CN110114680A - 用于诊断肺癌的组合物、方法和试剂盒 - Google Patents
用于诊断肺癌的组合物、方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
提供了用于鉴定在具有第一肺病症的受试者中与健康受试者或具有第二肺病症的受试者中表现出差异表达的生物标记物蛋白的方法。还提供了包含这些生物标记物蛋白的组合物和使用这些生物标记物蛋白或其组以诊断、分类和监测各种肺病的方法。本文提供的方法和组合物可用于诊断或分类受试者为患有肺癌或非癌症病症，以及区分不同类型的癌症(例如恶性与良性、SCLC与NSCLC)。
Description
相关申请
本申请要求2016年5月5日提交的U.S.S.N 62/332,054和2016年12月6日提交的U.S.S.N 62/430,853的优先权和权益，其全部内容通过引用以其整体并入本文。
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背景技术
肺病，特别是肺癌提出了重大的诊断挑战。在许多无症状患者中，放射学筛查如计算机断层摄影(CT)扫描是诊断范例的第一步。肺结节(PN)或不确定的结节位于肺部，通常在筛查高风险患者时发现或偶然发现。由于获得医疗保健的患者数量增加、筛查技术的迅速普及以及人口老龄化，预计确定的PN数量将增加。据估计，美国每年发现超过300万个PN。尽管大多数PN是良性的，但有些是恶性的，导致额外的干预。对于被认为恶性结节风险较低的患者，目前的医疗实践规定每三到六个月扫描，持续至少两年，以监测肺癌。识别PN和诊断之间的时间段是医学监视或“观察等待”的时间，并且可能引起对患者的压力并且由于重复的成像研究而导致显著的风险和费用。如果对发现患有良性结节的患者进行活组织检查，则成本和对患者造成伤害的可能性会不必要地增加。指示进行大手术以切除标本以进行组织活检和诊断。所有这些程序都与患者的风险相关，包括：疾病、伤害和死亡以及高经济成本。
通常，由于肺的大小和/或位置，不能对PN进行活组织检查以确定它们是良性还是恶性的。然而，PN与循环系统相连，因此如果是恶性的，癌症的蛋白质标记物可以进入血液并提供用于确定PN是否是恶性的信号。
需要能够替代或补充现有PN患者诊断方法的诊断方法，以改善诊断、降低成本并最大限度地减少侵入性手术和患者的并发症。本发明提供了用于鉴定蛋白质标记物以鉴定、诊断、分类和监测肺病症，特别是肺癌的新型组合物、方法和试剂盒。本发明使用基于血液的多重测定来区分良性肺结节和恶性肺结节，以对患有或不患有肺癌的患者进行分类。本发明可用于出现肺癌症状但没有肺结节的患者。
发明内容
某些方面本发明提供了一种确定受试者的肺病症不是癌症的可能性的方法，其通过测量从受试者获得的样品中的一组蛋白质的丰度；基于蛋白质测量计算癌症评分的概率，并且如果评分低于预定分数，则排除受试者的癌症。当排除癌症时，受试者不接受治疗方案并经历定期监测。定期监测可包括例如肺功能测试(PFT)、肺成像、活组织检查或其任何组合。在一些实施例中，成像是X射线、胸部计算机断层摄影(CT)扫描或正电子发射断层摄影(PET)扫描。
在某些方面，本发明提供了一种确定受试者的肺结节不是肺癌的可能性的方法，包括使得自受试者的血液样品与蛋白水解酶接触以从血液样品中存在的一组蛋白质产生肽片段，其中所述组包含选自BGH3、C163A、LG3BP、GELS、IBP3、LUM、MASP1、PEDF和S10A6的两种蛋白质；将来自所述组的产生的肽片段与标记的合成肽片段组合，所述合成肽片段对应于来自所述组的产生的肽片段；进行选择的反应监测质谱法以测量肽片段的丰度；基于肽片段测量计算肺癌评分的概率；如果步骤中的评分低于预定分数，则排除受试者的肺癌。
在一些方面，所述组包括LG3BP和C163A。当排除肺癌时，定期监测受试者。在某些方面，受试者具有低至中度的癌症风险。
在其他方面，该方法还包括医生对癌症风险的评估。在某些方面，受试者被指定为医生对癌症风险的评估在0到1之间。
在一些方面，癌症风险由癌症风险预测因子Ci(k)确定，其被确定为其中判定阈值Ti是结节不大于15mm的患者的{Si(k)}的中值。
在其他方面，肺结节的直径小于或等于3cm。在一些方面，肺结节的直径为约0.8cm至3.0cm。
在一些方面，该组包含LG3BP和C163A，并且反转比为0.07。在一些方面，该组包含BGH3和C163A，并且反转比为0.06。在一些方面，该组包含LG3BP和GELS，并且反转比为0.05。在一些方面，该组包含LG3BP和IBP3，并且反转比为0.07。在一些方面，所述组包含LUM和C163A，并且反转比率为0.06。在一些方面，该组包含MASP1和C163A，并且反转比为0.07。在一些方面，该组包含MASP1和IBP3，并且反转比为0.06。在一些方面，所述组包括PEDF和C163A，并且反转比为0.07。在一些方面，所述组包括S10A6和C163A，并且反转比为0.06。在一些方面，所述组包括S10A6和ENPL，并且反转比为0.06。在一些方面，所述组包括LUM和GELS，并且反转比为0.02。
本发明涉及用于鉴定可能是良性的肺结节的Xpresys Lung版本2(XL2)血液测试，因此那些结节可以安全地避免风险和昂贵的侵入性操作，例如活组织检查和手术。虽然每年检测到的大多数肺结节是良性的(75％-85％)，但62％经历了不必要的活检，35％经历了不必要的手术，或两者兼而有之。
XL2的关键性能指标是其阴性预测值(NPV)，因为XL2是癌症排除测试。基于预期的PANOPTIC研究，XL2的中值NPV为98％(CI：92％-100％)，该研究跨越33个站点并招募685名受试者。美国胸科医师学会(ACCP)指南推荐95％NPV随时间观察肺结节。
Xpresys Lung版本2(XL2)在几个方面优于Xpresys Lung版本1(XL1)，最值得注意的是：
·XL2是在两项大型前瞻性研究中开发和验证的；XL1是在两项中等规模的回顾性研究中开发和验证的。
·XL2利用XL1蛋白生物标记物的子集，最准确地识别良性肺结节。
·XL2将蛋白质生物标记物与之前已经验证(并获得ACCP指南认可)的五种临床因素整合在一起，可用于评估肺结节的癌症/良性状态。
统计上，XL2在性能上优于PET。具体而言，在PANOPTIC研究中，XL2和PET可以直接在同一受试者上进行比较，XL2的NPV为98％(CI：92％-100％)，而PET的NPV为79％(CI：66％-88％)。XL2比四种最常见的临床风险因子算法(Mayo、VA、Brock和Herder)具有统计学上优越的性能，其中XL2和临床风险因子算法在相同受试者上进行比较。XL2在相同受试者中比较XL2和医生癌症风险评估的情况下比医生具有统计学上优越的性能。
如果在PANOPTIC中使用XL2，则可以避免36％的不必要的侵入性操作(活组织检查和/或手术)。XL2有可能避免每年超过36,000例手术、1,600例住院治疗和近750例死亡。此外，XL2将为现行实践增加另一个安全因素。如果在PANOPTIC中使用XL2，那么只有3％的恶性结节会被错误地送到CT监测。相比之下，在PANOPTIC试验预期使用人群中，45％的恶性肺结节患者被错误地送往CT监测(即现行做法)。
在某些方面，本发明还提供了一种确定受试者的肺结节是肺癌的可能性的方法，包括使得自受试者的血液样品与蛋白水解酶接触以从血液样品中存在的一组蛋白质产生肽片段，其中所述组包含选自BGH3、C163A、LG3BP、GELS、IBP3、LUM、MASP1、PEDF和S10A6的两种蛋白质；将来自所述组的产生的肽片段与标记的合成肽片段组合，所述合成肽片段对应于来自所述组的产生的肽片段；进行选择的反应监测质谱法以测量肽片段的丰度；基于肽片段测量计算肺癌评分的概率；如果评分等于或高于预定分数，则划入受试者的肺癌。
在一些方面，所述组包括LG3BP和C163A。当划入肺癌时，定期监测受试者。在某些方面，受试者具有低至中度的癌症风险。
在其他方面，该方法还包括医生对癌症风险的评估。在某些方面，受试者被指定为医生对癌症风险的评估在0到1之间。
在一些方面，癌症风险由癌症风险预测因子Ci(k)确定，其被确定为其中判定阈值Ti是结节不大于15mm的患者的{Si(k)}的中值。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本说明书中引用的所有专利和出版物均通过引用并入。
附图说明
图1A和1B是一系列图表，描绘了从预期的PANOPTIC研究中获得的样品的医师癌症风险评估(pCA)。图1A描绘了所有样品的pCA的条形图(n＝422；263良性，159癌症)；癌症患病率为38％。KOL指导可以是针对低至中度风险受试者的排除测试(pCA<＝50％)。图1B描绘了pCA的条形图，其中所有样品处于阶段1a(n＝340；224良性，116癌症)；癌症患病率为34％。
图2A和2B是一系列条形图，描绘了所有癌症风险类别的表现。该图描绘了通过单独的pCA或pCA+XL2评估的癌症风险。
图3是条形图，其描绘了与单独使用pCA相比，通过使用pCA+XL2获得的所有癌症风险类别的侵入性程序的减少。
图4是一系列图表，描述了低到中等风险受试者样品的表现。该图描绘了通过单独的pCA或pCA+XL2评估的癌症风险。
图5是条形图，其描绘了与单独使用pCA相比，通过使用pCA+XL2获得的低到中度风险类别的侵入性程序的减少。
图6描绘了从具有低中度风险的受试者样品获得的XL2 ROC曲线。
图7A和7B是描绘由pCA、pCA+XL1或pCA+XL2指示的癌症风险评估的一系列图。
图8是描述各种评估方法的性能的一系列图表。图8中显示的方法是XL2、pCA、PET、B1b和Mayo。
图9是一对受试者工作特征(ROC)图，描绘了与XL2性能相关的阴性预测值(NPV)(左图)和阴性似然比(NLR)(右图)区域。
图10是描绘pCA、PET和各种低风险和中等风险受试者的临床模型(pCA<＝50％)的性能的图。仅XL2(LG3BP和C163A的组)。
图11是描绘pCA、PET和各种低风险和中等风险受试者的临床模型(pCA<＝50％)的性能的图。仅XL2(LUM和C163A的组)。
图12是描绘与B1a整合的XL2的性能的图。XL2+B1a在关键性能区域优于pCA和B1a(见图10)。
图13是描绘与Mayo集成的XL2的性能的图表。
图14是描绘XL2与Mayo整合对侵入性程序使用的影响的图。高达0.15的风险阈值，没有一个癌症(18)被错误地引导至侵入性手术，而50个良性中的20个(40％)被重新引导回CT监视。
图15是描绘作为反向特异性的函数的替代性能基准的灵敏度的图。
图16是描绘pCA或XL2+Mayo的灵敏度作为反向特异性的函数的图。
图17是描绘侵入性程序随着XL2+Mayo分级器的使用增加而减少的图表。
图18是登记和排除的患者的图。数据不足类别包括没有医生pCA的患者、无法进行随访或未进行第二次手术的患者、以及最终诊断或未经最终诊断的治疗。如果无法检测血样、无法确诊、或CT检查不足以建立良性诊断，则包括方案失败。
图19是曲线图，示出通过十分位数显示恶性肿瘤(PCA)的医师预测概率(前两列是5倍％的增量)。显示197个癌症结节和195个良性结节。
图20是示出了蛋白质组试验(XL2)与医师PCA、PET、以及VA和Mayo癌症风险方程的ROC曲线比较的曲线图。这种表现为178名低风险患者具有。阴影区域是性能≥95％NPV的区域。显示的百分比是蛋白质组学测试(XL2)、医师pCA、PET和三个风险等式(VA、Brock和Mayo)的AUC值。
图21是显示五种临床风险因子和蛋白质组比LG3BP/C163A的比较的图
图22是示出针对参数t的不同值和T＝0.5的整合模型(IntMod)的性能的图。对于t值在.14和.39之间的值，发生最佳持续性能，其中AUC值均为至少62％并且p值均低于0.008(Mann-Whitney)。
图23是显示蛋白质组比、Mayo算法和整合模型(比率+Mayo)的比较的图。灵敏度为90％，特异性为33％，与Mayo模型和蛋白质组比率相比，整合模型具有统计学上显著的更好性能。
图24是显示由十分位数显示的PANOPTIC试验医师预测试概率(pCA)计数的图表(前两列是5％增量)。显示196个癌症结节和196个良性结节。
图25是显示PANOPTIC试验中肺结节的图，所述肺结节按大小与癌症和良性结节的比例分开。显示392个结节：196个癌结节和196个良性结节。
图26是显示在PANOPTIC预期用途组(n＝178)上XL2的性能的图。红色曲线是XL2(#1)的受试者工作特征(ROC)曲线，其为76％(95％CI 69％-82％)并且显著优于随机(p值9.4E-5)。灰色区域(#2)代表产生95％或更高的NPV的所有灵敏度和特异性对。蓝点(#3)代表XL2灵敏度为97％、特异性为44％、NPV为98％的灵敏度和特异性。
图27是显示XL2与六种癌症风险预测因子的比较的图。
图28是显示预期用途组中XL2与pCA的比较的图。XL2与pCA的比较灵敏度为90％，是pCA实现的最高灵敏度。蓝色拱形箭头描绘了被比较的各个ROC曲线上的两个点。
图29是显示XL2与四种临床风险预测因子的比较的图。比较在90％和97％灵敏度下进行。蓝色箭头描绘了与XL2比较的四个临床风险预测曲线上的各个点。
图30是显示具有PET扫描的预期用途组中的75名患者的XL2和PET的AUC比较的图。
图31是显示由十分位数显示的PANOPTIC试验医师预测试概率(pCA)计数的图表(前两列是5％增量)。显示196个癌症结节和196个良性结节。
图32是显示PANOPTIC试验中肺结节的图，所述肺结节按大小与癌症和良性结节的比例分开。显示392个结节：196个癌结节和196个良性结节。
图33是显示在PANOPTIC预期用途组(n＝178)上XL2的性能的图。实曲线是XL2(#1)的受试者工作特征(ROC)曲线，其AUC为76％(95％CI 69％-82％)并且显著优于随机(p值9.4E-5)。灰色区域(#2)代表产生95％或更高的NPV的所有灵敏度和特异性对。蓝点(#3)代表XL2灵敏度为97％、特异性为44％、NPV为98％的点。
图34是示出XL2与六个癌症风险预测因子比较的图。
图35是显示预期用途组中XL2与pCA的比较的图。XL2与pCA的比较灵敏度为90％，是pCA实现的最高灵敏度。蓝色拱形箭头描绘了被比较的各个ROC曲线上的两个点。
图36是显示XL2与四种临床风险预测因子的比较的图。比较在90％和97％灵敏度下进行。蓝色箭头描绘了与XL2比较的四个临床风险预测曲线上的各个点。
图37是显示具有PET扫描的预期用途组中的75名患者的XL2和PET的比较的图。
具体实施方式
所公开的发明源于令人惊讶的发现，即在患有肺结节的患者中，存在血液中的蛋白质标记物，其特异性地鉴定和分类肺癌。因此，本发明为患者提供了与患者肺癌早期检测相关的独特优点，包括延长寿命、降低发病率和死亡率、在筛选和重复筛查期间减少暴露于辐射、以及微创诊断模型。重要的是，本发明的方法允许患者避免侵入性手术。
胸部计算机断层摄影(CT)扫描的常规临床应用每年识别出数百万个肺结节，其中只有少数是恶性的，但对于诊断为非小细胞肺癌(NSCLC)的患者，其五年生存率为15％，这是令人沮丧的。肺结节患者肺癌的早期诊断是首要任务，作为基于临床表现的决策，结合当前的非侵入性诊断选项，如胸部CT和正电子发射断层摄影(PET)扫描，以及其他侵入性替代方案，未改变I期NSCLC患者的临床结果。尺寸为8毫米至20毫米之间的肺部结节的子群日益被认为相对于8毫米以下恶性肿瘤的较低速率和20毫米以上恶性肿瘤的更高速率是“中间”[9]。使用经胸针吸引术或支气管镜检查通过活组织检查对肺结节进行侵入性取样可提供NSCLC的细胞病理学诊断，但也与假阴性和非诊断结果相关。总之，肺结节管理的关键未满足的临床需求是一种非侵入性诊断测试，其区分具有不确定肺结节(IPN)的患者的恶性和良性过程，特别是在8mm和20mm之间。
临床决策或多或少激进的治疗基于风险因素，除了成像以外，主要是结节大小、吸烟史和年龄[9]。由于这些尚无定论，因此非常需要基于分子的血液检测，该检测既非侵入性又可提供风险因素和成像的补充信息。
因此，这些和相关的实施方案将用于肺病症的筛选方法，特别是肺癌诊断。更重要的是，本发明可用于确定患者的临床管理。也就是说，本发明的方法可用于划入或排除个体受试者的特定治疗方案。
癌症生物学需要一种分子策略来解决评估肺癌风险的未满足的医疗需求。诊断医学领域已经发展了技术和分析，为检测蛋白质的变化提供灵敏的机制。本文描述的方法使用LC-SRM-MS技术来测量在患有恶性PN的患者中统一改变的血浆蛋白浓度。该蛋白质特征指示肺癌。LC-SRM-MS是一种提供血浆中循环蛋白质的定量和鉴定的方法。蛋白质表达水平的变化，例如但不限于信号因子、生长因子、切割的表面蛋白质和分泌的蛋白质，可以使用这种敏感技术来检测癌症。本文提出的是基于血液的分类测试，以确定患有肺结节的患者具有良性或恶性结节的可能性。本发明提出分类算法，其预测PN是良性或恶性的相对可能性。
更广泛地说，证明了本发明有许多变化，它们也是PN是良性或恶性的可能性的诊断试验。这些是蛋白质组、蛋白质标准品、测量方法和/或分类算法的变化。
如本文所公开的，基于对呈现肺结节的受试者的大型前瞻性研究开发了双蛋白质组测定法。
表A提供了本公开的双蛋白质组的示例性配对。
表A：用于排除肺癌的两种蛋白质的组合。
表A中数字表示本公开内容的不同的组合物，其包含两种蛋白质，在确定受试者肺部结节不是肺癌的可能性的方中使用。例如，组合物#1包含基因BGH3和C163A，而组合物#10包含基因C163A和GELS。
用于排除受试者中癌症的优选组列于表1中。在各种其他实施例中，根据本发明的组包括测量在表1中列出的蛋白质中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多种。
表B提供了本公开的多蛋白质组的示例性组合，其包含BGH3、C163A、LG3BP、GELS、IBP3、LUM、MASP1、PEDF和S10A6中的一种或多种。
表B：用于排除肺癌的至少一种蛋白质的组合。
表B中数字表示本公开内容的不同的组合物，其包含选自BGH3、C163A、LG3BP、GELS、IBP3、LUM、MASP1、PEDF和S10A6的至少一种蛋白质，在确定受试者肺部结节不是肺癌的可能性的方中使用。例如，组合物#1包括基因BGH3而组合物#309包括基因BGH3、C163A、LG3BP、GELS、IBP3、LUM、MASP1、PEDF和S10A6。
术语“肺结节”(PN)是指可通过放射摄影技术显现的肺部病变。肺结节是直径小于或等于3厘米的任何结节。在一个实例中，肺结节的直径为约0.8cm至2cm。
术语“肿块”或“肺部肿块”是指最大直径大于3厘米的肺结节。
术语“血液活组织检查”是指血液的诊断研究，以确定患有结节的患者是否具有可被分类为良性或恶性的病症。
术语“验收标准”是指化验、测试、诊断或产品应符合考虑其预期用途可接受的一组标准。如本文所用，验收标准是测试列表、分析程序的参考和适当的测量，其被限定用于将用于诊断的测定或产品。例如，分类器的验收标准是指一组预定范围的系数。
术语“平均最大AUC”是指计算性能的方法。对于本发明，在通过向前或向后选择限定应该在组中的蛋白质组的过程中，一次一个地除去或添加蛋白质。可以生成具有性能的图(Y轴上的AUC或部分AUC评分和X轴上的蛋白质)，使性能最大化的点表示产生最佳结果的蛋白质的数量和组。
术语“部分AUC因子或pAUC因子”大于通过随机预测预期的。在灵敏度＝0.90时，pAUC因子是ROC曲线下的梯形面积，从0.9到1.0特异性/(0.1*0.1/2)。
术语“增量信息”是指可以与其他诊断信息一起使用以提高诊断准确性的信息。增量信息与临床因素例如包括结节大小、年龄或性别无关。
术语“分数”或“评分”是指计算样品的概率可能性。对于本发明，接近1.0的值用于表示样品是癌症的可能性，接近0.0的值表示样品是良性的可能性。
术语“稳健”是指不会因违反其所依据的假设而受到严重干扰的测试或程序。对于本发明，稳健的测试是这样的测试，其中质谱分析色谱图的蛋白质或转变已经进行手动审查并且“通常”没有干扰信号。
术语“系数”是指分配给逻辑回归方程中用于对样品进行评分的每种蛋白质的权重。
在本发明的某些实施例中，考虑根据MC CV的逻辑回归模型，每个蛋白质的模型系数的模型系数和变异系数(CV)可以增加或减少，这取决于测量蛋白质分类器的方法(或模型)。对于组中每种列出的蛋白质，对于系数和CV中的每一个，存在大约、至少、至少大约或至多大约2、3、4、5、6、7、8、9、或10倍，或可以在其中衍生的任何范围。或者，考虑本发明的定量实施例可以关于大约、至少、至少大约或至多大约10％、20％、30％、40％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或其中可衍生的任何范围进行讨论。
术语“最佳团队成员”是指在随机组选择算法中排名最佳的蛋白质，即在组中表现良好。当结合到分类器中时，这些蛋白质可以将癌症与良性样品分离。“最佳团队成员”蛋白质是“合作蛋白”的同义词。术语“合作蛋白”是指蛋白质在高性能蛋白质组中出现的频率高于偶然预期的蛋白质。这产生了蛋白质的合作分数，可以测量在高性能组上的频繁出现程度。例如，合作评分为1.5的蛋白质在高性能组中出现，比仅偶然预期的多1.5倍。
本文关于肺病症使用的术语“分类”是指编译和分析表达数据以使用统计技术提供分类以帮助诊断肺病，特别是肺癌的行为。
如本文所使用的术语“分类”是指用统计显著性的预定水平对疾病状态之间进行区分的算法。两类分类器是使用来自样品的测量的数据点并将数据分类为两组之一的算法。在某些实施例中，分类器中使用的数据是生物样品中蛋白质的相对表达。可以将受试者中的蛋白质表达水平与先前诊断为无疾病或具有特定病症的患者的水平进行比较。
“分类器”最大化区分随机选择的癌症样品与随机选择的良性样品的概率，即ROC曲线的AUC。
除了具有差异表达的分类器的组成蛋白外，它还可以包括具有最小生物变异或没有生物学变异的蛋白质，以便能够在临床样本内或之间评估变异性或缺乏变异性；这些蛋白质可称为内源蛋白质，并作为其他分类蛋白质的内部对照。
本文所用术语“标准化”或“标准器”是指用标准值表示差异值，以调整由于样品处理、样品制备和质谱测量而非样品中蛋白质浓度的生物学变化引起的技术变化所产生的影响。例如，当测量差异表达的蛋白质的表达时，蛋白质表达的绝对值可以用表达基本恒定的标准蛋白质表达的绝对值表示。这可以防止样品制备和质谱测量的技术变化阻碍样品中蛋白质浓度水平的测量。
如本文所用的术语“病症”通常是指疾病、事件或健康状况的变化。
本文所用的术语“治疗方案”包括进一步的诊断测试，通常用于确定肺结节是良性还是恶性。治疗方案包括通常用于诊断肺结节或肿块的诊断测试，例如CT扫描、正电子发射断层摄影(PET)扫描、支气管或组织活检。本文使用的治疗方案还意在包括通常用于治疗恶性肺结节和/或肺癌的治疗性治疗，例如化学疗法、放射疗法或外科手术。
术语“诊断”和“诊断性”还分别包括术语“预后”和“预后性”，以及这些程序在两个或多个时间点上用于监测随时间的诊断和/或预后的应用，以及基于此的统计学建模。此外，术语诊断包括：a.预测(确定患者是否可能发生过度增生性疾病)b.预后(预测患者在未来的预选时间内是否可能有更好或更差的结果)c.治疗选择d.治疗药物监测e.复发监测。
美国肺癌协会提供以下肺癌分期定义。在T0期，没有原发肿瘤的证据。在Tis期，存在原位癌。T1期表示3cm或更小的肿瘤。T1a期表示具有2cm或更小的肿瘤。T1b期表示尺寸大于2cm但小于3cm的肿瘤。T2期表示尺寸大于3cm但小于或等于7cm的肿瘤。T2a期表示尺寸大于3cm但小于或等于5cm的肿瘤。T2b期表示尺寸大于5cm但是7cm或更小的肿瘤。T3期表示超过7cm的肿瘤或侵入胸壁、、膈神经、膈肌、壁层胸膜、顶叶心包或纵隔胸膜的肿瘤；或主支气管中小于2cm的肿瘤。T4期表示侵入以下任何一种的肿瘤：心脏、食道、纵隔、气管、喉返神经、隆突、椎体或不同同侧叶中的单独肿瘤结节。
在一些实施例中，例如，将生物样品分类为源自具有肺病的受试者可以指实验室产生的结果和相关报告，而诊断可以指医学专业人员使用该分类识别或验证肺部疾病的行为。
如本文所用，关于生物样品的术语“提供”是指直接或间接从受试者获得生物样品。例如，“提供”可以指从受试者直接获得生物样品的行为(例如，通过抽血、组织活检、灌洗等)。同样，“提供”可以指间接获得生物样品的行为。例如，提供可以指从直接获得样品的一方接收样品的实验室的行为，或者指从存档获得样品的行为。
如本文所用，“肺癌”优选是指肺的癌症，但可包括人或其他哺乳动物的呼吸系统的任何疾病或其他病症。呼吸道肿瘤疾病包括例如小细胞癌或小细胞肺癌(SCLC)，非小细胞癌或非小细胞肺癌(NSCLC)，鳞状细胞癌，腺癌，支气管肺泡癌，混合肺癌，恶性胸膜间皮瘤，未分化的大细胞癌，巨细胞癌，同步肿瘤，大细胞神经内分泌癌，腺鳞癌，未分化癌；和小细胞癌，包括燕麦细胞癌，混合小细胞/大细胞癌和组合小细胞癌；以及腺样囊性癌，错构瘤，粘液表皮样肿瘤，典型类癌肺肿瘤，非典型类癌肺肿瘤，外周类癌肺肿瘤，中央性类癌肺癌，胸膜间皮瘤和未分化肺癌和起源于肺外的癌症，如已经从身体其他部位转移到肺部的继发性癌症。肺癌可属于任何期或等级。优选地，该术语可以用于统称任何发育异常、增生、瘤形成或转移，其中蛋白质生物标记物表达高于正常水平，例如可以通过与相邻健康组织比较来确定。
非癌肺病症的实例包括慢性阻塞性肺病(COPD)，良性肿瘤或细胞肿块(例如，错构瘤、纤维瘤、神经纤维瘤)，肉芽肿，结节病，以及细菌(例如结节病)或真菌(例如组织胞浆菌病)病原体引起的感染。在某些实施例中，肺部病症可与放射照相PN的出现相关联。
如本文所用，“肺组织”及“肺癌”分别是指肺本身的组织或癌，以及与肺下面的层和支撑结构例如胸膜、肋间肌、肋骨和呼吸系统的其他元件相邻和/或在其内的组织。在这种情况下，呼吸系统本身被认为表示鼻腔、鼻窦、咽、喉、气管、支气管、肺、肺叶、肺泡、肺泡管、肺泡囊、肺泡毛细血管、细支气管、呼吸性细支气管、内脏胸膜、壁层胸膜、胸膜腔、膈肌、会厌、腺样体、扁桃体、口腔和舌头等。组织或癌症可以来自哺乳动物，并且优选来自人，尽管猴、猿、猫、狗、牛、马和兔都在本发明的范围内。本文所用的术语“肺病”是指与肺有关的疾病、事件或健康状况的变化，包括例如肺癌和各种非癌症状况。
“准确度”是指测量或计算的数量(测试报告值)与其实际(或真实)值的一致程度。临床准确度与真实结果(真阳性(TP)或真阴性(TN)与错误分类结果(假阳性(FP)或假阴性(FN))的比例有关，并且可以陈述为敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)或阴性预测值(NPV)，或为可能性、优势比以及其他量度。
如本文所用的术语“生物样品”是指可能含有一种或多种生物标记蛋白的任何生物来源的样品。生物样品的实例包括组织、器官或体液，例如全血、血浆、血清、组织、灌洗液或用于检测疾病的任何其他样品。
如本文所用的术语“受试者”是指哺乳动物，优选人。
如本文所用的术语“生物标记物蛋白”是指来自患有肺病症的受试者的生物样品中的多肽与来自对照受试者的生物样品的多肽。生物标记物蛋白质不仅包括多肽本身，还包括其微小变体，包括例如一个或多个氨基酸取代或修饰，例如糖基化或磷酸化。
如本文所用的术语“生物标记物蛋白质组”是指多种生物标记物蛋白质。在某些实施例中，组中蛋白质的表达水平可与受试者中肺病症的存在相关联。在某些实施例中，生物标记物蛋白质组包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100种蛋白质。在某些实施例中，生物标记物蛋白质组包含100-125种蛋白质、125-150种蛋白质、150-200种蛋白质或更多种蛋白质。
如本文所用，关于病症的“正治疗”或“治疗”可以指预防病症、减缓病症的发作或发展速率、降低发生病症的风险、预防或延迟与病症相关的症状的发展、减少或结束与病症相关的症状、产生病症的完全或部分消退，或其某些组合。
如本文所用的术语“排除”是指选择受试者不接受治疗方案。
本文使用的术语“划入”是指选择受试者接受治疗方案。
生物标记物水平可能因疾病的治疗而改变。生物标记物水平的变化可以通过本发明测量。生物标记物水平的变化可用于监测疾病或治疗的进展。
“改变的”、“变化的”或“显著不同的”是指与可合理比较的状态、轮廓、测量等的可检测的变化或差异。本领域技术人员应该能够确定合理的可测量变化。这些变化可能全部也可能不变。它们可能是递增的，不必是线性的。它们可能是数量级的。变化可以是增加或减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多，或0％到100％之间的任何值。或者，改变可以是1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更多倍，或在1倍和5倍之间的任何值。变化可以是统计学显著的，p值为0.1、0.05、0.001或0.0001。
使用本发明的方法，首先进行患者的临床评估。如果存在更高的癌症可能性，则临床医生可以划入疾病，这将需要进行诊断测试选项，产生增加和/或证实诊断可能性的数据。疾病的“划入”需要具有高度特异性的检验。
“FN”是假阴性，对于疾病状态测试意味着将疾病受试者错误地分类为非疾病或正常。
“FP”是假阳性，对于疾病状态测试意味着将正常受试者错误地分类为患有疾病。
术语“划入”是指具有高特异性的诊断测试，其与临床评估结合表明癌症的更高可能性。如果临床评估的癌症可能性较低，临床医生可采取立场来排除疾病，这需要进行产生降低诊断可能性的数据的诊断测试。“排除”需要高灵敏度的测试。
术语“排除”是指具有高灵敏度的诊断测试，其与临床评估相结合表明癌症的可能性较低。
术语“测试的敏感性”是指患有疾病的患者具有阳性测试结果的概率。这来源于患有该疾病的具有阳性检测结果(真阳性)的患者数除以患有该疾病的患者总数，包括具有真阳性结果的患者和具有阴性结果即假阴性的疾病患者。
术语“测试的特异性”是指没有疾病的患者将具有阴性测试结果的概率。这来源于没有患病的检测结果为阴性(真阴性)的患者数除以所有没有该疾病的患者，包括具有真阴性结果的患者和没有患有该疾病且具有阳性检测结果例如假阳性的患者。虽然测试的敏感性、特异性、真假阳性率和真假阴性率提供了测试性能的指示，例如相对于其他测试，根据测试结果对个体患者做出临床决策，但临床医生需要关于给定人群的测试的性能参数。
术语“阳性预测值”(PPV)是指阳性结果正确识别患有该疾病的患者的概率，即真阳性的数量除以真阳性和假阳性的总和。
术语“阴性预测值”或“NPV”通过TN/(TN+FN)或所有阴性测试结果的真阴性分数计算。它本身也受到疾病流行和预期测试人群的预测试概率的影响。
术语“疾病的患病率”是指在特定时期疾病或事件发生的所有新老病例的数量。患病率表示为事件数为分子且风险人群为分母的比率。
术语发病率是指一段特定时间内的发展一些新疾病的风险的量度；在一段时间内新病例的数量，最好以分母表示为比例或比率。
根据“全国肺癌筛查试验”的肺癌的风险按年龄和吸烟史分类。高风险-年龄≥55岁和≥30包-年吸烟史；中等风险-年龄≥50岁和≥20包-年吸烟史；低风险-年龄<50岁或<20包-年吸烟史。
术语“阴性预测值”(NPV)是指阴性测试正确识别没有疾病的患者的概率，即真阴性的数量除以真阴性和假阴性的总和。如果其中患者可被视为其一部分的给定人群的患病率是已知的，具有足够PPV的测试的阳性结果可用于划入患者的疾病，而具有足够NPV的测试的阴性结果可用于排除疾病。
临床医生必须根据其内在性能参数(包括敏感性和特异性)及其外在性能参数(如阳性预测值和阴性预测值)决定使用诊断测试，这取决于疾病在特定人群中的患病率。
可能影响疾病可能性的临床评估的附加参数包括患者对已知药剂的先前频率和接近度，例如暴露风险，其直接或间接与疾病原因例如二手烟、辐射等以及还与肺结节的放射学外观或表征相关联，不包括大小。结节的描述可以包括实体、半实体或磨玻璃样结节，其基于CT扫描技术采用的相对灰度密度的光谱来表征它。
“质谱法”是指包括使用电离源从呈现在探针表面的样品上呈现的分析物产生气相离子并用质谱仪检测气相离子的方法。
技术液相色谱选择反应监测质谱(LC-SRM-MS)用于测定选择蛋白质组的表达水平，其中蛋白质在血液中发现。候选蛋白质列于表1中。
表1.
