CN1922490A - 使用蛋白质组学技术鉴定癌症蛋白生物标志物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了癌症的诊断和辅助诊断方法，所述方法是建立在非常适合于区分癌症病例和健康人的生物标志物的鉴定基础上，这些生物标志物是通过本发明独特的、新颖的筛选法来鉴定的，在此鉴定的生物标志物还可以用来预测和监视癌症。本发明包括瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子－II在卵巢癌的诊断、预测和监测中的使用。

Description

使用蛋白质组学技术鉴定癌症蛋白生物标志物的方法
相关申请的前后参照
本申请请求美国的申请号为60/545,581、申请日为2004年2月19日，以及美国的优先申请号60/545,900、申请日为2004年2月20日的专利申请的优先权。该两个引用的申请文件都合并为这里的参照。
资金
本发明由政府支持作出，由美国能源部颁发的准许号为DE-FG02-ER63462，政府在本发明中有特定权利。
背景技术
在美国，卵巢上皮癌(EOC)是与癌症相关的造成妇女死亡的第四大主要原因和妇产科癌症死亡的最主要原因。上皮卵巢癌极少有早期症状，而是在癌症后期才会表现出来，因此上皮卵巢癌病人生存的机会很小。2005年，将近25000名妇女被诊断患有卵巢癌，有约13500名死于这种疾病。卵巢癌治疗的最主要限制是：i)缺乏肿瘤早期检测标志物。ii)对化疗药物的耐受iii)缺乏早期预警症状。其高死亡率是由于对这个疾病无法进行早期检测：近70％的卵巢癌患者是在癌症后期才被诊断出来。早期(癌症I期和II期)诊断发现的卵巢癌病人中，视乎肿瘤分化的程度，其五年生存率则可高达60至90％之间。高危人群的卵巢癌的发生要比普通人群早10-15年(即是在四十岁而不是六十岁)。治疗上皮卵巢癌的最有希望的方法之一是早期检测。现有最常用的测试——癌抗原CA125(CA125)具有生物学不确定性，在癌症早期诊断的临床意义非常有限。作为一个单个的标志物，CA125对I期上皮卵巢癌的预测准确率低于10％。即使是CA125加上超声筛查，也仅能将准确率提高到大约20％。特定标志物的缺乏使得卵巢癌的临床筛选和早期检测非常困难。
目前，还没有一种可行的商业测试方法可以用于诊断早期或晚期的卵巢癌。因此，我们急需一种可用于诊断早期或晚期卵巢癌的测试方法。
发明内容
本发明包括一种对病例的癌症诊断和辅助诊断方法，其包括，将一个病例样本中的一个或多个生物标志物的表达与所述的一个或多个生物标志物的预定标准一一进行比较；其中，所述的一个或多个生物标志物是从以下组中挑选出来的：次级淋巴组织趋化因子(6Ckine)、血管紧张素转换酶(ACE)、脑源性神经营养因子(BDNF)、癌抗原CA125(CA125)、血管内皮细胞-白细胞黏附分子(E-Selectin)、表皮生长因子(EGF)、骨髓前体抑制因子(Eot2)、表皮生长因子受体1(ErbB1)、卵泡调节因子(follistatin)、肝癌因子4(HCC4)、疱疹病毒入侵调节蛋白(HVEM)、胰岛素样生长因子-II(IGF-II)、胰岛素样生长因子结合蛋白-I(IGFBP-1)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-1可溶性受体II(IL-lsrII)、白细胞介素-2可溶受体a(IL-2sRa)、瘦素(leptin)、巨噬细胞集落刺激因子受体-R(M-CSF R)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、巨噬细胞炎性蛋白la(MIP-la)、巨噬细胞炎性蛋白3b(MIP3b)、基质金属蛋白酶-8(MMP-8)、基质金属蛋白酶-7(MMP7)、髓样造血细胞抑制因子-1(MPIF-1)、骨质素(OPN)、P53复合体蛋白PARC(PARC)、血小板生长因子Rb(PDGF Rb)、催乳素(prolactin)、蛋白C(ProteinC)、转化生长因子-b RIII(TGF-b RIII)、肿瘤坏死因子受体-1(TNF-R1)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、血管黏附蛋白(VAP-1)、血管内皮生长因子受体2(VEGF R2)和血管内皮生长因子受体3(VEGF R3)；其中，所述样本中的一个或多个生物标志物的表达与该一个或多个生物标志物的预定标准相比具有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
在一个实施例中，一个预定的标准符合以下条件：(a)在一个健康人中所述生物标志物的表达水平，或者(b)在同一个人中所述生物标志物在非癌症组织中的表达水平。
在一个实施例中，所述方法进一步包括将两个或以上生物标志物的表达进行比较，其中，癌症诊断是基于分数的分类方法(score-based classification method)为基础。在一个例子中，所述方法包括将m个不同生物标志物的表达进行比较；其中每个生物标志物被赋予0或1的分数，其中，如果所述生物标志物的表达与该生物标志物预定标准的表达没有明显区别的话，该生物标志物被赋予的分数是0，而如果所述生物标志物的表达与该生物标志物预定标准的表达有明显区别的话，该生物标志物被赋予的分数是1；其中，一个病例被赋予的是全部的分数，相当于m个不同标志物被赋予的分数的总和；其中一个给定的端值t被用作癌症的诊断或辅助诊断。
