CN107765005A - 早期小细胞肺癌筛查方法及试剂盒 - Google Patents

早期小细胞肺癌筛查方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种早期小细胞肺癌筛查方法及试剂盒，该方法是：采用角质素酶蛋白(YKL‑40)联合神经元特异性烯醇化酶(NSE)二联检进行早期小细胞肺癌的筛查。通过上述方式，本发明能够提高预测早期小细胞肺癌的准确性。

Description

早期小细胞肺癌筛查方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及肿瘤筛查技术领域，特别是涉及一种早期小细胞肺癌筛查方法及试剂盒。
背景技术
肺癌是生活当中常见的恶性肿瘤，在临床当中发现男性肺癌的患者多于女性。国家癌症中心根据72个肿瘤登记处上报的、覆盖全国8550万人口的、2009-2011年的数据，预估了2015年中国癌症发病及死亡情况。据统计数据估计，2015年中国癌症总发病429.16万例，总死亡281.42万例，肺癌和胃癌位居全国癌症发病及死亡的前两位。
肺癌的病因未完全清楚。其病因可能与吸烟、大气污染、电离辐射、职业(石棉、碑、沥青、烟尘等)有关。一般将肺癌分为非小细胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer，简写NSCLC)和小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer，简写SCLC)两大类。肺癌的检验与检测方法很多，包括：1、痰脱落细胞学检查；2、免疫学检查：例如，癌胚抗原(CEA)，其它的肺癌标记物有鳞状细胞癌抗原(SCC)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)；3、胸水检查；4、活组织检查；5、X线检查，等等。这些方法除了免疫学检查大部分不太适合早期的筛查。
值得一提的是，小细胞肺癌患者(SCLC)血清NSE明显增高，而非小细胞肺癌(NSCLC)患者并无明显增高，故NSE可作为SCLC与NSCLC的鉴别诊断。NSE的浓度与转移部位或脑部转移没有相关性，但是与临床分期如疾病进展有很好的相关性。血清NSE水平与SCLC的临床分期呈正相关，因此，血清NSE检测对SCLC的病情监测、疗效评价及预测复发等具有重要的临床价值。但是NSE的异常表达并不真正构成SCLC的早期辅助诊断指标。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种早期小细胞肺癌筛查方法及试剂盒，能够提高预测早期小细胞肺癌的准确性。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种角质素酶蛋白(YKL-40)联合神经元特异性烯醇化酶(NSE)在早期小细胞肺癌筛查中的用途。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种筛查早期小细胞肺癌的方法，所述方法包括：检测样品中YKL-40和NSE的含量；
若NSE的含量在其临界值范围内，且YKL-40的含量大于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较大的小细胞肺癌风险，
若NSE的含量大于其临界值范围，且YKL-40的含量等于或小于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较小的小细胞肺癌风险。
其中，所述样品为血液样品。
其中，所述临界值范围为正常人的含量范围或为良性肿瘤及炎性病人的含量范围。