在本发明的一个实施例中，包含2种蛋白质的组被验证用于排除受试者的肺癌。在一些方面，蛋白质组包括从表1选择的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种蛋白质。在一些方面，肺结节约为1mm至80mm。例如，肺结节可以在8mm-30mm之间。
首先使用生物信息学和生物统计学分析来鉴定具有统计学显著差异表达的单个蛋白质，然后使用这些蛋白质衍生蛋白质或蛋白质组的一种或多种组合，与任何单个蛋白质相比，这些组合共同表现出优异的区分性能。生物信息学和生物统计学方法用于推导组中每个单独蛋白质的系数(C)，反映其相对表达水平，即增加或减少，以及关于组的净区分能力相对于其他蛋白质的权重或重要性。组的定量区分能力可以表示为数学算法，其中每个组成蛋白的项是其系数和蛋白质血浆表达水平(P)的乘积(通过LC-SRM-MS测量)，例如C×P，其中算法由n个蛋白质组成，描述为：C1×P1+C2×P2+C3×P3+...+Cn×Pn。以预定统计显著性水平区分疾病状态的算法可以指“疾病分类器”。除了具有差异表达的分类器的组成蛋白外，它还可以包括具有最小生物变异或没有生物学变异的蛋白质，以便能够在临床样本内或之间评估变异性或缺乏变异性；这些蛋白质可称为典型天然蛋白质，并作为其他分类蛋白质的内部对照。
在某些实施例中，通过MS测量肽表达水平。MS分析离子在其产生后通过其母体蛋白质的蒸发产生的质谱，并基于其质荷比与其他离子分离。获取MS数据的最常见模式是1)全扫描采集，产生典型的总离子电流图(TIC)，2)选择离子监测(SIM)，和3)选择反应监测(SRM)。
在本文提供的方法的某些实施例中，通过LC-SRM-MS测量生物标记物蛋白表达水平。LC-SRM-MS是具有有效地滤除除了期望分析物以外的所有分子和污染物的电势的串联质谱法的高选择性方法。如果分析样品是复杂混合物，其可能在限定的分析窗口内包含几种同量异位物质，这是特别有益的。LC-SRM-MS方法可以使用三重四极杆质谱仪，如本领域中已知的，其包括三个四极杆组。在第一个四极杆组中进行第一级质量选择，并且选择性传输的离子在第二个四极杆组中被碎片化。所得的跃迁(产物)离子被传送到第三个四极杆组，其执行第二级质量选择。通过第三四极杆组传输的产物离子由检测器测量，该检测器产生代表选择性传输的产物离子数的信号。调节施加到第一和第三四极杆的RF和DC电势以(分别)选择具有在窄的指定范围内的m/z值的前体和产物离子。通过指定适当的跃迁(前体和产物离子的m/z值)，可以以高灵敏度和选择性测量对应于靶蛋白的肽。信噪比优于传统的串联质谱(MS/MS)实验，该实验在第一个四极杆中选择一个质量窗口，然后测量离子检测器中所有生成的跃迁。LC-SRM-MS。
在某些实施例中，如本文所公开的用于诊断或监测肺癌的SRM-MS测定法可利用衍生自表1中列出的蛋白质的一种或多种肽和/或肽转变。在某些实施例中，所述测定可利用100或更多、150或更多、200或更多、250或更多、300或更多、345或更多、或371或更多种生物标记蛋白的肽和/或肽转变。在某些实施例中，每种生物标记物蛋白可以使用两种或更多种肽，并且在某些这些实施例中，可以使用四种或更多种肽中的三种或更多种。类似地，在某些实施例中，每个肽可以使用两个或更多个转变，并且在这些实施例的某些中每个肽可以使用三个或更多；四个或更多；或者五个或更多个转变。在一个实施例中，用于诊断肺癌的LC-SRM-MS测定法可测量对应于与每种生物标记物蛋白质相关的选定肽的五种转变的强度。可以根据在该分析期间观察到的信号强度估计每种肽的可实现的定量限(LOQ)。
生物标记物蛋白的表达水平可以使用本领域已知的任何合适的方法测量，包括但不限于质谱(MS)、反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)、微阵列、基因表达的系列分析(SAGE)、通过大规模平行签名测序基因(MPSS)的表达分析、免疫测定(例如，ELISA和其他基于抗体的检测方法)、免疫组织化学(IHC)、转录组学和蛋白质组学。
为了评估特定肽转变组的诊断性能，为每个显著转变产生ROC曲线。
这里使用的“ROC曲线”(受试者工作特性)是指二元分类器系统的真实阳性率(灵敏度)与假阳性率(特异性)的曲线图，因为其区分阈值是变化的。ROC曲线可以通过绘制阳性中的真阳性分数(TPR＝真阳性率)与阴性中的假阳性分数(FPR＝假阳性率)等效地表示。ROC曲线上的每个点代表对应于特定决策阈值的灵敏度/特异性对。图7和9提供了一组患病受试者和一组非患病受试者中生物标记物或生物标记物组敏感性和特异性值的分布之间的功能关系的图示。
AUC表示ROC曲线下的面积。AUC是1)生物标记物或生物标记物组和2)ROC曲线的诊断准确性的总体指示。AUC由“梯形规则”决定。对于给定的曲线，数据点通过直线段连接，垂直线从横坐标竖立到每个数据点，并且计算如此构造的三角形和梯形的面积之和。在本文提供的方法的某些实施例中，生物标记物蛋白的AUC为约0.75至1.0。在某些这些实施例中，AUC在约0.8至0.8、0.9至0.95或0.95至1.0的范围内。
如本文所用的术语“反转”是指双蛋白分类器中两种蛋白质的比例。
术语“医师癌症评估”(pCA)包括医生用于估计受试者中结节为癌症的概率的各种估计。例如，pCA可以基于医生的临床训练和经验，包括考虑来自CAT扫描(CT)的结节的外观和大小，患者的年龄和吸烟史。在某些情况下，pCA涉及使用采用上述相同因素的方程(即结节的外观和大小，患者的年龄和吸烟史)。例如，国家癌症研究所为医生提供评估癌症风险的工具(www.cancer.gov/resources-for/hp#rats)。虽然这些工具不是专门针对肺癌开发的，但这些评估中存在的一些变量是相关的，包括但不限于患者的病史或癌症家族史，癌症遗传易感性，年龄，种族和生活方式选择(通过吸烟或暴露于辐射接触致癌物质、饮食、免疫系统健康、获得预防性护理和健康检查等方面)。
本文提供的方法是微创的并且几乎没有或没有不利影响的风险。因此，它们可用于诊断、监测和提供未表现出任何肺病症状的受试者以及被分类为发展肺病的低风险的受试者的临床管理。例如，本文所公开的方法可用于诊断未患有PN和/或过去未呈现PN但仍被认为有发展PN和/或肺部疾病的风险的受试者的肺癌。类似地，本文公开的方法可以用作严格预防措施，以诊断被分类为发展肺病的低风险的健康受试者。
本发明提供了一种确定受试者的肺病症是癌症的可能性的方法，其通过测量从受试者获得的样品中的一组蛋白质的丰度；基于蛋白质测量计算癌症评分的概率，并且如果评分低于预定分数，则排除受试者的癌症，其中当排除癌症时，受试者不接受治疗方案。治疗方案包括例如肺功能测试(PFT)、肺成像、活组织检查、手术、化学疗法、放射疗法或其任何组合。在一些实施例中，成像是X射线、胸部计算机断层摄影(CT)扫描或正电子发射断层摄影(PET)扫描。
在另一方面，本发明进一步提供了一种确定受试者中存在肺病症的可能性的方法，其通过测量从受试者获得的样品中蛋白质组的丰度，基于蛋白质测量计算癌症评分的概率，以及如果评分等于或大于预定分数，则推断所述肺病症的存在。肺病症是肺癌，例如非小细胞肺癌(NSCLC)。有发展肺癌风险的受试者
在一些方面，所述组包括选自以下的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36种蛋白质：BGH3、C163A、LG3BP、GELS、IBP3、LUM、MASP1、PEDF、S10A6、TSP1、COIA1、ISLR、TETN、FRIL、GRP78、ALDOA、LRP1、FIBA、PRDX1、GSLG1、KIT、CD14、EF1A1、TENX、AIFM1、GGH、IBP3、ENPL、ERO1A、6PGD、ICAM1、PTPA、NCF4、SEM3G、1433T、RAP2B、MMP9、FOLH1、GSTP1、EF2、RAN、SODM、DSG2、FRIL、TSP1、LRP1、PRDX1、TETN、TBB3、COIA1、GGH、A1AG1、AIFM1、AMPN、CRP、GSLG1、IBP3、KIT、NRP1、6PGD、CH10、CLIC1、COF1、CSF1、CYTB、DMKN、DSG2、EREG、ERO1A、FOLH1、ILEU、K1C19、LYOX、MMP7、NCF4、PDIA3、PTGIS、PTPA、RAN、SCF、SEM3G、TBA1B、TCPA、TERA、TIMP1、TNF12和UGPA。
受试者患有或怀疑患有肺结节。肺结节的直径小于或等于3厘米。在一个实施例中，肺结节的直径为约0.8cm至2.0cm。受试者可能患有IA期肺癌(即肿瘤小于3cm)。
分子风险反转Ri的癌症风险预测因子Ci(k)如下确定
其中反转Ri的判定阈值Ti在表X中定义，并且结节患者的{Si(k)}的中值不大于15mm。
生物样品，例如组织、血液、血浆、血清、全血、尿液、唾液、生殖器分泌物、脑脊髓液、汗液和排泄物。
在一个方面，确定癌症的可能性由与分数相关的敏感性、特异性、阴性预测值或阳性预测值确定。确定的分数具有阴性预测值(NPV)至少约60％、至少70％或至少80％。
通过选择的反应监测质谱法，使用特异性结合被检测蛋白质的化合物或肽转变，进行测量步骤。在一个实施例中，与被测蛋白质特异性结合的化合物是抗体或适配体。
在具体的实施例中，本文公开的诊断方法用于排除受试者的治疗方案，测量从受试者获得的样品中的一组蛋白质的丰度，基于蛋白质测量计算癌症评分的概率，和如果样品中确定的分数低于预定分数，则排除受试者的治疗方案。在一些实施例中，该组包含至少2种选自ALDOA、FRIL、LG3BP、IBP3、LRP1、ISLR、TSP1、COIA1、GRP78、TETN、PRDX1和CD14的蛋白质。
在一些实施例中，如果排除癌症，则存在一段观察等待的时期。观察等待可包括定期跟踪检查以评估肺结节是否已改变特征。后续检查可包括例如血液测定、X射线、肺功能测试或CT扫描。
在某些实施例中，本文公开的诊断方法可以与其他临床评估方法组合使用，包括例如各种放射照相和/或侵入性方法。类似地，在某些实施例中，本文公开的诊断方法可用于鉴定其他临床评估方法的候选者，或评估受试者将从其他临床评估方法中受益的可能性。
生物样品(例如血浆或血清)中某些蛋白质的高丰度可能阻碍测定感兴趣的蛋白质的能力，特别是在感兴趣的蛋白质以相对低的浓度表达的情况下。有几种方法可以解决这个问题，包括富集、分离和耗尽。富集使用亲和剂通过分类从样品中提取蛋白质，例如通过糖捕获除去糖基化蛋白质。分离使用诸如凝胶电泳或等电聚焦的方法将样品分成多个部分，这些部分在蛋白质含量中基本上不重叠。耗尽通常使用亲和柱，通过利用诸如IgY14/Supermix(SigmaSt.Louis，MO)的先进技术去除血液中最丰富的蛋白质，例如白蛋白，该技术能够去除大多数最丰富的蛋白质。
在本文提供的方法的某些实施例中，可以在测定生物标记物或推定的生物标记物蛋白表达水平之前对生物样品进行富集、分离和/或耗尽。在某些这些实施例中，血液蛋白质最初可以通过糖捕获方法加工，其富集糖基化蛋白质，允许定量测定法检测高pg/ml至低ng/ml浓度范围的蛋白质。糖捕获的示例性方法是本领域熟知的(参见，例如，美国专利号7,183,188；美国专利申请公布号2007/0099251；美国专利申请公布号2007/0202539；美国专利申请公布号2007/0269895号；和美国专利申请公布号2010/0279382)。在其他实施例中，血液蛋白质可以最初通过蛋白质消耗方法处理，其允许通过去除丰富的蛋白质来检测样品中通常模糊的生物标记物。在一个这样的实施例中，蛋白质消耗方法是Supermix(Sigma)消耗方法。
在某些实施例中，生物标记物蛋白质组包含2至100种生物标记物蛋白质。在某些这些实施例中，组包括2至5、6至10、11至15、16至20、21至25、5至25、26至30、31至40、41至50、25至50、51至75、76至100种的生物标记物蛋白质。在某些实施例中，生物标记物蛋白质组包含一种或多种生物标记物蛋白质的子组，每个子组包含至少两种生物标记物蛋白质。例如，生物标记物蛋白质组可包含由在特定肺病症中过表达的生物标记物蛋白质组成的第一子组和由在特定肺病症中低表达的生物标记物蛋白质组成的第二子组。
在本文提供的方法、组合物和试剂盒的某些实施例中，生物标记物蛋白质可以是与肺癌一起表现出差异表达的蛋白质。例如，在某些实施例中，生物标记物蛋白可以是表1中列出的与肺癌相关的蛋白质之一。
在其他实施例中，本文公开的诊断方法可用于区分两种不同的肺病症。例如，该方法可用于将肺病症分类为恶性肺癌与良性肺癌，NSCLC与SCLC，或肺癌与非癌症病症(例如，炎性病症)。
在某些实施例中，提供试剂盒用于诊断受试者的肺病。这些试剂盒用于检测一种或多种生物标记物蛋白的表达水平。任选地，试剂盒可包含以标签或单独插页形式使用的说明书。试剂盒可含有特异性结合本文所述组中蛋白质的试剂。这些试剂可包括抗体。试剂盒还可以含有与本文所述的组中的mRNA表达蛋白特异性结合的试剂。这些试剂可包括核苷酸探针。试剂盒还可以包括用于检测特异性结合本文所述的蛋白质的试剂的试剂。这些试剂可包括荧光团。
Xpresys Lung
1.介绍
1.1背景
Xpresys Lung由Integrated Diagnostics，Inc.(InDi)开发已过去七年。该公司由具有系统生物学、计算机科学、化学和分子生物学背景的科学家创立。LeeHood，MD，PhD是联合创始人和董事会成员，拥有多项成就和奖项(en.wikipedia.org/wiki/Leroy_Hood)。领导团队和投资者经验丰富且资历丰厚(参见InDiDx.com)。
1.2 Xpresys Lung介绍性摘要
Xpresys Lung已被开发用于区分良性和恶性肺结节。Xpresys Lung是蛋白质的血液测试，结合了使用大数据集的蛋白质组学和计算机科学的专业知识。几十年来，质谱一直被用作分子诊断技术，仪器的最新进展允许一次测量数百种蛋白质[X.-J.Li,C.Hayward,P.-Y.Fong,M.Dominguez,S.W.Hunsucker,L.W.Lee,M.McLean,S.Law,H.Butler,M.Schirm,O.Gingras,J.Lamontagne,R.Allard,D.Chelsky,N.D.Price,S.Lam,P.P.Massion,H.Pass,W.N.Rom,A.Vachani,K.C.Fang,L.Hood和P.Kearney,"A Blood-Based ProteomicClassifier for the Molecular Characterization of Pulmonary Nodules,"ScienceTranslational Medicine,vol.5,no.207,p.207ra142,2013]癌症分泌并流出与正常细胞不同的蛋白质，并且这些蛋白质的一些在血液中循环。InDi开始于388种蛋白质候选物和从患有良性和恶性肺结节的两种患者中存储的血液样品。最初的分析使用11种蛋白质的组合发现并验证良性结节的预测因子[A.Vachani,H.I.Pass,W.N.Rom,D.E.Medthun,E.S.Edell,M.Laviolette,X.-J.Li,P.-Y.Fong,S.W.Hunsucker,C.Hayward,P.J.Mazzone,D.K.Madtes,Y.E.Miller,M.G.Walker,J.Shi,P.Kearney,K.C.Fang和P.P.Massion,"Validation of a Multiprotein Plasma Classifier to Identify Benign LungNodules,"Journal of Thoracic Oncology,vol.10,no.4,第629-637页,2015]。XpresysLung第一版(XL1)提供了超过医生用于区分良性和恶性肺结节的临床风险因素的显著性能。InDi现已完成了方案采集的血液样品的进一步工作，以完善第二版Xpresys Lung(XL2)，其是一种确定哪些结节是良性的稳健测试。
这个新版本XL2以四种方式改进XL1，如第3.7节所述。它们是：1)精确的预期用途人口；2)鉴定在鉴定良性肺结节中最准确的前11种蛋白质中的2种；3)纳入五个临床风险因素；和4)基于两项大型前瞻性研究的发现和验证，其中使用统一的方案而不是归档生物库来收集样品。
XL2实现了识别良性结节的高性能。在98％的阴性预测值(NPV)下，灵敏度为97％(表H，第3.6节)。这种改进的测试性能明显优于PET(NPV为79％(CI：66％-88％)(第3.3.3.3节)。XL2的表现明显优于四种临床风险预测因子(Mayo、VA、Brock和Herder)(第3.3.3.2节)。XL2将为医生提供最好的证据，以确定哪些结节是良性的。
XL2将位于PET、支气管镜检查、穿刺活检和手术之前(第2.4.2节)。来自XL2的高NPV值的置信度将指导更多患有良性结节的患者进入CT监测。这将实现Xpresys Lung的目标：避免不必要的进一步评估良性结节，尤其是侵入性手术。
XL2的预计临床效用是侵入性手术减少36％(第2.4.1节)。这些侵入性手术的减少将减少手术、手术死亡率和活检并发症住院治疗(第2.4.3节)。
在确定覆盖范围后，InDi打算进行前瞻性介入试验。该试验将证实XL2产生的结果在医疗保健服务情况中具有临床效用。该试验总结在第4节。
2.Xpresys Lung的临床方面和肺结节
2.1 Xpresys Lung预期用途和描述
2.1.1预期用途
Xpresys Lung版本2(XL2)用于评估40岁或40岁以上患者的8-30mm肺结节，其中医生估计癌症风险较低(癌症的预测概率为0至50％)。Xpresys Lung的目标是识别那些可能是良性的结节，这样可以通过CT监测安全地观察这些结节，而不是进行昂贵且有风险的侵入性手术，如活组织检查和手术。
2.1.2 Xpresys Lung的描述
XL2是一种风险预测因子，可将分子(蛋白质组学)测量与临床风险因素相结合。测量与癌症或良性过程相关的蛋白质。这些蛋白质从肺中的细胞分泌或流出，并在血浆样品中测量。XL2结果将报告为可能良性(90-98％阴性预测值)或不确定(测试后癌症风险并未显著低于癌症的测试前风险)。详情请参阅第3.6节。
2.2肺结节的未满足需求显著且增长
2.2.1肺结节
2.2.1.1定义
肺结节是通过X射线成像看到的圆形致密物。X射线成像可以是胸片(CXR)或计算机辅助断层扫描(CAT扫描)。结节主要被肺组织包围，也称为硬币病变，孤立性肺结节或病变，或肺部的“斑点”。直径大于30毫米的圆形致密物是肺肿块，而不是结节。结节的边缘可以描述为光滑或不规则(星状或带状的)，并且不规则的边缘更多地指示癌症。具有光滑边缘的重度钙化结节通常是良性的，并且未显示出随时间增长的实体结节被认为是良性的。使用改进的CT成像，现在可以看到亚实性结节、磨玻璃样不透明物或部分实性结节，并有不同的指南。本申请的重点是8-30毫米的实体结节，而不是亚实体结节。
有关结节及其评估的全面综述，请参阅Patel等人的两部分系列文章。[V.K.Patel,S.K.Naik,D.P.Naidich,W.D.Travis,J.A.Weingarten,R.Lazzaro,D.D.Gutterman,C.Wentowski,H.B.Grosu和S.Raoof,"A Practical AlgorithmicApproach to the Diagnosis and Management of Solitary Pulmonary Nodules.Part1:Radiologic Characteristics and Imaging Modalities,"Chest,vol.143,no.3,第825-339页,2013；V.K.Patel,S.K.Naik,D.P.Naidich,W.D.Travis,J.A.Weingarten,R.Lazzaro,D.D.Gutterman,C.Wentowski,H.B.Grosu和S.Raoof,"A PracticalAlgorithmic Approach to the Diagnosis and Management of Solitary PulmonaryNodules.Part 2:Pretest Probabiity and Algorithm,"Chest,vol.143,no.3,pp.840-846,2013]。
2.2.1.2每年检测的结节数
在美国每年检测到的新肺结节估计数为157万[M.K.Gould,T.Tang,I.-L.A.Liu,J.Lee,C.Zheng,K.N.Danforth,A.E.Kosco,J.L.Di Fiore和D.E.Suh,"Recent Trends inthe Identification of Incidental Pulmonary Nodules,"American Journal ofRespiratory and Critical Care Medicine,vol.192,no.10,第1208-1214页,2015]。由于包括CT扫描技术改进和进行的更多CT扫描在内的多种因素的结合，新肺结节的数量一直在增加。157万的估计是对于直径为4-30毫米的结节；8-30毫米结节的估计是每年800,000。
2.2.1.3偶然和筛查的结节
上述估计每年有157万个结节，仅是对于偶然发现的结节，不包括另外150万个筛查结节。偶然意味着成像是由于结节检测以外的原因而进行的。例如，心脏、上腹部和甚至乳房X线照相术的成像包括肺组织，因此肺结节是偶然的发现。
肺癌筛查目前在美国已有报道。截至2016年4月26日，共有806个网站注册用于筛选(www.acr.org/quality-safety/national-radiology-data-registry/lung-cancer-screening-registry-请参阅核心文件，2016年6月20日访问)。初步估计，一旦筛查计划到位，每年将发现另外150万个结节。全国肺部筛查试验(NSLT)的筛查阳性率为24％，估计美国有700万人符合NSLT入选标准[The National Lung Screening Trial Research Team,"Reduced Lung-Cancer Mortality with Low-Dose Computed Tomographic Screening,"The New England Journal of Medicine,vol.365,pp.395-409,2011]。
2.2.1.4肺结节“流行病”和保健
早期发现肺结节是降低肺癌死亡率的一个很好的机会，但它具有重大风险。这些风险既适用于患者，也适用于医疗保健。对于患者来说，一个主要问题是不必要的侵入性手术的风险，以找到少数癌症结节。XL2解决了这些可避免的程序。
对于医疗保健服务，风险既是成本又是医疗保健系统超负荷。大多数结节患者将超过65岁。在NLST中，超过57％的NSLT登记者年龄超过65岁。结节检测率随着年龄的增长而急剧增加，至少到89岁。因此，医疗保险登记者更有可能符合肺癌筛查标准并且检测到更多的结节。如果结节≥8mm，则表明了进一步测试，XL2解决了这些可避免的程序。
2.2.1.5与医疗保险人口的相关性
在每年偶然发现或通过肺癌筛查发现的300万个结节中，大多数将是医疗保险年龄。最近的四项研究强调了肺癌评估对医疗保险人群的重要性：
·在18个站点回顾性图表回顾性研究中，377名符合条件的患者的平均年龄为65[M.T.Tanner,J.Aggarwal,M.K.Gould,P.Kearney,G.Diette,A.Vachini,K.C.Fang和G.A.Silvestri,"Management of Pulmonary Nodules by Community Pulmonologists.AMulticenter Observational Study,"Chest,vol.148,no.6,pp.1405-1414,2015]。所有患者的结节直径为8-20mm。
·一项针对12个站点和475名患者的前瞻性研究发现，62.5％的患者为65岁或以上[A.Vachani,Z.Hammoud,S.Springmeyer,N.Cohen,D.Nguyen,C.Williamson,S.Starnes,S.Hunsucker,S.Law,X.-J.Li,A.Porter和P.Kearney,"Clinical Utility of a PlasmaProtein Classifier for Indeterminate Lung Nodules,"Lung,vol.193,no.6,pp.1023-1027,2015]。所有患者的结节直径为8-30mm。
·在33个站点和685名患者的前瞻性研究中，超过50％的患者为65岁或以上(PANOPTIC研究)。所有患者的结节直径为8-30mm。
·最近的一项研究报告称，在2009年1月至2011年12月期间，来自5％医保理赔的随机抽样的8,979名医疗保险患者因胸部CT扫描异常而接受了肺癌评估[T.Lokhandwala,M.A.Bittoni,R.A.Dann,A.O.D'Souza,M.Johnson,R.J.Nagy,R.B.Lanman,R.E.Merritt和D.P.Carbone,"Costs of Diagnostic Assessment for Lung Cancer:A Medicare ClaimsAnalysis,"Clinical Lung Cancer,2016]。
2.2.2肺结节评估：现行做法和改进需求
2.2.2.1指南
各组已公布肺结节评估指南[H.MacMahon,J.H.Austin,G.Gamsu,C.J.Herold,J.R.Jett,D.P.Naidich,E.F.Patz和S.J.Swensen,"Guidelines for Management ofSmall Pulmonary Nodules Detected on CT Scans:A Statement from the FleischnerSociety,"Radiology,vol.237,no.2,pp.395-400,2005；M.K.Gould,J.Donington,W.R.Lynch,P.J.Mazzone,D.E.Midthun,D.P.Naidich和R.S.Wiener,"Evaluation ofIndividuals With Pulmonary Nodules:When Is It Lung Cancer？:Diagnosis andManagement of Lung Cancer,3rd ed:American Cllege of Chest PhysiciansEvidence-Based Clinical Practice Guidelines,"Chest,vol.143,no.5_suppl,pp.e93S-e120S,2013；M.E.Callister,D.R.Baldwin,A.R.Akram,S.Barnard,P.Cane,J.Draffan,K.Franks,F.Gleeson,R.Graham,P.Malhotra,M.Prokop,K.Rodger,M.Subesinghe,D.Waller和I.Woolhouse,"British Thoracic Society Guidelines Forthe Investigation and Management of Pulmonary Nodules,"Thorax,vol.70,no.Suppl2,pp.ii1-ii54,2015]。美国胸科医师学会(ACCP)发布并更新了一套关于肺癌的指南。2013年更新的ACCP肺结节指南是美国肺病学家使用的主要参考。重点关注ACCP 4.0节关于≥8mm结节，Xpresys Lung的预期用途。
2.2.2.2 8-30mm“不确定”结节的一般方法
用胸部CT扫描以外的成像发现结节(第2.2.1.3节)。因此，经常需要对结节进行高分辨率成像的胸部CT。单独的CT发现或之前的图像可能表明结节是良性的。Patel及其同事已经综述了结节的成像和鉴别诊断的细节。当单独的CT成像不是确定性的时，结节被描述为“不确定的”。
在任何结节被确定为良性之前，使用专家评审员在344个结节的回顾性研究中研究CT成像准确性[J.W.Fletcher,S.M.Kymes,M.Gould,N.Alzraki,R.E.Coleman,V.J.Lowe,C.Marn,G.Segall,L.A.Thet和K.Lee,"A Comparison of the Diagnostic Accuracy of{18]F-FDG PET and CT in the Characterization of Solitary Pulmonary Nodules,"Journal of Nuclear Medicine,vol.49,pp.179-185,2008.]。CT结果(排除128[27％]而没有“参考标准”或“不确定结果”之后)显示敏感性为95.6％(95％CI，91.3％-97.9％)，特异性为40.6％(95％CI，33.0％-48.7％)。预计一般放射科医师对不确定结节的CT解释结果较差。
大多数8-30毫米的结节是不确定的。ACCP指南指出：“虽然临床和放射学[CT扫描]特征不能可靠地区分大多数人的良性和恶性结节，但在订购影像学检查或活组织检查程序之前估计恶性肿瘤的临床概率仍然很重要”。通过临床判断或定量风险模型估计恶性肿瘤的预测概率(pCA)(参见第2.2.4节)。建立pCA创建三个分组(不包括高手术风险的患者)，低、中和高概率。指南修订版之间的确切数字发生了变化，但相似，pCA<5％为低，>65％pCA为高。一般的概念是，如果结节是恶性的，将通过进一步的CT监测观察低风险患者以观察生长。
相反，指南建议高风险组的患者直接接受手术治疗。逻辑是癌症的概率足够高，以致阴性活组织检查不会改变护理途径。
建议中级风险组(5-65％pCA)通常在下一步进行PET扫描进入诊断性阶段。阴性PET表明良性结节，因此患者随后进行CT扫描。阳性PET扫描继续进行手术或活组织检查。这是整体概念，但PET具有敏感性和特异性问题，如第2.2.6节所述。
2.2.2.3指南和当前实践中的问题
指南在概念上是好的，但是它主要基于弱的证据，并且有证据表明它们没有被遵循。
该指南基于薄弱的证据。ACCP指南使用GRADE系统，大多数关于≥8mm结节的建议都是2C，这是一个低质量证据的弱推荐。有3项建议属于1C级，这是一项强有力的低质量证据推荐，其是：征求患者偏好，如果有恶性增长证据则进行进一步评估，以及偏好胸腔镜而不是打开活检。
有大量证据表明没有遵循指南[D.R.Baldwin,"Development of Guidelines forthe Management of Pulmonary Nodules:Toward Better Implementation,"Chest,vol.148,no.6,pp.1365-1367,2015；R.S.Wiener,M.K.Gould,C.G.Slatore,B.G.Fincke,L.M.Schwartz和S.Woloshin,"Resource Use and Guideline Concordance inEvaluation of Pulmonary Nodules for Cancer:Too Much and Too Little Care,"JAMAInternal Medicine,vol.174,no.6,pp.871-880,2014]。一项针对15家退伍军人医院和300名患者的回顾性群组研究发现，只有45％的患者对结节的护理符合指南。一项肺部社区实践对18项实践和377名患者的观察性记录概述发现，结节管理有很大差异。良性结节的手术率为35％，手术率对于低、中、高危患者相同。风险类别由研究计算，尽管风险较低，但28％有活检，17％有手术。此外，CT监测观察到的恶性结节率为24.5％，导致诊断延误的风险。