在另一实施例中，所述方法包括将两个或以上生物标志物的表达进行比较，其中，癌症的诊断是通过将所述的两个或以上生物标志物的表达形式与所述生物标志物的预定标准形式一一进行比较而得出的，其中表达形式不同即可作出癌症的诊断或辅助诊断。在一个例子中，所述预定标准的形式是通过使用机械阅读技术(machine learningtechnique)将所述两个或以上生物标志物在癌症患者与健康人中的表达进行比较而决定的。在另一个例子中，所述预定标准的形式是通过使用向量支持模式(support vectormachines)、K值临近分类模式(K-nearest neighbor classifier)，或者树枝分类分析模式(Classification tree analysis)将所述两个或以上生物标志物在癌症患者与健康人中的表达进行比较而确定的。
在一个实施例中，所述方法用于卵巢癌的诊断，该方法进一步包括对表2中未鉴定出的卵巢癌的附加生物标志物的检测。在一个例子中，卵巢癌的附加生物标志物可从以下组中选出：人类角质激肽释放酶(HSCCE)，激肽释放酶4(kallikrein 4)，激肽释放酶5(kallikrein 5)，激肽释放酶6(蛋白酶M)(kallikrein 6)，激肽释放酶8(kallikrein 8)，激肽释放酶9(kallikrein 9)，激肽释放酶10(kallikrein 10)，癌抗原CA125(CA125)，癌抗原15-3(CA15-3)，癌抗原19-9(CA19-9)，肿瘤抗原OVX1(OVX1)，溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid(LPA))，癌胚抗原(CEA)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF))，丝氨酸蛋白水解酶(prostasin)，癌抗原54-61(CA54-61)，癌抗原72(CA72)，肿瘤抗原HMFG2(HMFG2)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-10(IL-10)，脂质结合唾液酸(LSA)，肿瘤抗原NB70K(NB70K)，碱性磷酸酶同工酶(PLAP)，结肠癌抗原(TAG72)，肿瘤坏死因子(TNF)，组织纤维蛋白溶酶激活剂(TPA)，肿瘤抗原UGTF(UGTF)，肿瘤抗原HE4(HE4)，基质金属蛋白酶2(matrix metalloprotease 2)，肿瘤抗原Tetranectin(Tetranectin)，抑制素(Inhibin)，肿瘤抗原Mesothelyn(Mesothelyn)，肿瘤抗原MUC1(MUC1)，表皮生长因子(VEGF)，肿瘤抗原CLDN3(CLDN3)，肿瘤抗原NOTCH3(NOTCH3)，肿瘤抗原E2F3(E2F 3)，肿瘤抗原RACGAP1(RACGAP1)，肿瘤抗原HN1(HN1)，阿朴脂蛋白Al(apolipoprotein Al)，层粘连蛋白(laminin)，肿瘤抗原claudin 3(claudin 3)，肿瘤抗原claudin 4(claudin 4)，肿瘤相关钙信号传导子-1(TROP-1/Ep-CAM)，肿瘤相关钙信号传导子-2(TROP-2)，肿瘤抗原Ladininl(Ladininl)，肿瘤抗原S100A2(S100A2)，肿瘤抗原PAI-2(PAI-2)，肿瘤抗原CD24(CD24)。肿瘤抗原Lipocalin2(Lipocalin 2)，肿瘤抗原TADG-15(TADG-15)，肿瘤抗原Stratifin(Stratifin)，转移生长因子-β受体III(transforming growth factor-beta receptor III)，血小板生长受体α(platelet-derived growth factor receptor alpha)，肿瘤抗原SEMACAP3(SEMACAP3)，肿瘤抗原ARHI(ARHI)，凝血蛋白2(thrombospondin 2)，肿瘤抗原Dab2/DOC2(Dab2/DOC2)，结合珠球蛋白-α亚单位(haptoglobin-alpha subunit)。在另一实施例中，卵巢癌的附加生物标志物是α-胰岛素抑制剂重链H4片段。在一个例子中，卵巢癌的附加生物标志物是癌抗原CA125。
上述癌症的诊断或辅助诊断方法可应用于任何一种癌症或肿瘤。在一个实施例中，这种方法用于诊断乳癌。在另一实施例中，这种方法用于诊断宫颈癌。