为解决上述技术问题，本发明采用的又一个技术方案是：提供一种角质素酶蛋白(YKL-40)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)联合检测体外诊断试剂盒，所述体外诊断试剂盒包括：包被在第一层析材料上的标记的抗YKL-40第一抗体和标记的抗NSE第一抗体；包被在第二层析材料上的未标记的抗YKL-40第二抗体和未标记的抗NSE第二抗体。
其中，所述标记的抗YKL-40第一抗体和标记的抗NSE第一抗体是采用量子点或荧光微球进行标记的。
其中，所述体外诊断试剂盒用于早期小细胞肺癌的筛查。
为解决上述技术问题，本发明采用的又一个技术方案是：提供一种用于早期小细胞肺癌筛查的角质素酶蛋白(YKL-40)试剂盒，所述角质素酶蛋白(YKL-40)试剂盒与NSE试剂盒联合使用。
本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明采用角质素酶蛋白(YKL-40)联合神经元特异性烯醇化酶(NSE)二联检进行早期小细胞肺癌的筛查。由于角质素酶蛋白(YKL-40)的灵敏度比神经元特异性烯醇化酶(NSE)高，通过这种方式，能够提高预测早期小细胞肺癌的准确性。
附图说明
图1是临床样品中YKL-40含量的实验数据一分析示意图；
图2是临床样品中NSE含量的实验数据一分析示意图；
图3是临床样品中YKL-40含量的实验数据另一分析示意图；
图4是临床样品中NSE含量的实验数据另一分析示意图；
图5a-5c是临床样品中健康人群的实验数据；
图6是临床样品中良性肿瘤及炎症病人的实验数据；
图7a-7c是临床样品中小细胞肺癌病人的实验数据。
具体实施方式
在详细介绍本发明之前，先介绍一下肺癌的症状以及现有的检测肺癌的方法及局限性。
肺癌的症状包括：咳嗽在中心型肺癌较早出现，常以阵发性、刺激性干咳为首发症状，无痰或仅有少量的白色泡沫状粘液痰。咯血，间断或持续性痰中带血，肺癌一般少有引起大咯血。如病变累及胸膜或胸壁则可出现持续、固定而剧烈的胸痛。中心型肺癌引起气道阻塞时可有胸闷、气促。晚期时，随着对气管、支气管的压迫，呼吸困难可能很严重，发热，多继发于支气管、肺部感染。全身症状可有消瘦、乏力、食欲减退和体重减轻体征，早期可无阳性体征。肿瘤增大时可有气管移位。阻塞支气管可出现肺不张体征。部分阻塞支气管时，2％的患者可有限局性喘鸣音。除肺内体征外，如肿瘤压迫上腔静脉，而出现颈部、胸部浅表静脉怒张。可有颈部锁骨上或腋窝淋巴结肿大及杵状指(趾)。神经系统表现如喉返神经受压，出现声带麻痹、声音嘶哑。影响交感神经出现Horner氏征，异位内分泌综合征如Cushing综合征，男性乳房肥大等。肺癌转移，可出现相应器官损害的体征。其他常见的肺外表现，如增生性骨关节病、皮肌炎、黑棘皮症和神经肌病等。实际情况是，病人出现上述症状时都已经处于晚期，耽误治疗的良机。
目前肺癌的检验包括：
1、痰脱落细胞学检查：取材方便，方法简单，应用广泛，应多次送检提高阳性率。
2、免疫学检查：癌胚抗原(Carcino-Embryonic Antigen，简写CEA)，肺癌特别是腺癌，CEA可升高，但也见于其它恶性肿瘤和非肿瘤疾病，对连续观察肿瘤的复发和判断预后具有一定价值，其它的肺癌标记物有鳞状细胞癌抗原(Squamous Cell CarcinomaAntigen，简写SCC)和神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific Enolase，简写NSE)。
3、胸水检查：癌性胸水多呈血性，胸水量较多，可找肿瘤细胞。
4、活组织检查：其是诊断肺癌的重要方法，通过活检可做出病理学诊断，确定肺癌及病理类型；其中包括肺癌转移的浅表淋巴结的活检穿刺或手术，胸壁针刺肺活检，经纤维支气管镜支气管粘膜和肺活检，开胸肺活检，纵隔镜检查和活检。