如Vachani等人所总结的，良性结节的手术率在10％至55％之间，他们发表了一项来自196名肺病学家的调查，这些调查支持非侵入性生物标记物对管理决策的强烈和独立影响的潜力[A.Vachani,N.T.Tanner,J.Aggarwal,C.Mathews,P.Kearney,K.C.Fang,G.Silvestri和G.B.Diette,"Factors That Influence Physician Decision Making forIndeterminate Pulmonary Nodules,"Annals of the American Thoracic Society,vol.11,no.10,pp.1586-1591,2014]。由于与手术相关的发病率和死亡率，良性结节的高手术率是有问题的。手术风险数据取决于人口和使用的程序。医保年龄患者肺叶切除术后的手术死亡率估计值为2-3％(第2.4.3.2节)。
因此，目前的做法有明显的改进机会。在社区实践中，良性结节的可避免的手术率为35％[7]，以及据报道高达55％。可避免的PET扫描、活组织检查和手术的高比率分别在第2.4.1.3节、第2.4.3.1节和第2.4.3.2节中讨论。
2.2.3医师预测试癌症概率(pCA)，降低癌症风险组和未满足的需求
该指南建议通过临床判断或使用诸如Mayo方程等模型来确定恶性肿瘤的预测概率(pCA)[S.J.Swensen,M.D.Silverstein,D.M.Ilstrup,C.D.Schleck和E.S.Edell,"TheProbbility of Malignancy in Solitary Pulmonary Nodules.Application to SmallRadiologically Indeterminate Nodules,"Archives of Internal Medicine,vol.157,no.8,pp.849-855,1997；S.J.Swensen,M.D.Silverstein,E.S.Edell,V.F.Trastek,G.L.Aughenbaugh,D.M.Ilstrup和C.D.Schleck,"Solitary Pulmonary Nodules:ClinicalPrediction Model Versus Physicians,"Mayo Clinic Proceedings,vol.74,no.4,pp.319-329,1999]。肺病专家统一使用他们的临床判断来分配pCA[R.S.Wiener,C.G.Slatore,C.Gillespie和J.A.Clark,"Pulmonologists'Reported Use of Guidelinesand Shared Decision-making in Evaluation of Pulmonary Nodules:A QualitativeStudy,"Chest,vol.148,no.6,pp.1415-1421,2015],而其他医生没有确定pCA[S.E.Golden,R.S.Wiener,D.Sullivan,L.Ganzini和C.G.Slatore,"Primary CareProviders and a System Problem:A Qualitative Study of Clinicians Caring forPatients With Incidental Pulmonary Nodules,"Chest,vol.148,no.6,pp.1422-1429,2015]。
PANOPTIC试验(第2.3节)在临床呈现时、CT扫描后和其他试验前收集pCA结果。该研究中的医生在80％的时间内使用他们的临床判断，并且明显优于最常使用的两种定量风险模型VA[M.K.Gould,L.Ananth和P.G.Barnett,"A Clinical Model to Estimate thePretest Probability of Lung Cancer in Patients with Solitary PulmonaryNodules,"Chest,vol.131,no.2,pp.383-388,2007]和Mayo,(AUC 0.85vs 0.75(VA)p<0.001以及vs 0.78(Mayo)p＝0.011)。这表明医生pCA最适合将患有结节的患者分离到更高和更低的癌症风险组，例如50％或更低的癌症风险的pCA(XL2的预期用途组)。
对医生pCA数据的进一步分析阐明了对XL2的需求。如图24所示，医生擅长将大多数癌性结节放入pCA大于50％，大多数良性结节放入pCA 50％或更低。然而，大多数良性结节不属于建议进行CT监测的低风险(0-5％pCA)类别。大多数良性结节属于建议进一步评估的中度风险类别。这些评估导致许多良性结节经历风险和昂贵的程序。在PANOPTIC中，33个研究站点几乎都是学术中心和综合健康网络，但良性结节手术率为18％，良性结节活检率为30％。社区肺部实践(大多数患者接受护理)的可比数据是35％的手术是在良性结节上进行的，62％的活组织检查是在良性结节上进行的。
因此，未满足的需求是为治疗医师提供低风险结节的测试(pCA为50％或更低)。对于良性结节，该测试应具有高的阴性预测值(NPV)结果。然后，测试结果表明结节是低风险(0-5％pCA)，建议进行CT监测。
2.2.3.1低风险患者的医师pCA
如图24所示，医生很好地确定了所有结节(整个风险人群)的风险，AUC为85％。然而，他们并没有风险较低(pCA 50％或更低)患者(n＝178，29例癌症和149例良性结节)那么好。在那些风险较低的患者中，医生AUC为0.69，并在图28中以图形方式显示，第3.3.4.1节。
大多数这些良性结节属于中度风险人群，其中指南建议进一步评估。如果遵循这些指南，149名良性结节患者中的大多数将进行可避免的成像和活组织检查。这强调了对XL2的需求，并在临床实用程序的第2.4和3.4节中进一步讨论。
2.2.4定量癌症风险模型
PANOPTIC结果显示，医生在分配癌症风险预测概率(pCA)方面优于定量模型。肺结节癌症风险的主要因素是大小。图25显示了与大小相关的癌症患病率的增加。其他主要因素是吸烟史和年龄。由于CT筛查刚刚在美国实施，大多数风险模型是针对偶然结节而不是筛查到的结节开发的。
2.2.4.1偶然结节模型
Mayo诊所和退伍军人管理局(VA)医院小组已经开发出基于相似但不相同的因素的预测模型。VA模型中癌症的患病率相当高，因此其不同地进行。这些和其他模型已在ACCP2013指南中进行了总结，并对Mayo模型提供了支持。指南第4.1节的第一句内容为：“虽然临床和影像学特征无法可靠地区分大多数人的良性和恶性结节，但在订购检查或活组织检查程序之前估计恶性肿瘤的临床概率仍然很重要。”
2.2.4.2筛查的结节
利用两项加拿大肺癌筛查试验，McWilliams发表了一组AUC>0.90的定量方程[A.McWilliams,M.C.Tammemagi,J.R.Mayo,H.Roberts,G.Liu,K.Soghrati,K.Yasufuku,S.Martel,F.Laberge,M.Gingras,S.Atkar-Khattra,C.D.Berg,K.Evans,R.Finley,J.Yee,J.English,P.Nasute,J.Goffin,S.Puksa,L.Stewart,S.Tsai,M.R.Johnston,D.Manos,G.Nicholas,G.D.Goss,J.M.Seely,K.Amjadi,A.Tremblay,P.Burrowes,P.MacEachern,R.Bhatia,M.-S.Tsao和S.Lam,"Probability of Cancer in Pulmonary NodulesDetected on First Screening CT,"The New England Journal of Medicine,vol.369,no.10,pp.910-919,2013]。方程可通过布鲁克大学获得。合并数据包括2,961名患者，但只有144名(<5％)结节是恶性的。它们包括亚实体结节，但79％是实体。平均结节大小为4.1mm，中位数为3.4mm，与癌症比例较低一致。该模型中癌症的预测因子包括年龄较大、女性、肺癌家族史、肺气肿、结节大小较大、上叶结节位置、部分实性结节类型、结节数较低和推测。
McWilliams的论文建议将他们的方程用于基线筛查、低剂量CT扫描(而不是偶然发现的结节)的结节。
2.2.5用于放射科医师和CT扫描结节报告的指南；Lung-RADS和Fleishner
有放射科医师使用的关于报告肺结节和随访成像间隔的指南。偶然结节<8mm的指南来自Fleishner Society。针对偶然发现的结节开发了Fleishner指南。
美国放射学院对肺癌筛查计划的指南是Lung-RADS(www.acr.org/Quality- Safety/Resources/LungRADS)。Lung-RADS的开发旨在改善对临床医生的报告和管理建议。一个目标是减少需要进一步评估的假阳性报告的数量，而不增加假阴性。根据文献，如在NLST中使用的，他们将被认为是“阳性”的结节的大小从4mm改变为6mm。Lung-RADS的另一个目标是基于结节大小、CT成像密度以及结节是否存在于基线、扩大或随访时新的肺癌筛查计划的结构化报告系统。Lung-RADS不包括临床医生使用的其他临床因素，如吸烟史、年龄、结节位置或暴露(例如石棉)。
2.2.6 PET扫描
正电子发射断层扫描与造影剂(PET)在肺癌分期中很有用，但PET对肺结节的诊断具有显著的局限性。这些局限是缺乏灵敏度，特别是对于较小的结节，非标准化的阅读和报告，以及炎症和感染性结节的假阳性扫描。
2.2.6.1 PET灵敏度。较小的结节难以成像，PET最初仅限于>10mm的结节。低代谢恶性肿瘤中的小结节和低对比度摄取是PET成像灵敏度的主要限制。单中心PET经验报告的初始灵敏度估计为95％。在2007年ACCP审查时，估计下降到87％。目前的估计值范围为72％至94％，并在2013年ACCP指南的4.2.3节中进行了概述。2014年的一项荟萃分析报告，当包括传染性肺病区域时，汇总灵敏度为89％(95％CI，86％-91％)和高度异质性[S.A.Deppen,J.D.Blume,C.D.Kensinger,A.M.Morgan,M.C.Aldrich,P.P.Massion,R.C.Walker,M.L.McPheeters,J.B.Putnam和E.L.Grogan,"Accuracy of FDG-PET to Diagnose LungCancer in Areas With Infectious Lung Disease.A Meta-analysis,"JAMA,vol.312,no.12,pp.1227-1236,2014]。
关于结节的PET的早期出版物令人鼓舞，因此2007年的ACCP指南给予PET证据等级2A，但对证据质量和偏倚风险的担忧降低了对2C级的建议[V.S.Nair,V.Sundaram,M.K.Gould和M.Desai,"Utilization of[18F]FDG PET Imaging in the National LungScreening Trial,"Chest,2016]。Patel的评论文章最初表明PET“非常准确”，但在对最新数据进行总结之后，他们强调了PET的缺点，并增加了PET最适合具有“中间”pCA的结节的限制。最近一项使用NLST数据的研究显示PET用于结节的患者占14,195例患者的11％，但在21％的病例中仍然存在不适当的PET使用，这表明小结节的过度使用以及担心导致医疗费用过高。
最近PET已与CT结合以提高分辨率，因此尺寸限制已重新规定为8-10mm。预计该组合将改善结果，但成本增加且辐射暴露更高(第2.2.6.4节)
2.2.6.2 PET的报告有变化，并且通常只是主观报告。由于造影剂中的同位素降解(氟-18的半衰期约为110分钟)，给患者施用的剂量取决于同位素产生时的接近程度。因此，阳性或阴性PET的程度取决于正常高代谢区域的摄取与所讨论的区域的比较。这种比较通常只是主观报告，但可以测量。产生测量值，即标准摄取值(SUV)。SUV值大于2.5被认为是阳性。一些出版物，如Herder[G.J.Herder,H.van Tinteren,R.P.Golding,P.J.Kostense,E.F.Comans,E.F.Smit和O.S.Hoekstra,"Clinical Prediction Model to CharacterizePulmonary Nodules:Validation and Added Value of 18F-FluorodeoxyglucosePositron Emission Tomography,"Chest,vol.128,no.4,pp.2490-2496,2005]仅报告了四点描述性量度的主观结果，没有SUV值。随后的出版物必须使用SUV值以相似的量度进行猜测。例如，这些出版物之一(Al-Ameri)[A.Al-Ameri,P.Malhotra,H.Thygesen,P.K.Plant,S.Vaidyanathan,S.Karthik,A.Scarsbrook和M.E.Callister,"Risk of Malignancy inPulmonary Nodules:A Validation Study of Four Prediction Models,"Lung Cancer,vol.89,no.1,pp.27-30,2015]使用了3分制(division scale)的SUV，效果很好。然而，该论文未报告其139位PET扫描患者的结节的平均或中位数大小以及评估的结节数量。在总共244名患者中，他们报告188例患有单发结节(可能是其余部分有多发结节)，103例患者中最大结节≤10mm，且该研究没有解决PET灵敏度问题，其似乎有许多较小的结节。因此，很难得出结论或与公开基本结节特征(如结节大小)的其他研究相比较。
因此，这些示例出版物Herder和Al-Ameri强调了在PET解释和报告中缺乏跨站点和医生的标准化。
2.2.6.3结节的假阳性扫描是另一个问题。对社区实践的Tanner图表审查发现假阳性PET扫描率为39％。另外值得注意的是，37％的患者进行了PET扫描，并且和与监测相比，活检和手术强度增加相关(P<.0001)。
Deppen报告了一项荟萃分析，其中包括传染性肺病的流行区域。除了关于肺结节诊断准确性的极端异质性外，流行区的特异性仅为61％，而非流行区为77％。他们得出结论，他们的数据不支持使用FDP-PET诊断流行地区的肺癌。美国的这些流行地区包括密西西比河、俄亥俄州和密苏里河流域地区以及美国西南部地区，包括加利福尼亚中央山谷。
2.2.6.4 PET是非侵入性的，但不是无风险的。单独PET的辐射剂量在14mSv时是显著的。当与CT结合时，如通常那样，剂量增加至24mSv。为了比较，用于筛选的低剂量CT是1.4mSv。
2.3.支持Xpresys Lung的InDi临床研究
Integrated Diagnostics(InDi)与领先的医生和科学家合作，在主要期刊和会议上制作同行评审出版物和演示文稿。该研究是在分子诊断、肺癌和肺结节领域的主要领导者的合作下构思、设计和实施的。这些努力将在此所附出版物中概述其结果的细节。XL2的结果以及与现有评估工具的比较见第3节。
2.3.1 XL1的发现、核实和验证
Xpresys Lung的最初发现始于388种候选蛋白，并为其中371种开发了一种检测方法。第一个样品是来自3个站点(n＝143)的冷冻血浆，并且鉴定了36个合作蛋白用于分类器。核实来自4个站点(n＝104)的13种蛋白质，并且随着发现工作在2013年发表在ScienceTranslational Medicine[1]上。此时，确定该系统生物学和蛋白质组学方法最适合排除8至30mm大小的结节中的恶性肿瘤。用11种蛋白质验证XL1，其中5种是诊断性的，6种用于标准化，使用4个站点的新档案样品(n＝141)，并在2015年发表在Journal of ThoracicOncology[2]上。
2.3.2调查和图表总结
InDi与波士顿医疗保健公司签订合同，对肺科医生进行调查，以确定他们的实践模式以及对肺结节生物标记物的潜在接受程度。需求和接受度在2014年得到确认并公布。
波士顿医疗保健公司还收集了社区肺实践综合图表总结数据，以了解大多数肺结节的管理实践模式。对来自18个地理位置不同的站点的377名患者的结节管理进行了评估。结果已在国家会议上公布，并于2015年发布[10]。特别值得注意的是发现良性结节的活检率为61％，手术率为35％。
2.3.3分析验证
分析验证已于2015年进行并发布[X.-J.Li,L.W.Lee,C.Hayward,M.-Y.Brusniak,P.-Y.Fong,M.McLean,J.Mulligan,D.Spicer,K.C.Fang,S.W.Hunsucker和P.Kearney,"AnIntegrated Quantification Method to Increase the Precision,Rocustness,andResolution of Protein Measurement in Human Plasma Samples,"ClinicalProteomics,vol.12,no.3,2015]。
2.3.4临床实用和XL2的发现/验证
研究1013是一项从2012年开始的前瞻性研究，招募了来自12个站点的475名患者。该研究是独特的，因为它包括正在接受确定肺结节是良性还是癌性的程序的患者。因此，可以进行组织诊断，如果使用Xpresys Lung，可以评估侵入性操作的使用可能发生的变化。如果遵循XL1结果，主要发现是减少32％，但24％的恶性结节将被送往CT监测。
研究1013结果也用于发现XL2(3.1节)。
2.3.5 PANOPTIC和XL2验证研究1001(PANOPTIC)也开始于2012年并从33个站点招收685名患者。该研究包括在开始任何诊断测试之前的所有预期用途结节。该研究是独特的，因为收集了医生预测癌症概率(pCA)。数据用于验证XL2(第3.1节)，并在本文档中提供性能和比较数据。
2.4临床实用性、XL2的预期临床使用和XL2对侵入性手术的影响
2.4.1临床实用性
XL2是一种稳健的测试，用于确定哪些低风险结节是良性的。XL2解决的临床需求是将更多患有良性结节的患者适当地放入CT监测中。这将避免不必要的成像和侵入性程序，这是XL2的主要临床实用性。PANOPTIC试验的结果可用于估计XL2在许多阴性预测值(NPV)中的作用(表H，第3.6节)。在这里，我们将使用98％的NPV值并讨论临床背景。使用98％的NPV，因为大多数可能的良性报告的NPV为98％(表H，第3.6节)。
2.4.1.1 98％NPV的临床实用性
在NPV为98％时，XL2的灵敏度为97％，特异性为44％(表D，第3.2节)。如果XL2用于所有低风险结节(n＝178)，PANOPTIC对良性结节侵入性操作的减少将为36％(42个中的15个)(3.4节)。
测试的患者数量为178名患者，69名(39％)将接受“可能良性”测试结果，98％概率(NPV)为良性。非常高的NPV可能会导致单独的CT监视。
低风险组中有29个恶性结节，29个中有13个(45％)被临床医生送往CT监测。在98％NPV水平使用XL2可使1名患者(3％)接受CT监测(表G，第3.4节)。
2.4.1.2临床实用性和PET扫描
在NPV水平为98％时，使用XL2可以避免在良性结节患者中获得56例(36％)PET扫描中的21例。在同一组中，对恶性结节进行了19次PET扫描，然后将其错误地送至CT监视。使用XL2会减少到仅1次PET扫描，然后进行CT监测。
2.4.2 XL2测试的预期临床使用和时间安排
Integrated Diagnostics(InDi)计划将XL2推广给学术和社区的肺病学家。XL2的主要目标是减少预期使用人群中可避免的成像和良性结节的程序。测试结果文件(第3.6节)将报告阴性预测值90-98％作为实际值，并报告为“可能良性”。然后，订购医生可以决定患者适当的风险等级。如果患者对手术不利，可以选择较低的NPV结果，例如95％。相反，如果患者对监测CT的观察期非常不利，那么可能需要98％的NPV结果来决定CT监测。
2.4.2.1 XL2测试的时间安排
Xpresys Lung 2将在几个点之一用于评估患者结节。大多数情况下，XL2将用于CT扫描后和任何其他成像(如PET)之前的低风险不确定结节(第2.2.2.2节)。如果在PET扫描之前进行，则PANOPTIC中的XL2显示出有利的临床效用(第2.4.1.2节)。这种使用可以避免PET的费用和高辐射的风险(2.2.6.4)。
XL2也可用于有侵入性手术或手术禁忌症的患者，然后再决定进行CT监测或照射等经验性治疗。
2.4.3 XL2影响对不确定结节的侵入性程序
在本节中，InDi将评估XL2对侵入性程序的影响以及与这些程序相关的发病率和死亡率。
有两种类型的侵入性诊断程序：活组织检查和手术切除。
2.4.3.1结节活检
可以通过支气管镜或穿过胸壁的针以CT图像引导获得活组织检查。社区实践图表审查发现，38％的患者进行了活检。活组织检查或手术并发症随着年龄、吸烟史和其他肺部疾病而增加。
通过支气管镜进行活检的风险最低，出血或气胸的风险为2-4％。该程序的缺点是结节的取样不准确。正确的采样平均值约为50％。采用现代导航技术可以提高正确的采样率。用于结节的支气管镜活检目前约占结节的20％。
大约15％的结节患者进行针吸活检，出血风险为1％，气胸风险为15-19％[R.S.Wiener,L.M.Schwartz,S.Woloshin和G.Welch,"Population-Based Risk forComplications After Transthoracic Needle Lung Biopsy of a Pulmonary Nodule:AnAnalysis of Discharge Records,"Annals of Internal Medicine,vol.155,no.3,pp.137-144,2011]。大约一半(7％)的气胸患者需要胸管放置并且住院时间很长。大多数针活组织检查是诊断性的，但恶性结节的非诊断结果的风险约为20％。
活组织检查(联合支气管镜检查和针头)在约25％的结节(200,000)中进行，程序用于良性结节，占42-62％(104,000)。活组织检查的并发症导致住院率为2-7％(支气管镜检查和穿刺活检并发症的范围，中位数为4.5％)。这意味着每年有4,680次超额住院治疗(104,000x.045)可能是可以避免的。
2.4.3.2结节手术
最终，大多数恶性结节进行手术切除，约15-25％的患者在手术前进行了活组织检查(不包括在XL2影响估算中)。结节人群的良性和恶性结节的整体手术率约为34％(每年270,000)。并发症包括死亡(CMS人群中2％[C.E.Iniguez,K.W.Armstrong,Z.Cooper,J.S.Weissman,C.T.Ducko,J.O.Wee,M.P.Martinez,R.Bueno,M.T.Jaklitsch和D.C.Wiener,"Thirty-Day Mortality After Lobectomy in Elderly Patients Eligiblefor Lung Cancer Screening,"The Annals of Thoracic Surgery,vol.101,no.2,pp.541-546,2016])、肺部漏气延长(3-5％)和肺炎(1-8％)。
已公布的良性结节手术率为31-44％[The National Lung Screening TrialResearch Team,"Results of Initial Low-Dose Computed Tomographic Screening forLung Cancer,"The New England Journal of Medicine,vol.368,no.21,pp.1980-1991,2013]。这相当于每年约102,000例手术(270,000x.38[中等范围])和2,052例死亡(270,000x.38x.02)，这对于没有患肺癌的患者可以避免。
2.4.3.3 XL2影响估算
使用上面计算的潜在可避免侵入性程序的数字，并假设XL2在报销后具有广泛的用途。增加侵入性手术减少36％的临床实用数据(第2.4.3和3.4节)，然后XL2有可能节省超过36,000例手术，超过1,600例住院治疗，和每年近750例死亡。其中大部分发生在CMS患者群体中(第2.2.1.5节)。
3.XL2的技术和性能总结
本节介绍XL2测试的以下详细信息：
开发和验证(第3.1节)：
·XL2是在两项大型和一般性的前瞻性研究中开发和验证的，包括PANOPTIC研究，该研究在33个站点招募了685名受试者。
·XL2是根据美国国家医学院严格的测试开发指南开发和验证的。
·XL2开发和验证实现最高水平的证据，其是前瞻性的并且在大量独立站点进行。
性能(第3.2节)：
·XL2具有阴性预测值、灵敏度和特异性为98％(CI：92％-100％)、97％(CI：82％-100％)和44％(CI：36％-52％)。
比较性能(第3.3节)：
·XL2优于当前的实践，PET和四种临床风险预测模型，具有统计学显著优越性能。
XL2的潜在临床效用：益处和危害(第3.4节)：
·两项前瞻性研究可以计算XL2的潜在临床效用。
·在PANOPTIC中，如果使用XL2，将消除36％的良性肺结节侵入性手术。
·重要的是，XL2比目前的实践更安全。如果在PANOPTIC中使用XL2，那么只有3％的恶性肺结节会被错误地从侵入性手术中引出。相比之下，医生错误地使45％的恶性肺结节远离侵入性手术。
本节以XL2的正式规范(第3.5节)、XL2结果的报告(第3.6节)以及XL1和XL2(第3.7节)之间的主要差异描述结束。
3.1 XL2的开发和验证
XL2是在研究1013(NCT01752101)开发，然后核验，并在PANOPTIC研究(NCT01752114)进行验证。研究1013和PANOPTIC都是由Integrated Diagnostics设计和赞助的肺结节的前瞻性研究，主要目的是开发和验证Xpresys Lung。这些研究总结在表C。
表C：研究1013和PANOPTIC显示开发阶段以及站点和患者的数量。
XL2的开发和验证遵循美国国家医学院(NAM)测试开发和验证最佳实践指南所定义的测试开发的最佳实践[IOM(Institutes of Medicine),Evolution ofTranslational'Omics:Lessons Learned and the Path Forward,Washington D.C.:TheNational Academies Press,2012]。具体地，发现和验证都是前瞻性的，并在大量独立站点进行。此外，核验和验证在严格的致盲协议下进行并利用第三方统计员。这是NAM可实现的最高水平的临床验证。可以查看研究1013[RD35，RDXX]的XL2早期开发和发现的详情。验证方案和结果也可供查看[DES25，VAL25]。
3.2在PANOPTIC试验中XL2的性能
3.2.1 XL2的性能测量和结果
XL2的性能基于预期使用人群中的178名PANOPTIC受试者。诊断测试的四个标准性能量度是灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。
·灵敏度：XL2正确预测为恶性的恶性肺结节的百分比。
·特异性：XL2正确预测为良性的良性肺结节的百分比。
·阴性预测值(NPV)：XL2预测是良性的肺结节是良性的百分比。
·阳性预测值(PPV)：XL2预测为恶性的肺结节是恶性的百分比。
XL2被设计为肺癌排除测试，也就是说，它识别可能是良性的肺结节，以便使用CT监视并且可以避免侵入性操作。因此，报告肺结节可能是良性的准确性具有至关重要的临床意义。该性能量度是NPV。
什么NPV最适合决定途径？这取决于患者的偏好和医生的建议(第2.2.2.2节)。ACCP指南建议，如果癌症发生率低于5％，可以通过CT监测观察肺结节。这相当于NPV值超过95％。XL2已经过验证，NPV值为90％或更高。表D显示了XL2的性能，NPV值为90％至98％以及95％置信区间(CI)。我们注意到，该研究中可能良性报告中最大比例的NPV为98％。
90％NPV值是最低的，被认为“可能良性”。这是因为低于90％的NPV值与肺结节良性的测试前概率没有统计学差异。在PANOPTIC的预期使用人群中，该值为83.7％。这低于表D中所有NPV值的95％低CI。从其测试前概率，低于90％NPV的测试结果不具有肺结节良性的测试后概率。在这些情况下，结果被认为是“不确定”。
表D：NPV值为90％至98％以及低于90％的来自PANOPTIC研究的178名患者的XL2的性能和可能的良性报告。NPV等于或高于90％NPV的测试结果报告为“可能良性”，而低于90％NPV的测试结果报告为“不确定”。
3.2.2 XL2的图形性能
通常使用受试者工作特性(ROC)曲线以图形方式描绘诊断测试的性能。图26显示了预期使用群体内178个PANOPTIC受试者单独XL2的ROC曲线。这种相同的图形格式将用于多个图。
此ROC图上有三个标记，值得注意后续图形。
标记#1是XL2的ROC曲线本身。曲线离随机越远，如虚线对角线所示，诊断测试的整体性能越好。这通常通过曲线下面积(AUC)来测量。
标记#2是‘95％NPV区’。诊断测试的NPV完全取决于其灵敏度、特异性和疾病患病率。此依赖关系由以下式获得：
在XL2的情况下，预期使用人群中的癌症患病率为16.3％。这意味着我们可以确定那些导致临床相关NPV至少为95％的灵敏度和特异性值。这些灵敏度和特异性值在图26中描绘为‘95％NPV区’。用于排除肺结节中癌症的稳健的诊断测试应该在该区域内具有灵敏度和特异性。
95％NPV区的另一个重要方面是XL2将与其他癌症风险预测因子进行比较(第3.3.3节)。
标记#3是XL2ROC曲线上达到最大NPV的点。此时XL2的灵敏度为97％，特异性为44％，NPV为98％。强调NPV是因为图形区域与例如XL2的排除测试最相关。
3.3 XL2的比较性能
3.3.1与XL2比较的当前风险预测因子选择
本节将XL2与其他六种肺结节癌症风险预测因子进行比较。所有比较均使用风险较低的预期用途人群中相同的178名PANOPTIC患者进行。这允许进行“苹果对苹果”的比较。这六个预测因子分为如下三类。
