JP4777580B2 - 炎症および炎症状態の検出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
緒言
本発明は米国政府からの基金によって一部支援されており(NIH 助成金 No. AI40686)、従って、米国政府は本発明のある種の権利を有し得る。
【０００２】
発明の背景
単核食細胞（単球およびマクロファージ）は、先天性および獲得免疫の双方に重要な構成要素であり、中枢神経系を含む身体の実質的に全ての器官において見られる。単核食細胞は、抗体依存性および非依存性の両方の細胞毒性、食作用および細菌の死滅、活力を失った赤血球の破壊、Ｔ細胞活性化のための抗原の提示、および多種多様な炎症性サイトカインの分泌に関与する。
【０００３】
炎症性サイトカインの分泌は、単核食細胞エフェクター機能と同様に、可溶性のメディエーターによって、極めて影響を受ける。例えば、インターフェロンガンマ(IFNγ)による誘導、およびリポ多糖、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)、インターロイキン−１(IL-1)または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)に曝すことによって、単核食細胞がTNFα、IL-1およびインターロイキン−６(IL-6)などの炎症性サイトカインを分泌するように刺激することができる(Auger, M. J. and J. A. Ross. 1992. In: The Macrophage: the natural Immune System, New York: Oxford University Press, pp. 1-74)。インターロイキン−１０（IL-10；当初、サイトカイン合成抑制因子として知られた）は、広範な炎症性サイトカインの発現を阻害することが、インビトロ(Berkman, N. et al. 1995. J. Immunol. 155:4412-4418; de Waal Malefyt, R. et al. 1991. J. Exp. Med. 174:1209-1220)並びにインビボ(Chernoff, A.E. et al. 1995. J. Immunol. 154:5492-5499; van der Poll, T. et al. 1997. J. Immunol. 158:1971-1975)で示されている。グルココルチコイド、インターロイキン−４(IL-4)およびインターロイキン−１３(IL-13)もまた、単核食細胞によって産生された炎症性サイトカインの発現を下方調節することが示されている。炎症性サイトカインの放出を阻害することに加え、グルココルチコイドはまた、単核食細胞にCD163の発現を上方調節する（upregulate）ことが示されている(Hogger, P. et al. 1998. Pharm. Res. 15:296-302; Hogger, P. et al. 1998. J. Immunol. 161:1883-1890; Wenzel, I. et al. 1996. Eur. J. Immunol. 26:2758-2763)。
【０００４】
CD163は、システインリッチスカベンジャーレセプターファミリー群Ｂのメンバーである単核食細胞制限抗原である。正常ヒトマクロファージは、CD163に対して明確に着色し、インビボでのグルココルチコイド処理によってCD163の発現が増大する(Zwadlo-Klarwasser, G. et al. 1992. Int. Arch. Allergy Immunol. 97:178-180; Zwadlo-Klarwasser, G. et al. 1990. Int. Arch. Allergy Immunol. 91:175-180)。これらCD163の強く発現する（bright）マクロファージは、多数の炎症器官で見られる通り、炎症の解決に役割を担うかもしれないことが示唆され(Zwadlo, G. et al. 1987. Exp. Cell Biol. 55:295-304)、そして不完全に特徴付けられた抗炎症性メディエーターを放出することが示されている(Zwadlo-Klarwasser, G. et al. 1995. Int. Arch. Allergy Immunol. 107:430-431)。
【０００５】
CD163に顕著な類似性を有する１つの単核食細胞マーカーはp155である(Morganelli, P. et al. 1988. J. Immunol. 140:2296-2304)。この134kDa(無修正)/155kDa(修正)のグリコプロテインの発現は、単核食細胞に限定され、グルココルチコイド処理によって上方調節される。ここに、CD163がP155と同一であり、この分子が抗炎症性分子として活性を有し得ることが見出された。従って、このグリコプロテインは、ヒトにおける炎症および炎症状態並びに炎症進行のためのバイオマーカーとして有用であると考えられる。
ここに、ヒト血漿におけるCD163の検出するための方法が開発された。本方法は、ヒトにおいて炎症および炎症進行をモニタリングするのに有用である。
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、生体試料におけるCD163のレベルを定量し得るように、生体試料とCD163捕捉抗体およびCD163検出抗体とを接触させることを含む、生体試料、好ましくは血漿試料におけるCD163を検出するための方法を提供することである。本発明の方法は、特に、炎症状態または炎症進行の経過のモニタリングに有用である。
本発明の他の目的は、CD163を含む炎症の予防用および治療用組成物を提供することである。一態様において、該組成物は、さらにグルココルチコイドを含む。
【０００７】
本発明の他の目的は、細胞または組織と、CD163分子単独またはグルココルチコイドとの組み合わせとを接触させることを含む、炎症の徴候および症状を低減する方法を提供することである。
また本発明の他の目的は、CD163単独またはグルココルチコイドとの組み合わせを含む組成物の有効量を動物に投与することを含む、動物における炎症の予防または治療のための方法を提供することである。
【０００８】
発明の詳細な説明
CD163は、タンパク質のスカベンジャーレセプターシステインリッチファミリーのグルココルチコイド誘導性メンバーである。CD163は、ヒトマクロファージで多く発現することが知られているが、末梢血中単球の５０％未満で見られることが報告されている。ここに、先の報告に対し、全てのCD14ポジティブの単球の９９％以上がCD163を発現していることを見出した。また、グルココルチコイド様のIL-10が培養ヒト単球で高いCD163発現を誘導することも見出した。グルココルチコイド−誘導CD163発現についても試験し、抗IL-10によって誘導されず、IL-10処理が付加的であることから、IL-10非依存的メカニズムによることを見出した。また、先に同定された機能未知の単球／マクロファージマーカーであるp155が、CD163と同じであることを見出した。CD163がグルココルチコイドおよびIL-10などの潜在的な抗炎症性メディエーターによって上方調節されるという事実は、CD163が、重要な抗炎症性分子であり、炎症および炎症状態に対して潜在的なバイオマーカーである可能性を示している。
【０００９】
RM3/1、Ber-Mac3およびその他のモノクローナル抗体（mAbs）を用いた先の研究は、循環する単球の０％〜４０％だけがCD163に対しポジティブであることが報告されている(Hogger, P. et al. 1998. Pharm. Res. 15:296-302; Hogger et al. 1998. J. Immunol. 161:1883-1890; Zwadlo, G. et al. 1987. Exp. Cell Biol. 55:295-304; Backe, E. et al. 1991. J. Clin. Path. 44:946-953; van den Heuvel, M. et al. 1999. J. Leuk. Biol. 66:858-866)。しかしながら、CD163、Mac 2-48と同一と示されているp155に対する他の抗体を用いた先の研究は、一貫して、ほとんど全ての新しく単離された単球がCD163に対しポジティブであることを示す。低いアフィニティーのRM3/1抗体およびBer-Mac3抗体の次善の検出（従来、FITCで標識した２次抗体だけを用いていた）によってこの矛盾が説明されることの可能性に取り組むために、新しく単離されたPBMCsをAML 2.23(抗-CD14)およびビオチン化RM3/1若しくはビオチン化Mac2-48でコンジュゲートしたFITCで染色し、その後、SAPEで検出した。
