他表位，特异性蛋白质的同工型(isoform)，乃至生物过程上游或下游的化合物或已进行翻译后修饰的化合物可替代所鉴定的分析物或生物标志物，只要适当地将相关和相对的化学计量考虑在内即可。本领域技术人员认识到，替代的抗体和结合剂可用于确定任何特定分析物的水平，只要将其特异性和结合亲和力作为因素考虑到分析中。

多种算法可用于测量或确定用于本发明方法和测试试剂盒的分析物或生物标志物的表达水平。一般考虑这样的算法能够在简单截止值测量之外测量分析物水平。因此，考虑这种算法的结果一般被美国食品和药物管理局归类为多元指数分析。算法的具体类型包括：知识发现引擎(KDE^TM)、回归分析、判别分析、分类树分析、随机森林、

支持向量机、One R、kNN和启发式朴素贝叶斯分析、神经网络及其变体。

虽然有许多非常复杂的算法来计算未知样品是癌症的可能性，但是基于测量几种标志物(优选少于约5种)的简单逻辑斯蒂回归模型对于诊断模型的效果通常很好。其理论为本领域技术人员所公知。还有许多选择，关于其可使用软件——商业和免费(和开放资源)软件包。

逻辑斯蒂模型的训练由以下组成：将样本分成病例和对照，然后使用所选择的软件来优化回归系数，对于每种标志物有一个回归系数，加上一个偏差参数，使得逻辑斯蒂模型用于训练数据的似然性最大化。

训练后，回归系数集合就限定了逻辑斯蒂模型。通过将生物标志物的水平放入逻辑斯蒂方程中，本领域技术人员可容易地使用这种类型的诊断模型来预测任何新样品鉴定为病例或对照的可能性。此外，当计算的可能性的截止值在0至1变化时，也可通过计算灵敏度和特异性来构建ROC。使用逻辑斯蒂回归计算可能性包括以下步骤：1)测量生物标志物的水平：

对于每种生物标志物，测量并记录其水平。作为实施者的指导，以下讨论假设使用N种生物标志物，并且其指定的测量值为x₁、x₂....x_n-

2)计算‘z’值

在逻辑斯蒂回归模型中计算的中心量是‘z’参数。其定义如下，

z＝β₀+β₁x₁+β₂x₂+....+β_n x_n。方程1(1)。

参数β0称为偏差或截距，而β₁，β₂，....β_n称为权数。指定β_s限定逻辑斯蒂回归模型。通常，训练过程确定了β_s，在其中通过改变β_s将状态已知(“疾病”或“良性”)的样品用于优化似然函数。一旦完成训练过程之后，则选择β_s的值以产生正确确定的最优似然性(likelihood)。

对于具有测量生物标志物水平：x₁、x₂....x_n和β_s预定集合的未知样品，本领域技术人员可根据方程(1)计算z值。

3)计算逻辑斯蒂函数的值：

逻辑斯蒂函数f(z)定义为

f(z)＝e^z/(e^z+1) 方程(2)

给定2)中计算的z值，可根据方程(2)评价f(z)。在一些应用中，使用z的自然对数代替方程(2)中的z。

4)做出诊断决定：

对于任意z值，逻辑斯蒂函数产生了在(0.0至1.0)的值。在一个典型应用中，0.5的截止用于区分对照与病例。因此，得分＞0.5的样品称为病例，而得分＜＝0.5的样品称为对照。在诊断过程的一些应用中，使用另一些截止值(例如，0.65)。

实施例

实施例1

提供以下讨论和实施例来描述并举例说明本发明。就这一点而论，它们不应理解为限制本发明的范围。本领域技术人员应理解，许多其他的实施方案也在本发明的范围内，正如在本说明书和权利要求书中进行描述一样。

使用知识发现引擎分析数据

Correlogic描述了使用进化和模式识别算法来评价复杂数据集，包括知识发现引擎(KDE^TM)和

参见，例如Hitt等，美国专利No.6,925,389，“Process for Discriminating Between Biological StatesBased on Hidden Patterns From Biological Data”(2005年8月2日授权)；Hitt，美国专利No.7,096,206，“Heuristic Method of Classification，”(2006年8月22日授权)和Hitt，美国专利No.7,240,038，“Heuristic Method ofClassification，”(2007年7月3日授权)。2006年3月23日公开的美国公开专利申请2006/0064253，Hitt等，“Multiple high-resolution serumproteomic features for ovarian cancer detection”进一步阐明了使用该技术来评价源自卵巢癌样品的质谱数据。