目前的实践：目前估计肺结节癌风险的实践是基于医生临床判断的初始医师癌症风险评估[A.A.Balekian,G.A.Silvestri,S.M.Simkovich,P.J.Mestaz,G.D.Sanders,J.Daniel,J.Porcel和M.K.Gould,"Accuracy of Clinicians and Models forEstimating the Probability That a Pulmonary Nodule is Malignant,"Annals ofthe America Thoracic Society,vol.10,no.6,pp.629-635,2013]。这也代表了在PANOPTIC中评估超过80％的肺结节的癌症风险估计值，也是ACCP指南(第2.2.4.1节)中推荐的做法。
PET：PET在ACCP指南中被引用，用作评估癌症风险的工具。在PANOPTIC研究中，PET用于75/178＝42％的预期使用受试者。
临床风险预测因子：已经讨论了四种临床风险预测因子(第2.2.4节)，并在此评估：Mayo，VA，Brock和Herder。在ACCP指南中引用了Mayo和VA，然而，在PANOPTIC研究中，不到20％的医生使用它们。包括Brock和Herder模型是为了完整性，但分别在第2.2.4.2和2.2.6.2节中讨论的PANOPTIC研究中没有被医生使用。我们注意到，因为Herder模型需要进行PET，所以PANOPTIC研究中只有75/178＝42％的预期使用受试者具有Herder结果。
3.3.2比较方法
在3.3.3节中，XL2和其他六种癌症风险预测因子以ROC曲线表示。这将给出这些风险预测因子在重要的‘95％NPV区’中的AUC和性能方面的总体印象。但是，没有任何统计条款(claim)。第3.3.4节保留了完整的统计处理。
在3.3.4节中，XL2以严格的统计方式与其他六种癌症风险预测因子进行了‘苹果对苹果’比较。除PET的情况外，所有这些比较均基于以下方法：
·比较基于95％NPV区的性能进行。
·利用McNemar统计检验[Q.McNemar,"Note On the Sampling Error of theDifference Between Correlated Proportions or Percentages,"Psycometrika,vol.12,no.2,pp.153-157,1947]。当比较同一组样品上的预测因子并且具有固定的灵敏度(或固定的特异性)时，McNemar测试是最合适的。
在PET的情况下，由于PET在‘95％NPV区’中性能不佳，因此无法进行McNemar比较。相反，直接进行NPV性能比较。
3.3.3 XL2与所有其他风险预测因子的图形比较
在对XL2与其他风险预测因子进行正式统计比较之前，我们先从六个风险预测因子相对于XL2的整体情况开始。为此，我们使用ROC图(图27)可视化性能并测量整个AUC。我们不会根据整个AUC进行统计比较，因为这不是排除测试的相关指标(尽管XL2具有最高的AUC)。第3.3.4节利用了正式的统计比较。
图27显示了单个ROC图中的XL2和其他六个风险预测因子。表E中显示了图27中所有预测因子的AUC。我们对这种预期使用人群的头对头比较做了三次直接评论，癌症风险为50％或更低：
·XL2具有卓越的整体性能(最高AUC)，但更重要的是，在‘95％NPV区'中性能最佳。
·目前的实践(pCA)整体性能非常差(AUC＝69％)，但在‘95％NPV区'内性能特别差。
·PET整体性能并且也在‘95％NPV区'内最差(AUC＝58％)。
虽然最重要的因素是XL2在95％NPV区域的卓越性能，但值得注意的是，即使在95％NPV区域之外，XL2的性能仍然优于或等同于所有其他癌症风险预测因子、PET和pCA。
表E：癌症风险预测因子的总体AUC和95％CI
3.3.4统计比较
在本节中，XL2在正式统计意义上与当前实践(pCA)、四个临床风险预测因子、然后PET进行比较。
3.3.4.1 XL2与当前实践(pCA)的比较
将XL2与当前实践相比较，医生对低风险组中癌症预测概率(pCA)的临床判断(pCA为50％或更低)。如图28所示，pCA从未达到所需的95％NPV水平。由于pCA达到的最高灵敏度为90％，因此该水平用于比较XL2与pCA的性能。
使用McNemar检验(第3.3.2节)，在90％的相同灵敏度下，XL2具有显著更高的特异性，p值为2.12E-11。
3.3.4.2 XL2与临床风险预测因子的比较
我们将XL2与四种临床风险预测因子(Mayo、VA、Brock和Herder)进行比较。见图29。比较是在XL2和所有四种临床风险预测因子达到的90％和97％的灵敏度下进行的。我们包括这两种灵敏度用于稳健的比较。
使用McNemar检验(第3.3.2节)，在灵敏度为90％和97％时，XL2的特异性明显高于表F中报告的p值的四个临床风险预测因子。我们注意到XL2与所有模型之间的比较除外Herder都是在所有178名PANOPTIC患者身上进行的。对于Herder(需要进行PET)，只能比较75名患者。这个较低的样品数导致较高(但仍然显著)的p值。
表F：对于偶然(Mayo和VA)和筛查(Brock)结节，XL2与临床风险预测因子的比较。Herder将临床因素与PET相结合。
| 比较 | 90％灵敏度p值 | 97％灵敏度p值 |
| XL2 vs.Mayo | 0.0009 | 0.0009 |
| XL2 vs.VA | 1.562e-11 | 2.71E-7 |
| XL2 vs.Brock | 0.0021 | 0.0051 |
| XL2 vs.Herder | 0.0455 | 0.0233 |
3.3.4.3 XL2与PET的比较
在XL2的预期使用中的178名PANOPTIC患者中，75名患者进行了诊断性PET。图30中的比较基于这75名患者。
由于PET永远不会达到95％的NPV区域或足够高的灵敏度，因此不能应用McNemar检验。相反，我们将PET的NPV直接与XL2的NPV进行比较。
PET的最高NPV为79％(95％CI：66％-88％)，因此将此与XL2达到95％的NPV(95％CI：89％-99％)时进行比较。这两个CI不重叠，因此，与PET相比，XL2具有明显更好的NPV。
3.4 XL2的潜在临床效用：益处和危害
PANOPTIC是一项非介入性研究，但是，通过回答以下问题，可以从PANOPTIC估计XL2的潜在临床效用：
“如果在PANOPTIC中使用XL2来识别可能是良性的肺结节，那么有多少良性(有益)和恶性(危害)结节会从侵入性手术进入CT监视？”
在NPV＝98％时(见表G)，XL2在PANOPTIC中具有以下潜在的临床效用：
·15/42＝36％的良性结节可以从不必要的侵入性手术中获益(益处)。
·1/29＝3％的恶性结节将被错误地送往CT监视(危害)。
在NPV＝95％时(见表G)，XL2在PANOPTIC中具有以下潜在的临床效用：
·20/42＝48％的良性结节可以从不必要的侵入性手术中获益(益处)。
·2/29＝7％的恶性结节将被错误地送往CT监视(危害)。
表G：XL2的潜在临床效用
XL2的安全性如何？我们观察到，在PANOPTIC的预期用途人群中，13/29＝45％的恶性结节被送往CT监测(然后有延迟诊断的风险)。将其与表G中显示的估计值进行比较，表明XL2将为减少不必要的侵入性操作同时向CT监视发送较少的恶性结节提供了安全测试。
3.5 XL2的技术定义
XL2将两种血浆蛋白(LG3BP和C163A)的相对丰度与五种临床危险因素(年龄、吸烟状况、结节直径、结节毛刺状态和结节位置)相结合。关于这些蛋白质的功能细节可以在[1]中找到。XL2为受试者k提供数值XL_2(k)，定义如下：
X＝-6.8272+0.0391*年龄+0.7917*吸烟者+0.1274*直径+1.0407*毛刺+0.7838*位置
其中年龄是受试者的年龄，如果受试者是前吸烟者或当前吸烟者，则吸烟者为1(否则为0)，直径为肺结节的大小，单位为mm，如果肺结节呈毛刺，则毛刺为1(否则0)，如果肺结节位于肺上叶则位置为1(否则为0)。整合临床风险因素的线性函数X是Mayo临床风险预测因子的简化，其消除了癌症风险历史因素。
XL_2()范围在0和1之间。XL_2(k)越接近0，受试者k越可能具有使用PANOPTIC数据计算的非常高的NPV。
表H中显示了NPV值为90％至98％的XL_2()函数的范围，以及其他关键性能指标。
3.6报告XL2结果
XL2结果将报告为可能良性或不确定，NPV值和置信区间显示在可能良性报告中。
可能良性和不确定性的分离是基于研究人群的癌症患病率和统计学比较。在PANOPTIC研究中，预期使用人群的癌症患病率为16.3％，对应于良性患病率为83.7％。换句话说，在任何临床判断或测试之前，肺结节良性的预测试概率为83.7％。当良性的测试后概率(即NPV)为90％或更高时，XL2报告“可能良性”，如表H所示。
注意，当“k”值超过0.354时，NPV小于90％的置信区间将与人口的83.7％的患病率重叠。因此，这将是在当测试报告从可能良性变为不确定时。
表H：可能良性结果的多个阴性预测值的报告的XL2性能、测试报告和百分比(n＝178名患者)
3.7 Xpresys Lung 1(XL1)和Xpresys Lung 2(XL2)的主要差别
XL2是XL1的第二代版本，与XL1相比有四个重大改进：
3.7.1.预期用途群体
XL2的预期用途群体是具有较低癌症风险(50％或更低的测试前概率)的患者，而XL1的预期用途群体包括所有患者风险组(0％-100％)。在KOL领导人的指导和XL1的商业经验下，很明显医生需要进行一项测试来区分良性结节和恶性结节。对于风险较低而不是较高风险的患者，这种需求最大(第2.2.3节)。这种对预期使用人群的关注导致了性能的提高。
3.7.2.分子因子减少
研究1013的发现工作确定了两种蛋白质(LG3BP和C163A)，其比XL1的五种诊断蛋白质更准确，可用于识别癌症风险较低的患者的良性结节。可能的原因是低风险结节和高风险结节之间的蛋白质表达不同[RDXX]。
3.7.3.临床风险因素的增加
XL1纯粹是一种分子检测，而XL2则含有已知临床风险因素的分子标记(第3.5节)。这不仅提高了XL2相对于XL1的性能，而且对医生很有吸引力，因为这些是他们目前用于评估癌症风险的临床风险因素。也就是说，XL2并没有试图取代目前使用临床风险因素的做法，而是用分子因子增强了目前的做法(第3.3.3.1节)。
3.7.4.临床证据质量
XL1是在五个档案生物库上开发和验证的。相反，XL2是在两项前瞻性研究中开发和验证的，其中使用统一方案收集样品。第一个‘研究1013’跨越了12个站点并招募了475名受试者。第二个‘PANOPTIC’跨越了33个站点并招募了685名受试者。因此，XL2更适用于临床实践。此外，PANOPTIC收集了癌症风险和临床因素的医生概率，以允许XL2直接与肺结节评估中的当前实践进行比较。
提供以下实施例是为了更好地说明要求保护的发明，而不应解释为限制本发明的范围。就提及具体材料而言，其仅用于说明的目的而非意图限制本发明。本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围的情况下开发等同的手段或反应物而不需要发明创造能力。
实施例
实施例1：执行的诊断性排除研究的总结
执行的研究
能够排除受试者是否具有癌症的诊断测定证据基于三个主要的临床验证和效用研究。这些研究建立在2013年末在Science Translational Medicine上发表的最初科学和临床发现的基础上(Li,X.等人Sci Transl Med.2013年10月16；5(207)：207ra142)。第一个主要的临床验证研究是回顾性验证研究(Vachani,A.等人，J Thorac Oncol.2015年4月；10(4)：629-37)，使用来自Xpresys Lung临床预期用途患者的141个临床样本。研究中包括四个利用多种收集方案的临床站点。
第二临床研究，研究1013，是临床效用的前瞻性收集的单个方案研究。这项大型研究包括从12个站点收集的353个临床样本。该研究设计侧重于较高的癌症风险患者，以确定是否可以识别导致包括良性手术在内的不必要的侵入性诊断程序的诊断错误，并将其重新转至标准治疗CT随访以证明其良性(Vachani,A.等人Lung.2015年12月；193(6)：1023-7)。
第三项研究，研究1001，正在进行中，作为第二项临床实用性研究以及护理结节检查标准中的确认性临床验证。该研究在本文中称为PANOPTIC。我们能够报告该研究的中期分析，因为超过200名患者完成了为期2年的完整随访，其余400名患者至少1年进入了研究。研究1001代表来自XL预期用途内的患者的604个临床样本。北美有32个站点正在参与，所有结节处理数据都包含在试验设计中，包括PET扫描数据(演示文稿：ATS Podium Abstract；2016年5月；正在进行的手稿)。
研究1001具有比其他两个研究以下显著优点：
1.由于样品采集是标准化的，研究规模和站点数量很大，并且该研究是所有癌症风险组(低、中、高)的所有人，因此排除诊断分析的性能是最普遍性的。
2.可以将排除诊断测定与所有三种临床结节风险管理模型(‘VA’、‘Mayo’和‘Brock’)进行比较，因为在研究1001中收集数据以允许计算这些模型。
3.可以直接与PET比较排除诊断测定的AUC以及似然比。
PANOPTIC的目标是：确认XL1的性能(基于11种蛋白质的排除测定(参见美国专利9,201,044和9,304,137)；确定XL2的性能，XL2是适于转移至抗体平台的XL1的改进；和确定XL1(和XL2)与单独的医师评估相比具有增量益处和协同益处。
PANOPTIC研究允许获得初始医师对癌症风险的评估。这样可以探索医生如何评估风险，根据风险评估选择遵循程序，以及XL如何针对不同的风险分层进行评估。
可以对医生的临床风险评估(pCA)进行以下观察。医生有效地识别癌症受试者；相反，良性受试者的分布在癌症风险轴上保持均匀。商业和临床机会包括XL测定将能够排除良性侵入性程序。在60％pCA及以上时，癌症急剧上升。
对于高风险(60％和更高)，可能不建议使用排除测试来指导受试者进行CT监测。因此，XL2可对低风险和中等风险的受试者具有最佳性能。在研究1013中确定了低风险和中等风险受试者的最佳反转(使用结节大小作为风险的代表)，并在研究1001的中期分析中进行了验证。
对于排除测试，品质因数如下：1-筛查阳性率＝可能的良性率。这是测试的诊断产率。产生更多排除的测试是优选的.NPV或LR-：阴性预测值或阴性似然比捕获“可能良性”结果是正确的置信度(参见，例如，图9)。
XL2不仅仅是分子分类器，而是分子分类器与风险预测器如pCA、VA、Mayo或Brock的整合。整合的形式如下，其中s是被测试的受试者，P是与XL2整合的风险预测器。
如果XL2(s)<＝阈值，则
风险(s)＝P(s)-50％
否则
风险(s)＝P(s)
结束
如果XL2表示“可能良性”，则医生应将风险降低50％。我们不需要P(s)来执行测试。
为了建立基线，评估了针对低和中度风险受试者(pCA<＝50％)的pCA、PET和各种临床模型(VA、Mayo、Brock1a)的性能(参见图10-12)。请注意，Brock1b没有足够的受试者来生成可靠的ROC图。
XL2与任何风险预测器整合导致提高性能。
在图10和图11中，关键区域中性能最佳的预测器是Mayo。因此，XL2整合的最佳性能可能出现在Mayo。
用于排除肺癌的两种蛋白质肺癌测定。
先前描述的用于排除受试者肺癌的肺癌测定依赖于11-蛋白质测定。参见美国专利9,201,044和9,304,137，其内容通过引用整体并入本文。本文描述的是2-蛋白质测定法，与上文提到的11-蛋白质测定法相比，其具有更高的诊断产率。因此，2-蛋白质测定导致具有良性肺结节的受试者的侵入性操作的减少。本文描述的2-蛋白质测定也称为XL2。11-蛋白质测定也称为XL1。
XL2是在353个受试者/12站点前瞻性研究中开发的，并在随后的604个受试者/33站点前瞻性研究中进行临床验证。临床验证研究在本文中称为PANOPTIC。
XL2在XL1上有各种创新，包括：
XL2是使用单一样品采集方案在大量前瞻性采集的样品(～1000)中开发和验证的，这些样品来自大量站点(～40)。相比之下，XL1是在较少的一组站点的较小的档案样品上开发和验证的。
XL2是XL1的改进版。具体而言，XL1由5种诊断蛋白和6种标准化蛋白组成。XL2包括5种诊断蛋白中的1种和6种标准化蛋白中的1种。因此，XL2是基于2-蛋白质的排除诊断测定。
XL2旨在将分子标记与医生对癌症风险(pCA)的评估结合起来。XL2的验证表明，分子标记和医生的评估的整合提高了对每个人的癌症风险评估。
本文前述11-蛋白质测定和2-蛋白质测定的预期用途群体是至少40岁的个体，其具有通过放射学检测的大小在约8mm和30mm之间的肺结节。此外，XL2的预期用途是识别直径8mm至30mm的可能的良性肺结节，概率很高。尽管已经针对所有癌症风险组进行了验证，但XL2显示出低至中度风险肺结节的最佳性能。
本文描述的研究的目的是验证对11-蛋白质测定的一种或多种改进。每个细化分类器，在此称为反转，基于两种蛋白质的比例。经验证的反转列于下表2中。
表2.反转(双蛋白分类器)
对于表2中列出的每个反转，按顺序测试以下参数。
参数1：pCA(k)+Ri
在PANOPTIC研究中，每个受试者k由他/她的医生分派癌症风险(0-1)。这表示为pCA(k)。分子风险反转Ri的癌症风险预测因子Ci(k)如下
其中反转Ri的判定阈值Ti在表3中定义，并且是具有不大于15mm的结节的患者的{Si(k)}的中值。
该研究的参数1是所有受试者的{Ci(k)}的AUC显著大于0.5。
| 编号 | 蛋白质P1 | 蛋白质P2 | 阈值(T<sub>i</sub>) |
| 1 | LG3BP | C163A | 1.2838 |
| 2 | MASP1 | C163A | -0.6518 |
| 3 | PEDF | C163A | 2.0114 |
| 4 | LG3BP | IBP3 | 0.0420 |
| 5 | BGH3 | C163A | 1.2933 |
| 6 | S10A6 | C163A | -0.3331 |
| 7 | LUM | C163A | 4.7819 |
表3.参数1的反转判定阈值
参数2：pCA(k)≤50％的Ri
该研究的参数2是具有pCA(k)≤50％的受试者的{Si(k)}的AUC显著大于0.5。
参数3：具有结节大小的上限的Ri
该研究的参数3是结节大小不大于预定界限B的受试者的{Si(k)}的AUC显著大于0.5。该参数包含一系列子参数，每个子参数对应一个特定值{B＝15，16,...,30mm}。固定序列程序(参见A.Dmitrienko等，“Key multiplicity Issues in Clinical DrugDevelopment,”Stat Med,32(2013),第1079-111页；和A.Dmitrienko 等，“MultipleTesting Problems in Pharmaceutical Statistics,Chapman&Hall/Crc BiostatisticsSeries,xvi页,304p；每个的内容通过引用整体并入本文)用于如下顺序地测试子参数：测试B＝15mm的第一子参数。如果验证，则测试下一个B＝16mm的子条款。如果验证，则测试第三个子参数。在此测试序列期间，如果B＝N的子参数未在某个界限N处验证，则测试过程立即停止，并且后续子参数将根本不进行测试。然后用{B＝15,16,…,(N-1)mm}验证参数3。
参数4：Ri
该研究的参数4是所有受试者的{Si(k)}的AUC显著大于0.5。
实施例2：PANOPTIC研究概述
PANOPTIC是一项前瞻性研究，33个站点683名患者参加。所有符合条件的研究参与者满足下面描述的预期用途标准。
这项前瞻性、多中心和盲法观察性研究的总体目标是从新诊断肺结节的受试者中收集血液样本和临床数据，以及NSCLC的潜在人口统计学和地理风险概况。受试者在登记前提供了书面知情同意书。在登记时，与手术活检程序相关联地进行血液样品收集和处理的统一方案，并且在1年和2级的受试者访谈中结合病例报告表格的临床数据捕获。还收集了医生对癌症风险的评估。该观察性研究的方案中未规定任何治疗、程序或干预措施；但是，每个参与中心的诊断护理标准(SOC)都将适用。
受试者入选和排除标准
入选标准
受试者参加研究前在筛选时必须满足的入选标准：
·年龄≥40岁
·吸烟史：从不、当前或以前
·受试者在肺部或胸部诊所由胸腔科医师和/或在加入时由胸外科医生进行肺结节评估
·在受试者登记后60天内进行基线CT扫描，确定肺结节
·最大结节的最大尺寸由CT≥8mm和≤30mm确定
·受试者愿意为血液样本的采集提供知情同意书
排除标准
·在登记资格时的结节检查表明任何先前尝试或完成的诊断活检程序，例如经胸针穿刺、支气管镜活检或手术
·先前的CT扫描可用，其先前确定相同的8至30mm肺结节，考虑将研究纳入最新的CT扫描，而不考虑候选结节的放射照相特征，如尺寸密度或外观
·目前对任何癌症的诊断
·事先诊断肺结节检出2年内任何癌症，除了非黑色素瘤皮肤癌
·在受试者登记后30天内给予血液制品，例如包装的红细胞、新鲜冷冻血浆、血小板
·积极参与治疗试验
·人类免疫缺陷病毒(HIV)或丙型肝炎的历史
适用的样品和裁决规则
分析应受以下限制：
·仅限于2013年11月或之前进行初始CT扫描的受试者的样品可用于本研究
·仅来自满足上述入选/排除标准的患者样品可以在该研究中使用
·每个患者除了初始CT程序之外还需要至少一个其他程序，并且没有退出研究
·如果患者进行了手术，则需要进行最终的病理诊断
·如果患者进行活组织检查，则需要进行最终的病理诊断。例外情况是在进行活组织检查后结节已经消退，并且可以标记为良性
·CT或PET(成像)只能用于推定良性诊断，但不能用于癌症诊断
临床数据的盲法
为了达到进行盲法研究的目的，分析团队(由Bioinformatics和研发团队的成员组成)将无法在锁定的临床数据库中获得最终的临床诊断，例如NSCLC或良性诊断。盲目程序由程序管理监督。
·临床操作将符合条件的受试者列表发送到程序管理。该列表包括受试者ID(其还提供有关站点ID的信息)、样品ID、样品采集日期、受试者年龄、受试者性别、受试者吸烟状况、包年数和结节大小(根据初始CT扫描确定)。
·程序管理创建新的随机数以替换每个样品ID和站点ID，然后将此列表(不包括原始样品ID和站点ID)发送给Bioinformatics团队。
·然后，Bioinformatics团队设计样品的实验批量布局，在可能的情况下，根据站点和储存年龄(基于采血日期)批量匹配良性和癌症样品，并最大限度地减少良性或癌症状态、结节大小、性别、受试者年龄、吸烟状况和包年数在批次之间的任何潜在偏差。
·程序管理接收批次布局，删除所有受试者临床信息，用原始ID号替换随机化样品和站点编号，随机化各批次的顺序，并将此列表(仅包括受试者ID和样品ID)提供给实验室人员用于分析。
XL肺部分析
在血液样本中蛋白水平使用多反应监测(MRM)质谱(MS)基于在美国专利9201044和9304137中指定和描述的程序进行测定，每一专利的内容都通过引用以其全部并入本文。
样品分析
使用LC-SRM-MS测量方法分析每个样品如下：
1.使用来自Sigma-Aldrich的IGy14和Supermix耗尽柱，从高丰度的蛋白质进行样品耗尽。
2.使用胰蛋白酶将样品消化成胰蛋白酶肽。
3.通过LC-SRM-MS分析样品，其在Waters nanoacuity LC系统上使用30分钟梯度，然后在AB-Sciex 5500三重四极杆装置上对1550次转变进行SRM-MS分析。
4.获得并记录1550次转变中的每一次的原始跃迁离子计数。
在每个步骤处并行(步骤2和4)或背靠背(步骤1和3)处理匹配的样品。这最小化了分析变化。最后，根据处理日，样品分批进行样品分析的步骤1和2。
IgY14-SuperMix免疫亲和柱的制备
使用分别含有2：1比例的IgY14和SuperMix免疫亲和树脂的浆液(Sigma Aldrich)在内部制备免疫亲和柱。简言之，将混合免疫亲和树脂浆液(10ml，50％)加入到玻璃色谱柱(Tricorn，GE Healthcare)中，使树脂在重力流下沉降，在柱中产生5ml树脂体积。将柱加盖并置于Agilent 1100系列HPLC系统上以进一步装填(20分钟，0.15M碳酸氢铵，2ml/min)。然后通过重复注射HPS样品的等分试样评估研究中使用的每个柱的性能。在开始每批临床样品的免疫亲和分离之前评估柱性能。
IgY14-Sumermix免疫亲和色谱
在免疫亲和分离之前，将血浆样品(60μl)稀释(分别为0.15M碳酸氢铵，1：2v/v)并过滤(0.2μmAcroPrep96孔滤板，Pall Life Sciences)。使用三种缓冲液(装载/洗涤：0.15M碳酸氢铵；汽提/洗脱：0.1M甘氨酸，pH 2.5；中和：0.01M Tris-HCl，0.15M NaCl，pH7.4)，在连接至Agilent 1100系列HPLC系统的IgY14-SuperMix柱上分离稀释的血浆(90μl)，具有负载-洗涤-洗脱-中和-再平衡循环(总时间36分钟)。使用UV吸光度(280nm)监测未结合和结合的级分，并在分离后进行基线分解。仅收集含有低丰度蛋白质的未结合级分用于下游处理和分析。在酶消化之前将未结合的级分冻干。
低丰度蛋白质的酶消化
在温和的变性条件下(200μl的1：10.1M碳酸氢铵/三氟乙醇v/v)重构低丰度蛋白质并使其孵育(30分钟，室温，轨道振荡器)。然后稀释样品(800μl的0.1M碳酸氢铵)并用胰蛋白酶消化(普林斯顿分离；每个样品0.4μg胰蛋白酶，37℃，16小时)。在固相提取之前将消化的样品冻干。
固相提取
在质谱法之前，使用固相提取来减少样品中的盐和缓冲液含量。将含有胰蛋白酶肽的冻干样品重构(350μl的0.01M碳酸氢铵)并孵育(15分钟，室温，轨道振荡器)。然后将还原剂加入样品(30μl的0.05M TCEP)中并孵育样品(60分钟，室温)。加入稀酸和低百分比的有机溶剂(375μl的90％水/10％乙腈/0.2％三氟乙酸)以优化肽的固相萃取。根据制造商的方案调节提取板(Empore C18,3M Bio-analytical Technologies)。将样品上样到固相提取板上，洗涤(500μl的95％水/5％乙腈/0.1％三氟乙酸)并洗脱(200μl的52％水/48％乙腈/0.1％三氟乙酸)到收集板中。将洗脱液分成两等份，每个等分试样在真空浓缩器中干燥。一个等分试样立即用于质谱分析，而另一个等分试样储存(-80℃)并根据需要使用。在LC-SRM MS分析之前，重构样品(12μl的90％水/10％乙腈/0.2％甲酸)。
批处理要求
由实验室主任自行决定，每个批次可以在单独的耗尽柱上运行；或者耗尽柱可以用于其他目的，只要每个耗尽柱不超过三批。
数据分析计划
分类器
在该研究中测定的反转列于表2中。
验证分类器
每个反转将依次针对四项研究条款进行测试。使用DeLong等人描述的方法评估AUC的单侧95％低置信区间(LCB)：“Comparing the areas under two or morecorrelated receiver operating characteristic curves:a nonparametricapproach,”Biometrics 44(1988)，837-45，其内容以其整体并入本文。
参数1
使用等式(1)对所有受试者评估癌症风险预测因子{Ci(k)}。根据{Ci(k)}和所有受试者的疾病状态评估AUC及其95％LCB。如果AUC的95％LCB不小于0.5，则该参数得到验证。
参数2
基于{Si(k)}和pCA(k)≤50％的受试者的疾病状态评估AUC及其95％LCB。如果AUC的95％LCB不低于0.5，则条款得到验证。
参数3
固定序列程序(参见Dimitrienko A.Dmitrienko等，“Key multiplicity Issuesin Clinical Drug Development,”StatMed,32(2013),第1079-111页；和A.Dmitrienko等，“Multiple Testing Problems in Pharmaceutical Statistics,Chapman&Hall/CrcBiostatistics Series,xvi页,304p；每个的内容通过引用整体并入本文)用于测试该参数的子参数。基本上，根据{Si(k)}和结节大小不大于B(15mm)的受试者的疾病状态评估AUC及其95％LCB。如果AUC的95％LCB不小于0.5，则子参数得到验证。对于B的其他值重复该过程(16,17，...mm)，直到B＝30mm或子参数未通过验证。
参数4
基于{Si(k)}和所有受试者的疾病状态评估AUC及其单侧95％LCB。如果AUC的95％LCB不低于0.5，则条款得到验证。
分析概述
·Bioinformatics将在完成所有样品的实验分析后从数据仓库导出质谱数据。
·对于每个样品，Bioinformatics将确定每个测试模型的分类器评分
·Bioinformatics将发送包含实验质谱数据的电子表格和每个样品的分类器评分给程序管理
·程序管理将为所有相关文件加上时间戳
·程序管理将执行上述指定的数据分析
·时间戳文件
·时间戳服务提供商：DigiStamp，时间戳授权机构(TSA)。
·软件：软件为每个文件创建唯一标识符或指纹(SHA-512Hash)。该软件将文件的指纹发送到DigiStamp的计算机，该计算机将文件的指纹和当前时间组合，创建返回并存储在指定文件位置的数字时间戳证书。数据分析前加盖时间戳的文件包括PANOPTICS研究临床数据概况、实验批次布局文件和实验质谱数据。
实施例3：PANOPTIC验证报告
来源数据
属于原始220个受试者的受试者包括验证集。其中五人在最初的医师评估之前进行了PET检查，因此被从验证集取消。这导致总共169名受试者(98名良性，71名癌症)。
验证参数
验证参数在实施例2中描述。该实施例中给出的结果遵循实施例2中给出的参数。
注意事项
某些条款是针对那些pCA＝50％的受试者。然而，在研究集合中，受试者被分为风险箱，特别是40％-50％、50％-60％等。因此，pCA 50％用于避免包含51％至60％的pCA风险。
PANOPTIC结果
PANOPTIC结果显示在下表中。每行的最后两列是AUC和单侧Mann-Whitney显著性检验，其AUC>0.5。
表4：LG3BP/C163A
概述LG3BP/C163A：对于15mm至22mm(包括端点)的结节尺寸，满足条款1、条款2、条款3，和满足条款4。
表5：MASP1/C163A
| 参数1：MASP1/C163A 0.88416 4.4301e-18 |
| 参数2：MASP1/C163A 0.66732 0.073907 |
| 参数3：MASP1/C163A结节尺寸：15 0.62438 0.036185 |
| 参数3：MASP1/C163A结节尺寸：16 0.58737 0.080989 |
| 参数3：MASP1/C163A结节尺寸：17 0.60396 0.037407 |
| 参数3：MASP1/C163A结节尺寸：18 0.60674 0.027511 |
| 参数3：MASP1/C163A结节尺寸：19 0.59444 0.04199 |
| 参数3：MASP1/C163A结节尺寸：20 0.58165 0.06176 |