【００１０】
Mac 2-48染色は、わずかに高かったが、ほとんど全てのCD14を強発現（bright）するPBMCsは、RM3/1およびMac 2-48の両方に対してポジティブであり、一方、大半のCD14を弱発現（dim）するか、発現しない（negative）PBMCsはネガティブであった。PBMCsがCD14強発現細胞に対してゲート化（gated）された場合、９９％以上がRM3/1およびMac 2-48の両方に対してポジティブであり、一方、P3対照モノクローナル抗体は、ゲート化細胞の１％以下を検出した。よく精製された単球を、新鮮なPBMCsに置き換えて用いた場合、実質的に同一の結果が得られる。これらの結果は、CD163がほぼ全てのCD14−ポジティブ循環単球で発現されることを示している。
【００１１】
異なるサイトカインがCD163の発現に影響し得るか否かを評価するために、新たに単離したPBMCsを、種々のサイトカインの存在下で、200nM DEX（CD163上方調節のポジティブコントロールとして）または対照培地にて、２４時間培養した。次いで、細胞を染色およびフローサイトメトリー分析に供試した。
【００１２】
IL-10単独または合成グルココルチコイドDEX単独でのPBMCsの２４時間処理によって、単球のCD163発現は、それぞれ４倍および７倍まで増加した（ｐ＜０.０１）。IL-10添加の組み合わされたDEX処理によって、単球をDEX単独またはIL-10単独で培養した場合よりも、有意により高いCD163発現がもたらされ、IL-10とあわせて用いたグルココルチコイド処理の場合、相加効果を示した（ｐ＜０.０１）。他の試験したサイトカインで、用いた濃度で統計的に有意な単球のCD163発現に対する効果を有するものはなく、またDEX誘導による発現の上方調節を有意に増大または低減させるものはなかった。IL-10およびグルココルチコイド処理によるCD163の発現の増大はもまた、単球溶解物のウェスタンブロットによって示された。これらのデータは、CD163の上方調節が、グルココルチコイドの抗−炎症作用に役割を果たすことを示している。
【００１３】
単球でのCD163の発現の増大が、RNAおよびタンパク質合成の増大によるものかどうかを測定するために、ノーザンブロットを単球溶解物について行なった。単球をIL-10、グルココルチコイドFP、または対照の培地で８時間処理した。CD163のmRNAレベルは、IL-10またはFPの添加によって、検出不能から強いバンドまで増大した。このことは、IL-10またはグルココルチコイド類によるCD163の誘導は、少なくとも部分的に、増大したRNAおよびタンパク質合成によることを示している。
【００１４】
IL-10処理とCD163発現との間の投与量−応答の関係は、0.1〜100ng/mlのIL-10の存在下で２４時間、PBMCsを培養することによって確定された。CD163発現のレベルがIL-10濃度に関する場合、結果はＳ字投与応答曲線（sigmoidal dose response curve）であった。CD163発現は、対照と比較した場合、10および100ng/mlのIL-10処理によって、約３.５倍に増大した（ｐ＜０.０１）。
【００１５】
単核食細胞への直接的効果に加えて、DEXはCD163発現を、リンパ球によって産生されたIL-10の量に代わることによって、間接的に上方調節するであろうことの可能性がある。この可能性を試験するために、ブロッキング抗−IL-10 IgGの存在下または非存在下で、PBMCsをIL-10、DEXまたは対照培地とともに培養した。結果は、CD163の発現は抗−IL-10の存在によって対照またはDEX処理細胞に有意な影響がなかったことを示した。しかしながら、CD163発現のIL-10上方調節は、抗−IL-10によって抑制され（ｐ＜０.０１）、CD163発現は対照レベル近くまで減少した。これらの知見は、DEXが、IL-10と独立したメカニズムによってCD163発現を増大したことを示している。
【００１６】
CD163のレベルについてグルココルチコイドとの組合わせにおけるサイトカインの効果を試験することに加えて、リポ多糖(LPS)との組合せにおけるグルココルチコイドの効果を試験するために研究を行なった。LPS単独で培養された単球は、CD163検出のための免疫蛍光技術を用いて、その表面で検出されるCD163のレベルは低かった。先に示したように、DEXまたはIL-10単独による細胞処理によってCD163の発現は増大する。しかしながら、単球をLPSと組み合わせたDEXで４８時間培養した場合、それらはCD163発現において相乗的に増大し、DEX単独の効果は、LPS処理を加えた場合、２倍以上にまで増大した。
【００１７】
LPSでのさらなるインビトロでの研究は、LPSが単球表面のCD163の２時間以内の剥離（shedding）を誘導するという、ホルボールエステルPMAを用いた他による研究と整合する結果を示した。PMAは、培養における単球からの表面CD163の急速な剥離を誘導し、これはプロテアーゼ阻害剤によりブロックされる効果であることが示されている(Droste, A. Et al. 1999. Biochem. Biophys. Res. Commun. 256:110-113)。従って、PMA同様、LPSはCD163剥離を誘導することができる。LPS誘導剥離は、DEXで４８時間培養した単球でもおこり、新鮮に単離された単球よりも５〜１０倍のより高い表面CD163のレベルを有していた。LPS添加グルココルチコイド処理によりCD163レベルが増大した細胞において、前述の通り、表面CD163分子は、PMA誘導剥離に対し感受性を残しているが、LPSでの後の処理によって誘導された剥離におおむね耐性である。後のLPS誘導によるCD163剥離に対するこのLPS付与耐性は、後の炎症性損傷に対する耐性について報告されたエンドトキシン前処理（pre-conditioning）と同様である。
【００１８】
サイトカインIL-10の効果は、グルココルチコイドと同様に、新鮮に単離された単核食細胞でのCD163発現を増大するので、サイトカインの中ではユニークであることが示された。このCD163における増大は、高度に精製された単球または確立されたヒト単球細胞系THP-1を用いた研究から、PBMCsを用いて行なわれたものと一致するという結果が得られたように、単球への直接的効果であると考えられている。対照的に、他のサイトカイン（IL-4およびIL-13を含む）の多数は、試験した濃度でCD163発現の上方調節をしなかった。IL-4、IL-10およびIL-13はいずれもTNFαなどの炎症性サイトカインの単球産生を阻害することが報告されているが(Cosentino, G. et al. 1995. J. Immunol. 155:3145-3151; Joyce, D.A. et al. 1996. Cytokine 8:49-57; Joyce, D.A. et al. 1996. J. Interferon Cytokine Res. 16:511-517)、IL-10およびIL-4/IL-13による単球食細胞の表面分子の異なる調節は先例がない。例えば、CD163同様にCD64は、IL-10によって上方調節されるが、IL-4またはIL-13によってはされない(de Waal Malefyt, R. et al. 1993. J. Immunol. 151:6370-6381; te Velde, A.A. et al. 1992. J. Immunol. 149:4048-4052)。
【００１９】