当通过Correlogic知识发现引擎分析数据集时，发现下述五-生物标志物的组对于不同卵巢癌分期提供了如表I所述的灵敏度和特异性。具体地，KDE模型1[2_0008_20]对于I期卵巢癌返回了相对高的准确度并且包括这些标志物：癌抗原19-9(CA19-9，Swiss-Prot登录号：Q9BXJ9)、C反应蛋白(CRP，Swiss-Prot登录号：P02741)、成纤维细胞生长因子碱性蛋白(FGF-basic，Swiss-Prot登录号：P09038)和肌红蛋白(Swiss-Prot登录号：P02144)。KDE模型2[4_0002-10]对于III期、IV期和“晚”期卵巢癌返回了相对高的准确度并且包括这些标志物：丙型肝炎NS4抗体(Hep C NS4Ab)、核糖体P抗体和CRP。KDE模型3[4_0009_140]对于I期卵巢癌返回了相对高的准确度并且包括这些标志物：CA19-9、TGFα、EN-RAGE(Swiss-Prot登录号：P80511)、表皮生长因子(EGF，Swiss-Prot登录号：P01133)和HSP90α抗体。KDE模型4[4_0026_100]对于II期和III期、IV期和“晚”期卵巢癌返回了相对高的准确度并且包括这些标志物：EN-RAGE、EGF、癌抗原125(CA125，Swiss-Prot登录号：Q14596)、纤维蛋白原(Swiss-Prot登录号：α链P02671、β链P02675、γ链P02679)、载脂蛋白CIII(ApoCIII，Swiss-Prot登录号：P02656)、霍乱毒素和CA19-9。KDE模型5[4_0027_20]对于II期和III期、IV期和“晚”期卵巢癌也返回了相对高的准确度并且包括这些标志物：蛋白酶3(cANCA)抗体、纤维蛋白原、CA125、EGF、CD40(Swiss-Prot登录号：Q6P2H9)、促甲状腺激素(TSH，Swiss-Prot登录号：αP01215、βP01222P02679、瘦素(Swiss-Prot登录号：P41159)、CA19-9和淋巴细胞趋化因子(Swiss-Prot登录号：P47992)。考虑本领域技术人员可使用KDE分析工具基于所选择分析物之水平来鉴定生物标志物的其他可能有用集合的预测或诊断值。注意，KDE算法可基于标志物的相对丰度选择并利用多种标志物；并且给定标志物(例如，模型IV中霍乱毒素的水平)可以是零，但是这与在具体分组中选择的其他标志物的组合有关。

本领域技术人员将了解，在比较KDE与其他分析技术的相对性能时，本说明书中使用的大小有限的数据集可导致不同结果，例如不同的标志物组和不同的准确度。这些特定的KDE模型构建于相对小的数据集，其使用40个I期卵巢癌和40个正常/良性样品；并且对上述II、III/IV期的平衡进行盲性测试。因此，I期样品的特异性反映了样品集合的大小和可能的过度拟合。考虑到测试集合相比于训练集合来说大小相对较大，还预期非卵巢癌样品平衡的特异性下降。总之，考虑到高灵敏度值，为I期样品开发的生物标志物组还为较晚期卵巢癌提供了可能有用的预测性和诊断性测定。

然而，生物标志物组的这些实例说明了可调节多个参数来影响模型性能。例如，在将多种不同数目的特征组合在一起的这些情况下，使用了多个匹配值，使用了多种不同长度的遗传算法演变并且产生了节点数目不同的模型。通过对本领域技术人员显而易见的常规实验方法，可将这些参数的组合用于产生临床相关性能的其他模型。

表I.使用知识发现引擎分析以开发I期特异性分类模型的结果。

使用随机森林的方法和分析

本领域技术人员已知的一种优选分析技术是Breiman，RandomForests.Machine Learning，2001.45：5-32的技术；其由Segel，MachineLearning Benchmarks and Random Forest Regression，2004和Robnik-Sikonja，Improving Random Forests，in Machine Learning，ECML，2004Proceedings，J.F.B.等编，2004，Springer：Berlin进一步描述。对于本发明的方法，也可使用并考虑随机森林的另一些变体，例如回归森林、存活森林和加权群体随机森林。

因为本领域技术人员已知的，在一些情况下，分析物测定中的每一种是变量的独立测量，所以缩放数据以针对每种测定的不同变量进行调节是合适的。在这些情况下，双权、MAD或等价缩放是合适的，但是在一些情况下，不期望缩放具有显著影响。随机森林顶部的引导程序层用于得到以下讨论的数据。

在本发明的一些优选实施方案中，考虑的生物标志物的组是：

a.癌抗原125(CA125，Swiss-Prot登录号：Q14596)和表皮因子生长受体(EGF-R，Swiss-Prot登录号：P00533)。

b.CA125和C反应蛋白(CRP,Swiss-Prot登录号：P02741)。

c.CA125、CRP和EGF-R。

d.CA125、CRP和EGF-R中的任一种或更多种，以及铁蛋白(Swiss-Prot登录号：重链P02794；轻链；P02792)、白细胞介素8(IL-8，Swiss-Prot登录号：P10145)和金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1，Swiss-Prot登录号：P01033)中的任一种或更多种。