| 参数3：MASP1/C163A结节尺寸：21 0.58078 0.06301 |
| 参数3：MASP1/C163A结节尺寸：22 0.55919 0.12083 |
| 参数3：MASP1/C163A结节尺寸：23 0.56181 0.10483 |
| 参数3：MASP1/C163A结节尺寸：24 0.57234 0.068414 |
| 参数3：MASP1/C163A结节尺寸：25 0.57215 0.064556 |
| 参数3：MASP1/C163A结节尺寸：26 0.57627 0.051455 |
| 参数3：MASP1/C163A结节尺寸：27 0.57463 0.052909 |
| 参数3：MASP1/C163A结节尺寸：28 0.57247 0.056965 |
| 参数3：MASP1/C163A结节尺寸：29 0.56819 0.066798 |
| 参数3：MASP1/C163A结节尺寸：30 0.56051 0.09023 |
| 参数4：MASP1/C163A 0.56051 0.09023 |
概述MASP1/C163A：对于15mm的结节尺寸，满足条款1和条款3。
表6：PEDF/C163A
| 参数1：PEDF/C163A 0.87259 3.2344e-17 |
| 参数2：PEDF/C163A 0.57534 0.25881 |
| 参数3：PEDF/C163A结节尺寸：15 0.66418 0.0088174 |
| 参数3：PEDF/C163A结节尺寸：16 0.63306 0.016511 |
| 参数3：PEDF/C163A结节尺寸：17 0.62523 0.015913 |
| 参数3：PEDF/C163A结节尺寸：18 0.61849 0.016582 |
| 参数3：PEDF/C163A结节尺寸：19 0.61543 0.017316 |
| 参数3：PEDF/C163A结节尺寸：20 0.6135 0.016101 |
| 参数3：PEDF/C163A结节尺寸：21 0.61166 0.017184 |
| 参数3：PEDF/C163A结节尺寸：22 0.59594 0.028772 |
| 参数3：PEDF/C163A结节尺寸：23 0.5936 0.028672 |
| 参数3：PEDF/C163A结节尺寸：24 0.59951 0.020315 |
| 参数3：PEDF/C163A结节尺寸：25 0.60978 0.010438 |
| 参数3：PEDF/C163A结节尺寸：26 0.60966 0.0094973 |
| 参数3：PEDF/C163A结节尺寸：27 0.6051 0.011353 |
| 参数3：PEDF/C163A结节尺寸：28 0.5993 0.015128 |
| 参数3：PEDF/C163A结节尺寸：29 0.59308 0.02027 |
| 参数3：PEDF/C163A结节尺寸：30 0.58709 0.026891 |
| 参数4：PEDF/C163A 0.58709 0.026891 |
概述PEDF/C163A：对于15mm至30mm(包括端点)的结节尺寸，满足条款1、条款3，和满足条款4。
表7：LG3BP/IBP3
概述LG3BP/IBP3：满足条款1。
表8：BGH3/C163A
概述BGH3/C163A：对于15mm至19mm(包括端点)的结节尺寸，满足条款1和条款3。
表9：S10A6/C163A
| 参数1：S10A6/C163A 0.88517 3.5019e-18 |
| 参数2：S10A6/C163A 0.74951 0.015293 |
| 参数3：S10A6/C163A结节尺寸：15 0.61692 0.045638 |
| 参数3：S10A6/C163A结节尺寸：16 0.57258 0.12278 |
| 参数3：S10A6/C163A结节尺寸：17 0.58054 0.083869 |
| 参数3：S10A6/C163A结节尺寸：18 0.58326 0.067335 |
| 参数3：S10A6/C163A结节尺寸：19 0.57119 0.096478 |
| 参数3：S10A6/C163A结节尺寸：20 0.56244 0.11956 |
| 参数3：S10A6/C163A结节尺寸：21 0.55682 0.14109 |
| 参数3：S10A6/C163A结节尺寸：22 0.56688 0.092872 |
| 参数3：S10A6/C163A结节尺寸：23 0.56024 0.11075 |
| 参数3：S10A6/C163A结节尺寸：24 0.5744 0.062988 |
| 参数3：S10A6/C163A结节尺寸：25 0.58082 0.044543 |
| 参数3：S10A6/C163A结节尺寸：26 0.57643 0.051086 |
| 参数3：S10A6/C163A结节尺寸：27 0.57525 0.05147 |
| 参数3：S10A6/C163A结节尺寸：28 0.56822 0.068365 |
| 参数3：S10A6/C163A结节尺寸：29 0.56848 0.065962 |
| 参数3：S10A6/C163A结节尺寸：30 0.57287 0.053344 |
| 参数4：S10A6/C163A 0.57287 0.053344 |
概述S10A6/C163A：对于15mm的结节尺寸，满足条款1、条款2和条款3。
表10：LUM/C163A
| 条款1：LUM/C163A 0.87978 7.175e-18 |
| 条款2：LUM/C163A 0.70254 0.039734 |
| 条款3：LUM/C163A结节尺寸：15 0.64988 0.015154 |
| 条款3：LUM/C163A结节尺寸：16 0.62903 0.019362 |
| 条款3：LUM/C163A结节尺寸：17 0.64216 0.0073979 |
| 条款3：LUM/C163A结节尺寸：18 0.62692 0.011249 |
| 条款3：LUM/C163A结节尺寸：19 0.61486 0.017766 |
| 条款3：LUM/C163A结节尺寸：20 0.61173 0.017495 |
| 条款3：LUM/C163A结节尺寸：21 0.61141 0.017384 |
| 条款3：LUM/C163A结节尺寸：22 0.60876 0.01565 |
| 条款3：LUM/C163A结节尺寸：23 0.59753 0.023826 |
| 条款3：LUM/C163A结节尺寸：24 0.61151 0.010887 |
| 条款3：LUM/C163A结节尺寸：25 0.62001 0.0057733 |
| 条款3：LUM/C163A结节尺寸：26 0.61964 0.0052434 |
| 条款3：LUM/C163A结节尺寸：27 0.61676 0.0056818 |
| 条款3：LUM/C163A结节尺寸：28 0.61264 0.0069845 |
| 条款3：LUM/C163A结节尺寸：29 0.61532 0.005575 |
| 条款3：LUM/C163A结节尺寸：30 0.60391 0.010689 |
| 条款4：LUM/C163A 0.60391 0.010689 |
概述LUM/C163A：对于15mm至30mm(包括端点)的结节尺寸，满足条款1、条款2、条款3，和满足条款4。
在PANOPTIC研究中的XL2性能
医师癌症风险评估(pCA)
PANOPTIC的独特而有价值的特征是医生对肺结节的癌症风险的初步评估被捕获。
这样可以探索医生如何评估风险，根据风险评估选择遵循程序，以及如何针对不同的风险分层进行XL。
PANOPTIC研究中所有样品的pCA如图1A所示；在阶段1a的PANOPTIC研究中所有样品的pCA显示在图1B中。
对所有风险类别的性能：指南分析
XL2的一个目标是将分子标记与医生对癌症风险的评估整合起来，以改善风险分层。
结果概述
将pCA与XL2组合可将特异性提高2.4倍。参见图2A、2B和表11、12、13。
如果遵循指南，则将2.4倍以上的良性结节正确地引导至CT监视。McNemar的统计检验用于证明pCA+XL2明显优于单独的pCA。
表11：分析性能
| TP | FP | FN | TN | Sens | Spec | PPV | NPV | |
| pCA | 158 | 235 | 1 | 28 | 99％ | 11％ | 40％ | 97％ |
| pCA+XL2 | 157 | 196 | 2 | 67 | 99％ | 26％ | 45％ | 97％ |
| XL2 | 126 | 185 | 33 | 78 | 79％ | 30％ | 41％ | 70％ |
表12：仅限于1a期的性能(n＝340)
| TP | FP | FN | TN | Sens | Spec | PPV | NPV | |
| pCA | 115 | 198 | 1 | 26 | 99％ | 12％ | 37％ | 96％ |
| pCA+XL2 | 114 | 167 | 2 | 57 | 98％ | 25％ | 41％ | 97％ |
注意，对1a期的限制不会改变结论。
与单独的pCA相比，pCA+XL1和pCA+XL2在分类受试者方面明显更好(p值＝2.2e-5)。
图2B显示癌症风险等于或低于5％的良性和癌症的数量。在不显著增加癌症数量的情况下，由pCA+XL1和pCA+XL2引起的良性数量显著高于单独的pCA。
假设：如果XL1(XL2)返回“可能良性”，则pCA减少50％，否则无变化。
下表13显示了pCA、XL1和XL2在所有中期分析样品上的各自性能以及pCA+XL1和pCA+XL2的组合(以及在实践中更具代表性的)性能。
表13分析性能-所有样品
| 模型 | Sens | Spec | PPV | NPV | PPV* | NPV* | LBR* |
| pCA | 97 | 22 | 48 | 92 | 29 | 96 | 17 |
| XL1** | 77 | 26 | 43 | 60 | 26 | 77 | 26 |
| XL2 | 89 | 31 | 49 | 79 | 30 | 90 | 26 |
| pCA+XL1 | 95 | 40 | 54 | 91 | 35 | 96 | 32 |
| pCA+XL2 | 95 | 52 | 59 | 93 | 39 | 97 | 40 |
(*)调整至人口癌症患病率25％。
(**)XL1自己的优化阈值为0.40；结合pCA阈值为0.43
主要的比较是没有XL(即pCA)和XL(即pCA+XL1、pCA+XL2)的实践：
关键量度是NPV*，其是排除正确的概率，以及LBR*，其是诊断产率。
而pCA+XL1(96％)和pCA+XL2(97％)对单独的pCA具有相同的排除置信度(96％)。
与单独的pCA(17％)相比，pCA+XL1(32％)和pCA+XL2(40％)具有明显更多的良性结节排除。
所有样品上的性能：程序使用
对于该分析，鉴定了通过pCA+XL2测试为“可能良性”且最初引至侵入性程序的样品的数量(图3)。这决定了XL2对减少良性结节侵入性程序的潜在影响：
·良性结节从侵入性程序转为CT监视：
17/79＝22％
·从侵入性程序到CT监视的恶性结节：
2/157＝1％
低中度风险样品上的性能：指南分析
对于该分析，单独的pCA、单独的XL2和pCA与XL2的整合的性能在5％癌症风险阈值附近评估(图4A和表14、15和16)。图4描绘了当XL1(XL2)应用于低至中风险患者时程序使用的变化。在某些方面，规则是“如果可能良性然后放置在CT监视中”。
对于XL1，良性侵入性手术的数量从22减少到18(减少18％)。另外2名癌症患者通过pCA接受CT监测。
对于XL2，良性侵入性手术的数量从22减少到10(减少55％)。1)将另外的癌症患者通过pCA进行CT监测。
如果适用于所有患者，无视pCA，则减少分别为12％和36％。2)其他癌症患者通过pCA进行CT监测。
图7描绘了从具有低至中度风险的受试者样品获得的XL2 ROC曲线。
总结
将pCA与XL2组合可将特异性提高2.4倍。如果遵循指南，则将2.4倍以上的良性结节正确地引导至CT监视。
表14：分析性能-低至中等风险样品
| TP | FP | FN | TN | Sens | Spec | PPV | NPV | |
| pCA | 19 | 180 | 1 | 28 | 95％ | 13％ | 10％ | 97％ |
| XL2 | 19 | 157 | 1 | 51 | 95％ | 25％ | 11％ | 98％ |
| pCA+XL2 | 19 | 143 | 1 | 65 | 95％ | 31％ | 12％ | 98％ |
表15：仅限于1a期的性能(n＝306)
| TP | FP | FN | TN | Sens | Spec | PPV | NPV | |
| pCA | 18 | 161 | 1 | 26 | 95％ | 14％ | 10％ | 96％ |
| pCA+XL2 | 18 | 131 | 1 | 56 | 95％ | 30％ | 12％ | 98％ |
注意，对1a期的限制不会改变结论。
表16：分析性能-低至中等风险样品
| 模型 | Sens | Spec | PPV | NPV | PPV* | NPV* | LBR* |
| pCA | 85 | 29 | 17 | 92 | 9 | 96 | 28 |
| XL1 | 85 | 24 | 16 | 90 | 8 | 95 | 23 |
| XL2 | 92 | 29 | 18 | 96 | 9 | 98 | 28 |
| pCA+XL1 | 69 | 53 | 20 | 91 | 10 | 96 | 52 |
| pCA+XL2 | 69 | 68 | 27 | 93 | 14 | 97 | 65 |
*调整至人口癌症患病率25％。
表16显示了pCA、XL1和XL2在所有中期分析样品上的各自性能以及pCA+XL1和pCA+XL2的组合(以及在实践中更具代表性的)性能。
主要的比较是没有XL(即pCA)和XL(即pCA+XL1、pCA+XL2)的实践：
关键量度是NPV*，其是排除正确的概率，以及LBR*，其是诊断产率。
而pCA+XL1(96％)和pCA+XL2(97％)对单独的pCA具有相同的排除置信度(96％)。
与单独的pCA(28％)相比，pCA+XL1(52％)和pCA+XL2(65％)具有明显更多的良性结节排除。
低中度风险样品上的性能：程序使用
对于该分析，鉴定了通过pCA+XL2测试为“可能良性”且最初引至侵入性程序的样品的数量，以确定XL2对减少良性结节的侵入性程序的潜在影响(图5)。数据表明
·良性结节从侵入性程序转为CT监视：15/50＝30％
·恶性结节从侵入性程序转为CT监视：1/18＝6％
注意，恶性结节从侵入性转为CT监测的进展如下：
·15良性；1癌症
·21良性；4癌症
·32良性；4癌症
所有风险类别的侵入性手术中总良性为79，侵入性手术中的总癌症结节为157。
风险评估
图7A描述了风险评估和风险分布箱进入指南建议的风险组。图7B描述了由指南解释的风险评估。图8显示“低于5％”和高于5％的箱。
比较分析
对pCA、XL2、PET和临床模型进行比较分析(图8)。在第一次分析中，评估了所有临时样品中每个预测因子的独立性能。
数据表明如下：
·对于95％灵敏度的排除测试，pCA、XL2和Mayo实际上是等效的，其次是Brock 1b和PET。
·然而，由于样品数量较少(n<＝172)，这些估计值的可变性很高。
·此外，用于PET的决策阈值是SUV>＝2.5，导致其ROC上的单个点。
·VA和B1a算法被省略，因为它们在性能上略差并且使图形变得混乱。
·注意，在此分析中，XL2不使用pCA(仅NS<＝15mm)，因为在XL2预测器中使用pCA可能被认为是不公平的(因为PET和B1b没有)。
由于pCA结果是不同因素的组合，问题不在于pCA是否优于其他预测因子，而是其他哪些预测因子为医生的风险评估增加了最大的增值。也就是说，哪个具有最佳性能：pCA+XL2、pCA+PET或pCA+临床模型。
使用相同的规则将预测因子与pCA结合起来：
·如果pCA和预测因子都具有低风险，则降低pCA风险。
·如果pCA和预测因子都具有高风险，则增加pCA风险。
·如果pCA和预测变量不一致，使用pCA风险。
·数据表明以下内容：与pCA结合使用时，Brock模型不会提高性能。这可能并不奇怪，因为pCA使用了Brock模型(和其他模型)使用的所有因子。
·当与pCA结合使用时，Mayo模型不会提高性能。注意，pCA使用Mayo模型(和其他)使用的所有因子。
·PET不会改善医生风险评估。特别是在‘排除’区域。
·XL2改善了医生风险评估。特别是，在高置信度‘排除’(>95％灵敏度)曲线区域，XL2+pCA几乎是单独pCA的两倍(特异性为～40％对比～23％)。
·作为排除测试，XL2+pCA远远优于PET+pCA、B1b+pCA和Mayo+pCA。
反转性能
表15显示了测定的各种反转的性能。
表15反转性能
上表20中的数据表明，性能最佳的反转之一是LG3BP/C163A。
pCA、XL1、XL2、pCA+XL1和pCA+XL2的性能
表16描述了所有临时受试者的性能。表17描述了低至中度风险受试者的性能。数据表明，pCA+XL1导致良性结节的侵入性操作减少12％。数据进一步表明，pCA+XL2导致良性结节的侵入性操作减少36％。
表16：所有临时受试者的性能(n＝172)
| 模型 | Sens | Spec | PPV* | NPV* | LBR** |
| pCA | 97 | 22 | 29 | 96 | 17 |
| pCA+XL1 | 95 | 40 | 35 | 96 | 32 |
| pCA+XL2 | 95 | 52 | 39 | 97 | 40 |
*患病率调整为预期癌症患病率23％
**LBR＝可能良性率＝陈述“可能是良性”的测试报告的百分比
表17：低至中度风险受试者的性能(n＝88)
| 模型 | Sens | Spec | PPV* | NPV* | LBR** |
| pCA | 85 | 29 | 9 | 96 | 28 |
| pCA+XL1 | 69 | 53 | 10 | 96 | 52 |
| pCA+XL2 | 69 | 68 | 14 | 97 | 65 |
*患病率调整为预期癌症患病率23％
**LBR＝可能良性率＝陈述“可能是良性”的测试报告的百分比
数据表明pCA+XL1和pCA+XL2的性能明显优于单独的pCA。数据进一步表明pCA+XL2具有优于pCA+XL1的性能。
在XL1中测定的肽如下所示。下面还呈现了XL2，LG3BP/C163A的高性能反转。
下表18比较了XL1和XL2与PET以及VA、Mayo和Brock临床模型的性能。
下面提供的是原始Xpresys Lung(XL-1)的性能结果，为11种蛋白质，其包含诊断信号，以及Xpresys Lung2(XL-2)，其为Xpresys的改进版本，测量来自原始Xpresys产品的2种蛋白质并部署不同的数学分析：比率vs.逻辑回归。
虽然PET被广泛使用，但我们注意到不到20％的参与站点使用了临床模型。
表18
| XL2 | XL1 | PET | VA | Mayo | Brock | |
| AUC | 82％ | 79％ | 74％ | 73％ | 71％ | 72％ |
| LR+ | 3.18 | 2.80 | 2.29 | 1.65 | 1.63 | 1.30 |
| LR- | 0.10 | 0.14 | 0.24 | 0.31 | 0.31 | 0.42 |
| PPV | 49％ | 46％ | 41％ | 33％ | 33％ | 28％ |
| NPV | 97％ | 96％ | 93％ | 92％ | 91％ | 89％ |
| Sens* | 93％ | 90％ | 85％ | 85％ | 85％ | 86％ |
| Spec | 71％ | 68％ | 63％ | 48％ | 48％ | 34％ |
下面提供的是与单独的其他各种临床模型相比，与Mayo整合的原始XL-2的性能结果。
表19
| NPV_adj | LR- | LBR | AUC | |
| XL2+Mayo | 97％ | .08 | 54％ | 77％ |
| Mayo | 97％ | .10 | 46％ | 71％ |
| B1a | 95％ | .15 | 31％ | 70％ |
| pCA | 89％ | .37 | 13％ | 73％ |
| VA | 88％ | .40 | 12％ | 60％ |
| PET | 81％ | .71 | 75％ | 61％ |
在每个度量的XL2+Mayo都有最佳性能，唯一的例外是PET的LBR。然而，PET在LBR的置信度非常低。
Mayo的性能迅速下降。为了获得与XL2+Mayo相同的LBR(54％)，Mayo的NPV_adj和LR-分别为87％和0.44。
另一种方法是在研究中固定SPR(筛选阳性率)并观察性能。
表20
*最接近的值
下面提供对在此呈现的表中使用的缩写的解释。
AUC：此统计数据代表曲线下面积。它由受试者(R)工作(O)曲线(C)定义。ROC曲线是诊断性能的标准度量，通过绘制测试的灵敏度或真阳性率(检测癌症的能力)vs.测试的各种测试阈值设置的假阴性率(1-特异性)来获得。
LR：“似然比”用于评估执行诊断测试的值。该测试的灵敏度和特异性用于确定患者的测试结果是否有效地改变了与没有疾病的患者相比存在病症的可能性。该统计数据被认为与疾病流行无关。阳性似然比(LR+)为3被认为是癌症风险的中度增加，而阴性似然比(LR-)为0.1被认为是癌症风险的大幅下降。
PPV：“阳性预测值”是指阳性结果正确识别患有该疾病的患者的概率。
NPV：“阴性预测值”是指阴性结果正确识别没有患病的患者的概率。
SENS：“测试的灵敏度”指的是与疾病的患者将有阳性测试结果的概率。
Spec:“测试的特异性”是指没有疾病的患者将具有阴性测试结果的概率。
XL-1： 1：肺癌风险分层测试，其监测5种诊断蛋白和6种正常化蛋白。
XL-2： 2：肺癌风险分层测试，监测2种诊断蛋白。XL-1的改进。
PET：正电子发射断层扫描。
CT：计算机断层扫描。
VA、Mayo、Brock：指用于计算肺癌风险的不同模型。
总结
数据表明，根据AUC测量，测试组明确分为两个性能组，其中XL2和XL1具有优于所测量的所有其他诊断模式(PET和临床模型)的AUC。
数据进一步表明2.根据似然比测量，XL-2和XL-1在阳性(LR+)和阴性(LR-)结果中均优于PET。Xpresys Lung和PET优于所有临床模型。
数据特别表明XL1和XL2在设计上特别强，作为排除测试。XL1和XL2的LR-性能将被认为是疾病测试后概率的统计“大幅下降”，而PET(和临床模型)对疾病测试后概率具有“轻微”到“中度”的影响。
实施例4：指南/实用基准的PANOPTIC性能
表21描述了Xpresys Lung产品概况。
表21：
Xpresys Lung从版本1(XL1)迁移到版本2(XL2)：
XL1是在具有多种收集方案的中等规模的档案生物库上开发和验证的。XL2是在单一方案下的大型前瞻性研究中开发和验证的。XL2允许转化为基于抗体(Ab)的平台(市场扩张，COGS减少)。针对XL2还收集了针对XL1收集的所有临床和商业数据。XL2将临床因素信息与分子信息相结合。
表22提供了Xpresys Lung的开发/证据计划。
表22：
XL1在约10％的样品中发现(～10％的站点)；所有回顾和多重方案。在约55％的样品(约40％的站点)上发现了XL2；最具前瞻性和单一的方案。XL2是研究1013和研究1001中表现最佳的分类器。
PANOPTIC是Xpresys Lung的预期使用人群中的全科研究。PANOPTIC由于其在样品和站点数量方面的规模而具有高度一般化的结果。PANOPTIC收集了每个肺结节的肺癌风险的初步医师评估(pCA)。PANOPTIC允许评估Xpresys Lung在实际操作中的增量效益。PANOPTIC收集了足够的临床数据，以比较Xpresys Lung与基准如PET和已建立的临床因素模型(VA、Mayo和Brock)的性能。pCA、PET、VA和Mayo都在肺结节管理ACCP指南中提及。PANOPTIC允许评估整合Xpresys Lung与pCA和临床因素模型如VA、Mayo和Brock。PANOPTIC允许对Xpresys Lung的临床实用性进行前瞻性回顾性分析。
Xpresys Lung的性能与实践中使用的工具以及ACCP肺结节管理指南中定义的工具进行了比较：
pCA：医师癌症风险评估
PET：正电子发射断层扫描
VA：临床因素模型(在VA系统内开发)
Mayo：临床因素模型(Mayo开发)
Brock：临床因素模型(不在指南中)
排除相关的性能量度：
NPV：阴性预测值(肺结节良性的概率)。
LBR：可能良性率(1-SPR)(“可能良性”的测试报告的百分比)
关键观察：在目标高性能区域内，pCA性能不佳。有机会改善医生风险评估，因为没有额外工具的医生可能倾向于过度治疗。在目标高性能区域内，PET性能不佳。这并不奇怪，因为PET通常用于治疗(不排除)肺癌。在临床因素算法中，Mayo和Brock具有良好的性能，而VA表现不佳。XL2与pCA、Mayo、Brock和VA中的任何一个结合使用可提高性能。
表23提供了性能比较。
表23：
| 1-SPR | NPV | LR- | AUC | |
| XL2+Mayo | 54％ | 97％ | .08 | 77％ |
| Mayo | 54％ | 87％ | .44 | 71％ |
| B1a | 55％ | 85％ | .52 | 70％ |
| pCA | 39％＊ | 86％ | .50 | 73％ |
| VA | 54％ | 81％ | .72 | 60％ |
| PET | 75％＊ | 81％ | .71 | 61％ |
比较尝试修复1-SPR参数(诊断产率)。只有与Mayo整合的XL2才能实现可操作的NPV。还提供了阴性似然比(LR-)。
达到15％的风险阈值，没有恶性结节被错误地引导至侵入性手术。40％的良性结节从侵入性手术中拯救出来。这代表了对当前实践的显著改进。
实施例5：PANOPTIC试验继续
介绍
肺结节是一个越来越大的机遇和挑战，最近估计美国每年有160万个结节作为偶然成像发现[Gould MK，Tang T，Liu IA，Lee J，Zheng C，Danforth KN，Kosco AE，Di FioreJL和Suh DE.Recent Trends in the Identification of Incidental PulmonaryNodules.Am J Resp Crit Care Med 2015；192：1208-1214]。随着肺癌筛查的实施，预计结节的这种指数增长将继续[Aberle DR，Adams AM，Berg CD等人Reduced lung cancermortality with low-dose computed tomographic screening.N Engl J Med 2011；365：395-409]。结节的计算机断层扫描(CT)分析可以识别区分良性和恶性的特征，但大多数结节仍然是不确定的，需要做出关于诊断测试和活组织检查的决定。
对直径≥8mm的不确定结节的评估应遵循医生对癌症预测概率(pCA)的估计[Gould MK，Donington J，Lynch WR等人，Evaluation of individuals with pulmonarynodules：when is it lung cancer？Diagnosis and management of lung cancer，3rded：American College of Chest Physicians evidence-based clinical practiceguidelines.Chest 2013；143：e93S-e120s]。低pCA估计值≤5％是通常用于观察具有进一步CT监测的结节的阈值。该观察阈值目标是平衡不必要程序的风险与观察期对恶性结节造成伤害的可能性。这种低阈值的影响是有限的，因为只有9.5％的不确定结节在肺部实践中风险较低[Tanner NT,Aggarwal J,Gould MK,Kearny P,Diette G,Vachani A,Fang KC,Silvestri GA.Management of Pulmonary Nodules by Community Pulmonologists:AMulticenter Observational Study.Chest 2015；148:1405-1414]。
在肺部实践中，80％的结节被归类为中度风险，pCA在5％和65％之间。[TannerNT,Aggarwal J,Gould MK,Kearny P,Diette G,Vachani A,Fang KC,SilvestriGA.Management of Pulmonary Nodules by Community Pulmonologists:A MulticenterObservational Study.Chest 2015；148:1405-1414]。在该广泛的中间类别中，75％的结节是良性的，25％是恶性的，因此这些结节的分化将对当前使用的测试和程序产生最大的影响。例如，在社区肺部实践中，65％的良性结节至少进行了一次活检，36％进行了手术。使用更好的工具，这些是可避免的侵入性程序。
由于最大比例的结节是良性的，因此可以区分良性结节的血液检查将有利于患者护理。一项对经验丰富的肺病专家的调查发现，假设的血液检查导致了进行侵入性检测的决定的重大改变[Vachani A，Tanner NT，Aggarwal J，Mathews C，Kearney P，Fang KC，Silvestri G，Diette GB.Factors that influence physician decision making forindeterminate pulmonary nodules.Ann Am Thorac Soc 2014；11:1586–1591]。使用多反应质谱法开发基于蛋白质组学的血液测试[Gould MK，Tang T，Liu IA，Lee J，Zheng C，Danforth KN，Kosco AE，Di Fiore JL和Suh DE.Recent Trends in the Identificationof Incidental Pulmonary Nodules.Am J Resp Crit Care Med 2015；192：1208-1214]其中蛋白质候选物(n＝388)在存档的血液样品上进行评估，得到13种蛋白质分类器[Li XJ,Hayward C,Fong PY等人A blood-based proteomic classifier for the molecularcharacterization of pulmonary nodules.Sci Transl Med 2013；5:207ra142]。与四参数临床模型相比，该分类器提供了改进的性能，并且与患者年龄、烟草使用、结节大小和慢性阻塞性肺病的诊断无关[Vachani A,Pass HI,Rom WN,Midthun DE,Edell ES,Laviolette M,Li XJ,Fong PY,Hunsucker SW,Hayward C,Mazzone PJ,Madtes DK,MillerYE,Walker MG,Shi J,Kearney P,Fang KC,Massion PP.Validation of a multiproteinplasma classifier to identify benign lung nodules.J Thorac Oncol 2015；10:629-637]。使用前瞻性采集的血浆(n＝353)评估该试验的临床效用，估计接受侵入性手术的良性结节患者减少32％[Tanner NT,Aggarwal J,Gould MK,Kearny P,Diette G,Vachani A,Fang KC,Silvestri GA.Management of Pulmonary Nodules by CommunityPulmonologists:A Multicenter Observational Study.Chest 2015；148:1405-1414]。