本发明还包括一种对某个病例进行癌症诊断或辅助诊断的方法，该方法包括将病例样本中的一个或多个生物标志物与所述一个或多个生物标志物的预定标准一一进行比较；所述一个或多个生物标志物是从以下组中挑选出来的：催乳素(prolactin)，巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)，骨质素(OPN)，胰岛素样生长因子-II(IGF-II)，血管内皮细胞-白细胞黏附分子(E-Selectin)，瘦素(leptin)，表皮生长因子(EGF)，白细胞介素-17(IL-17)，髓样造血细胞抑制因子-1(MPIF-1)，以及白细胞介素2可溶受体a(IL-2sRa)；并且，所述样本中的一个或多个生物标志物的表达与该一个或多个生物标志物表达的预定标准一一比较有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
本发明还包括一种对某个病例进行癌症诊断或辅助诊断的方法，该方法包括将病例样本中的一个或多个生物标志物与所述一个或多个生物标志物的预定标准一一进行比较；所述一个或多个生物标志物是从以下组中挑选出来的：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II；并且，所述样本中的一个或多个生物标志物的表达与该一个或多个生物标志物表达的预定标准一一比较有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
本发明还包括一种对某个病例进行癌症诊断或辅助诊断的方法，该方法包括将病例样本中的以下四个生物标志物：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II的表达与所述生物标志物的预定标准一一进行比较；其中，所述样本中的两个或以上生物标志物的表达与该一个或多个生物标志物表达的预定标准一一比较有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
本发明还包括一种对某个病例进行卵巢癌诊断或辅助诊断的方法，该方法包括将病例样本中的以下四个生物标志物：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II的表达与所述生物标志物的预定标准一一进行比较；其中，所述样本中的两个或以上生物标志物的表达与该一个或多个生物标志物表达的预定标准一一比较有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
本发明还包括一种对某个病例进行乳癌诊断或辅助诊断的方法，该方法包括将病例样本中的以下四个生物标志物：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II的表达与所述生物标志物的预定标准一一进行比较；其中，所述样本中的两个或以上生物标志物的表达与该一个或多个生物标志物表达的预定标准一一比较有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
本发明还包括一种对某个病例进行结肠癌诊断或辅助诊断的方法，该方法包括将病例样本中的以下四个生物标志物：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II的表达与所述生物标志物的预定标准一一进行比较；其中，所述样本中的两个或以上生物标志物的表达与该一个或多个生物标志物表达的预定标准一一比较有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
在一个实施例中，上述方法包括将催乳素和/或骨质素与所述生物标志物的预定标准进行比较，其中，所述生物标志物的表达与预定标准比较有所增长即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
在一个实施例中，上述方法包括将瘦素和/或胰岛素样生长因子-II与所述生物标志物的预定标准进行比较，其中，所述生物标志物的表达与预定标准比较有所减少即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
在一个实施例中，上述癌症的诊断或辅助诊断方法包括对两个或以上的生物标志物的表达进行检测。在一个例子中，所述两个或以上的生物标志物从以下组中挑选出来：催乳素，巨噬细胞迁移抑制因子，骨质素，胰岛素样生长因子-II，血管内皮细胞-白细胞黏附分子，瘦素，表皮生长因子，白细胞介素-17，髓样造血细胞抑制因子-1，以及白细胞介素2可溶受体a。在另一个例子中，所述两个或以上的生物标志物从以下组中挑选出来：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。在一个例子中，所述两个或以上生物标志物中的至少两个在表达上具有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
在一个实施例中，上述在癌症诊断中诊断或辅助的方法包括对三个或以上的生物标志物的表达进行对比。在一个例子中，所述三个或以上的生物标志物从以下组中挑选出来：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。在一个例子中，所述三个或以上生物标志物的表达具有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