e.表II和表III所示生物标志物组中的任一种。

f.前述生物标志物组(a至e)中的任一种，以及以下列表中其他生物标志物的任一种或更多种(如果之前没有包括在前述组(a至e)内的话)：α2巨球蛋白(A2M，Swiss-Prot登录号：P01023)、载脂蛋白A1-1(ApoA1，Swiss-Prot登录号：P02647)、载脂蛋白C-III(ApoCIII，Swiss-Prot登录号：P02656)、载脂蛋白H(ApoH，Swiss-Prot登录号：P02749)、β2微球蛋白(B2M，Swiss-Prot登录号：P23560)、β细胞素(Swiss-Prot登录号：P35070)、C反应蛋白(CRP,Swiss-Prot登录号：P02741)、癌抗原19-9(CA19-9，Swiss-Prot登录号：Q9BXJ9)、癌抗原125(CA125，Swiss-Prot登录号：Q14596)、胶原II型抗体、肌酸激酶MB(CK-MB，Swiss-Prot登录号：脑P12277；肌肉P06732)、C反应蛋白(CRP,Swiss-Prot登录号：P02741)、结缔组织生长因子(CTGF，Swiss-Prot登录号：P29279)、双链DNA抗体(dsDNA Ab)、EN-RAGE(Swiss-Prot登录号：P80511)、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)(C-C基序趋化因子11、小可诱导细胞因子(small-inducible cytokine)A11和嗜酸性细胞趋化蛋白(Eosinophil chemotactic protein)，Swiss-Prot登录号：P51671)、表皮生长因子受体(EGF-R，Swiss-Prot登录号：P00533)、铁蛋白(Swiss-Prot登录号：重链P02794；轻链P02792)、促卵泡激素(FSH，促卵泡激素β亚基、FSH-β、FSH-B、促卵泡素β链、促卵泡素亚基β，Swiss-Prot登录号：P01225)、触珠蛋白(Swiss-Prot登录号：P00738)、HE4(主要附睾特异性蛋白E4、附睾分泌蛋白E4、推定蛋白酶抑制剂WAP5和WAP四-二硫化物核心结构域蛋白2，Swiss-Prot登录号：Q14508)、胰岛素(Swiss-Prot登录号：P01308)、胰岛素样生长因子1(IGF-1，Swiss-Prot登录号：P01343)、胰岛素样生长因子II(IGF-II，Somatomedin-A，Swiss-Prot登录号：P01344)、胰岛素因子VII(Swiss-Prot登录号：P08709)、白细胞介素6(IL-6，Swiss-Prot登录号：P05231)、白细胞介素8(IL-8，Swiss-Prot登录号：P10145)、白细胞介素10(IL-10，Swiss-Prot登录号：P22301)、白细胞介素18(IL-18，Swiss-Prot登录号：Q14116)、瘦素(Swiss-Prot登录号：P41159)、淋巴细胞趋化因子(Swiss-Prot登录号：P47992)、巨噬细胞源趋化因子(MDC，Swiss-Prot登录号：O00626)、巨噬细胞抑制因子(SWISS PROT)、巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α，Swiss-Prot登录号：P10147)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF、苯丙酮酸互变异构酶、糖基化抑制因子、GIF，Swiss-Prot登录号：P14174)、肌红蛋白(Swiss-Prot登录号：P02144)、骨桥蛋白(骨唾液酸蛋白1、分泌型磷蛋白1、SPP-1、尿结石蛋白、Nephropontin、尿桥蛋白，Swiss-Prot登录号：P10451)、胰岛细胞(GAD)抗体、催乳素(Swiss-Prot登录号：P01236)、干细胞因子(SCF，Swiss-Prot登录号：P21583)、肌腱蛋白C(Swiss-Prot登录号：P24821)、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1，Swiss-Prot登录号：P01033)、肿瘤坏死因子α(TNF-α，Swiss-Prot登录号：P01375)、肿瘤坏死因子RII(TNF-RII，Swiss-Prot登录号：Q92956)、血管性血友病因子(vWF，Swiss-Prot登录号：P04275)和在本说明书所引用参考文献中鉴定为癌症信息的其他生物标志物。

使用随机森林分析方法，鉴定了对I期卵巢癌具有高预测值的优选的七种生物标志物的组。其包括：ApoA1、ApoCIII、CA125、CRP、EGF-R、IL-18和肌腱蛋白。在使用这些标志物通过随机森林针对I期癌症建立并选择相对更准确的模型时，对于I期卵巢癌的灵敏度范围为约80％至约85％。对于II期灵敏度也为约95％，并且对于III/IV期灵敏度为约94％。总特异性为约70％。

类似地，鉴定了对II期卵巢癌具有高预测值的优选的七种生物标志物的组。其包括：B2M、CA125、CK-MB、CRP、铁蛋白、IL-8和TIMP1。对于II期的优选模型的灵敏度为约82％并且特异性为约88％。

对于III期、IV期和晚期卵巢癌，鉴定了以下19种生物标志物的组：A2M、CA125、CRP、CTGF、EGF-R、EN-RAGE、铁蛋白、触珠蛋白、IGF-1、IL-8、IL-10、胰岛素、瘦素、淋巴细胞趋化因子、MDC、TIMP-1、TNF-α、TNF-RII、vWF。对于III/IV期的优选模型的灵敏度为约86％并且特异性为约89％。

表II和表III中示出了用于检测、诊断和监测卵巢癌的其他优选生物标志物或分析物组。这些组包括CA-125、CRP和EGF-R，并且在大多数情况下包括CA19-9。在表II中，每个选自20种优选分析物的20个这种七分析物的组在列1至20中示出。在表III中，每个选自23种优选分析物的20个此类七分析物的组在列1至20中示出。

对于卵巢癌所有分期的其他优选生物标志物组(或模型)包括：(a)CA-125、CRP、EGF-R、CA-19-9、Apo-AI、Apo-CIII、IL-6、IL-18、MIP-1a、肌腱蛋白C和肌红蛋白；(b)CA125、CRP、CA19-9、EGF-R、肌红蛋白、IL-18、Apo CIII；以及(c)CA125、CRP、EGF-R、CA19-9、Apo CIII、MIP-1a、肌红蛋白、IL-18、IL-6、Apo AI、肌腱蛋白C、vWF、触珠蛋白、IL-10。任选地，可将以下生物标志物的任一种或更多种添加到这些生物标志物或者上文或表格中所公开的其他生物标志物组中的任一种中(其程度为任何这样的组在其中没有被特别地鉴定)：vWF、触珠蛋白、IL-10、IGF-I、IGF-II、催乳素、HE4、ACE、ASP和抵抗素。