5、纤维支气管镜检查：可直接观察支气管内病变，看到肿物及管壁浸润；通过支气管镜可做活组织检查，细胞刷或生理盐水冲洗，提供细胞学、病理学检查的标本。
6、X线检查：
(一)胸部X片：肺癌的诊断中占有十分重要的地位，通过X线检查可初部确定病变的部位、范围和性质。
1、中心型肺癌：(1)限局性肺气肿，为肺癌的早期表现，吸气相投照胸片较易显示。(2)阻塞性肺炎：它是中心型肺癌的重要表现。其特点为：在同一部位反复发生；经抗生素治疗可以吸收，但很少完全吸收；阻塞性肺炎常常合并肺膨胀不全。(3)阻塞性肺不张，尤其与肺门肿块及肿大淋巴结一起形成“S”征象，有诊断意义。(4)肺门肿块：肿瘤侵犯周围肺组织，侵及肺门淋巴结，共同在肺门区形成肿块。
2、周边型肺癌：多呈孤立的类球形病灶，大多数为单发。早期病变密度较低、边缘模糊，可有细小毛刺影，有的病变呈分叶状或有脐样切迹。病变可形成空洞，壁厚，内壁凹凸不平空洞多偏心，可有突出于腔内的结节病变，可伴有肺门、纵隔淋巴结转移、淋巴结肿大。
(二)断层摄影：能层次地显示病变及肿大淋巴结的轮廓及大小。能显示气管、支气管阻塞的征象。可见支气管壁不规则地增厚，管腔狭窄、中断或管腔内肿物，或可见典型的鼠尾状、漏斗状、平直或杯状中断。
(三)电子计算机体层X线扫描(CT)：对发现密度较低及处于隐蔽部位如心脏旁、脊柱旁的肿瘤有定一价值，对隐性肺癌可帮助寻找肿瘤部位。
上述方法中，除了免疫学检查外，均不适合作为早期小细胞肺癌检测的方法。本发明采用角质素酶蛋白(YKL-40)联合神经元特异性烯醇化酶(NSE)二联检进行早期小细胞肺癌的筛查。由于角质素酶蛋白(YKL-40)的灵敏度比神经元特异性烯醇化酶(NSE)高，通过这种方式，能够提高预测早期小细胞肺癌的准确性。
下面结合附图和实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供角质素酶蛋白(YKL-40)联合神经元特异性烯醇化酶(NSE)在早期小细胞肺癌筛查中的用途。
神经元特异性烯醇化酶(NSE)是参与糖酵解途径的烯醇化酶中的一种，存在于神经组织和神经内分泌组织中。NSE在脑组织细胞的活性最高，外周神经和神经分泌组织的活性水平居中，最低值见于非神经组织、血清和脊髓液。它被发现在与神经内分泌组织起源有关的肿瘤中，特别是SCLC中有过量的NSE表达，导致血清中NSE明显升高。
神经元特异性烯醇化酶NSE的临床意义：
小细胞肺癌患者(SCLC)血清NSE明显增高，而非小细胞肺癌(NSCLC)患者并无明显增高，故NSE可作为SCLC与NSCLC的鉴别诊断。NSE浓度与转移部位或脑部转移没有相关性，但是与临床分期如疾病进展有很好的相关性。血清NSE水平与SCLC的临床分期呈正相关，因此，血清NSE检测对SCLC的病情监测、疗效评价及预测复发具有重要的临床价值。但是，NSE的异常表达并不真正构成SCLC的早期诊断指标。
研究结果表明角质素酶YKL-40是炎症因子，同时又是肿瘤标记物，从炎症到癌变的过程中，它在血液中的含量会随着病情的程度而增加。的确，仅仅使用角质素酶作为标记物，它是不足以准确定位的，而且心血管疾病和糖尿病也会导致血液中角质素酶升高。但当它与其他癌症标记物一同检测时，就能更有效地帮助临床预警癌症，这是因为从炎症到癌症，它在血液中含量会显著增加。
本申请的发明人研究发现角质素酶YKL-40是炎症因子，同时又是肿瘤标记物，从炎症到癌变的过程中，它在血液中的含量会随着病情的程度而增加。仅仅使用角质素酶作为标记物，它是不足以准确定位的，而且心血管疾病和糖尿病也会导致血液中角质素酶升高。但当它与其他癌症标记物一同检测时，就能更有效地帮助临床预警癌症，这是因为从炎症到癌症，它在血液中含量会显著增加。
为了准确定位小细胞肺癌，本申请的发明人提出一种二联检测法，就是在卵巢癌辅助诊断的标记物NSE基础上，再增加角质素酶的检测。