进一步细化血浆试验以结合五种临床因素来区分良性和恶性肺结节，并在大型前瞻性试验中进行了评估。有关临床医师估计的测试前概率、手术使用和指南依从性的详细信息已发表[Vachani A,Hammoud Z,Springmeyer S,Cohen N,Nguyen D,Williamson C,Starnes S,Hunsucker S,Law S,Li XJ,Porter A,Kearney P.Clinical Utility of aPlasma Protein Classifier for Indeterminate Lung Nodules.Lung 2015；193:1023-27]。
方法
研究设计
PANOPTIC试验是一项前瞻性、多中心、观察性试验，回顾性评估蛋白质组学试验的表现。患者护理不受方案的指导或影响。严格遵循盲法方案。所有站点都获得了当地(n＝24)或中央(9)机构审查委员会的批准。
站点选择
学术保健中心、教学医院和大型肺部实践(通常是综合网络的一部分)被邀请参加。在北美的40个站点中，根据地理位置、兴趣和资格选择了33个站点(31个美国站点和2个加拿大站点)。
患者选择
纳入标准包括：8-30毫米直径的结节，年龄≥40岁，在基线CT的60天内由肺科医生和/或胸外科医生进行诊断评估。
排除标准包括：没有先前尝试或完成诊断性活检程序，例如经胸针穿刺，支气管镜活检或手术，既往CT扫描以前未确定正在考虑的相同肺结节，目前尚无任何癌症诊断，未事先诊断为肺结节检测2年内的任何癌症(非黑色素瘤皮肤癌除外)，并且在受试者入组后30天内不给予血液制品。
数据采集
在登记时和另外的测试之前，记录医生预测试癌症概率(pCA)(0-5％、6-10％、11-20％、21-30％、31-40％等)。获得血液样品并按照方案进行处理以适当储存和运输。在基线和随后的所有CT扫描中收集结节位置、大小和轮廓。收集成像和程序数据，直至明确诊断、结节消退或至少一年的影像学稳定性。PET或PET/CT扫描结果记录为SUV值≥2.5mSv或者不是。记录了包括支气管镜检查、经胸穿刺活检和手术在内的手术数据。
蛋白质组学血浆试验
该测试(Xpresys Lung，Integrated Diagnostics，Seattle，WA)基于如前所述的质谱MRM-MS[Vachani A,Pass HI,Rom WN,Midthun DE,Edell ES,Laviolette M,Li XJ,Fong PY,Hunsucker SW,Hayward C,Mazzone PJ,Madtes DK,Miller YE,Walker MG,ShiJ,Kearney P,Fang KC,Massion PP.Validation of a multiprotein plasma classifierto identify benign lung nodules.J Thorac Oncol 2015；10:629-637,Li XJ,HaywardC,Fong PY等人Ablood-basedproteomic classifier for the molecularcharacterization of pulmonary nodules.Sci Transl Med 2013；5:207ra142]，并根据美国国家科学院医学指导开发[IOM(Institutes of Medicine),Evolution ofTranslational'Omics:Lessons Learned and the Path Forward,Washington D.C.TheNational Academies Press,2012]。从先前的前瞻性研究(NCT01752101)进行前瞻性开发[Vachani A,Hammoud Z,Springmeyer S,Cohen N,Nguyen D,Williamson C,Starnes S,Hunsucker S,Law S,Li XJ,Porter A,Kearney P.Clinical Utility of a PlasmaProtein Classifier for Indeterminate Lung Nodules.Lung 2015；193:1023-27]。发现、核验和验证的细节单独发表[In preparation:Mazzone PP,Kearney P,Hunsucker S,Law S,Li XJ,Porter A.Development of a Proteomic Test Combined with ClinicalRisk Factors.2016]。该测试的先前版本基于11种蛋白质[Vachani A,Hammoud Z,Springmeyer S,Cohen N,Nguyen D,Williamson C,Starnes S,Hunsucker S,Law S,LiXJ,Porter A,Kearney P.Clinical Utility of a Plasma Protein Classifier forIndeterminate Lung Nodules.Lung 2015；193:1023-27]。我们评估了是否可以根据三个因素改进测试性能；重点关注最佳表现蛋白质标记物，将预期用途群体细化为低风险组(pCA≤50％)，并将该试验与临床风险因素相结合。有关详细信息，请参阅补充材料。该测试使用两种血浆蛋白(LG3BP和C163A)的相对丰度，与五种临床风险因素(年龄、吸烟状况、结节直径、结节毛刺状态和结节位置)整合，以及区分可能是良性的肺结节与仍然不确定的那些的规定决策阈值。
数据分析
通过CT成像的病理学、分辨率或没有扩大来确定结节是良性的。恶性确定基于组织学。观察期至少为一年，最长为两年。使用MATLAB，版本8.3.0.532(MathWorks)和MedCalc，版本16.4(MedCalc Software bvba)进行统计学分析。方差分析的卡方检验用于比较各组，p值≤0.05被认为是显著的。为了比较癌症风险预测因子，McNemar统计检验以固定的灵敏度或特异性使用[McNemar Q.Note On the Sampling Error of the DifferenceBetween Correlated Proportions or Percentages.Psycometrika,1947；12:153-157]。除非另有说明，否则所呈现的结果基于中值阴性预测值(NPV)。
医生、患者以及实验室和统计人员对蛋白质分类器和临床信息的结果不知情。
Xpresys Lung(XL)的技术定义和公式
XL将两种血浆蛋白(LG3BP和C163A)的相对丰度与五种临床风险因素(年龄、吸烟状况、结节直径、结节毛刺状态和结节位置)相结合。关于这些蛋白质的功能细节可以发现于[Granville CA,Dennis PA.An overview of lung cancer genomics andproteomics.Am J Respir Cell Mol Biol 2005；32:169–176]。XL为受试者k提供数值XL_2(k)，定义如下：
X＝-6.8272+0.0391*年龄+0.7917*吸烟者+0.1274*直径+1.0407*毛刺+0.7838*位置
其中年龄是受试者的年龄，如果受试者是前吸烟者或当前吸烟者，则吸烟者为1(否则为0)，直径为肺结节的大小，单位为mm，如果肺结节呈毛刺，则毛刺为1(否则0)，如果肺结节位于肺上叶则位置为1(否则为0)。整合临床风险因素的线性函数X是Mayo临床风险预测因子的简化[GouldMK,Ananth L,Barnett PG.Veterans Affairs SNAP CooperativeStudy Group.A clinical model to estimate the pretest probability of lungcancer in patients with solitary pulmonary nodules.Chest2007；131:383-388]。
XL_2(k)范围在0和1之间。XL_2(k)越接近0，受试者k越可能具有使用PANOPTIC数据计算的非常高的NPV。表2s中显示了NPV值为90％至98％的XL_2(k)函数的范围，以及其他性能指标。
结果
从2012年11月至2015年12月，共有685名患者参加了前瞻性研究，392名患者符合分析条件。不符合纳入/排除标准，59例患者未发生血样或基线CT。另外234人没有资格，如图18所示。所有392名患者的完整数据均超过一年，350名患者的完整数据为2年。195例(49.7％)患者出现良性结节，197例(50.3％)出现恶性结节，患病率为50％。表24包括了基线人口统计学，按良性或恶性结节分层。
表24.所有患者的患者人口统计学、吸烟史和肺结节特征、恶性结节(癌症)和良性结节。N/A为不可用。
癌症患者更可能是女性(p＝0.03)和当前吸烟者(p＝0.05)，但吸烟的平均包年数的差异是临界显著的(p＝0.051)。良性结节患者(20％)更可能从不吸烟(p<0.01)。与良性组(14.4mm)相比，癌组中的结节明显更大(19.2mm)，上叶位置更可能是恶性结节(p<0.01)。
与诊断相比的医生预测试癌症概率(pCA)结果如图19所示。该图表明，医生擅长一般将良性结节分为低风险(≤50％)和恶性结节分为风险较高(>50％)。这些结果的AUC为0.85±0.02。正如预期的那样，只有6％的结节属于0-5％的低风险组，但大多数良性结节的风险低于50％。该低风险组(pCA≤50％)是该蛋白质组学测试的预期用途。表25显示了低风险组178名患者的人口统计学、吸烟和结节信息，其中149名为良性结节，29名为恶性结节，患病率为16％。
表25. 178名低风险患者的所有、恶性(癌)结节和良性结节的患者人口统计学、吸烟史、肺结节特征和诊断或组织型。N/A表示不可用。
178名患者的蛋白质组学检测的中位数性能为NPV为98％(95％CI 92％-100％)，灵敏度为97％(82％-100％)。其他NPV的性能如表26所示。
表26.在可能良性结果(n＝178名患者)的多阴性预测值的Xpresys Lung性能和测试报告和不确定结果的阈值。
蛋白质组学测试与医师pCA、PET和三种癌症风险等式的比较如图20所示。用于比较的癌症风险等式是用于结节评估的那些[Gould MK,Ananth L,Barnett PG.VeteransAffairs SNAP Cooperative Study Group.A clinical model to estimate the pretestprobability of lung cancer in patients with solitary pulmonary nodules.Chest2007；131:383-388；McWilliams A,Tammemagi MC,Mayo JR等人Probability of cancerin pulmonary nodules detected on first screening CT.N Engl J Med 2013；369:910-919；Nair VS,Sundaram V,Gould MK,Desai M.Utilization of[18F]FDG PETimaging in the National Lung Screening Trial.Chest 2016；150:621-630]。蛋白质组学测试具有最佳性能，具有所有比较器的最高AUC。与医生pCA相比，所有结节的AUC为85％，低风险结节的AUC为69％，未达到95％NPV区，与蛋白质组学检测相比显著表现不佳(p<0.001)。同样，PET AUC仅为58％，PET的最高NPV为79％(95％CI：66％-88％)。当NPV直接比较蛋白质组学测试，NPV为95％(95％CI：89％-99％)明显优于PET。三个临床风险等式进入95％NPV区域，但蛋白质组学测试明显更好，p值≤0.002。
讨论
PANOPTIC试验评估蛋白质组学血液检查，并通过确定可以安全地进行CT监测的大部分良性结节来显示出优异的性能。
性能基于阴性预测值(NPV)，其中中值为98％(95％CI 92％-110％)。这种高NPV将提供对癌症的测试后概率小于5％的置信度，并且可以推荐CT监测。与目前可用的工具相比，这种蛋白质组学测试明显更好。使用现有的工具，医生无法确定哪种中间风险，不确定的结节是否良性，因此他们继续进行进一步的评估。由于最大比例的结节属于这个中间风险组，因此对新工具的需求相当大。
当遇到肺结节时，临床医生需要考虑一系列诊断工具。这些选项中的每一个都有好处和风险。一种选择是PET-CT扫描，它是非侵入性的，但具有可观的费用和高辐射暴露[Brix G,Lechel U,Glatting G,Ziegler SI,Münzing W,Müller SP,Beyer T.Radiationexposure of patients undergoing whole-body dual-modality 18F-FDG PET/CTexaminations.J Nucl Med 2005；46:608-613；Rivera MP,Mehta AC,WahidiMM.Establishing the diagnosis of lung cancer:diagnosis and management of lungcancer,3rd ed:American College of Chest Physicians evidence-based clinicalpractice guidelines.Chest 2013；143:Suppl 5:e142S-e165S]。结节可以通过支气管镜进行活检，这是微创的，但仅在34％到88％的时间内产生诊断[Wiener RS,Schwartz LM,Woloshin S,Welch HG.Population-Based Risk for Complications afterTransthoracic Needle Lung Biopsy of a Pulmonary Nodule:An Analysis ofDischarge Records.Ann Intern Med 2011；155:137-144]。结节CT引导经胸穿刺活检有较好的诊断率，但气胸并发症的风险为15％[Lokhandwala T,Dann TR,Johnson M,D’SouzaAO.Costs of the Diagnostic Workup for Lung Cancer:A Medicare ClaimsAnalysis.International Journal of Radiation Oncology 2014；90(5)：S9-S10]。手术活检的并发症发生率为5％[Gould MK,Donington J,Lynch WR,et al.Evaluation ofindividuals with pulmonary nodules:when is it lung cancer？Diagnosis andmanagement of lung cancer,3rd ed:American College of Chest Physiciansevidence-based clinical practice guidelines.Chest 2013；143:e93S–e120S]。一项大型医疗保险索赔分析发现，在总诊断费用中，43.1％是由于无肺癌患者的活检[Lung-RADS.American College of Radiology.http://www.acr.org/Quality-Safety/Resources/LungRADS访问于2016年9月25日]。因此，避免不必要的额外评估良性肺结节将有利于患者护理和医疗保健系统。
蛋白质组学测试未与Lung-RADS进行比较。Lung-RADS是针对LDCT肺癌筛查发现的结节而开发的。Lung-RADS主要根据结节的大小构建报告和管理建议，目标是通过增加被认为是阳性结节的大小来减少假阳性[Yip R,Henschke CI,Yankelevitz DF,Smith JP.CTScreening for Lung Cancer:Alternative Definitions of Positive Test ResultBased on the National Lung Screening Trial and International Early LungCancer Action Program Databases.Radiology 2014；273:591-596]。使用来自全国肺筛查试验的数据评估Lung-RADS，并且在基线时假阳性率从27％降低至13％[Pinsky PF,Gierada DS,Black W,Munden R,Nath H,Aberle D,Kazerooni E.Performance of Lung-RADS in the National Lung Screening Trial:A Retrospective Assessment.AnnIntern Med 2015；162：485-491]。然而，在这项回顾性二级分析中，灵敏度从NLST的94％降至85％。
该试验的优势包括其可扩展性：除了具有高水平证据的研究设计外，还具有规模大、定义明确且地理分布广泛的人群[10]。收集医生预测试癌症概率是该试验的重要组成部分，并证实了将蛋白质组学检测重点放在低风险人群上的价值。该试验的局限性在于回顾性分析了血浆蛋白质测试的效果，因此需要进行蛋白质组学测试的前瞻性介入试验。此外，研究站点也没有代表社区实践。
总之，医生擅长将结节分为较低和较高风险组。当这种稳健的蛋白质组学测试应用于低风险组时，可以预期明显更多的良性结节患者将被正确地引入CT监测。然后，这些患者将能够避免不必要的侵入性手术，从而避免了手术的焦虑和费用以及手术并发症。
实施例6：持续的临床评估
介绍
我们之前已经验证了一种基于血液的风险预测因子，该预测因子使用了11种分子因子(A.K.Brady等人,Survival outcome according to KRAS mutation status innewly diagnosed patients with stage IV non-small cell lung cancer treatedwith platinum doublet chemotherapy.Oncotarget6,30287(Oct 6,2015))，并建立了前瞻性收集生物库的潜在的临床应用(A.Vachani et al.,Clinical Utility of a PlasmaProtein Classifier for Indeterminate Lung Nodules.Lung193,1023(Dec,2015))。另外，已经验证了几个纯粹由临床风险因素组成的风险预测因子(M.K.Gould,L.Ananth,P.G.Barnett,S.C.S.G.Veterans Affairs,A clinical model to estimate the pretestprobability of lung cancer in patients with solitary pulmonarynodules.Chest131,383(Feb,2007)；A.McWilliams等人，Probability of cancer inpulmonary nodules detected on first screening CT.The New England journal ofmedicine369,910(Sep 5,2013)；S.J.Swensen,M.D.Silverstein,D.M.Ilstrup,C.D.Schleck,E.S.Edell,The probability of malignancy in solitary pulmonarynodules.Application to small radiologically indeterminate nodules.Arch InternMed157,849(Apr 28,1997))。在这里，我们探讨两个终点：
·首先，分子标记在性能上与风险预测的临床因素相当，并且
·其次，分子和临床风险因素的整合可以更好地预测风险。
最可靠的临床工具是那些在独立样品集上经历多次性能验证的工具(C.Micheel,S.J.Nass,G.S.Omenn,Institute of Medicine(U.S.).Committee on the Review ofOmics-Based Tests for Predicting Patient Outcomes in Clinical Trials.,Evolution of translational omics:lessons learned and the path forward.(National Academies Press,Washington,D.C.,2012),pp.xv,338p)。因此，该分析的重点不是发现新的分子或临床风险因素，而是对前瞻性收集的样品集中单独和整合的先前验证的标记和因子的评估。评估的分子标记物是先前发现并验证为预测肺结节中癌症风险的那些(X.J.Li et al.,A blood-based proteomic classifier for the molecularcharacterization of pulmonary nodules.Science translational medicine5,207ra142(Oct 16,2013)；A.Vachani等人，Validation of a multiprotein plasmaclassifier to identify benign lung nodules.Journal of thoracic oncology:official publication of the International Association for the Study of LungCancer10,629(Apr,2015))。临床风险因素，也曾被证实可预测肺结节的癌症风险，包括年龄、结节大小、吸烟史、结节位置和结节推测(S.J.Swensen,M.D.Silverstein,D.M.Ilstrup,C.D.Schleck,E.S.Edell,The probability of malignancy in solitarypulmonary nodules.Application to small radiologically indeterminatenodules.Arch Intern Med157,849(Apr 28,1997))。最后，使用先前报道的肺结节管理的前瞻性试验(NCT01752101)获得的样品来研究终点(A.Vachani et al.,Clinical Utilityof a Plasma Protein Classifier for Indeterminate Lung Nodules.Lung193,1023(Dec,2015))。该试验中的所有受试者都进行了侵入性操作(活组织检查和/或手术)。我们选择关注这些受试者，因为它允许评估风险预测工具如何准确识别经过不必要的侵入性手术的良性肺结节。
方法
研究设计
试验NCT01752101是一项前瞻性、多中心、观察性试验，回顾性评估分子和临床标记物的性能。患者护理不受方案的指导或影响。严格遵循盲法方案。所有站点都获得了当地或中央机构审查委员会的批准。
患者选择
患有不确定肺结节的患者在美国12个地理位置不同的站点就诊。符合条件的患者是肺结节直径在8-30mm之间，最小40岁，并且最近完成CT引导针吸(TTNA)或具有确定诊断的支气管镜活组织检查或计划进行外科肺活检。排除标准包括肺结节鉴别5年内的既往恶性肿瘤或临床肿瘤分期≥T2，淋巴结分期≥2，或转移性疾病的证据。
所有TTNA和支气管镜检查程序分类为诊断(提供特定的恶性或良性病理诊断)，或非诊断(肺结节的具体病因仍未知)。所有外科手术程序分为诊断(即没有特定的事先诊断)或治疗(即在TTNA或支气管镜检查之前进行手术，产生恶性诊断)。
最后，这里的分析集中在那些肺结节直径在8到20mm之间的受试者。这些是令人感兴趣的，因为20mm以下的肺结节更难以分类为恶性或良性。
数据采集
获得血液样品并按照方案进行处理以适当储存和运输(11)。在基线和随后的所有CT扫描中收集结节位置、大小和轮廓。收集关于成像和程序的数据，直到在知情同意的21天内发生确定性诊断。记录了包括支气管镜检查、经胸穿刺活检和手术在内的手术数据。
分子和临床标记物
该测定(Xpresys TMLung，Integrated Diagnostics，Seattle，WA)基于如前所述的质谱MRM-MS(X.J.Li等人,A blood-based proteomic classifier for the molecularcharacterization of pulmonary nodules.Science translational medicine5,207ra142(Oct 16,2013)；A.K.Brady等人,Survival outcome according to KRASmutation status in newly diagnosed patients with stage IV non-small cell lungcancer treated with platinum doublet chemotherapy.Oncotarget 6,30287(Oct 6,2015)；A.Vachani等人,Clinical Utility of a Plasma Protein Classifier forIndeterminate Lung Nodules.Lung193,1023(Dec,2015)；X.J.Li等人，An integratedquantification method to increase the precision,robustness,and resolution ofprotein measurement in human plasma samples.Clinical proteomics12,3(2015))，它根据美国国家科学院医学指南开发(C.Micheel,S.J.Nass,G.S.Omenn,Institute ofMedicine(U.S.).Committee on the Review of Omics-Based Tests for PredictingPatient Outcomes in Clinical Trials.,Evolution of translational omics:lessonslearned and the path forward.(National Academies Press,Washington,D.C.,2012),pp.xv,338p)并监测11种蛋白质。收集的临床因素包括年龄、吸烟状况、结节直径、结节毛刺和结节位置。
数据分析
所有统计分析均使用Matlab(Mathworks inc.，版本8.3.0.532)和MedCalc，版本16.4(MedCalc Software bvba)进行。方差分析的卡方检验用于比较各组，p值≤0.05被认为是显著的。医生、患者以及实验室和统计人员对蛋白质分类器和临床信息的结果不知情。分别使用Mann-Whitney和Fisher精确检验评估连续和分类变量。所有置信区间均报告为双侧二项式95％置信区间(CI)。
结果
在2012年4月至2014年12月期间，共有475名受试者在注册研究NCT01752101中进行了前瞻性登记。其中，50名受试者违反了纳入/排除标准；另外43名受试者患有除NSCLC以外的肺癌；另外26名受试者缺少数据；另外3名受试者违反了血液样品采集方案。这使得353名患者有资格进行分析(更详细信息参见(A.Vachani等人,Clinical Utility of aPlasma Protein Classifier for Indeterminate Lung Nodules.Lung 193,1023(Dec,2015)))。在353名符合条件的受试者中，222名结节大小为8-20mm。基线人口统计数据如表27所示。
表27.所有222名受试者的患者人口统计学和肺结节特征。
在该受试者群体中，癌症患病率为81％(222名受试者中的180名)。患有恶性结节的受试者的平均年龄(67.1岁)与良性结节的受试者(64.8岁)没有显著差异。吸烟史被分为“从不”、“以前”和“当前”类别，类似于恶性和良性结节的受试者。结节大小在具有恶性结节(14.7mm)的受试者和具有良性结节(14.1mm)的受试者之间没有显著差异。
在评估的11种蛋白质组学标记物中，5种先前被报道为诊断性的(ALDOA、COIA1、TSP1、FRIL和LG3BP)，6种被报道为内源性标准化物(C163A、PEDF、LUM、GELS、MASP和PTPRJ)(A.Vachani等人，Validation of a multiprotein plasma classifier to identifybenign lung nodules.Journal of thoracic oncology:official publication of theInternational Association for the Study of Lung Cancer10,629(Apr,2015)；；X.J.Li等人，An integrated quantification method to increase the precision,robustness,and resolution of protein measurement in human plasmasamples.Clinical proteomics12,3(2015))。在该分析中，我们关注比率对P1/P2，P1是诊断蛋白，P2是标准化物。在所有这些蛋白质比率对中，LG3BP/C163A具有60％的最大AUC，用于将222名受试者分类为恶性或良性。通过Mann-Whitney检验，这明显优于随机检验(p值0.025)。这两种蛋白质的比例LG3BP/C163A将用于评估所述的研究假设。表28列出了所有比率对的AUC性能。