DEXと組み合わされた場合、IL-10は、試験されたサイトカインのうち、DEX単独処理よりもCD163発現が有意に増大した唯一のものである。用いたDEXの濃度が、＞９０％でグルココルチコイドレセプターに対して飽和しており、用いたIL-10の投与量は、最大のCD163誘導をもたらすものであるから、これらの処理の相加効果は、グルココルチコイドおよびIL-10が、独立したメカニズムでCD163発現に影響していることを示唆している。この結論は、さらに、抗−IL-10抗体（IL-10の生体活性をブロックする）が、CD163のIL-10誘導を対照レベルまで低減するが、CD163のDEX誘導には何の効果ももたないという知見によって支持される。このことはグルココルチコイド効果が、細胞外IL-10の上昇レベルに依存せず、最初のIL-10合成および遊離の増大によるCD163発現の上方調節をしないことを示している。
【００２０】
DEX添加のGM-CSFまたはIL-4のいずれもDEX単独処理に対してCD163を増強させないという知見は、最近の報告のものと対照的である。Van den Heuvelおよびその共同研究者(van den Heuvel, M. et al. 1999. J. Leuk. Biol. 66:858-866)は、GM-CSFもIL-4単独もCD163発現に何の影響も与えないことを見出した一方で、彼らは、DEX添加のGM-CSFまたはIL-4を用いる相乗効果を検出した。この不一致は、おそらく単離方法、培養条件および刺激の期間などの実験手順の相違によるものである。先の報告において、単球は、勾配遠心分離、リンパ球ロゼット化（rosetting）および単球粘着によって精製され、一方、密度遠心分離を用いた本研究はPBMCsを精製した。さらに、先の研究では細胞を２日間処理したのに対し、細胞を２４時間処理した。
【００２１】
CD163発現へのIL-10効果に対する投与量応答曲線は、0.1ng/mlから10 ng/mlまでのIL-10濃度のダイナミックレンジを示す。このことは、MIP-1α(Berkman, N. et al. 1995. J. Immunol. 155:4412-4418)、メタロプロテイナーゼ(Lacraz, S. et al. 1992. J. Clin. Invest. 90:382-388)およびTNFレセプター(Hart, P.H. et al. 1996. J. Immunol. 157:3672-3680)の発現と同様、組織因子発現および関連する凝血活性などの単球機能の広い範囲のIL-10の効果に関する先の知見(Ernofsson, M. et al. 1996. Br. J. Haematol. 95:249-257; Ones, L.T. et al. 1996. Cytokine 8:822-827)と一致する。
【００２２】
CD163がグルココルチコイドおよびIL-10などの潜在的抗炎症性メディエーターによって上方調節されるという事実は、このCD163が重要な抗炎症性分子であり得ることを示している。さらに、これらのデータは、患者の炎症または炎症状態の存在を検出する手段として、血液または血漿などの生体試料におけるCD163検出の使用への支持を提供する。
【００２３】
炎症のバイオマーカーとしてCD163の使用を提供するために、血漿などの生体試料におけるCD163の検出方法が開発された。検出のアッセイは、CD163捕捉抗体としてMAC2-158またはMAC2-48並びにCD163検出抗体として商業的に利用可能なビオチン化抗体RM3/1などのCD163特異的抗体を用いたELISAアッセイである。簡潔に述べると、精製したMAC2-158またはMAC2-48抗体でプレートを被覆し、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ブロッキング緩衝液を各プレートのウェルに添加することおよび室温で３０分間インキュベートすることによって非特異的結合をブロックした。洗浄後、試験する血漿試料を添加し、そしてプレートを４℃で一晩または室温で２時間、インキュベートした。洗浄後、検出抗体RM3/1を加え、およびプレートを再びインキュベートした。ストレプトアビジンアルカリホスファターゼタグを用い、プレートを現像した。
【００２４】
このアッセイを用いて、CD163の相対的レベルを正常温度の心肺バイパスを行なった心臓手術中の４患者の血漿においてアッセイした。心臓手術の患者は、TNF、IL-6およびコルチゾールの上昇、続く急性期タンパク質の肝臓での放出によって示されるような、再生可能な急性の炎症応答を示すことが知られている。この応答は、組織損傷、虚血性再潅流傷害、外来膜（foreign membranes）の暴露（心肺バイパスを用いた場合）、および一過性の内毒素血を含むいくつかのメカニズムによって生じ得る。これら試験した患者の４サンプルのうち４つにおいて、血漿CD163が心肺バイパスに続く６０分間でおよそ２倍に増大し、そして手術後１日で、基準レベルよりわずか下に戻った。加えて、これら患者の血漿中のCD163レベルは、血漿中のインターロイキン−６（IL-6）のレベルと相関を示した。手術のストレス、感染または他の炎症過程に先立って、ヒト血漿中に、検出可能なIL-6は存在しないことから、これは重要な知見である。従って、これらのデータは、CD163の時間経過と炎症の他のマーカーとの関係を示し、可溶性CD163が炎症応答の間の急性期タンパク質として作用するという最初の実証を提供するものである。
【００２５】
上記の心臓病患者よりも制御されたセッティングにおいて、感染に対するインビボの炎症応答により綿密に似せるために、健康なボランティアにLPSを4 ng/kg注射注入投与し、血漿中の可溶性CD163のレベルをモニターした。上述の通り、LPSは、インビトロで単球からCD163の剥離を誘導することを示した。血漿サンプルは基準値（LPSの投与前）、次いでLPS注入後、注入初期の７２時間後まで種々の時点で採取した。血漿中のCD163のレベルを本発明のアッセイを用いて測定した。血漿中の可溶性CD163レベルは、基準値のレベルと比較して７倍ほども増大し、１〜２時間でピークになり、そしてLPS投与後１２時間で、５ボランティアのうち４つが上昇したままであった。１２時間でレベルが減少した１ボランティアにおいて、８時間で基準値レベルに戻る前に、４時間まで上昇したままであった。既知の急性期タンパク質、グルココルチコイドおよび前炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのレベルにおける変化もまた、それらのレベルが血漿中の可溶性CD163の出現と相関を示すかを決定するためにモニターした。CRP、炎症性刺激に応答して肝細胞で分泌する急性期血漿タンパク質のレベルは、８時間まで血漿中で増大するが、LPS投与後２４時間までにピークに達しなかった。TNFα、IL-6およびIL-10、即ち、LPS注入に続き産生される既知のもの全ての血漿レベルは、それぞれLPS投与後１、２および４時間でピークに達した。血漿コルチゾールレベルは、LPS投与後４時間で増大をはじめたが、６時間までピークに達しなかった。これらのデータは、可溶性CD163が、血漿中で検出可能な急性炎症性応答で誘導される、最も早期の変化の１つであることを示した。従って、CD163は、炎症性応答カスケードの早期シグナリング現象として作用する。
【００２６】
従って、本発明は、炎症または炎症状態を有することが知られているか、または有することが予想される個体由来の生体試料においてCD163のレベルを検出する方法を提供する。生体試料とは、限定されるものではないが、血漿、全血、血清、尿、唾液、精液、脳脊髄液または滑液を含むことを意味する。炎症性状態は、限定されるものではないが、ループス、慢性関節リュウマチ、感染および手術を含む種々の原因によるものである可能性がある。本方法は、血漿などの生体試料と、MAC2-158またはMAC2-48などのCD163特異的抗体との接触、および、次いでRM3/1などのビオチン化抗体でのELISAアッセイでの検出を含む。この方法は、患者の炎症または炎症状態の存在または経過に対するモニタリングに特に有用である。
【００２７】