请参见图1至图4，临床检测103例健康人群的血样、26例良性肿瘤及炎性病人的血样、113例小细胞肺癌病人的血样，图1是检测病人血样中的YKL-40，横坐标表示三种不同血样对应的人群，纵坐标表示YKL-40的含量，单位是ng/ml，图2是检测病人血样中的NSE，横坐标表示三种不同血样对应的人群，纵坐标表示NSE的含量，单位是ng/ml，图3与图1相似，只是在作图时将健康人群、良性肿瘤及炎性病人合并在一起，以便于更加清楚地看出健康人群、良性肿瘤及炎性病人与小细胞肺癌病人中YKL-40含量的差别，图4与图2相似，只是在作图时将健康人群、良性肿瘤及炎性病人合并在一起，以便于更加清楚地看出健康人群、良性肿瘤及炎性病人与小细胞肺癌病人中NSE含量的差别。
从图1和图3中可以看出，健康人群、良性肿瘤及炎性病人中YKL-40含量与小细胞肺癌病人中YKL-40含量之间的差异非常明显，小细胞肺癌病人中YKL-40含量显著高于健康人群、良性肿瘤及炎性病人中YKL-40含量，通过检测YKL-40含量，可以将健康人群、良性肿瘤及炎性病人与小细胞肺癌病人区分开来。从图2和图4可以看出，健康人群、良性肿瘤及炎性病人中NSE含量与小细胞肺癌病人中NSE含量之间的差异不是特别明显，小细胞肺癌病人中NSE含量只是稍微高于健康人群、良性肿瘤及炎性病人中NSE含量，通过检测NSE含量，不能完全将健康人群、良性肿瘤及炎性病人与小细胞肺癌病人区分开来。
因此，结合图1至图4，可以看到，YKL-40的灵敏度显然高于NSE。而且，在正常对照组中，有21例血样的NSE超出正常范围，但它们血样中的YKL-40都在正常范围，如果采用单一的NSE，则定性为阳性，经本申请YKL-40联合NSE的二联检测可以定为阴性，经过确诊，这21例血样确实为阴性。因此，本申请YKL-40联合NSE的二联检测法，确实优于原先的单一NSE检测法。
本发明还提供一种筛查早期小细胞肺癌的方法，该方法包括：
A、检测样品中YKL-40和NSE的含量；
B、若NSE的含量在其临界值范围内，且YKL-40的含量大于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较大的小细胞肺癌风险，若NSE的含量大于其临界值范围，且YKL-40的含量等于或小于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较小的小细胞肺癌风险。
其中，该样品为血液样品，例如：血清、血浆、全血等。
其中，临界值范围为正常人的含量范围或为良性肿瘤及炎性病人的含量范围。在实际应用中，临界值范围根据具体的临床数据进行确定。
在上述初期的实验数据中已经发现，加入YKL-40成为二联检测以后，有以下二项较为显著的优点：第一，当NSE指标还处于临界值范围时(Borderline Risk，临界值范围的含量，还不足以定位阳性时)，但是如果同时伴有YKL-40的显著增高，有助于定性为阳性。这样，使小细胞肺癌的早期辅助诊断阳性率，增加到更高的比例。在接诊的肺癌病人中大概20％的肺癌是小细胞肺癌。这种小细胞肺癌恶性程度高，倍增时间短，转移早而广泛。目前对小细胞肺癌分期主要依据临床辅助诊断及细胞与病理学检验结果分为局限期和广泛期。如果肿瘤局限于一侧胸腔，且能被纳入一个放射治疗野的，即为局限期；如果肿瘤超出局限期范围即为广泛期。在本发明实施方式中，小细胞肺癌是经过X光和其它CT扫描等辅助诊断方法确定肿瘤的位置后，经病理学检查与其他类型的肺癌相鉴别并确诊。由于所收集的样本，癌细胞都已经转移到整个胸腔，处于广泛期。本发明实施方式中，总共收集了113例临床小细胞肺癌病人血清样本，103例正常人群血清样本(即没有肺部疾病的人群，也没有发现其它疾病的人群)，26例阳性肺囊肿，或哮喘与肺纤维化病人血清样本，但没有肺癌，具体数据请参见图5a至图7c。