表28.所有蛋白质组比率对P1/P2的AUC性能，其中P1是五种诊断蛋白(ALDOA、COIA1、TSP1、FRIL和LG3BP)之一，P2是六种标准化蛋白(C163A、PEDF、LUM、GELS、MASP和PTPRJ)之一。
研究终点#1
我们评估了五种临床危险因素(结节大小、受试者年龄、受试者吸烟史、结节位置和结节毛刺)和蛋白质组学比率LG3BP/C163A的个体性能。图21显示了使用ROC图的五种临床风险因子和分子标记物LG3BP/C163A的性能。在比较这六个因子时，蛋白质组比率具有最高的AUC(60％)并且明显优于随机(p值＝0.025)。相比之下，没有一个临床风险因素的AUC显著优于随机(AUC出现在括号中)：结节大小(55％)、年龄(57％)、吸烟史(55％)、结节位置(48％)和结节性毛刺(55％)。
研究终点#2
为了解决第二个研究终点，我们需要将五个临床风险因素与蛋白质组学比率相结合整合。使用决策树方法进行这种整合(L.Breiman,Classification and regressiontrees.Wadsworth statistics/probability series(Chapman&Hall,Boca Raton,Fla.,1993),pp.x,358p)。首先使用蛋白质组比LG3BP/C163A，基于决策阈值“t”将肺结节分类为更低或更高的风险(参见下面的公式，其中“k”表示评估中的肺结节)。其次，根据五种临床风险因素计算癌症风险评分“ClinFact”。注意ClinFact风险算法是‘Mayo’算法的简化，省略了癌症的历史因素(5)。如果肺结节风险较低，如由蛋白质组学比率LG3BP/C163A确定的，那么Mayo风险预测会减少固定量“T”，否则保持不变。我们称这个整合模型为“IntMod”。有效地，蛋白质组比LG3BP/C163A用于鉴定低风险肺结节以排除肺癌。
X＝-6.8272+0.0391*年龄+0.7917*吸烟者+0.1274*直径+1.0407*毛刺+0.7838*位置
我们注意到这个整合模型有两个需要了解的参数，即“t”和“T”。
参数t和T的最佳值
在这个分析中，我们了解了积分参数t和T的最佳值。评估了t(-1.1到3.3，增量为0.1)和T(0到1，增量为.1)的所有可能的值对，并且计算得到的IntMod预测器的AUC。我们做出以下观察：
·无论参数T的值如何，发生最高AUC值的t的最长连续延伸值为t＝0.14至0.39。在该范围内，AUC值均为至少62％。也就是说，对于IntMod，这是具有高性能和稳定性能的参数t的值范围。
·在t＝0.14至0.39的范围内，当T＝0.5时，绝大多数t值(29个中的23个)达到最大AUC。特别地，对于t＝0.29和T＝0.5，实现的最大AUC为63.1％。
·在t＝0.14至0.39的整个范围内，当T＝0.5时，实现的AUC与0.5显著不同，p值均小于0.008(Mann-Whitney检验)。
为了进一步讨论，我们选择t＝0.29和T＝0.5，因为它在具有强性能的最长连续值范围内。但是，重要的是要指出，对于该范围内的任何t值(0.14至0.39)，整合模型的性能基本相同。图22显示了IntMod对参数t的所有值和T＝0.5的AUC性能。
蛋白质组比、Mayo和整合模型的比较性能
在这些受试者上，蛋白质组比率、简化的Mayo算法和整合模型IntMod的AUC性能分别为60％、58％和63％。这些如图23所示。虽然这些AUC值表明整合模型的性能优于蛋白质组比和单独的Mayo，但我们关注的是IntMod ROC曲线上的临床相关点(灵敏度＝90％，特异性＝33％)，以使用McNemar检验在相同灵敏度和特异性下统计地比较于蛋白质组学比率和Mayo模型的性能。通常需要高灵敏度来自信地排除肺癌。
使用McNemar检验，整合模型对蛋白质组比(p值0.031)和Mayo模型(p值0.008)具有明显更好的特异性(当灵敏度固定为90％时)。类似地，使用McNemar检验，整合模型对蛋白质组比(p值<0.001)和Mayo模型(p值<0.001)具有显著更好的灵敏度(当特异性固定为33％时)。
讨论
确认了本研究中测试的两个终点。首先，蛋白质组学标记物LG3BP/C163A具有与五种常用临床风险因子相当(实际上优越)的性能。其次，该蛋白质组学标记与五种临床危险因素的整合导致风险预测因子在统计学上优于蛋白质组学标记和临床风险因子。该结果肯定了整合风险预测因子可以更好地预测肺结节管理。
该分析评估了来自12个站点的一组新的前瞻性采集样品中先前报告的五个临床风险因子和11个蛋白质组学标记。对多个样品集的风险标记进行评估有助于确定其在临床使用中的性能和适当用途。在这项研究中，我们专注于直径8到20毫米并经历了侵入性手术的肺结节亚群。该亚群是重要的，因为它包含过度治疗的良性肺结节，因此，能够评估临床危险因素和蛋白质组学标记物，以便识别可以避免不必要的侵入性操作的良性肺结节。值得注意的是，本研究中观察到的性能值肯定低于先前报道的使用相同临床危险因素和蛋白质组学标记的其他肺结节人群的性能值；被测试的群体很重要。
整合模型的设计值得一些评论。首先，评估蛋白质组比率而不是单个蛋白质标记物。其原因在于比率特别有用，因为它们对于预分析和分析变化进行标准化(X.J.Li等人，An integrated quantification method to increase the precision,robustness,andresolution of protein measurement in human plasma samples.Clinicalproteomics12,3(2015))。此外，为了减少过度拟合的可能性，我们避免使用两种以上的蛋白质组标记物。其次，除了这里使用的决策树方法，还有许多其他有效的方法来整合临床和蛋白质组学风险因素，包括逻辑回归(D.Freedman,Statistical models:theory andpractice.(Cambridge University Press,Cambridge；New York,2009),pp.xiv,442p)，支持向量机(N.Cristianini,J.Shawe-Taylor,An introduction to support vectormachines:and other kernel-based learning methods.(Cambridge University Press,Cambridge；New York,2000),pp.xiii,189p)和随机森林(T.Hastie,R.Tibshirani,J.H.Friedman,The elements of statistical learning:data mining,inference,andprediction.Springer series in statistics(Springer,New York,2001),pp.xvi,533p)等等。
实施例7
Xpresys Lung版本2(XL2)是一种血液测试，旨在用于识别可能是良性的肺结节，因此这些结节可以安全地避免风险和昂贵的侵入性操作，如活组织检查和手术。详见2.1节。
据估计，每年在美国偶然或通过肺癌筛查计划检测到超过300万个肺结节。大多数肺结节患者属于医保年龄。详细信息请参见第2.2节。
虽然每年检测到的大多数肺结节是良性的(75％-85％)，但62％经历了不必要的活检，35％经历了不必要的手术，或两者兼而有之。详细信息请参见第2.2节。
XL2的关键性能指标是其阴性预测值(NPV)，因为XL2是癌症排除测试。基于预期的PANOPTIC研究，XL2的中值NPV为98％(CI：92％-100％)，该研究跨越33个站点并招募685名受试者。美国胸科医师学会(ACCP)指南推荐95％NPV随时间观察肺结节。详细信息请参见第3.2节。
Xpresys Lung版本2(XL2)在几个方面优于Xpresys Lung版本1(XL1)，最值得注意的是(详见3.7节):(1)XL2是在两项大型前瞻性研究中开发和验证的；XL1是在两项中等规模的回顾性研究中开发和验证的；(2)XL2利用XL1蛋白生物标记物的一部分，最准确地识别良性肺结节；(3)XL2将蛋白质生物标记物与之前已经验证(并通过ACCP指南认可)的五种临床因素整合在一起，可用于评估肺结节的癌症/良性状态。
统计上，XL2在性能上优于PET。具体而言，在PANOPTIC研究中，XL2和PET可以直接在同一受试者上进行比较，XL2的NPV为98％(CI：92％-100％)，而PET的NPV为79％(CI：66％-88％)。详细信息请参见第3.3节。
XL2比四种最常见的临床风险因子算法(Mayo、VA、Brock和Herder)具有统计学上优越的性能，其中XL2和临床风险因子算法在相同受试者上进行比较。详细信息请参见第3.3节。
XL2在相同受试者中比较XL2和医生癌症风险评估的情况下比医生具有统计学上优越的性能。详细信息请参见第3.3节。
如果在PANOPTIC中使用XL2，则可以避免36％的不必要的侵入性操作(活组织检查和/或手术)。XL2有可能避免每年超过36,000例手术、1,600例住院治疗和近750例死亡。其中大部分发生在医保患者群体中。有关详细信息，请参见第2.2节和第3.4节。
与目前的做法相比，XL2使用起来非常安全。具体而言，如果在PANOPTIC中使用XL2，那么只有3％的恶性结节会被错误地送到CT监测。相比之下，在PANOPTIC试验预期使用人群中，45％的恶性肺结节患者被错误地送往CT监测。详细信息请参见第3.4节。
为了确保预期用途人群被客观地定义为在医疗保险人群中使用的风险较低，患者必须满足以下条件：(1)新发现直径在8mm和30mm之间的肺结节；(2)目前不是吸烟者；(3)Mayo临床风险预测值为40％或更低。
Mayo临床风险预测因子是ACCP指南中确定的用于肺结节风险评估的经过验证的公式。Mayo公式包含以下临床风险因素：结节大小、吸烟史、年龄、结节位置、结节毛刺和癌症病史。
1.Xpresys Lung介绍性概述
Xpresys Lung已被开发用于区分良性和恶性肺结节。Xpresys Lung是蛋白质的血液测试，结合了使用大数据集的蛋白质组学和计算机科学的专业知识。几十年来，质谱一直被用作分子诊断技术，仪器的最新进展允许一次测量数百种蛋白质。癌症分泌并流出与正常细胞不同的蛋白质，并且这些蛋白质的一些在血液中循环。InDi开始于388种蛋白质候选物和从患有良性和恶性肺结节的两种患者中存储的血液样品。最初的分析使用11种蛋白质的组合发现并验证良性结节的预测因子。Xpresys Lung第一版(XL1)提供了超过医生用于区分良性和恶性肺结节的临床风险因素的显著性能。InDi现已完成了方案采集的血液样品的进一步工作，以完善第二版Xpresys Lung(XL2)，其是一种确定哪些结节是良性的稳健测试。
这个新版本XL2以四种方式改进XL1，如第3.7节所述。它们是：1)精确的预期用途人口；2)鉴定在鉴定良性肺结节中最准确的前11种蛋白质中的2种；3)纳入五个临床风险因素；和4)基于两项大型前瞻性研究的发现和验证，其中使用统一的方案而不是归档生物库来收集样品。
XL2实现了识别良性结节的高性能。在98％的阴性预测值(NPV)下，灵敏度为97％(表34，第3.6节)。这种改进的测试表现明显优于PET(NPV为79％，95％CI为66％-88％)(第3.3.4.3节)。XL2的表现明显优于四种临床风险预测因子(Mayo、VA、Brock和Herder)(第3.3.4.2节)。XL2将为医生提供最好的证据，以确定哪些结节是良性的。
XL2将位于PET、支气管镜检查、穿刺活检和手术之前(第2.4.2节)。来自XL2的高NPV值的置信度将指导更多患有良性结节的患者进入CT监测。这将实现Xpresys Lung的目标：避免不必要的进一步评估良性结节，尤其是侵入性手术。
XL2的预计临床效用是侵入性手术减少36％(第2.4.1节)。这些侵入性手术的减少将减少手术、手术死亡率和活检并发症住院治疗(第2.4.3节)。
在确定覆盖范围后，InDi打算进行前瞻性介入试验。该试验将证实XL2产生的结果在医疗保健服务情况中具有临床效用。该试验总结在第4节。
2.Xpresys Lung的临床方面和肺结节
2.1 Xpresys Lung预期用途和描述
2.1.1预期用途
Xpresys Lung版本2(XL2)用于评估40岁或40岁以上患者的8-30mm肺结节，其中医生估计癌症风险较低(癌症的预测概率为0至50％)。为了被定义为医保人群中的风险较低，患者必须具有基于Mayo模型的癌症的预测概率<40％，而且不是当前的吸烟者。XpresysLung的目标是识别那些可能是良性的结节，这样可以通过CT监测安全地观察这些结节，而不是进行昂贵且有风险的侵入性手术，如活组织检查和手术。
2.1.2 Xpresys Lung的描述
XL2是一种风险预测因子，可将分子(蛋白质组学)测量与临床风险因素相结合。测量与癌症或良性过程相关的蛋白质。这些蛋白质从肺中的细胞分泌或流出，并在血浆样品中测量。XL2结果将报告为可能良性(90-98％阴性预测值)或不确定(测试后癌症风险并未显著低于癌症的测试前风险)。详情请参阅第3.6节。
2.2肺结节的未满足需求显著且增长
2.2.1肺结节
2.2.1.1定义
肺结节是通过X射线成像看到的圆形致密物。X射线成像可以是胸片(CXR)或计算机辅助断层扫描(CAT扫描)。结节主要被肺组织包围，也称为硬币病变，孤立性肺结节或病变，或肺部的“斑点”。直径大于30毫米的圆形致密物是肺肿块，而不是结节。结节的边缘可以描述为光滑或不规则(星状或带状的)，并且不规则的边缘更多地指示癌症。具有光滑边缘的重度钙化结节通常是良性的，并且未显示出随时间增长的实体结节被认为是良性的。使用改进的CT成像，现在可以看到亚实性结节、磨玻璃样不透明物或部分实性结节，并有不同的指南。本申请的重点是8-30毫米的实体结节，而不是亚实体结节。
有关结节及其评估的综合评论，请参阅V.K.Patel等人的两部分系列，“APractical Algorithmic Approach to the Diagnosis and Management of SolitaryPulmonary Nodules.Part 1:Radiologic Characteristics and Imaging Modalities,”Chest,vol.143,no.3,pp.825-339,2013；和V.K.Patel等人，“A Practical AlgorithmicApproach to the Diagnosis and Management of Solitary Pulmonary Nodules.Part2:Pretest Probabiity and Algorithm,”Chest,vol.143,no.3,pp.840-846,2013。
2.2.1.2每年检测的结节数
在美国每年检测到的新肺结节估计数为157万[7]。由于包括CT扫描技术改进和进行的更多CT扫描在内的多种因素的结合，新肺结节的数量一直在增加。157万的估计是对于直径为4-30毫米的结节；8-30毫米结节的估计是每年800,000。
2.2.1.3偶然和筛查的结节
上述估计每年有157万个结节，仅是对于偶然发现的结节，不包括另外150万个筛查结节。偶然意味着成像是由于结节检测以外的原因而进行的。例如，心脏、上腹部和甚至乳房X线照相术的成像包括肺组织，因此肺结节是偶然的发现。
肺癌筛查目前在美国已有报道。截至2016年4月26日，有806个网站注册用于筛选(http://www.acr.org/quality-safety/national-radiology-data-registry/lung-cancer-screening-registry-请参阅核心文件，访问于6月20,2016)。初步估计，一旦筛查计划到位，每年将发现另外150万个结节。全国肺部筛查试验(NSLT)的筛查阳性率为24％，估计美国有700万人符合NSLT入选标准。
2.2.1.4肺结节“流行病”和保健
早期发现肺结节是降低肺癌死亡率的一个很好的机会，但它具有重大风险。这些风险既适用于患者，也适用于医疗保健。对于患者来说，一个主要问题是不必要的侵入性手术的风险，以找到少数癌症结节。XL2解决了这些可避免的程序。
对于医疗保健服务，风险既是成本又是医疗保健系统超负荷。大多数结节患者将超过65岁。在NLST中，超过57％的NSLT登记者年龄超过65岁。结节检测率随着年龄的增长而急剧增加，至少到89岁。因此，医疗保险登记者更有可能符合肺癌筛查标准并且检测到更多的结节。如果结节≥8mm，则表明了进一步测试，XL2解决了这些可避免的程序。
2.2.1.5与医疗保险人口的相关性
在每年偶然发现或通过肺癌筛查发现的300万个结节中，大多数将是医疗保险年龄。最近的四项研究强调了肺癌评估对医疗保险人群的重要性：(1)在18个站点回顾性图表回顾性研究中，377名符合条件的患者的平均年龄为65岁。所有患者的结节直径为8-20mm。(2)一项针对12个站点和475名患者的前瞻性研究发现，62.5％的患者为65岁或以上。所有患者的结节直径为8-30mm。(3)在33个站点和685名患者的前瞻性研究中，超过50％的患者为65岁或以上(PANOPTIC研究)。所有患者的结节直径为8-30mm。(4)最近的一项研究报告称，在2009年1月至2011年12月期间，来自5％医保理赔的随机抽样的8,979名医疗保险患者因胸部CT扫描异常而接受了肺癌评估。
2.2.2肺结节评估：现行做法和改进需求
2.2.2.1指南
各组已公布肺结节评估指南。美国胸科医师学会(ACCP)发布并更新了一套关于肺癌的指南。2013年更新的ACCP肺结节指南是美国肺病学家使用的主要参考。重点关注ACCP4.0节关于≥8mm结节，Xpresys Lung的预期用途。
2.2.2.2 8-30mm“不确定”结节的一般方法
用胸部CT扫描以外的成像发现结节(第2.2.1.3节)。因此，经常需要对结节进行高分辨率成像的胸部CT。单独的CT发现或之前的图像可能表明结节是良性的。Patel及其同事已经综述了结节的成像和鉴别诊断的细节。当单独的CT成像不是确定性的时，结节被描述为“不确定的”。
在任何结节被确定为良性之前，使用专家评审员在344个结节的回顾性研究中研究CT成像准确性。CT结果(排除128[27％]而没有“参考标准”或“不确定结果”之后)显示敏感性为95.6％(95％CI，91.3％-97.9％)，特异性为40.6％(95％CI，33.0％-48.7％)。预计一般放射科医师对不确定结节的CT解释结果较差。
大多数8-30毫米的结节是不确定的。ACCP指南指出：“虽然临床和放射学[CT扫描]特征不能可靠地区分大多数人的良性和恶性结节，但在订购影像学检查或活组织检查程序之前估计恶性肿瘤的临床概率仍然很重要”。通过临床判断或定量风险模型估计恶性肿瘤的预测概率(pCA)(参见第2.2.4节)。建立pCA创建三个分组(不包括高手术风险的患者)，低、中和高概率。指南修订版之间的确切数字发生了变化，但相似，pCA<5％为低，>65％pCA为高。一般的概念是，如果结节是恶性的，将通过进一步的CT监测观察低风险患者以观察生长。
相反，指南建议高风险组的患者直接接受手术治疗。逻辑是癌症的概率足够高，以致阴性活组织检查不会改变护理途径。
建议中级风险组(5-65％pCA)通常在下一步进行PET扫描进入诊断性阶段。阴性PET表明良性结节，因此患者随后进行CT扫描。阳性PET扫描继续进行手术或活组织检查。这是整体概念，但PET具有敏感性和特异性问题，但PET具有敏感性和特异性问题，如第2.2.6节所讨论。
2.2.2.3指南和当前实践中的问题
指南在概念上是好的，但是它主要基于弱的证据，并且有证据表明它们没有被遵循。
该指南基于薄弱的证据。ACCP指南使用GRADE系统，大多数关于≥8mm结节的建议都是2C，这是一个低质量证据的弱推荐。有3项建议属于1C级，这是一项强有力的低质量证据推荐，其是：征求患者偏好，如果有恶性增长证据则进行进一步评估，以及偏好胸腔镜而不是打开活检。
有大量证据表明没有遵循指南。一项针对15家退伍军人医院和300名患者的回顾性群组研究发现，只有45％的患者对结节的护理符合指南。一项肺部社区实践对18项实践和377名患者的观察性记录概述发现，结节管理有很大差异。良性结节的手术率为35％，手术率对于低、中、高危患者相同。风险类别由研究计算，尽管风险较低，但28％有活检，17％有手术。此外，CT监测观察到的恶性结节率为24.5％，导致诊断延误的风险。
如Vachani等人所总结的，良性结节的手术率在10％至55％之间，他们发表了一项来自196名肺病学家的调查，这些调查支持非侵入性生物标记物对管理决策的强烈和独立影响的潜力[18]。由于与手术相关的发病率和死亡率，良性结节的高手术率是有问题的。手术风险数据取决于人口和使用的程序。医保年龄患者肺叶切除术后的手术死亡率估计值为2-3％(第2.4.3.2节)。
因此，目前的做法有明显的改进机会。在社区实践中，良性结节的可避免的手术率为35％，以及据报道高达55％。可避免的PET扫描、活组织检查和手术的高比率分别在第2.4.1.2节、第2.4.3.1节和第2.4.3.2节中讨论。
2.2.3医师预测试癌症概率(pCA)，降低癌症风险组和未满足的需求
该指南建议通过临床判断或使用诸如Mayo方程等模型来确定恶性肿瘤的预测概率(pCA)。肺病专家统一使用他们的临床判断来分配pCA，其他医生不确定pCA。
PANOPTIC试验(第2.3节)在临床呈现时、CT扫描后和其他试验前收集pCA结果。该研究中的医生在80％的时间使用他们的临床判断，并且明显优于最常使用的两种定量风险模型VA和Mayo(AUC 0.85 vs 0.75(VA)p<0.001和vs0.78(Mayo)p＝0.011)。这表明医生pCA可能最适合将患有结节的患者分离到更高和更低的癌症风险组，例如50％或更低的癌症风险的pCA。但并非所有医生都对确定pCA有信心，因此定义低风险人群的另一种方法是使用Mayo模型，其中pCA<40％并且不是当前的吸烟者。
对医生pCA数据的进一步分析阐明了对XL2的需求。如图31所示，医生擅长将大多数癌性结节放入pCA大于50％，大多数良性结节放入pCA 50％或更低。然而，大多数良性结节不属于建议进行CT监测的低风险(0-5％pCA)类别。大多数良性结节属于建议进一步评估的中度风险类别。这些评估导致许多良性结节经历风险和昂贵的程序。在PANOPTIC中，33个研究站点几乎都是学术中心和综合健康网络，但良性结节手术率为18％，良性结节活检率为30％。社区肺部实践(大多数患者接受护理)的可比数据是35％的手术是在良性结节上进行的，62％的活组织检查是在良性结节上进行的。
因此，未满足的需求是为治疗医师提供低风险结节的测试(pCA为50％或更低)。对于良性结节，该测试应具有高的阴性预测值(NPV)结果。然后，测试结果表明结节是低风险(0-5％pCA)，建议进行CT监测。
2.2.3.1低风险患者的医师pCA
如图31所示，医生很好地确定了所有结节(整个风险人群)的风险，AUC为85％。然而，他们并没有风险较低(pCA 50％或更低)患者(n＝178，29例癌症和149例良性结节)那么好。在那些风险较低的患者中，医生AUC为0.69，并在图35中以图形方式显示。
大多数这些良性结节属于中度风险人群，其中指南建议进一步评估。如果遵循这些指南，149名良性结节患者中的大多数将进行可避免的成像和活组织检查。这强调了对XL2的需求，并在临床实用程序的第2.4和3.4节中进一步讨论。
2.2.4定量癌症风险模型
PANOPTIC结果显示，医生在分配癌症风险预测概率(pCA)方面优于定量模型。肺结节癌症风险的主要因素是大小。图32显示了与大小相关的癌症患病率的增加。其他主要因素是吸烟史和年龄。由于CT筛查刚刚在美国实施，大多数风险模型是针对偶然结节而不是筛查到的结节开发的。
2.2.4.1偶然结节模型
Mayo诊所和退伍军人管理局(VA)医院小组已经开发出基于相似但不相同的因素的预测模型。VA模型中癌症的患病率相当高，因此其不同地进行。这些和其他模型已在ACCP2013指南中进行了总结，并对Mayo模型提供了支持。指南的第一句内容为：“虽然临床和影像学特征无法可靠地区分大多数人的良性和恶性结节，但在订购检查或活组织检查程序之前估计恶性肿瘤的临床概率仍然很重要。”
2.2.4.2筛查的结节
利用两项加拿大肺癌筛查试验，McWilliams发表了一组AUC>0.90的定量方程。方程可通过布鲁克大学获得。
合并数据包括2,961名患者，但只有144名(<5％)结节是恶性的。它们包括亚实体结节，但79％是实体。平均结节大小为4.1mm，中位数为3.4mm，与癌症比例较低一致。该模型中癌症的预测因子包括年龄较大、女性、肺癌家族史、肺气肿、结节大小较大、上叶结节位置、部分实性结节类型、结节数较低和毛刺。
McWilliams的论文建议将他们的方程用于基线筛查、低剂量CT扫描(而不是偶然发现的结节)的结节。
2.2.5用于放射科医师和CT扫描结节报告的指南；Lung-RADS和Fleishner
有放射科医师使用的关于报告肺结节和随访成像间隔的指南。偶然结节<8mm的指南来自Fleishner Society。针对偶然发现的结节开发了Fleishner指南。
美国放射学院对肺癌筛查计划的指南是Lung-RADS(www.acr.org/Quality-Safety/Resources/LungRADS)。Lung-RADS的开发旨在改善对临床医生的报告和管理建议。一个目标是减少需要进一步评估的假阳性报告的数量，而不增加假阴性。根据文献，如在NLST中使用的，他们将被认为是“阳性”的结节的大小从4mm改变为6mm。Lung-RADS的另一个目标是基于结节大小、CT成像密度以及结节是否存在于基线、扩大或随访时新的肺癌筛查计划的结构化报告系统。Lung-RADS不包括临床医生使用的其他临床因素，如吸烟史、年龄、结节位置或暴露(例如石棉)。
2.2.6 PET扫描
正电子发射断层扫描与造影剂(PET)在肺癌分期中很有用，但PET对肺结节的诊断具有显著的局限性。这些局限是缺乏灵敏度，特别是对于较小的结节，非标准化的阅读和报告，以及炎症和感染性结节的假阳性扫描。
2.2.6.1 PET灵敏度。
较小的结节难以成像，PET最初仅限于>10mm的结节。低代谢恶性肿瘤中的小结节和低对比度摄取是PET成像灵敏度的主要限制。单中心PET经验报告的初始灵敏度估计为95％。在2007年ACCP审查时，估计下降到87％。目前的估计值范围为72％至94％，并在下面的2013年ACCP指南中进行了审核。2014年的一项荟萃分析报告，当包括传染性肺病区域时，汇总灵敏度为89％(95％CI，86％-91％)和高度异质性。
关于结节的PET的早期出版物令人鼓舞，因此2007年的ACCP指南给予PET证据等级2A，但对证据质量和偏倚风险的担忧降低了对2C级的建议。Patel的评论文章最初表明PET“非常准确”，但在对最新数据进行总结之后，他们强调了PET的缺点，并增加了PET最适合具有“中间”pCA的结节的限制。最近一项使用NLST数据的研究显示PET用于结节的患者占14,195例患者的11％，但在21％的病例中仍然存在不适当的PET使用，这表明小结节的过度使用以及担心导致医疗费用过高。
最近PET已与CT结合以提高分辨率，因此尺寸限制已重新规定为8-10mm。预计该组合将改善结果，但成本增加且辐射暴露更高。
2.2.6.2 PET报告
PET的报告有变化，并且通常只是主观报告。由于造影剂中的同位素降解(氟-18的半衰期约为110分钟)，给患者施用的剂量取决于同位素产生时的接近程度。因此，阳性或阴性PET的程度取决于正常高代谢区域的摄取与所讨论的区域的比较。这种比较通常只是主观报告，但可以测量。产生测量值，即标准摄取值(SUV)。SUV值大于2.5被认为是阳性。一些出版物，如Herder仅报告了四点描述性量表的主观结果，没有SUV值。随后的出版物必须使用SUV值以相似的量度进行猜测。例如，这些出版物中的一个(Al-Ameri)使用了3分制的SUV，结果很好。然而，该论文未报告其139位PET扫描患者的结节的平均或中位数大小以及评估的结节数量。在总共244名患者中，他们报告188例患有单发结节(可能是其余部分有多发结节)，103例患者中最大结节≤10mm，且该研究没有解决PET灵敏度问题，其似乎有许多较小的结节。因此，很难得出结论或与公开基本结节特征(如结节大小)的其他研究相比较。
因此，这些示例出版物Herder和Al-Ameri强调了在PET解释和报告中缺乏跨站点和医生的标准化。
2.2.6.3 PET的误报
结节的假阳性扫描是另一个问题。对社区实践的Tanner图表审查发现假阳性PET扫描率为39％。另外值得注意的是，37％的患者进行了PET扫描，并且和与监测相比，活检和手术强度增加相关(P<.0001)。
Deppen报告了一项荟萃分析，其中包括传染性肺病的流行区[S.A.Deppen等人,“Accuracy of FDG-PET to Diagnose Lung Cancer in Areas With Infectious LungDisease.A Meta-analysis,”JAMA,vol.312,no.12,pp.1227-1236,2014]。除了关于肺结节诊断准确性的极端异质性外，流行区的特异性仅为61％，而非流行区为77％。他们得出结论，他们的数据不支持使用FDP-PET诊断流行地区的肺癌。美国的这些流行地区包括密西西比河、俄亥俄州和密苏里河流域地区以及美国西南部地区，包括加利福尼亚中央山谷。
2.2.6.4 PET风险
PET是非侵入性的，但不是无风险的。单独PET的辐射剂量在14mSv时是显著的。当与CT结合时，如通常那样，剂量增加至24mSv。为了比较，用于筛选的低剂量CT是1.4mSv。
2.3支持Xpresys Lung的InDi临床研究
Integrated Diagnostics(InDi)与领先的医生和科学家合作，在主要期刊和会议上制作同行评审出版物和演示文稿。该研究是在分子诊断、肺癌和肺结节领域的主要领导者的合作下构思、设计和实施的。这些努力将在此所附出版物中概述其结果的细节。XL2的结果以及与现有评估工具的比较如下所示。
2.3.1 XL1的发现、核实和验证
Xpresys Lung的最初发现始于388种候选蛋白，并为其中371种开发了一种检测方法。第一个样品是来自3个站点(n＝143)的冷冻血浆，并且鉴定了36个合作蛋白用于分类器。核实来自4个站点(n＝104)的13种蛋白质，并且随着发现工作在2013年发表在ScienceTranslational Medicine[1]上[X.-J.Li,C.等人,“A Blood-Based ProteomicClassifier for the Molecular Characterization of Pulmonary Nodules,”ScienceTranslational Medicine,vol.5,no.207,p.207ra142,2013]。此时，确定该系统生物学和蛋白质组学方法最适合排除8至30mm大小的结节中的恶性肿瘤。用11种蛋白质验证XL1，其中5种是诊断性的，6种用于标准化，使用4个站点的新档案样品(n＝141)，并在2015年发表在Journal of Thoracic Oncology[2][A.Vachani等人,“Validation of a MultiproteinPlasma Classifier to Identify Benign Lung Nodules,”Journal of ThoracicOncology,vol.10,no.4,pp.629-637,2015]。