本発明はまた、ヒトを含む動物における炎症の予防および治療における使用のためのCD163を含む組成物に関する。本発明の１態様において、細胞または組織はCD163と接触させられ、炎症は予防されるか、抑制されるか、または好転する（reversed）。他の態様において、炎症または炎症性疾患を治療するために、薬学的に許容し得るビヒクル中にCD163を含む組成物を炎症または炎症性疾患に苦しむ動物に投与する。治療が成功したことは、サイトカインなどの炎症性メディエーターの存在の減少を含む炎症の徴候および症状の減少によって示される。CD163は、単独またはグルココルチコイドなどの他の抗炎症性剤との組合せにおいて投与し得る。本発明に関連して、「有効量」とは、炎症の徴候および症状の減少などの所望の薬理学的効果を生じることができるCD163の量である。CD163と関連して投与される付加的な抗炎症剤の選択は、当業者によって日常的に行なわれ得る。投与するCD163の量の選択もまた、本明細書にある細胞培養の研究などの結果に基づき、当業者によって日常的に行われ得る。
以下の非制限的な例は、本発明をよりよく示すために提供されるものである。
【００２８】
例
例１：末梢血単核細胞（PBMCs）の単離および培養
Boyumの方法(Boyum, A. 1968. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 97:77-89)の後、フィコール−ヒパーク（Ficoll-Hypaque）(d＝1.077g)を用いてヘパリン添加ヒト全静脈血からPBMCsを単離した。次いでPBMCsをヘペス緩衝化（hepes buffered）RPMI 1640(Hazelton Biologicals, Lenexa, KS)/0.05％ゲンタマイシン(Elkins-Sinn, Inc., Cherry Hill, NJ)/1％ウシ胎仔血清(FBS)(Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT)で３回洗浄した。
【００２９】
サイトカイン処理の研究のために、単離PBMCsを2.0×106〜2.5×106 cells/mlの濃度でヘペス緩衝化RPMI 1640/0.05％ゲンタマイシン/10％ FBSに懸濁し、種々のメディエーターの存在下、３７℃で５％ＣＯ２で、９６ウェルプレート中で培養した。単核細胞は、他に示さない場合、培養中２４時間後、フローサイトメトリー分析のために染色した。はじめにプラスチック容器に接着した単球が２４〜４８時間で培養ウェルから一過的にはがれるので、このことは細胞回収率を高めた。
【００３０】
例２：染色およびフローサイトメトリー分析
全ての染色手順は４℃で行なった。簡潔に述べると、モノクローナル抗体のFcレセプター特異的結合をブロックするために、培養したPBMCsを正常ヒトIgG(6 mg/ml)、および30μg/mlのイソタイプ対照モノクローナル抗体P3または飽和量のモノクローナル抗体MAC2-48(20μg/ml)とともに１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、17.5μg/ml FITC標識化ヤギF(ab)２抗−マウスIgで１時間染色した。細胞を再び洗浄し、1％メタノールフリーホルマリンで固定した。
【００３１】
２色の研究用に、全容60mlで、少なくとも2mg/mlの正常ヒトIgGの存在下で、20μg/ml FITC AML 2.23またはFITC対照マウスモノクローナル抗体を添加した20μg/mlビオチン化MAC2-48、RM3/1、またはP3で細胞を１時間染色した。最初のモノクローナル抗体での染色の後、細胞を洗浄し、1:40希釈のSAPEで染色した。染色後すぐに、洗浄し固定していない細胞に対してフローサイトメトリー分析を行なった。
【００３２】
フォワードおよびサイドスキャッタを用いてゲート化した単球の細胞蛍光をベクトン・デッキンソン（Becton Dickenson）FACScan(Franklin Lakes, New Jersey)を用いて分析した。対応するMac 2-48染色細胞の平均蛍光強度（MFI）からP3染色単核細胞のMFIを引くことによってMFIを計算した。
【００３３】
例３：ノーザンハイブリダイゼーション
ウェスタンブロット用に記載したように、ヒト単球を単離し、一晩培養した。次いで、単球を5ng/ml IL-10(R&D Systems)または10-8M FPで８時間刺激した。Dreier, et al. (Dreier, J. et al. 1998. DNA Cell Biol. 17:321-323)に記載のように、IL-10刺激単球、グルココルチコイド刺激単球および対照単球から全RNAを単離した。試料あたり10μgの全RNAを1％アガロース、2％ホルムアルデヒドゲルで電気泳動的に分離し、LKB 2016 VacuGeneブロッティング装置をもちいて、20×クエン酸ナトリウム緩衝液(SSC)中、Hybond N+ナイロン膜(Amersham Inc., Arlington Heights, IL)に転写した。製造者による記載の通り、ジゴキシゲニンRNA標識化キット(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)およびT7 RNAポリメラーゼ(New England Biolabs, Schwalbach, Germany)を用いて、線状化DNAテンプレートからノーザンハイブリダイゼーション用アンチセンスRNAプローブを産生した。プレハイブリダイゼーションを68℃で１時間、高SDSハイブリダイゼーション緩衝液（7％ SDS、5×SSC、50％ホルムアミド、50mMリン酸ナトリウム、2％カゼイン、0.1％ N-ラウロイルサルコシン、pH 7.0）で行なった。続いて、熱変性プローブ（95℃、10分間）をプレハイブリダイゼーション溶液(100ng/ml)に添加し、68℃で16時間ハイブリダイズした。ナイロン膜を2×SSC、0.1％SDS溶液で室温５分間で２回洗浄し、0.5×SSCおよび0.1％SDSで68℃で１５分間で２回洗浄した。ハイブリダイゼーションの結果は、製造者(Boehringer Mannheim)による記載の通り、アルカリホスファターゼおよび基質CSPDと結合する抗ジゴキシゲニンFab断片による化学蛍光検出によって視覚化した。試料の等量のローディングをアクチンアンチセンスRNAプローブを用いたRNAのハイブリダイゼーションによって試験した。
【００３４】
例４：CD163に対するELISAアッセイ
ELISAプレートを5μg/ml精製MAC2-158（被覆緩衝液：0.1M NaHCO3、0.5M NaCl、HClでpH 8.4に調整）を用いて、ウェルあたり100μlで被覆した。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次いで、洗浄緩衝液（1×リン酸緩衝液および0.05％ Tween 20）で４回洗浄した。非特異結合を200μlのブロッキング緩衝液(10％ FBS含有リン酸緩衝液)を各ウェルに添加することによってブロックし、プレートを室温で30分間インキュベートした。次いでプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。100μl血漿(1:10希釈)を添加し、プレートを４℃で一晩、または室温で２時間インキュベートした。各プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した。検出抗体RM3/1をブロッキング緩衝液（100μl;リン酸緩衝液＋10％ FBS）に添加し、プレートを１時間インキュベートして、次に洗浄緩衝液で４回洗浄した。ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ(1/1000)をブロッキング緩衝液に添加し、プレートを室温で30分間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液で４回洗浄した。反応物を15mg PNPPタブレット(Sigma Chemical Co.)１つを15ml PNPP希釈剤（0.05M Na2CO3、0.001M MgCl2、pH 9.75）に溶かし、各ウェルに溶液の100μlを添加することによるPNPPシステムを用いて現像した。プレートは５〜３０分間現像した。反応を止めるために100μlの1M NaOHを添加した。プレートを405nmで分光光度計で読んだ。
緒言
本発明は米国政府からの基金によって一部支援されており(NIH 助成金 No. AI40686)、従って、米国政府は本発明のある種の権利を有し得る。
【０００２】
発明の背景