NSE和YKL-40的检测试剂由深圳海格德生物科技公司提供。在NSE的检测中，临界值(Cutoff)定为11，在103例正常人群样本中，有31例的样本超过临界值，假阳性率为30.1％。在26例良性肿瘤或炎症病人中病例中，有9例超过临界值，假阳性率为34.6％。在113例小细胞肺癌病人中25例低于临界值，漏检率也达到22.12％，因此NSE辅助诊断小细胞肺癌的检测率低于80％，敏感性很低，特异性也低，假阳性达到30％以上。在YKL-40的检测中，临界值(Cutoff)定为100，在103例正常人群样本中，有11例的样本超过临界值，在26例良性肿瘤例有21例超过临界值，假阳性率是80％，YKL-40是一个炎症因子，分泌到血液的量会随炎症程度而增加，因此当YKL-40水平增加，而增加幅度不大于300时，可以判定病人有其它炎症，需进一步确诊。但是，如果将正常人群和炎症病人作为对照组，将cutoff水平定为200，这样可以将YKL-40的假阳性排除，这样假阳性率低于3％。在113例小细胞肺癌病人中，有7例低于临界值200。但是如果结合NSE值对照YKL-40没有升高的病人，NSE水平都很高，可以认为病人得肺癌的可能性还是很大，需进一步排查。因此，NSE和YKL-40联检诊断小细胞肺癌比单一NSE筛查具有明显优势。
目前临床上使用的NSE检测法的假阳性率还是比较高。而从本申请的实验数据中分析，当NSE的检测出现异常增高时，而YKL-40并没有出现显著增高，癌症病变的几率就会减少很多。因此，加入YKL-40成为二联检测以后，可以帮助减低假阳性率。在这次113例病人血样检测中，也再次证实了这一优点的存在：在正常对照组中，有21例血样的NSE超出正常范围，但它们血样中的YKL-40都在正常范围，因此如用单一NSE标志物法定性为阳性的，经本申请的二联检测可以阴性。因此，加入了YKL-40的二联检测法，确实优于原先的NSE单一标志物的检测法。如果将正常人群加上炎症病人组做为对照组，二联检测的优势将更为明显。
目前在临床上，进行肺癌(或其他所有癌症)的确切诊断，仍然还是以病理学方法为主。而目前临床上使用的所有血样检测，包括本申请提供的二联检测法，都是对临床医生起到辅助性诊断作用，主要起到初期筛选性或预警性的作用。按照本申请的方法，检测结果为阳性的，不等于绝对的肺癌阳性。但是血液检测阳性的病例，与阴性病例比较，在肺癌的发病几率上说，要大出十倍乃至数十倍以上，足以让临床医生提高警觉，并给予病人进一步的必要检查。不少呼吸科医生反映，目前各种费用昂贵的检查(例如壁针刺肺活检，经纤维支气管镜支气管粘膜和肺活检，开胸肺活检，纵隔镜检查和活检，CT scan，MRI，或新型的超声波)，不可能大规模用于初期疾病筛选。因此对于不容易做出早期辅助诊断的小细胞肺癌，尤其需要有一项快速，简便，费用低，敏感度高，而结果相对可靠的初选辅助诊断方法。而本申请的方法以及产品正好满足这样的一种临床需求。
本发明还提供一种角质素酶蛋白(YKL-40)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)联合检测体外诊断试剂盒，该体外诊断试剂盒包括：
包被在第一层析材料上的标记的抗YKL-40第一抗体和标记的抗NSE第一抗体；
包被在第二层析材料上的未标记的抗YKL-40第二抗体和未标记的抗NSE第二抗体。
很显然，上述二联检的体外诊断试剂是采用层析法原理的。通过上述二联检的体外诊断试剂，可以检测样本中的YKL-40和NSE。
其中，该标记的抗YKL-40第一抗体和标记的抗NSE第一抗体是采用量子点或荧光微球进行标记的。当然，也可以采用胶体金进行标记。
其中，该体外诊断试剂盒用于早期小细胞肺癌的筛查。