本发明人考虑分析物(或生物标志物)的另一些信息性集合包含以下表IV中所示分析物中的任一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种和四种或更多种，以及表I、II或III中生物标志物集合的任意种与表Iv中分析物的任一种或更多种的组合，以及表IV中标志物的任一种或更多种与以上段落70至75中所讨论的或在本说明书其他地方确定的其他生物标志物集合中任意种的组合。用于本发明测试试剂盒和方法的另外的信息性分析物集合包含CA-125、CRP、ECG-R和HE4中的任一种或更多种以及表Iv中生物标志物的任一种或更多种。

因此，所考虑的生物标志物的集合包括例如下列的组合：CA-125、CRP和表IV中生物标志物的一种或更多种(或者两种或更多种)；CA-125、EGF-R和表Iv中生物标志物的任一种或更多种(或者两种或更多种)；CA-125、HE-4和表IV中生物标志物的任一种或更多种(或者两种或更多种)；CRP、EGF-R和表IV中生物标志物的任一种或更多种(或者两种或更多种)；CRP、HE-4和表Iv中生物标志物的任一种或更多种(或者两种或更多种)；以及EGF-R、HE-4和表IV中生物标志物的任一种或更多种(或者两种或更多种)。考虑根据本发明的上述生物标志物集合中具有信息性值的标志物包括VCAM-1、IL-6R、IL-18R和分拣蛋白(sortillin)。

另外，生物标志物组包含表Iv中生物标志物的任一种或更多种(或者两种或更多种)以及下面三个生物标志物集合中的任两种或更多种、三种或更多种和四种或更多种：(a)CA125、甲状腺素运载蛋白、ApoA-I、B2-微球蛋白和转铁蛋白；(b)CA125和瘦素、催乳素、骨桥蛋白和胰岛素样生长因子II；以及(c)OvaPlex：CA125、C反应蛋白、血清淀粉样A、IL-6和IL-8。

一般来说，考虑这些分析物的可溶形式，包括释放(shed)进入循环血和淋巴流中的蛋白质和肽片段及结构域。这些分析物可在血液、淋巴、血清、尿和其他体液中进行检测和分析。在本发明的组合物和方法中还考虑针对所公开生物标志物中任意种的自身抗体，以及编码这些生物标志物的核苷酸，从而可作为评估这些标志物水平的另一种间接方式来检测和定量。用于检测这些分子物质的适配体和其他化合物为本领域技术人员所公知。

表IV.

分析物＃	信息性分析物
		1	CA15-3(MUC-1)
2	Her2/Neu(erbB-2)
		3	激肽释放酶5
4	巨噬细胞抑制因子(MIF)
		5	骨桥蛋白
6	TAG-72
		7	总IGF-II
8	HE4
		9	Il6-R
10	全长IL6-R的释放形式Il6-R
		11	IL18-R
12	IL-18BP
		13	VCAM-1
14	IP-10(干扰素γ诱导10kD蛋白质)
		15	SMRP
16	TgII(组织型转谷氨酰胺酶)
		17	嗜酸性粒细胞趋化因子-1
18	Cyfra21-1(细胞角蛋白19片段)
		19	IGF2BP3
20	TIMP-1
		21	α-1抗胰蛋白酶
22	MMP7
		23	TAG-72
24	IL-8
		25	IL-6
26	Sortillin
		27	CD40
28	CA15-3
		29	α-1-抗胰凝乳蛋白酶
30	VEGF
		21	TTR(前白蛋白)
22	触珠蛋白

上述优选生物标志物的任两种或更多种具有预测的值，然而，出于临床目的将一种或更多种其他优选标志物添加到本文所述分析组的任意种中可增加组的预测值。另外，添加以上所列或另外在本说明书所引用之参考文献中确定的一种或更多种不同生物标志物也可增加生物标志物组的预测值，并因此被明确考虑。本领域技术人员可容易地评估此类额外生物标志物的用途。考虑适合于添加到本说明书所公开或要求保护的生物标志物集合(或组)中的另外的生物标志物，在灵敏度或特异性没有相应增加或生物标志物组总体的稳健性没有相应增加的情况下，不会导致灵敏度或特异性降低。优选灵敏度和/或特异性为至少约80％或更高，更优选至少约85％或更高，并且最优选至少约90％或95％或更高。

所公开诊断的结果可以是为了使用者或诊断专家的利益的输出，或者可在媒体上展示，例如但不限于计算机屏幕、计算机可读媒体、纸张或任何其他的可视媒体。

本发明的上述实施方案和优点在某种程度上在之前的描述和实施例中进行了描述，并且根据本说明书和实施例对本领域技术人员在某种程度上是显而易见的，并且可通过如本文所公开的实践本发明来进一步实现。例如，本发明的技术可通过以下过程容易地用于监测个体中卵巢癌的进展：通过评价以上所述的试样或生物样品，然后在一个或更多个较晚时间点适时地重复评价，使得相关生物标志物随时间的表达差异或失调指示所述个体中卵巢癌的进展或对治疗的响应。本专利申请中确定的所有参考、专利、期刊文章、网页和其他文件通过引用整体并入本文。