単核食細胞（単球およびマクロファージ）は、先天性および獲得免疫の双方に重要な構成要素であり、中枢神経系を含む身体の実質的に全ての器官において見られる。単核食細胞は、抗体依存性および非依存性の両方の細胞毒性、食作用および細菌の死滅、活力を失った赤血球の破壊、Ｔ細胞活性化のための抗原の提示、および多種多様な炎症性サイトカインの分泌に関与する。
【０００３】
炎症性サイトカインの分泌は、単核食細胞エフェクター機能と同様に、可溶性のメディエーターによって、極めて影響を受ける。例えば、インターフェロンガンマ(IFNγ)による誘導、およびリポ多糖、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)、インターロイキン−１(IL-1)または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)に曝すことによって、単核食細胞がTNFα、IL-1およびインターロイキン−６(IL-6)などの炎症性サイトカインを分泌するように刺激することができる(Auger, M. J. and J. A. Ross. 1992. In: The Macrophage: the natural Immune System, New York: Oxford University Press, pp. 1-74)。インターロイキン−１０（IL-10；当初、サイトカイン合成抑制因子として知られた）は、広範な炎症性サイトカインの発現を阻害することが、インビトロ(Berkman, N. et al. 1995. J. Immunol. 155:4412-4418; de Waal Malefyt, R. et al. 1991. J. Exp. Med. 174:1209-1220)並びにインビボ(Chernoff, A.E. et al. 1995. J. Immunol. 154:5492-5499; van der Poll, T. et al. 1997. J. Immunol. 158:1971-1975)で示されている。グルココルチコイド、インターロイキン−４(IL-4)およびインターロイキン−１３(IL-13)もまた、単核食細胞によって産生された炎症性サイトカインの発現を下方調節することが示されている。炎症性サイトカインの放出を阻害することに加え、グルココルチコイドはまた、単核食細胞にCD163の発現を上方調節する（upregulate）ことが示されている(Hogger, P. et al. 1998. Pharm. Res. 15:296-302; Hogger, P. et al. 1998. J. Immunol. 161:1883-1890; Wenzel, I. et al. 1996. Eur. J. Immunol. 26:2758-2763)。
【０００４】
CD163は、システインリッチスカベンジャーレセプターファミリー群Ｂのメンバーである単核食細胞制限抗原である。正常ヒトマクロファージは、CD163に対して明確に着色し、インビボでのグルココルチコイド処理によってCD163の発現が増大する(Zwadlo-Klarwasser, G. et al. 1992. Int. Arch. Allergy Immunol. 97:178-180; Zwadlo-Klarwasser, G. et al. 1990. Int. Arch. Allergy Immunol. 91:175-180)。これらCD163の強く発現する（bright）マクロファージは、多数の炎症器官で見られる通り、炎症の解決に役割を担うかもしれないことが示唆され(Zwadlo, G. et al. 1987. Exp. Cell Biol. 55:295-304)、そして不完全に特徴付けられた抗炎症性メディエーターを放出することが示されている(Zwadlo-Klarwasser, G. et al. 1995. Int. Arch. Allergy Immunol. 107:430-431)。
【０００５】
CD163に顕著な類似性を有する１つの単核食細胞マーカーはp155である(Morganelli, P. et al. 1988. J. Immunol. 140:2296-2304)。この134kDa(無修正)/155kDa(修正)のグリコプロテインの発現は、単核食細胞に限定され、グルココルチコイド処理によって上方調節される。ここに、CD163がP155と同一であり、この分子が抗炎症性分子として活性を有し得ることが見出された。従って、このグリコプロテインは、ヒトにおける炎症および炎症状態並びに炎症進行のためのバイオマーカーとして有用であると考えられる。
ここに、ヒト血漿におけるCD163の検出するための方法が開発された。本方法は、ヒトにおいて炎症および炎症進行をモニタリングするのに有用である。
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、生体試料におけるCD163のレベルを定量し得るように、生体試料とCD163捕捉抗体およびCD163検出抗体とを接触させることを含む、生体試料、好ましくは血漿試料におけるCD163を検出するための方法を提供することである。本発明の方法は、特に、炎症状態または炎症進行の経過のモニタリングに有用である。
本発明の他の目的は、CD163を含む炎症の予防用および治療用組成物を提供することである。一態様において、該組成物は、さらにグルココルチコイドを含む。
【０００７】
本発明の他の目的は、細胞または組織と、CD163分子単独またはグルココルチコイドとの組み合わせとを接触させることを含む、炎症の徴候および症状を低減する方法を提供することである。
また本発明の他の目的は、CD163単独またはグルココルチコイドとの組み合わせを含む組成物の有効量を動物に投与することを含む、動物における炎症の予防または治療のための方法を提供することである。
【０００８】
発明の詳細な説明
CD163は、タンパク質のスカベンジャーレセプターシステインリッチファミリーのグルココルチコイド誘導性メンバーである。CD163は、ヒトマクロファージで多く発現することが知られているが、末梢血中単球の５０％未満で見られることが報告されている。ここに、先の報告に対し、全てのCD14ポジティブの単球の９９％以上がCD163を発現していることを見出した。また、グルココルチコイド様のIL-10が培養ヒト単球で高いCD163発現を誘導することも見出した。グルココルチコイド−誘導CD163発現についても試験し、抗IL-10によって誘導されず、IL-10処理が付加的であることから、IL-10非依存的メカニズムによることを見出した。また、先に同定された機能未知の単球／マクロファージマーカーであるp155が、CD163と同じであることを見出した。CD163がグルココルチコイドおよびIL-10などの潜在的な抗炎症性メディエーターによって上方調節されるという事実は、CD163が、重要な抗炎症性分子であり、炎症および炎症状態に対して潜在的なバイオマーカーである可能性を示している。
【０００９】
RM3/1、Ber-Mac3およびその他のモノクローナル抗体（mAbs）を用いた先の研究は、循環する単球の０％〜４０％だけがCD163に対しポジティブであることが報告されている(Hogger, P. et al. 1998. Pharm. Res. 15:296-302; Hogger et al. 1998. J. Immunol. 161:1883-1890; Zwadlo, G. et al. 1987. Exp. Cell Biol. 55:295-304; Backe, E. et al. 1991. J. Clin. Path. 44:946-953; van den Heuvel, M. et al. 1999. J. Leuk. Biol. 66:858-866)。しかしながら、CD163、Mac 2-48と同一と示されているp155に対する他の抗体を用いた先の研究は、一貫して、ほとんど全ての新しく単離された単球がCD163に対しポジティブであることを示す。低いアフィニティーのRM3/1抗体およびBer-Mac3抗体の次善の検出（従来、FITCで標識した２次抗体だけを用いていた）によってこの矛盾が説明されることの可能性に取り組むために、新しく単離されたPBMCsをAML 2.23(抗-CD14)およびビオチン化RM3/1若しくはビオチン化Mac2-48でコンジュゲートしたFITCで染色し、その後、SAPEで検出した。
【００１０】