量子点(Quantum Dots)是由半导体材料，如硒化镉CdSe，组成的纳米颗粒，当量子点被一种普通光激发之后，可以释放出比普通荧光素强达数十倍的荧光，且有激发光谱宽、发射光谱窄的特点。发射光谱还可根据半导体材料的不同与纳米颗粒大小的不同而进行变动调节，且发射光的稳定性高，不会被淬灭。正是由于量子点荧光的这些优点，用量子点纳米颗粒标记的抗体，可比普通荧光素标记的抗体发光强度提升数百倍，从而使试剂的信号敏感度达到与化学发光的水平相当。
该试剂盒的开发技术路线大致分为以下几步：
筛选或自行研发检测肿瘤标志物的单克隆抗体；
抗体和量子点纳米颗粒或荧光微球偶联条件的确定和优化；
免疫层析法检测肿瘤标志物的条件确定和优化；
检测肿瘤标志物试剂盒的性能技术参数的确定和优化；
检测试剂盒的中试和大量生产条件和工艺的确定和优化；
试剂盒配套的荧光检测仪器的研发生产。
试剂盒开发的工艺流程采用以下几个步骤：配制包被和标记用的工作液体、抗体和量子点纳米颗粒或荧光微球偶联、制备荧光垫、制备样品垫、包被抗体到NC膜、干燥、试剂条的组装等。
本发明还提供一种用于早期小细胞肺癌筛查的角质素酶蛋白(YKL-40)试剂盒，该角质素酶蛋白(YKL-40)试剂盒与NSE试剂盒联合使用。
例如，用于早期小细胞肺癌筛查的角质素酶蛋白(YKL-40)酶联(ELISA)试剂盒。
总结来说，本申请的方法以及产品具有以下明显的优点：
(1)通过检测YKL-40在血液中的含量，可以明确划分正常人、炎症病人、癌症病人，在癌症情况下，它的水平随着病情发展而递增。
(2)NSE和YKL-40联检，可以弥补NSE的不足，小细胞肺癌的早期辅助诊断的灵敏度和特异度明显提高。
(3)早期辅助诊断小细胞肺癌的价值远高于目前临床上常用的检测方法，具有广阔的应用前景，填此领域的空白。
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种角质素酶蛋白(YKL-40)联合神经元特异性烯醇化酶(NSE)在早期小细胞肺癌筛查中的用途。
2.一种筛查早期小细胞肺癌的方法，其特征在于，所述方法包括：
检测样品中YKL-40和NSE的含量；
若NSE的含量在其临界值范围内，且YKL-40的含量大于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较大的小细胞肺癌风险，
若NSE的含量大于其临界值范围，且YKL-40的含量等于或小于其临界值范围，则初步判断提供所述样品的病人存在较小的小细胞肺癌风险。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品为血液样品。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述临界值范围为正常人的含量范围或为良性肿瘤及炎性病人的含量范围。
5.一种角质素酶蛋白(YKL-40)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)联合检测体外诊断试剂盒，其特征在于，所述体外诊断试剂盒包括：
包被在第一层析材料上的标记的抗YKL-40第一抗体和标记的抗NSE第一抗体；
包被在第二层析材料上的未标记的抗YKL-40第二抗体和未标记的抗NSE第二抗体。
6.根据权利要求5所述的体外诊断试剂盒，其特征在于，所述标记的抗YKL-40第一抗体和标记的抗NSE第一抗体是采用量子点或荧光微球进行标记的。
7.根据权利要求5所述的体外诊断试剂盒，其特征在于，所述体外诊断试剂盒用于早期小细胞肺癌的筛查。
8.一种用于早期小细胞肺癌筛查的角质素酶蛋白(YKL-40)试剂盒，其特征在于，所述角质素酶蛋白(YKL-40)试剂盒与NSE试剂盒联合使用。
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