实施例2

血清来自于专门进行开发和验证卵巢癌测试性能的前瞻性收集。从11个不同站点以均匀方案收集所有的样品，监测其依从性。西部学术审查委员会(Olympia，WA)和各个地点的IRB批准了FDA器械临床研究豁免(Investigational Device Exemption，IDE)号G050132的研究。收集地点(和IRB)是：Cedars-Sinai Medical Center，Los Angeles，CA(Cedars-Sinai Institutional Review Board)；Florida GynecologicOncology，Fort Meyers，FL(Lee Memorial Health System InstitutionalReview Committee)；Florida Hospital Cancer Institute，Orlando，FL(Florida Hospital Institutional Review Board)；The Harry and JeanetteWeinberg Cancer Institute at Franklin Square Hospital，Baltimore，MD(MedStar Research Institute Georgetown Oncology Institutional ReviewBoard)；Holy Cross Hospital，Silver Spring，MD(Holy Cross InstitutionalReview Board)；North Shore-Long Island Jewish Health System，Manhasset，NY(Institutional Review Board North Shore-Long IslandJewish Health System)；SUNY at Stony Brook，NY，Stony Brook，NY(Committee on Research Involving Human Subjects SUNY StonyBrook)；University of Alabama at Birmingham，Birmingham，AL(TheUniversity of Alabama at Birmingham Institutional Review Board forHuman Use)；University of Southern California，Norris Cancer Center，Los Angeles，CA and Women's and Children's Hospital，Los Angeles，CA(University of Southern California Health Sciences Campus InstitutionalReview Board)；Wake Forest University Health Sciences，Winston-Salem，NC(Institutional Review Board Wake Forest University School ofMedicine)和Women and Infants Hospital of Rhode Island，Providence，RI(Institutional Review Board Women and Infants’Hospital of RhodeIsland)。研究入选标准是至少18岁，具有根据美国国立综合癌症网络(NCCN)患者卵巢癌治疗指南的卵巢癌症状的女性，其包括具有或不具有盆腔肿块的女性。基于他们患卵巢癌的关系，参与者必须安排进行妇科外科手术，并且需要在手术后病理学对卵巢和离体组织进行评价以建立疾病状态的临床事实。排除标准是这样的女性，其不满足入选标准，不能提供知情同意书，正在怀孕或之前进行过卵巢癌治疗。在研究中得到每个参与者的书面知情同意书。去掉所有数据的标识并且不将结果返回给医师或患者。

使用来自病理学确定卵巢癌的患者的149个样品和来自病理学确定良性病症的患者的350个样品(图1)。卵巢癌样品包括疾病的所有分期和常见亚型。良性样品包括在整个研究群体中看到的良性病症的常见类型。在外科手术后得到完整临床病理学报告，以及患者年龄、人种、分期、亚型并且对每个样品编码收集地点。

在任何介入之前，将血液样品(10ml)收集到红顶玻璃(red top glass)真空保存管(Vacutainer tube)中。使血液在室温下凝结至少30分钟，以3,500g离心10分钟，将所得血清移到预先标记的冷冻管中，并立即储存在-80℃。在2小时内完成从抽取血液到冷冻的处理。所有样品都在干冰上运输至单个指定地点进行储存。为了进行等分，使所有样品在冰水混合物中解冻，然后转移至标记有编码识别的样品管中，所述编码识别使所有后续的实验者对于样品疾病状态是盲性的。

多重免疫测定

使用一组专用的多重免疫测定(Human

v1.0和Humanv1.0；(图2))测量了259种血清生物标志物。每个测定使用8点标准曲线校准，一式两份进行。使用曲线拟合软件将平均荧光强度(MFI)测量插入到最终蛋白质浓度中。一式两份地针对每个分析物，使用低、中、高水平的质量控制(QC)样品证实了测定性能。所有的标准品和QC样品都在复合血清基基质中以匹配样品背景基质。因为血清在先前优化的稀释下进行分析，所以高于校准曲线最大浓度的任何读数指定为最高标准品的浓度，而低于最小浓度的任何读数指定为值0。对于分析，使样品运行顺序随机化以避免由血清样品的疾病存在与否、疾病亚型或分期、患者年龄或年龄引起的任何顺序偏倚。

数据分析

使用可商购软件包进行血清分析物浓度的描述性统计、受试者工作特征(ROC)曲线和图形展示(点图)。使用非参数Kruskal-Wallis检验(ANOVA)，然后使用Dunn's多重比较后检验确定了统计学差异。对于所有的统计学比较，P值<0.05视为统计学显著。使用多光谱分析应用产生Pearson相关性矩阵。

使用多重免疫测定，在来自病理学确定上皮性卵巢癌的149名患者和具有良性卵巢病症的350名个体的血清中，同时测量了259种分子的水平(图1)。为了有助于确定生物标志物区分症状相似的癌症与良性妇科病症的能力，所有样品从相同的临床群体(最初基于存在附件肿块进行外科手术的女性)中得到。在任何介入之前和已知疾病状态之前收集所有的样品。随后通过离体组织的病理学检查来确定疾病状态。使用单一的样品收集方案来收集血清，监测顺从性。期望地在也监测其方案忠诚度的11个地点进行研究。这确保了样品质量并且消除了样品集合中的任何收集、加工和生物偏倚的可能性，这是许多其他研究所关注的。在该研究中没有使用正常的健康样品，原因是它们通常比良性病症更容易被区分并且引入了混淆因素，例如与面临手术的患者相比应力水平较低。如所期望的，患卵巢癌的个体中的平均患者年龄(61岁)比患良性病症的那些个体高(51岁)，并且随疾病表现的分期而增加(图1)。总体上，卵巢癌亚型的分布与美国群体中所有卵巢癌病例所见分布相类似，其中粘液性癌的比例(55％)比其他亚型大(图1)。研究中的良性对照代表常见良性卵巢病症，包括囊腺瘤、囊腺纤维瘤和纤维瘤。