Mac 2-48染色は、わずかに高かったが、ほとんど全てのCD14を強発現（bright）するPBMCsは、RM3/1およびMac 2-48の両方に対してポジティブであり、一方、大半のCD14を弱発現（dim）するか、発現しない（negative）PBMCsはネガティブであった。PBMCsがCD14強発現細胞に対してゲート化（gated）された場合、９９％以上がRM3/1およびMac 2-48の両方に対してポジティブであり、一方、P3対照モノクローナル抗体は、ゲート化細胞の１％以下を検出した。よく精製された単球を、新鮮なPBMCsに置き換えて用いた場合、実質的に同一の結果が得られる。これらの結果は、CD163がほぼ全てのCD14−ポジティブ循環単球で発現されることを示している。
【００１１】
異なるサイトカインがCD163の発現に影響し得るか否かを評価するために、新たに単離したPBMCsを、種々のサイトカインの存在下で、200nM DEX（CD163上方調節のポジティブコントロールとして）または対照培地にて、２４時間培養した。次いで、細胞を染色およびフローサイトメトリー分析に供試した。
【００１２】
IL-10単独または合成グルココルチコイドDEX単独でのPBMCsの２４時間処理によって、単球のCD163発現は、それぞれ４倍および７倍まで増加した（ｐ＜０.０１）。IL-10添加の組み合わされたDEX処理によって、単球をDEX単独またはIL-10単独で培養した場合よりも、有意により高いCD163発現がもたらされ、IL-10とあわせて用いたグルココルチコイド処理の場合、相加効果を示した（ｐ＜０.０１）。他の試験したサイトカインで、用いた濃度で統計的に有意な単球のCD163発現に対する効果を有するものはなく、またDEX誘導による発現の上方調節を有意に増大または低減させるものはなかった。IL-10およびグルココルチコイド処理によるCD163の発現の増大はもまた、単球溶解物のウェスタンブロットによって示された。これらのデータは、CD163の上方調節が、グルココルチコイドの抗−炎症作用に役割を果たすことを示している。
【００１３】
単球でのCD163の発現の増大が、RNAおよびタンパク質合成の増大によるものかどうかを測定するために、ノーザンブロットを単球溶解物について行なった。単球をIL-10、グルココルチコイドFP、または対照の培地で８時間処理した。CD163のmRNAレベルは、IL-10またはFPの添加によって、検出不能から強いバンドまで増大した。このことは、IL-10またはグルココルチコイド類によるCD163の誘導は、少なくとも部分的に、増大したRNAおよびタンパク質合成によることを示している。
【００１４】
IL-10処理とCD163発現との間の投与量−応答の関係は、0.1〜100ng/mlのIL-10の存在下で２４時間、PBMCsを培養することによって確定された。CD163発現のレベルがIL-10濃度に関する場合、結果はＳ字投与応答曲線（sigmoidal dose response curve）であった。CD163発現は、対照と比較した場合、10および100ng/mlのIL-10処理によって、約３.５倍に増大した（ｐ＜０.０１）。
【００１５】
単核食細胞への直接的効果に加えて、DEXはCD163発現を、リンパ球によって産生されたIL-10の量に代わることによって、間接的に上方調節するであろうことの可能性がある。この可能性を試験するために、ブロッキング抗−IL-10 IgGの存在下または非存在下で、PBMCsをIL-10、DEXまたは対照培地とともに培養した。結果は、CD163の発現は抗−IL-10の存在によって対照またはDEX処理細胞に有意な影響がなかったことを示した。しかしながら、CD163発現のIL-10上方調節は、抗−IL-10によって抑制され（ｐ＜０.０１）、CD163発現は対照レベル近くまで減少した。これらの知見は、DEXが、IL-10と独立したメカニズムによってCD163発現を増大したことを示している。
【００１６】
CD163のレベルについてグルココルチコイドとの組合わせにおけるサイトカインの効果を試験することに加えて、リポ多糖(LPS)との組合せにおけるグルココルチコイドの効果を試験するために研究を行なった。LPS単独で培養された単球は、CD163検出のための免疫蛍光技術を用いて、その表面で検出されるCD163のレベルは低かった。先に示したように、DEXまたはIL-10単独による細胞処理によってCD163の発現は増大する。しかしながら、単球をLPSと組み合わせたDEXで４８時間培養した場合、それらはCD163発現において相乗的に増大し、DEX単独の効果は、LPS処理を加えた場合、２倍以上にまで増大した。
【００１７】
LPSでのさらなるインビトロでの研究は、LPSが単球表面のCD163の２時間以内の剥離（shedding）を誘導するという、ホルボールエステルPMAを用いた他による研究と整合する結果を示した。PMAは、培養における単球からの表面CD163の急速な剥離を誘導し、これはプロテアーゼ阻害剤によりブロックされる効果であることが示されている(Droste, A. Et al. 1999. Biochem. Biophys. Res. Commun. 256:110-113)。従って、PMA同様、LPSはCD163剥離を誘導することができる。LPS誘導剥離は、DEXで４８時間培養した単球でもおこり、新鮮に単離された単球よりも５〜１０倍のより高い表面CD163のレベルを有していた。LPS添加グルココルチコイド処理によりCD163レベルが増大した細胞において、前述の通り、表面CD163分子は、PMA誘導剥離に対し感受性を残しているが、LPSでの後の処理によって誘導された剥離におおむね耐性である。後のLPS誘導によるCD163剥離に対するこのLPS付与耐性は、後の炎症性損傷に対する耐性について報告されたエンドトキシン前処理（pre-conditioning）と同様である。
【００１８】
サイトカインIL-10の効果は、グルココルチコイドと同様に、新鮮に単離された単核食細胞でのCD163発現を増大するので、サイトカインの中ではユニークであることが示された。このCD163における増大は、高度に精製された単球または確立されたヒト単球細胞系THP-1を用いた研究から、PBMCsを用いて行なわれたものと一致するという結果が得られたように、単球への直接的効果であると考えられている。対照的に、他のサイトカイン（IL-4およびIL-13を含む）の多数は、試験した濃度でCD163発現の上方調節をしなかった。IL-4、IL-10およびIL-13はいずれもTNFαなどの炎症性サイトカインの単球産生を阻害することが報告されているが(Cosentino, G. et al. 1995. J. Immunol. 155:3145-3151; Joyce, D.A. et al. 1996. Cytokine 8:49-57; Joyce, D.A. et al. 1996. J. Interferon Cytokine Res. 16:511-517)、IL-10およびIL-4/IL-13による単球食細胞の表面分子の異なる調節は先例がない。例えば、CD163同様にCD64は、IL-10によって上方調節されるが、IL-4またはIL-13によってはされない(de Waal Malefyt, R. et al. 1993. J. Immunol. 151:6370-6381; te Velde, A.A. et al. 1992. J. Immunol. 149:4048-4052)。
【００１９】
DEXと組み合わされた場合、IL-10は、試験されたサイトカインのうち、DEX単独処理よりもCD163発現が有意に増大した唯一のものである。用いたDEXの濃度が、＞９０％でグルココルチコイドレセプターに対して飽和しており、用いたIL-10の投与量は、最大のCD163誘導をもたらすものであるから、これらの処理の相加効果は、グルココルチコイドおよびIL-10が、独立したメカニズムでCD163発現に影響していることを示唆している。この結論は、さらに、抗−IL-10抗体（IL-10の生体活性をブロックする）が、CD163のIL-10誘導を対照レベルまで低減するが、CD163のDEX誘導には何の効果ももたないという知見によって支持される。このことはグルココルチコイド効果が、細胞外IL-10の上昇レベルに依存せず、最初のIL-10合成および遊離の増大によるCD163発現の上方調節をしないことを示している。