2.3.2调查和图表总结
InDi与波士顿医疗保健公司签订合同，对肺科医生进行调查，以确定他们的实践模式以及对肺结节生物标记物的潜在接受程度。需求和接受度在2014年得到确认并公布。
波士顿医疗保健公司还收集了社区肺实践综合图表总结数据，以了解大多数肺结节的管理实践模式。对来自18个地理位置不同的站点的377名患者的结节管理进行了评估。结果已在国家会议上公布，并于2015年发布[A.Vachani等人,“Clinical Utility of aPlasma Protein Classifier for Indeterminate Lung Nodules,”Lung,vol.193,no.6,pp.1023-1027,2015]。特别值得注意的是发现良性结节的活检率为61％，手术率为35％。
2.3.3分析验证
分析验证已于2015年进行并发布[X.-J.Li等人,“An IntegratedQuantification Method to Increase the Precision,Rocustness,and Resolution ofProtein Measurement in Human Plasma Samples,”Clinical Proteomics,vol.12,no.3,2015]。
2.3.4临床实用和XL2的发现/验证
研究1013是一项从2012年开始的前瞻性研究，招募了来自12个站点的475名患者。该研究是独特的，因为它包括正在接受确定肺结节是良性还是癌性的程序的患者。因此，可以进行组织诊断，如果使用Xpresys Lung，可以评估侵入性操作的使用可能发生的变化。如果遵循XL1结果，主要发现是减少32％，但24％的恶性结节将被送往CT监测。
研究1013结果也用于发现XL2。
2.3.5 PANOPTIC和XL2验证
研究1001(PANOPTIC)也于2012年开始，招募了来自33个站点的685名患者。该研究包括在开始任何诊断测试之前的所有预期用途结节。该研究是独特的，因为收集了医生预测癌症概率(pCA)。数据用于验证XL2并在本文档中显示性能和比较数据。
2.4临床实用性、XL2的预期临床使用和XL2对侵入性手术的影响
2.4.1临床实用性
XL2是一种稳健的测试，用于确定哪些低风险结节是良性的。XL2解决的临床需求是将更多患有良性结节的患者适当地放入CT监测中。这将避免不必要的成像和侵入性程序，这是XL2的主要临床实用性。来自PANOPTIC试验的结果可用于估计XL2在许多阴性预测值(NPV)中的作用(表34)。在这里，我们将使用98％的NPV值并讨论临床背景。使用98％的NPV，因为大多数可能的良性报告的NPV为98％(表34)。
2.4.1.1 98％NPV的临床实用性
在NPV为98％时，XL2的灵敏度为97％，特异性为44％(表30，第3.2节)。如果XL2用于所有低风险结节(n＝178)，PANOPTIC对良性结节侵入性操作的减少将为36％(42个中的15个)(3.4节)。
测试的患者数量为178名患者，69名(39％)将接受“可能良性”测试结果，98％概率(NPV)为良性。非常高的NPV可能会导致单独的CT监视。
低风险组中有29个恶性结节，29个中有13个(45％)被临床医生送往CT监测。在98％NPV水平使用XL2可使1名患者(3％)接受CT监测(表33，第3.4节)。
2.4.1.2临床实用性和PET扫描
在NPV水平为98％时，使用XL2可以避免在良性结节患者中获得56例(36％)PET扫描中的21例。在同一组中，对恶性结节进行了19次PET扫描，然后将其错误地送至CT监视。使用XL2会减少到仅1次PET扫描，然后进行CT监测。
2.4.2 XL2测试的预期临床使用和时间安排
Integrated Diagnostics(InDi)计划将XL2推广给学术和社区的肺病学家。XL2的主要目标是减少预期使用人群中可避免的成像和良性结节的侵入性程序。测试结果文件(第3.6节)将报告阴性预测值90-98％作为实际值，并报告为“可能良性”。然后，订购医生可以决定患者适当的风险等级。如果患者对手术不利，可以选择较低的NPV结果，例如95％。相反，如果患者对监测CT的观察期非常不利，那么可能需要98％的NPV结果来决定CT监测。
2.4.2.1 XL2测试的时间安排
Xpresys Lung 2将在几个点之一用于评估患者结节。大多数情况下，XL2将用于CT扫描后和任何其他成像(如PET)之前的低风险不确定结节(第2.2.2.2节)。如果在PET扫描之前进行，则PANOPTIC中的XL2显示出有利的临床效用(第2.4.1.2节)。这种用途可以避免PET的费用和高辐射的风险(第2.2.6.4节)。
XL2也可用于有侵入性手术或手术禁忌症的患者，然后再决定进行CT监测或照射等经验性治疗。
2.4.3 XL2影响对不确定结节的侵入性程序
在本节中，InDi将评估XL2对侵入性程序的影响以及与这些程序相关的发病率和死亡率。
有两种类型的侵入性诊断程序：活组织检查和手术切除。
2.4.3.1结节活检
可以通过支气管镜或穿过胸壁的针以CT图像引导获得活组织检查。社区实践图表审查发现，38％的患者进行了活检。活组织检查或手术并发症随着年龄、吸烟史和其他肺部疾病而增加。
通过支气管镜进行活检的风险最低，出血或气胸的风险为2-4％。该程序的缺点是结节的取样不准确。正确的采样平均值约为50％。采用现代导航技术可以提高正确的采样率。用于结节的支气管镜活检目前约占结节的20％。
大约15％的结节患者进行针吸活检，出血风险为1％，气胸风险为15-19％。大约一半(7％)的气胸患者需要胸管放置并且住院时间很长。大多数针活组织检查是诊断性的，但恶性结节的非诊断结果的风险约为20％。
活组织检查(联合支气管镜检查和针头)在约25％的结节(200,000)中进行，程序用于良性结节，占42-62％(104,000)。活组织检查的并发症导致住院率为2-7％(支气管镜检查和穿刺活检并发症的范围，中位数为4.5％)。这意味着每年有4,680次超额住院治疗(104,000x.045)可能是可以避免的。
2.4.3.2结节手术
最终，大多数恶性结节进行手术切除，约15-25％的患者在手术前进行了活组织检查(不包括在XL2影响估算中)。结节人群的良性和恶性结节的整体手术率约为34％(每年270,000)(InDi数据)。并发症包括死亡(CMS人群中2％)、肺部漏气延长(3-5％)和肺炎(1-8％)。
已公布的良性结节手术率为31-44％。这相当于每年约102,000例手术(270,000x.38[中等范围])和2,052例死亡(270,000x.38x.02)，这对于没有患肺癌的患者可以避免。
2.4.3.3 XL2影响估算
使用上面计算的潜在可避免侵入性手术的数据，并假设XL2在报销后有广泛使用，那么XL2有可能挽救超过36,000例手术、超过1,600例住院治疗和每年近750例死亡。其中大部分发生在CMS患者群体中(第2.2.1.5节)。
3.XL2的技术和性能总结
本节介绍XL2测试的以下详细信息：
开发和验证(第3.1节)：
XL2是在两项大型和一般性的前瞻性研究中开发和验证的，包括PANOPTIC研究，该研究在33个站点招募了685名受试者。
XL2是根据美国国家医学院严格的测试开发指南开发和验证的。
XL2开发和验证实现最高水平的证据，其是前瞻性的并且在大量独立站点进行。
性能(第3.2节)：
XL2具有阴性预测值、灵敏度和特异性为98％(CI：92％-100％)、97％(CI：82％-100％)和44％(CI：36％-52％)。
比较性能(第3.3节)：
XL2相对于目前的实践，PET和四种临床风险预测模型有利，并且表现出统计学上显著的优越性能。
XL2的潜在临床效用：益处和危害(第3.4节)：
两项前瞻性研究可以计算XL2的潜在临床效用。
如果在PANOPTIC中使用XL2，则可以消除36％的良性肺结节侵入性手术。
重要的是，XL2比目前的实践更安全。如果在PANOPTIC中使用XL2，那么只有3％的恶性肺结节会被错误地从侵入性手术中引出。相比之下，医生错误地使45％的恶性肺结节远离侵入性手术。
本节以XL2的正式规范(第3.5节)、XL2结果的报告(第3.6节)以及XL1和XL2(第3.7节)之间的主要差异描述结束。
3.1XL2的开发和验证
XL2是在研究1013(NCT01752101)开发，然后核验，并在PANOPTIC研究(NCT01752114)进行验证。研究1013和PANOPTIC都是由Integrated Diagnostics设计和赞助的肺结节的前瞻性研究，主要目的是开发和验证Xpresys Lung。这些研究总结在表29中。
表29：研究1013和PANOPTIC显示开发阶段以及站点和患者的数量。
| 研究1013 | PANOPTIC | |
| 开发阶段 | 发现 | 核验和验证 |
| 站点数量 | 12 | 33 |
| 入选患者 | 475 | 685 |
| 预期用途患者 | 22 | 178 |
XL2的开发和验证遵循了美国国家医学院(NAM)测试开发和验证最佳实践指南所定义的测试开发的最佳实践。具体地，发现和验证都是前瞻性的，并在大量独立站点进行。此外，验证和验证是在严格的盲法协议下进行的，并使用了第三方统计员。这是NAM可实现的最高水平的临床验证。可以查看研究1013的XL2早期开发和发现的详情。验证方案和结果也可供查看。
3.2在PANOPTIC试验中XL2的性能
3.2.1 XL2的性能测量和结果
XL2的性能基于预期使用人群中的178名PANOPTIC受试者。诊断测试的四个标准性能量度是灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。
灵敏度：XL2正确预测为恶性的恶性肺结节的百分比。
特异性：XL2正确预测为良性的良性肺结节的百分比。
阴性预测值(NPV)：XL2预测是良性的肺结节是良性的百分比。
阳性预测值(PPV)：XL2预测为恶性的肺结节是恶性的百分比。
XL2被设计为肺癌排除测试，也就是说，它识别可能是良性的肺结节，以便使用CT监视并且可以避免侵入性操作。因此，报告肺结节可能是良性的准确性具有至关重要的临床意义。该性能量度是NPV。
什么NPV最适合决定途径？这取决于患者的偏好和医生的建议(第2.2.2.2节)。ACCP指南建议，如果癌症发生率低于5％，可以通过CT监测观察肺结节。这相当于NPV值超过95％。XL2已经过验证，NPV值为90％或更高。表30显示了XL2的性能，NPV值为90％至98％以及95％置信区间(CI)。我们注意到，该研究中可能良性报告中最大比例的NPV为98％。
90％NPV值是最低的，被认为“可能良性”。这是因为低于90％的NPV值与肺结节良性的测试前概率没有统计学差异。PANOPTIC预期使用人群中良性肺结节的预测试概率为83.7％，低于表30中所有NPV值的95％CI。对于NP2低于90％的XL2结果，良性的测试后概率与良性的测试前概率无统计学差异。在这些情况下，测试结果被认为是“不确定”。有关XL2测试报告的完整详细信息，请参见第3.6节。
表30：来自PANOPTIC研究的178名患者的XL2的性能和可能良性报告，NPV值为90％至98％(‘可能良性')和低于90％(‘不确定')。
3.2.2 XL2的图形性能
通常使用受试者工作特性(ROC)曲线以图形方式描绘诊断测试的性能。图33显示了预期使用群体内178个PANOPTIC受试者单独XL2的ROC曲线。这种相同的图形格式将用于多个图。
此ROC图上有三个标记，值得注意后续图形。
标记#1是XL2的ROC曲线本身。曲线离随机越远，如虚线对角线所示，诊断测试的整体性能越好。这通常通过曲线下面积(AUC)来测量。
标记#2是‘95％NPV区’。诊断测试的NPV完全取决于其灵敏度、特异性和疾病患病率。此依赖关系由以下式获得：
在PANOPTIC研究中，预期使用人群中的癌症患病率为16.3％。这意味着我们可以确定那些导致临床相关NPV至少为95％的灵敏度和特异性值。这些灵敏度和特异性值在图33中描绘为‘95％NPV区’。用于排除肺结节中癌症的稳健的诊断测试应该在该区域内具有灵敏度和特异性。
95％NPV区的另一个重要方面是XL2将与其他癌症风险预测因子进行比较(第3.3.3节)。
标记#3是ROC曲线上XL2达到最大NPV的点。此时XL2的灵敏度为97％，特异性为44％，NPV为98％。强调NPV是因为图形区域与例如XL2的排除测试最相关。
3.3 XL2的比较性能
3.3.1与XL2比较的当前风险预测因子选择
本节将XL2与其他六种肺结节癌症风险预测因子进行比较。所有比较均使用风险较低的预期用途人群中相同的178名PANOPTIC患者进行。这允许进行“苹果对苹果”的比较。这六个预测因子分为如下三类。
目前的实践：目前估计肺结节癌风险的实践是基于医生临床判断的初始医师癌症风险评估。这也代表了在PANOPTIC中评估超过80％的肺结节的癌症风险估计值，也是ACCP指南(第2.2.4.1节)中推荐的做法。
PET：PET在ACCP指南中被引用，用作评估癌症风险的工具。在PANOPTIC研究中，PET用于178中75名(42％)预期使用受试者。
临床风险预测因子：已经讨论了四种临床风险预测因子(第2.2.4节)，并评估：Mayo、VA、Brock和Herder。在ACCP指南中引用了Mayo和VA，然而，在PANOPTIC研究中，不到20％的医生使用它们。包括Brock和Herder模型是为了完整性，但分别在第2.2.4.2和2.2.6.2节中讨论的PANOPTIC研究中没有被医生使用。我们注意到，因为Herder模型需要进行PET，所以PANOPTIC研究中只有178中75名(42％)预期使用受试者具有Herder结果。
3.3.2比较方法
在3.3.3节中，XL2和其他六种癌症风险预测因子以ROC曲线表示。这将给出这些风险预测因子在重要的‘95％NPV区’中的AUC和性能方面的总体印象。但是，没有任何统计条款(claim)。第3.3.4节保留了完整的统计处理。
在3.3.4节中，XL2以严格的统计方式与其他六种癌症风险预测因子进行了‘苹果对苹果’比较。除PET的情况外，所有这些比较均基于以下方法：
比较基于95％NPV区的性能进行。
利用McNemar统计检验。当比较同一组样品上的预测因子并且具有固定的灵敏度(或固定的特异性)时，McNemar测试是最合适的。
在PET的情况下，由于PET在‘95％NPV区’中表现不佳，因此无法进行McNemar比较。相反，直接进行NPV性能比较。
3.3.3XL2与所有其他风险预测因子的图形比较
在对XL2与其他风险预测因子进行正式统计比较之前，我们先从六个风险预测因子相对于XL2的整体情况开始。为此，我们使用ROC图(图34)可视化性能并测量整个AUC。我们不会根据整个AUC进行统计比较，因为这不是排除测试的相关指标(尽管XL2具有最高的AUC)。第3.3.4节包含正式统计比较的结果。
图34显示了单个ROC图中的XL2和其他六个风险预测因子。表34中显示了图34中所有预测因子的AUC。我们对这种预期使用人群的头对头比较做了三次直接评论，癌症风险为50％或更低：
1.XL2具有卓越的整体性能(最高AUC)，但更重要的是，在‘95％NPV区'中性能最佳。
2.目前的实践(pCA)整体性能非常差(AUC＝69％)，但在‘95％NPV区’内性能特别差。
3.PET整体性能并且也在‘95％NPV区’内最差(AUC＝58％)。
虽然最重要的因素是XL2在95％NPV区域的卓越性能，但值得注意的是，即使在95％NPV区域之外，XL2的性能仍然优于或等同于所有其他癌症风险预测因子、PET和pCA。
表31：癌症风险预测因子的总体AUC和95％CI
3.3.4统计比较
在本节中，XL2在正式统计意义上与当前实践(pCA)、四个临床风险预测因子、然后PET进行比较。
3.3.4.1 XL2与当前实践(pCA)的比较
将XL2与当前实践相比较，医生对低风险组中癌症预测概率(pCA)的临床判断(pCA为50％或更低)。如图35所示，pCA从未达到所需的95％NPV水平。由于pCA达到的最高灵敏度为90％，因此该水平用于比较XL2与pCA的性能。
使用McNemar检验(第3.3.2节)，在90％的相同灵敏度下，XL2具有显著更高的特异性，p值为2.12E-11。
3.3.4.2 XL2与临床风险预测因子的比较
我们将XL2与四种临床风险预测因子(Mayo、VA、Brock和Herder)进行比较。比较是在XL2和所有四种临床风险预测因子达到的90％和97％的灵敏度下进行的。我们包括这两种灵敏度用于稳健的比较。
使用McNemar检验(第3.3.2节)，在灵敏度为90％和97％时，XL2的特异性明显高于表32中报告的p值的四个临床风险预测因子。我们注意到XL2与所有模型之间的比较除外Herder都是在所有178名PANOPTIC患者身上进行的。对于Herder(需要进行PET)，只能比较75名患者。这个较低的样品数导致较高(但仍然显著)的p值。
表32：对于偶然(Mayo和VA)和筛查(Brock)结节，XL2与临床风险预测因子的比较。Herder将临床因素与PET相结合。
| 比较 | 90％灵敏度p值 | 97％灵敏度p值 |
| XL2 vs.Mayo | 0.0009 | 0.0009 |
| XL2 vs.VA | 1.562e-11 | 2.71E-7 |
| XL2 vs.Brock | 0.0021 | 0.0051 |
| XL2 vs.Herder | 0.0455 | 0.0233 |
3.3.4.3 XL2与PET的比较
在XL2的预期使用中的178名PANOPTIC患者中，75名患者进行了诊断性PET。以下比较基于这75名患者。
由于PET永远不会达到95％的NPV区域或足够高的灵敏度，因此不能应用McNemar检验。相反，我们将PET的NPV直接与XL2的NPV进行比较。
PET的最高NPV为79％(95％CI：66％-88％)，因此将此与XL2达到95％的NPV(95％CI：89％-99％)时进行比较。这两个CI不重叠，因此，与PET相比，XL2具有明显更好的NPV。
3.4 XL2的潜在临床效用：益处和危害
PANOPTIC是一项非介入性研究，但是，通过回答以下问题，可以从PANOPTIC估计XL2的潜在临床效用：
“如果在PANOPTIC中使用XL2来识别可能是良性的肺结节，那么有多少良性(有益)和恶性(危害)结节会从侵入性手术进入CT监视？”
在NPV＝98％时(见表33)，XL2在PANOPTIC中具有以下潜在的临床效用：(a)42例中15例(36％)良性结节将从不必要的侵入性手术中获益(益处)；(b)29例中1例(3％)恶性结节将被错误地送往CT监视(危害)。
在NPV＝95％时(见表33)，XL2在PANOPTIC中具有以下潜在的临床效用：(a)42例中20例(48％)良性结节将从不必要的侵入性手术中获益(益处)；(b)29例中2例(7％)恶性结节将被错误地送往CT监视(危害)。
表33：XL2的潜在临床效用
XL2的安全性如何？我们观察到，在PANOPTIC的预期用途人群中，29例中13例(45％)恶性结节被送往CT监测(然后有延迟诊断的风险)。将其与表33中显示的估计值进行比较，表明XL2将为减少不必要的侵入性操作同时向CT监视发送较少的恶性结节提供了安全测试。
3.5 XL2的技术定义
XL2将两种血浆蛋白(LG3BP和C163A)的相对丰度与五种临床危险因素(年龄、吸烟状况、结节直径、结节毛刺状态和结节位置)相结合。XL2为受试者k提供数值XL_2(k)，定义如下：
X＝-6.8272+0.0391*年龄+0.7917*吸烟者+0.1274*直径+1.0407*毛刺+0.7838*位置
其中年龄是受试者的年龄，如果受试者是前吸烟者或当前吸烟者，则吸烟者为1(否则为0)，直径为肺结节的大小，单位为mm，如果肺结节呈毛刺，则毛刺为1(否则0)，如果肺结节位于肺上叶则位置为1(否则为0)。整合临床风险因素的线性函数X是Mayo临床风险预测因子的简化，其消除了癌症风险历史因素。
XL_2(k)范围在0和1之间。XL_2(k)越接近0，受试者k越可能具有使用PANOPTIC数据计算的非常高的NPV。
表34中显示了NPV值为90％至98％的XL_2(k)函数的范围，以及其他关键性能指标。
3.6报告XL2结果
XL2结果将报告为可能良性或不确定，NPV值和置信区间显示在可能良性报告中。示例XL2测试申请表和测试报告表在XL2档案提交中显示为[DOC-000107]和[DOC-000106]。
可能良性和不确定性的分离基于研究人群的癌症患病率和统计学比较。在PANOPTIC研究中，预期使用人群的癌症患病率为16.3％，对应于良性患病率为83.7％。换句话说，在任何临床判断或测试之前，肺结节良性的预测试概率为83.7％。当良性的测试后概率(即NPV)为90％或更高时，XL2报告“可能良性”，如表34所示。
注意，当“k”值超过0.354时，NPV小于90％的置信区间将与人口的83.7％的患病率重叠。因此，这将是在当测试报告从可能良性变为不确定时。
表34：可能良性结果的多个阴性预测值的报告的XL2性能、测试报告和百分比(n＝178名患者)
3.7 Xpresys Lung 1(XL1)和Xpresys Lung 2(XL2)的主要差别
XL2是XL1的第二代版本，与XL1相比有四个重大改进：
3.7.1预期用途群体
XL2的预期用途群体是具有较低癌症风险的患者，而XL1的预期用途群体包括所有患者风险组(0％-100％)。在KOL的指导和XL1的商业经验中，很明显医生需要进行一项测试来区分良性和恶性结节，并且对风险较低而不是风险较高的患者的需求最大(第2.2.3节)。因此，对预期使用人群的关注导致了性能的提高。
3.7.2分子因子的减少
研究1013的发现工作确定了两种蛋白质(LG3BP和C163A)，其比XL1的五种诊断蛋白质更准确，可用于识别癌症风险较低的患者的良性结节。可能的原因是低风险结节和高风险结节之间的蛋白质表达不同[DOC-000114]。
3.7.3临床危险因素的增加
XL1纯粹是一种分子检测，而XL2则含有已知临床风险因素的分子标记(第3.5节)。这不仅提高了XL2相对于XL1的性能，而且对医生很有吸引力，因为这些是他们目前用于评估癌症风险的临床风险因素。也就是说，XL2并没有试图取代目前使用临床风险因素的做法，而是用分子因子增强了目前的做法。
3.7.4临床证据质量
XL1是在五个档案生物库上开发和验证的。相反，XL2是在两项前瞻性研究中开发和验证的，其中使用统一方案收集样品。第一个‘研究1013’跨越了12个站点并招募了475名受试者。第二个‘PANOPTIC’跨越了33个站点并招募了685名受试者。因此，XL2更适用于临床实践。此外，PANOPTIC收集了癌症风险和临床因素的医生概率，以允许XL2直接与肺结节评估中的当前实践进行比较。
4.建议的前瞻性介入研究
需要一项前瞻性介入研究来确定XL2的临床效用。具体而言，确定将XL2纳入临床实践导致改善的和可测量的临床结果。显示医生行为的变化是不够的，而是需要在可测量的临床终点上显著改善，例如减少对良性结节的侵入性程序。前瞻性介入研究的关键方面详述如下。我们注意到，目的是让MolDx参与本研究的设计，以确保一致。
目标：在一项前瞻性研究中确定，在治疗方案中使用XL2可以相对于目前的实践在统计学上显著改善临床结果。
临床终点：为了测量XL2的益处和危害，测量的主要终点是：(a)益处：相对于目前的实践，使用XL2对使用PET和侵入性手术(活组织检查或手术)对良性肺结节的显著减少；(b)危害：相对于目前的做法(不使用XL2)，使用XL2进行CT监测的恶性结节发生率没有显著增加。
研究设计：前瞻性介入研究将有一个干预组，其中XL2将用于指导治疗。具有足够高概率肺部结节良性的入组患者将进入CT监测，否则应接受常规护理。对照组将是来自相同参与站点的历史对照，或者是临时随机组。继续进行历史对照研究或RCT的决定将基于资源和参与站点进行。
控制和治疗组：控制和治疗(XL2)组将具有相同的纳入/排除标准以及结果判定。如果对照组是历史性的，那么将使用相同的常规护理方案从相同的参与站点选择受试者以控制偏倚。
影响大小和样品量：假设良性肺结节侵入性手术减少36％，目前实践的肺结节手术率为35％，估计研究的干预组需要548名受试者。
研究站点：理想情况下，前瞻性介入研究将在综合交付网络(IDN)内进行。在IDN内进行研究的好处是访问多个站点，实施标准方案和访问电子病历(EMR)系统。如果出于某种原因，IDN不可行，则可以在33个PANOPTIC研究站点的子集上执行该研究。
数据分析：将创建可包含以下元素的前瞻性数据分析计划：
如有必要，前瞻性定义的中期查看数据和任何产生的自适应调整。
完全定义治疗和对照组之间比较的统计处理。将包括意图处理分析的方法。
用于在测试研究中的多个条款的情况下解决多重性测试的预定义协议。
实施例8：划入应用
本文描述的分类器提供如下定义的癌症风险估计XL_2：
对于受试者k，XL_2(k)如下定义：
X＝-6.8272+0.0391*年龄+0.7917*吸烟者+0.1274*直径+1.0407*毛刺+0.7838*位置
其中年龄是受试者的年龄，如果受试者是前吸烟者或当前吸烟者，则吸烟者为1(否则为0)，直径为肺结节的大小，单位为mm，如果肺结节呈毛刺，则毛刺为1(否则0)，如果肺结节位于肺上叶则位置为1(否则为0)。
XL_2(k)范围在0和1之间。XL_2(k)越接近0，受试者k越有可能具有良性肺结节，并且XL_2(k)越接近1，受试者k越可能具有恶性肺结节。
如表35所示，随着XL_2值的增加，阳性预测值(PPV)增加，这相当于恶性肿瘤概率的增加。例如，当XL_2(k)高于0.354时，恶性肿瘤的概率至少为38％。在PANOPTIC研究中，癌症的测试前风险为16％，因此，这代表癌症风险增加38/16＝2.4倍。
表35
因此，XL_2是划入和排除癌症的风险预测因子。
Claims (30)
1.一种确定受试者的肺结节不是肺癌的可能性的方法，包括：
(a)使得自受试者的血液样品与蛋白水解酶接触以从血液样品中存在的一组蛋白质产生肽片段，其中所述组包含选自BGH3、C163A、LG3BP、GELS、IBP3、LUM、MASP1、PEDF和S10A6的两种蛋白质；
(b)将来自步骤(a)的组的产生的肽片段与标记的合成肽片段组合，所述合成肽片段对应于来自所述组的产生的肽片段；
(c)进行选择的反应监测质谱法以测量来自步骤(b)的肽片段的丰度；
(d)基于步骤(c)的肽片段测量计算肺癌评分的概率；和
(e)如果步骤(d)中的评分低于预定分数，则排除受试者的肺癌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述组包括LG3BP和C163A。
3.根据权利要求1所述的方法，其中当排除肺癌时，定期监测所述受试者。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者具有低至中度的癌症风险。
5.根据权利要求1所述的方法，还包括医生对癌症风险的评估。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述受试者被指定为医生对癌症风险的评估在0到1之间。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述癌症风险由确定为以下的癌症风险预测因子Ci(k)确定
其中判定阈值Ti是结节不大于15mm的患者的{Si(k)}的中值。
8.根据权利要求3所述的方法，其中所述定期监测是肺功能测试(PFT)、肺成像、活组织检查或其任何组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述肺成像是X射线、胸部计算机断层摄影(CT)扫描或正电子发射断层摄影(PET)扫描。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述肺结节的直径小于或等于3cm。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述肺结节的直径为约0.8cm至3.0cm。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择的反应监测质谱法使用特异性结合待检测的肽片段的化合物进行。
13.根据权利要求1所述的方法，所述组包括LG3BP和C163A并且反转比为0.07。
14.根据权利要求1所述的方法，所述组包含BGH3和C163A，并且所述反转比为0.06。
15.根据权利要求1所述的方法，所述组包括LG3BP和GELS并且反转比为0.05。
16.根据权利要求1所述的方法，所述组包括LG3BP和IBP3并且反转比为0.07。
17.根据权利要求1所述的方法，所述组包括LUM和C163A并且反转比为0.06。
18.根据权利要求1所述的方法，所述组包括MASP1和C163A并且反转比为0.07。
19.根据权利要求1所述的方法，所述组包括MASP1和IBP3并且反转比为0.06。
20.根据权利要求1所述的方法，所述组包括PEDF和C163A并且反转比为0.07。
21.根据权利要求1所述的方法，所述组包括S10A6和C163A并且反转比为0.06。
22.根据权利要求1所述的方法，所述组包括S10A6和ENPL并且反转比为0.06。
23.根据权利要求1所述的方法，所述组包括LUM和GELS并且反转比为0.02。
24.一种确定受试者的肺结节是肺癌的可能性的方法，包括：
(a)使得自受试者的血液样品与蛋白水解酶接触以从血液样品中存在的一组蛋白质产生肽片段，其中所述组包含选自BGH3、C163A、LG3BP、GELS、IBP3、LUM、MASP1、PEDF和S10A6的两种蛋白质；
(b)将来自步骤(a)的组的产生的肽片段与标记的合成肽片段组合，所述合成肽片段对应于来自所述组的产生的肽片段；
(c)进行选择的反应监测质谱法以测量来自步骤(b)的肽片段的丰度；
(d)基于步骤(c)的肽片段测量计算肺癌评分的概率；和
(e)如果步骤(d)中的分数等于或高于预定分数，则划入受试者的肺癌。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述组包括LG3BP和C 163A。
26.根据权利要求24所述的方法，其中当划入肺癌时，定期监测受试者。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述受试者具有低至中度的癌症风险。
28.根据权利要求24所述的方法，还包括医生对癌症风险的评估。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述受试者被指定为医生对癌症风险的评估在0到1之间。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述癌症风险由确定为以下的癌症风险预测因子Ci(k)确定
其中判定阈值Ti是结节不大于15mm的患者的{Si(k)}的中值。
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