为了确保一致性并帮助生物标志物比较，使用品质严格的高通量多重免疫测定在单个地点的单个平台上测量所有的259种标志物和499个样品。该研究的基础是我们之前对104种血清生物标志物的特征谱分析。本发明中另外155种血清生物标志物的大多数作为两个NCI资助的小型企业创新研究(Small Business Innovative Research，SBIR)奖励的一部分而开发，其特别针对具有合理文献支持表明对癌症生物标志物具有重要作用的标志物。所选择的生物标志物包括广泛范围的生物功能，主要涉及癌症，包括癌抗原、激素、凝血因子、组织建模因子(tissue modeling factor)、脂蛋白成分、蛋白酶和蛋白酶抑制剂、心血管风险标志物、生长因子、细胞因子/趋化因子、可溶形式的细胞信号传导受体、以及炎症和急性期反应物(图2)。本研究是最广泛的，并且与使用完全表征的质量受控样品的分子免疫测定范围的单个研究最一致。

对于每种生物标志物，产生ROC曲线并且将其曲线下面积(AUC)值与非信息性标志物的AUC(AUC=0.500)进行比较。相对于良性妇科病症，卵巢癌样品中总共有175种生物标志物失调(P值>0.05)。其中，136种生物标志物上调以及39种下调(图3和4)。AUC值最大的生物标志物在卵巢癌中主要是上调(图3、4和5)，值的范围在0.599至0.933。上调最大的标志物是HE4和CA-125，其AUC值分别为0.933和0.907，随后是白细胞介素2受体α(IL-2受体α)、α-1-抗胰蛋白酶、C反应蛋白、YKL-40、细胞纤连蛋白、癌抗原72-4(CA-72-4)和丝氨酸蛋白酶8(prostasin)，其AUC值为0.829至0.800(图3)。其余的127种上调生物标志物的AUC值的闭联集为0.797至0.556(图4)。其余的127种标志物中有三十四种的AUC值高于0.700。对于下调的生物标志物，AUC值的范围为0.556至0.745(图4)。这些中两种最具信息性的为甲状腺素运载蛋白(0.745)和载脂蛋白A-IV(0.713)，而其余生物标志物的AUC值低于0.700。

这是第一次，在受到一致性控制的分析条件下，对条理分明的样品集合，一起准确定量了20种生物标志物中AUC值最高的十三种，即HE4、IL-2受体α、YKL-40、细胞纤连蛋白、CA72-4、丝氨酸蛋白酶8(prostasin)、MMP-7、VEGF-B、钙防卫蛋白、IGFBP-2、LOX-1、神经毡蛋白1和MPIF-1，从而确定其对于卵巢癌的区分能力。该方法改善了生物标志物的比较并且应有助于在多生物标志物组开发中选择生物标志物。

为了进行本研究中两种最具信息性的生物标志物之间的比较，在特异性值的某一范围中确定对于HE4和CA-125的灵敏度。此外，对于每种生物标志物计算了最优截止值(定义为产生特异性和灵敏度的最大总和)。对于单独的HE4，随着特异性由80％增加至99.6％，灵敏度由89.0％降低至57.1％，而对于单独的CA-125，灵敏度由85.2％降低至30.2％。对于HE4和CA-125，分别给出灵敏度值为86.6％和74.5％，并且特异性值分别为89.4％和93.7％的情况下，最优截止分别为54.8pM和52.5U/mL。如通过ROC曲线所期望的，当在预定高灵敏度值下没有单独的生物标志物显示出高特异性时要权衡。例如，在100％灵敏度下，HE4和CA-125二者的特异性均为0％。在98％灵敏度下，HE4的特异性为30.6％，CA-125的特异性为35.4％。然而，为了得到相对良好的特异性值，灵敏度必须降低至约95％。在95％灵敏度下，HE4的特异性为50.9％，CA-125的特异性为45.4％。这些值与AUC曲线一起表明，在该群体上，HE4的表现比CA-125略好。此外，这些结果表明，该研究中生物标志物的信息性都不足以作为广泛应用的独立卵巢癌生物标志物，并且需要改进生物标志物组的性能以满足临床可接受的水平。

为了确定一些生物标志物是否对癌症的不同分期(特别是早期)具有更大的区分度，比较FIGO I期和II期样品(在具有基于标志物之检测的最大需要时)中AUC值高于0.800的九种生物标志物(图6)。对于FIGOI期样品，HE4和CA-125二者具有很高的区分度(P值<0.001)，然后以降序排列为C反应蛋白和CA72-4(P值0.001至0.01)，然后是α1-抗胰蛋白酶、YKL-40和丝氨酸蛋白酶8(prostasin)(P值0.01至0.05)。对于IL2受体α和细胞纤连蛋白，在I期癌症与良性病症之间没有显著性差异(P值>0.05)。对于FIGO II期样品，HE4和CA-125二者再次具有很高的区分度(P值<0.001)，然后是IL2受体α、α1-抗胰蛋白酶、YKL-40和CA72-4(P值0.001至0.01)，然后是C反应蛋白和细胞纤连蛋白(P值0.01至0.05)。对于丝氨酸蛋白酶8(prostasin)，没有显著性差异(P值>0.05)。