【００２０】
DEX添加のGM-CSFまたはIL-4のいずれもDEX単独処理に対してCD163を増強させないという知見は、最近の報告のものと対照的である。Van den Heuvelおよびその共同研究者(van den Heuvel, M. et al. 1999. J. Leuk. Biol. 66:858-866)は、GM-CSFもIL-4単独もCD163発現に何の影響も与えないことを見出した一方で、彼らは、DEX添加のGM-CSFまたはIL-4を用いる相乗効果を検出した。この不一致は、おそらく単離方法、培養条件および刺激の期間などの実験手順の相違によるものである。先の報告において、単球は、勾配遠心分離、リンパ球ロゼット化（rosetting）および単球粘着によって精製され、一方、密度遠心分離を用いた本研究はPBMCsを精製した。さらに、先の研究では細胞を２日間処理したのに対し、細胞を２４時間処理した。
【００２１】
CD163発現へのIL-10効果に対する投与量応答曲線は、0.1ng/mlから10 ng/mlまでのIL-10濃度のダイナミックレンジを示す。このことは、MIP-1α(Berkman, N. et al. 1995. J. Immunol. 155:4412-4418)、メタロプロテイナーゼ(Lacraz, S. et al. 1992. J. Clin. Invest. 90:382-388)およびTNFレセプター(Hart, P.H. et al. 1996. J. Immunol. 157:3672-3680)の発現と同様、組織因子発現および関連する凝血活性などの単球機能の広い範囲のIL-10の効果に関する先の知見(Ernofsson, M. et al. 1996. Br. J. Haematol. 95:249-257; Ones, L.T. et al. 1996. Cytokine 8:822-827)と一致する。
【００２２】
CD163がグルココルチコイドおよびIL-10などの潜在的抗炎症性メディエーターによって上方調節されるという事実は、このCD163が重要な抗炎症性分子であり得ることを示している。さらに、これらのデータは、患者の炎症または炎症状態の存在を検出する手段として、血液または血漿などの生体試料におけるCD163検出の使用への支持を提供する。
【００２３】
炎症のバイオマーカーとしてCD163の使用を提供するために、血漿などの生体試料におけるCD163の検出方法が開発された。検出のアッセイは、CD163捕捉抗体としてMAC2-158またはMAC2-48並びにCD163検出抗体として商業的に利用可能なビオチン化抗体RM3/1などのCD163特異的抗体を用いたELISAアッセイである。簡潔に述べると、精製したMAC2-158またはMAC2-48抗体でプレートを被覆し、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ブロッキング緩衝液を各プレートのウェルに添加することおよび室温で３０分間インキュベートすることによって非特異的結合をブロックした。洗浄後、試験する血漿試料を添加し、そしてプレートを４℃で一晩または室温で２時間、インキュベートした。洗浄後、検出抗体RM3/1を加え、およびプレートを再びインキュベートした。ストレプトアビジンアルカリホスファターゼタグを用い、プレートを現像した。
【００２４】
このアッセイを用いて、CD163の相対的レベルを正常温度の心肺バイパスを行なった心臓手術中の４患者の血漿においてアッセイした。心臓手術の患者は、TNF、IL-6およびコルチゾールの上昇、続く急性期タンパク質の肝臓での放出によって示されるような、再生可能な急性の炎症応答を示すことが知られている。この応答は、組織損傷、虚血性再潅流傷害、外来膜（foreign membranes）の暴露（心肺バイパスを用いた場合）、および一過性の内毒素血を含むいくつかのメカニズムによって生じ得る。これら試験した患者の４サンプルのうち４つにおいて、血漿CD163が心肺バイパスに続く６０分間でおよそ２倍に増大し、そして手術後１日で、基準レベルよりわずか下に戻った。加えて、これら患者の血漿中のCD163レベルは、血漿中のインターロイキン−６（IL-6）のレベルと相関を示した。手術のストレス、感染または他の炎症過程に先立って、ヒト血漿中に、検出可能なIL-6は存在しないことから、これは重要な知見である。従って、これらのデータは、CD163の時間経過と炎症の他のマーカーとの関係を示し、可溶性CD163が炎症応答の間の急性期タンパク質として作用するという最初の実証を提供するものである。
【００２５】
上記の心臓病患者よりも制御されたセッティングにおいて、感染に対するインビボの炎症応答により綿密に似せるために、健康なボランティアにLPSを4 ng/kg注射注入投与し、血漿中の可溶性CD163のレベルをモニターした。上述の通り、LPSは、インビトロで単球からCD163の剥離を誘導することを示した。血漿サンプルは基準値（LPSの投与前）、次いでLPS注入後、注入初期の７２時間後まで種々の時点で採取した。血漿中のCD163のレベルを本発明のアッセイを用いて測定した。血漿中の可溶性CD163レベルは、基準値のレベルと比較して７倍ほども増大し、１〜２時間でピークになり、そしてLPS投与後１２時間で、５ボランティアのうち４つが上昇したままであった。１２時間でレベルが減少した１ボランティアにおいて、８時間で基準値レベルに戻る前に、４時間まで上昇したままであった。既知の急性期タンパク質、グルココルチコイドおよび前炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのレベルにおける変化もまた、それらのレベルが血漿中の可溶性CD163の出現と相関を示すかを決定するためにモニターした。CRP、炎症性刺激に応答して肝細胞で分泌する急性期血漿タンパク質のレベルは、８時間まで血漿中で増大するが、LPS投与後２４時間までにピークに達しなかった。TNFα、IL-6およびIL-10、即ち、LPS注入に続き産生される既知のもの全ての血漿レベルは、それぞれLPS投与後１、２および４時間でピークに達した。血漿コルチゾールレベルは、LPS投与後４時間で増大をはじめたが、６時間までピークに達しなかった。これらのデータは、可溶性CD163が、血漿中で検出可能な急性炎症性応答で誘導される、最も早期の変化の１つであることを示した。従って、CD163は、炎症性応答カスケードの早期シグナリング現象として作用する。
【００２６】
従って、本発明は、炎症または炎症状態を有することが知られているか、または有することが予想される個体由来の生体試料においてCD163のレベルを検出する方法を提供する。生体試料とは、限定されるものではないが、血漿、全血、血清、尿、唾液、精液、脳脊髄液または滑液を含むことを意味する。炎症性状態は、限定されるものではないが、ループス、慢性関節リュウマチ、感染および手術を含む種々の原因によるものである可能性がある。本方法は、血漿などの生体試料と、MAC2-158またはMAC2-48などのCD163特異的抗体との接触、および、次いでRM3/1などのビオチン化抗体でのELISAアッセイでの検出を含む。この方法は、患者の炎症または炎症状態の存在または経過に対するモニタリングに特に有用である。
【００２７】
本発明はまた、ヒトを含む動物における炎症の予防および治療における使用のためのCD163を含む組成物に関する。本発明の１態様において、細胞または組織はCD163と接触させられ、炎症は予防されるか、抑制されるか、または好転する（reversed）。他の態様において、炎症または炎症性疾患を治療するために、薬学的に許容し得るビヒクル中にCD163を含む組成物を炎症または炎症性疾患に苦しむ動物に投与する。治療が成功したことは、サイトカインなどの炎症性メディエーターの存在の減少を含む炎症の徴候および症状の減少によって示される。CD163は、単独またはグルココルチコイドなどの他の抗炎症性剤との組合せにおいて投与し得る。本発明に関連して、「有効量」とは、炎症の徴候および症状の減少などの所望の薬理学的効果を生じることができるCD163の量である。CD163と関連して投与される付加的な抗炎症剤の選択は、当業者によって日常的に行なわれ得る。投与するCD163の量の選択もまた、本明細書にある細胞培養の研究などの結果に基づき、当業者によって日常的に行われ得る。
以下の非制限的な例は、本発明をよりよく示すために提供されるものである。
【００２８】
例
例１：末梢血単核細胞（PBMCs）の単離および培養
Boyumの方法(Boyum, A. 1968. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 97:77-89)の後、フィコール−ヒパーク（Ficoll-Hypaque）(d＝1.077g)を用いてヘパリン添加ヒト全静脈血からPBMCsを単離した。次いでPBMCsをヘペス緩衝化（hepes buffered）RPMI 1640(Hazelton Biologicals, Lenexa, KS)/0.05％ゲンタマイシン(Elkins-Sinn, Inc., Cherry Hill, NJ)/1％ウシ胎仔血清(FBS)(Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT)で３回洗浄した。
【００２９】
サイトカイン処理の研究のために、単離PBMCsを2.0×106〜2.5×106 cells/mlの濃度でヘペス緩衝化RPMI 1640/0.05％ゲンタマイシン/10％ FBSに懸濁し、種々のメディエーターの存在下、３７℃で５％ＣＯ２で、９６ウェルプレート中で培養した。単核細胞は、他に示さない場合、培養中２４時間後、フローサイトメトリー分析のために染色した。はじめにプラスチック容器に接着した単球が２４〜４８時間で培養ウェルから一過的にはがれるので、このことは細胞回収率を高めた。
【００３０】
例２：染色およびフローサイトメトリー分析
全ての染色手順は４℃で行なった。簡潔に述べると、モノクローナル抗体のFcレセプター特異的結合をブロックするために、培養したPBMCsを正常ヒトIgG(6 mg/ml)、および30μg/mlのイソタイプ対照モノクローナル抗体P3または飽和量のモノクローナル抗体MAC2-48(20μg/ml)とともに１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、17.5μg/ml FITC標識化ヤギF(ab)２抗−マウスIgで１時間染色した。細胞を再び洗浄し、1％メタノールフリーホルマリンで固定した。
【００３１】
２色の研究用に、全容60mlで、少なくとも2mg/mlの正常ヒトIgGの存在下で、20μg/ml FITC AML 2.23またはFITC対照マウスモノクローナル抗体を添加した20μg/mlビオチン化MAC2-48、RM3/1、またはP3で細胞を１時間染色した。最初のモノクローナル抗体での染色の後、細胞を洗浄し、1:40希釈のSAPEで染色した。染色後すぐに、洗浄し固定していない細胞に対してフローサイトメトリー分析を行なった。
【００３２】
フォワードおよびサイドスキャッタを用いてゲート化した単球の細胞蛍光をベクトン・デッキンソン（Becton Dickenson）FACScan(Franklin Lakes, New Jersey)を用いて分析した。対応するMac 2-48染色細胞の平均蛍光強度（MFI）からP3染色単核細胞のMFIを引くことによってMFIを計算した。
【００３３】
例３：ノーザンハイブリダイゼーション
ウェスタンブロット用に記載したように、ヒト単球を単離し、一晩培養した。次いで、単球を5ng/ml IL-10(R&D Systems)または10-8M FPで８時間刺激した。Dreier, et al. (Dreier, J. et al. 1998. DNA Cell Biol. 17:321-323)に記載のように、IL-10刺激単球、グルココルチコイド刺激単球および対照単球から全RNAを単離した。試料あたり10μgの全RNAを1％アガロース、2％ホルムアルデヒドゲルで電気泳動的に分離し、LKB 2016 VacuGeneブロッティング装置をもちいて、20×クエン酸ナトリウム緩衝液(SSC)中、Hybond N+ナイロン膜(Amersham Inc., Arlington Heights, IL)に転写した。製造者による記載の通り、ジゴキシゲニンRNA標識化キット(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)およびT7 RNAポリメラーゼ(New England Biolabs, Schwalbach, Germany)を用いて、線状化DNAテンプレートからノーザンハイブリダイゼーション用アンチセンスRNAプローブを産生した。プレハイブリダイゼーションを68℃で１時間、高SDSハイブリダイゼーション緩衝液（7％ SDS、5×SSC、50％ホルムアミド、50mMリン酸ナトリウム、2％カゼイン、0.1％ N-ラウロイルサルコシン、pH 7.0）で行なった。続いて、熱変性プローブ（95℃、10分間）をプレハイブリダイゼーション溶液(100ng/ml)に添加し、68℃で16時間ハイブリダイズした。ナイロン膜を2×SSC、0.1％SDS溶液で室温５分間で２回洗浄し、0.5×SSCおよび0.1％SDSで68℃で１５分間で２回洗浄した。ハイブリダイゼーションの結果は、製造者(Boehringer Mannheim)による記載の通り、アルカリホスファターゼおよび基質CSPDと結合する抗ジゴキシゲニンFab断片による化学蛍光検出によって視覚化した。試料の等量のローディングをアクチンアンチセンスRNAプローブを用いたRNAのハイブリダイゼーションによって試験した。
【００３４】
例４：CD163に対するELISAアッセイ
ELISAプレートを5μg/ml精製MAC2-158（被覆緩衝液：0.1M NaHCO3、0.5M NaCl、HClでpH 8.4に調整）を用いて、ウェルあたり100μlで被覆した。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次いで、洗浄緩衝液（1×リン酸緩衝液および0.05％ Tween 20）で４回洗浄した。非特異結合を200μlのブロッキング緩衝液(10％ FBS含有リン酸緩衝液)を各ウェルに添加することによってブロックし、プレートを室温で30分間インキュベートした。次いでプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。100μl血漿(1:10希釈)を添加し、プレートを４℃で一晩、または室温で２時間インキュベートした。各プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した。検出抗体RM3/1をブロッキング緩衝液（100μl;リン酸緩衝液＋10％ FBS）に添加し、プレートを１時間インキュベートして、次に洗浄緩衝液で４回洗浄した。ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ(1/1000)をブロッキング緩衝液に添加し、プレートを室温で30分間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液で４回洗浄した。反応物を15mg PNPPタブレット(Sigma Chemical Co.)１つを15ml PNPP希釈剤（0.05M Na2CO3、0.001M MgCl2、pH 9.75）に溶かし、各ウェルに溶液の100μlを添加することによるPNPPシステムを用いて現像した。プレートは５〜３０分間現像した。反応を止めるために100μlの1M NaOHを添加した。プレートを405nmで分光光度計で読んだ。
Claims (4)
- 生体試料において可溶性CD163の存在を検出するための方法であって、
ａ）試料とCD163捕捉抗体とを、CD163−抗体複合体を形成するように接触させること；および
ｂ）前記CD163−抗体複合体とCD163検出抗体とを、試料中のCD163のレベルが検出されるように接触させること
を含む、前記方法。 - CD163捕捉抗体がMAC2-158またはMAC2-48であり、CD163検出抗体がRM3/1である、請求項１に記載の方法。
- 生体試料がヒト血漿である、請求項１または２に記載の方法。
- 請求項１〜３のいずれかに記載の方法を介して、生体試料にCD163の存在を検出することを含む、炎症状態または炎症進行の経過をモニタリングするための方法。
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