评价了相同的九种生物标志物以确定在来自患良性病症之女性与各自患各种亚型卵巢癌之女性的样品之间是否有统计显著性差异(图7)。对于透明细胞癌，α1-抗胰蛋白酶和C反应蛋白具有很高的区分度(P值<0.001)，然后以降序排列为HE4、CA-125和IL2受体α(P值0.01至0.05)。对于YKL-40、细胞纤连蛋白、CA72-4和丝氨酸蛋白酶8(prostasin)，没有统计学差异(P值>0.05)。对于子宫内膜样癌，对于HE4和CA-125有高度显著性差异(P值<0.001)，并且对于C反应蛋白、细胞纤连蛋白、CA72-4有显著差异(P值0.01至0.05)。对于α1-抗胰蛋白酶、IL2受体α、YKL-40和丝氨酸蛋白酶8(prostasin)，没有统计学差异(P值>0.05)。对于粘液性癌，仅CA72-4具有显著性差异(P值0.01至0.05)。对于浆液性癌和混合性癌，所有的九种生物标志物都具有高度显著性差异(P值<0.001)。因此，除了粘液性癌之外，所述九种生物标志物对所有常见的卵巢癌亚型具有信息性，然而，其不同的区分能力表明标志物的不同组合可用于不同亚型。在优选发现用于粘液性亚型的更多信息性生物标志物时，相对比较少。事实上，该研究中仅6.0％的癌症为粘液性亚型(图1)。

为了简单和成本有效，使用单个生物标志物优先于使用多种生物标志物。然而，清楚的是，单个生物标志物可能无法捕获到复杂疾病(例如卵巢癌)的固有多样性。信息性测试试图以以下方式对多个生物标志物进行组合：每种标志物将不同类型的区分添加到整个患者群体或由其他标志物得到的群体亚分类中。简言之，与彼此相关性强的标志物相比，彼此相关性差的标志物有更大的机会使得各自贡献于组。因此，对最强的卵巢癌标志物(AUC值大于0.600的124种生物标志物)进行了相关性分析。使用Pearson相关系数作为距离度量来进行分层聚类，从而将共同变化的分子分类在一起。将成对的结果组成124×124矩阵(编号0至123)并使用热图进行展示，在所述热图中，强红色表示强的正相关，并且蓝色表示负相关(图8)。有四个主要聚类(聚类A至D，图8至13)，每个聚类代表彼此强相关的标志物。这些聚类中的每一个都包含是卵巢癌强标志物的标志物。聚类A(标志物1至10)包含两种强卵巢癌标志物CA72-4和MPIF-1(图9和10)。TNFR2存在于聚类B(标志物58-67；图XXX(表S3和S5)中。聚类C(标志物79至87)包含两种最强的卵巢癌标志物(HE4、CA-125--以及丝氨酸蛋白酶8(prostasin)和VEGF-B(图9和12)。与CA-125相关性最强的是间皮素(Pearson相关系数=0.600)、乳腺丝抑蛋白(0.599)、VEGF-D(0.568)、丝氨酸蛋白酶8(prostasin)(0.551)、激肽释放酶7(0.507)和VEGF-B(0.505)。乳腺丝抑蛋白(0.517)与HE4相关性最强，然后是TIMP-1(0.470)、丝氨酸蛋白酶8(prostasin)(0.463)、IL-2受体α(0.424)、VEGF-B(0.413)和VEGF-D(0.409)。最后，最大的聚类(聚类D；生物标志物32至55)由相关性松散的标志物构成，其包含几种优良的卵巢癌标志物，包括钙防卫蛋白、LOX-1、IL-6、YKL-40、细胞纤连蛋白、神经毡蛋白-1、α1-抗胰蛋白酶、TIMP-1、C反应蛋白和IL-2受体α(图9和13)。这些相关性数据可帮助推动生物标志物组的开发并且可了解卵巢癌中被扰乱的途径。

评价了AUC值大于0.800的九种标志物的组合性能以确定简单的多标志物方案的预测值。使用逻辑斯蒂回归组合了九种标志物，产生的AUC为0.950(标准误差：0.01213；95％CI：0.926-0.974；P值：<0.0001)。接着，将该性能与FDA允许使用的OVA1测试中的五种标志物进行比较。该研究中的样品通过妇科肿瘤医师收集。在OVA1510(k)总结中报道了类似的研究群体，其具有100％灵敏度(仅对于侵入性卵巢癌)和32.9％特异性。将五种标志物组合并建立逻辑斯蒂回归模型。与OVA1510(k)总结相一致的，对于该样品集合，在32.9％的特异性下，OVA1生物标志物给出了98.0％的灵敏度。有趣的是，对于这些样品，在32.9％的特异性下，单独的CA-125具有98.0％的灵敏度。这表明另外的OVA1标志物对总体分类贡献很小(如果有的话)。事实上，五种OVA1生物标志物的AUC值为0.912(标准误差：0.0157；95％CI：0.881-0.943；P值：<0.0001)，仅略高于AUC为0.907的单独的CA-125(标准误差：0.01571；95％CI：0.877-0.938；P值：<0.0001)。通过在固定特异性值下确定模型的灵敏度和在固定灵敏度值下确定模型的特异性来进一步比较两种模型(图14和15)。一般来说，在ROC曲线的所有点处，以Top9(前9种标志物)为基础的逻辑斯蒂回归模型胜过以OVA1标志物为基础的模型。在80％与95％之间的固定特异性值下，Top9模型比以OVA1标志物为基础的模型灵敏度大8％至10％。在较高的特异性(99％)下，Top9模型灵敏度大出约19％。在80％与99％之间的固定灵敏度下，Top9模型比以OVA1标志物为基础的模型特异性大8％至25％。

因为Top9组(前9种组)和OVA1组均包含对于绝经前和绝经后女性可差异性进行的标志物，所以通过绝经状态比较了两种组的的性能。对于Top9组，绝经前女性的AUC值(0.937)低于绝经后女性(0.953)。这与单个标志物分析相一致，所述单个标志物分析证明前三个单个标志物(HE4、CA-125和IL2-Rα)对于绝经后女性都表现得(分别为0.927、0.927和0.824；(图16))比绝经前女性(分别为0.912、0.907和0.812)要好。对于OVA1组，绝经前女性的AUC值(0.920)略低于绝经后女性(0.924)。另外，这与单个标志物分析相一致，所述单个标志物分析证明CA-125(似乎决定OVA1组性能的标志物)对于绝经前女性组(0.907)比对于绝经后女性(0.927)表现得更差。

已鉴定了新的生物标志物，其能够区分提取自具有良性卵巢病症之女性与提取自患卵巢癌之女性的样品。使用逻辑斯蒂回归模型对九种最具信息性的生物标志物进行的初步多变量分析表明相对于OVA1生物标志物具有显著改进的性能。该分析表明我们的数据具有改进OVA1和其他测试的潜力。

Claims

1.一种预测对象的卵巢癌状态的方法，其包括步骤：

在得自于所述对象的生物流体样品中测量CA-125和HE4的水平并且测量选自下列的一种或更多种生物标志物的水平：IL-2受体α(IL-2Rα)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、C反应蛋白(CRP)、YKL-40、细胞纤连蛋白(cFib)、丝氨酸蛋白酶8、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)、IL-8、IL-6、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)、凝集素样氧化LDL受体1(LOX-1)、神经毡蛋白1、TNFR2和MPIF-1；以及

使所述测量与卵巢癌状态相关联。

2.权利要求1的方法，其还包括测量癌抗原72-4(CA-72-4)的水平。

3.权利要求1的方法，其中所述卵巢癌状态是存在卵巢癌。

4.权利要求1的方法，其还包括：

基于所述状态安排对象治疗。

5.权利要求4的方法，其中安排对象治疗选自进行更多的测试、进行外科手术和不采取进一步的行动。

6.权利要求4的方法，其还包括：

在进行对象安排后在得自于所述对象的生物流体样品中测量CA-125和HE4的水平并且测量选自下列的一种或更多种生物标志物的水平：白细胞介素-2受体α(IL-2受体α)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、C反应蛋白(CRP)、YKL-40、细胞纤连蛋白(cFib)、癌抗原72-4(CA-72-4)、丝氨酸蛋白酶8、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)、IL-8、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、IL-6、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)、凝集素样氧化LDL受体1(LOX-1)、神经毡蛋白1、TNFR2和MPIF-1；

使所述测量与卵巢癌状态相关联；以及

确定对象安排是否导致卵巢癌状态改变。

7.权利要求1的方法，其中测量选自：检测所述生物标志物的存在与否、对生物标志物的量进行定量和对生物标志物的类型进行定性。

8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述生物标志物通过免疫测定进行测量。

9.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述关联通过软件分类算法进行。

10.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述样品选自血液、血清和血浆。

11.试剂盒，其包含：

a)一组亲和试剂，所述亲和试剂各自与CA-125和HE4以及选自下列的一种或更多种生物标志物选择性结合：白细胞介素-2受体α(IL-2受体α)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、C反应蛋白(CRP)、YKL-40、细胞纤连蛋白(cFib)、癌抗原72-4(CA-72-4)、丝氨酸蛋白酶8、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)、IL-8、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、IL-6、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)、凝集素样氧化LDL受体1(LOX-1)、神经毡蛋白1、TNFR2和MPIF-1；以及

b)一组容器，所述容器各自包含CA-125和HE4以及选自下列的一种或更多种生物标志物：白细胞介素-2受体α(IL-2受体α)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、C反应蛋白(CRP)、YKL-40、细胞纤连蛋白(cFib)、癌抗原72-4(CA-72-4)、丝氨酸蛋白酶8、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)、IL-8、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、IL-6、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)、凝集素样氧化LDL受体1(LOX-1)、神经毡蛋白1、TNFR2和MPIF-1。

12.权利要求11的试剂盒，其中所述亲和试剂是抗体。

13.权利要求11的试剂盒，其还包含使用所述亲和试剂来测量来自对象的样品中所述生物标志物水平的书面说明。

14.权利要求11的试剂盒，其还包含使用所述试剂盒来确定对象卵巢癌状态的书面说明。

15.一组纯化肽，其包含CA-125和HE4以及选自下列的一种或更多种生物标志物：白细胞介素-2受体α(IL-2受体α)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、C反应蛋白(CRP)、YKL-40、细胞纤连蛋白(cFib)、癌抗原72-4(CA-72-4)、丝氨酸蛋白酶8、金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)、IL-8、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、IL-6、血管内皮生长因子B(VEGF-B)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)、凝集素样氧化LDL受体1(LOX-1)、神经毡蛋白1、TNFR2和MPIF-1。

16.权利要求15的肽，其中所述肽的一种或更多种包含可检测标记。