在一个实施例中，上述癌症的诊断或辅助诊断方法包括对四个或以上的生物标志物的表达进行对比。在一个例子中，所述四个或以上的生物标志物包括：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。在一个例子中，所述四个或以上生物标志物的表达具有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
在一个例子中，用检测所述一个或多个生物标志物的试剂来检测或测量生物标志物的表达。在一个例子中，所述试剂是对所述一个或多个生物标志物特效的抗体或片段。在一个例子中，所述试剂使用一种可见物质直接或间接标记。在另一个例子中，所述一个或多个生物标志物的表达是用质谱分析进行检测的。在另一个例子中，所述一个或多个生物标志物的表达是通过测量对所述一个或多个生物标志物进行编码的信使RNA(mRNA)的转录水平来检测的。
在另一个例子中，所述一个或多个生物标志物是用如下方法来检测的：(a)检测由所述一个或多个生物标志物控制的多肽的表达；(b)检测控制所述生物标志物的多肽的表达；或(c)检测所述生物标志物的代谢物的表达。
在一个例子中，在上述方法中使用的样本是体液样本。在一个例子中，所述体液样本是血液或血清。
本发明还包括一种监视病例的癌症发展进度的方法。在一个例子中，本发明监视病例的癌症发展进度的方法包括：将一个病例样本中的一个或多个生物标志物的表达与在后来的时间点中从该病例中获得的样本的该一个或多个生物标志物的表达进行比较。其中，所述一个或多个生物标志物是从以下组中挑选出来的：次级淋巴组织趋化因子、血管紧张素转换酶、脑源性神经营养因子、癌抗原CA125、血管内皮细胞-白细胞黏附分子、表皮生长因子、骨髓前体抑制因子、表皮生长因子受体1、卵泡调节因子、肝癌因子4、疱疹病毒入侵调节蛋白、胰岛素样生长因子-II、胰岛素样生长因子结合蛋白-I、白细胞介素-17、白细胞介素-1可溶性受体II、白细胞介素-2可溶受体a、瘦素、巨噬细胞集落刺激因子受体-R、巨噬细胞迁移抑制因子、巨噬细胞炎性蛋白1a、巨噬细胞炎性蛋白3b、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-7、髓样造血细胞抑制因子-1、骨质素、P53复合体蛋白PARC、血小板生长因子Rb、催乳素、蛋白C、转化生长因子-b RIII、肿瘤坏死因子受体-1、肿瘤坏死因子-a、血管黏附蛋白、血管内皮生长因子受体2和血管内皮生长因子受体3；并且，所述一个或多个生物标志物的表达不同即可对病例的癌症发展进度作出诊断或辅助诊断。在一个例子中，所述一个或多个生物标志物是从以下组中挑选出来的：催乳素，巨噬细胞迁移抑制因子，骨质素，胰岛素样生长因子-II，血管内皮细胞-白细胞黏附分子，瘦素，表皮生长因子，白细胞介素-17，髓样造血细胞抑制因子-1和白细胞介素2可溶受体a。在一个例子中，所述一个或多个生物标志物是从以下组中挑选出来的：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
在一个例子中，上述监视癌症发展进度的方法包括对两个或以上生物标志物的表达进行比较。在一个例子中，所述两个或以上生物标志物是从以下组中挑选出来的：催乳素，巨噬细胞迁移抑制因子，骨质素，胰岛素样生长因子-II，血管内皮细胞-白细胞黏附分子，瘦素，表皮生长因子，白细胞介素-17，髓样造血细胞抑制因子-1，白细胞介素2可溶受体a。在另一个例子中，所述两个或以上生物标志物是从以下组中挑选出来的：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
在一个实施例中，上述癌症发展进度的监视方法包括对三个或以上生物标志物的表达进行比较。在一个例子中，上述癌症发展进度的监视方法包括对四个或以上生物标志物的表达进行比较。在一个例子中，上述癌症发展进度的监视方法包括对四个或以上生物标志物的表达进行比较，其中所述四个或以上生物标志物包括：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。在另一个例子中，上述癌症发展进度的监视方法包括对四个生物标志物的表达进行比较，其中所述四个生物标志物为：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
本发明还包括一种监测癌症治疗效果的方法。在一个例子中，本发明监测癌症治疗效果的方法包括：将接受至少一部分治疗之前的病例样本中的一个或多个生物标志物的表达与已经接受至少一部分治疗的该病例样本中的所述一个或多个生物标志物的表达进行比较；其中所述的一个或多个生物标志物是从以下组中挑选出来的：次级淋巴组织趋化因子、血管紧张素转换酶、脑源性神经营养因子、癌抗原CA125、血管内皮细胞-白细胞黏附分子、表皮生长因子、骨髓前体抑制因子、表皮生长因子受体1、卵泡调节因子、肝癌因子4、疱疹病毒入侵调节蛋白、胰岛素样生长因子-II、胰岛素样生长因子结合蛋白-I、白细胞介素-17、白细胞介素-1可溶性受体II、白细胞介素-2可溶受体a、瘦素、巨噬细胞集落刺激因子受体-R、巨噬细胞迁移抑制因子、巨噬细胞炎性蛋白1a、巨噬细胞炎性蛋白3b、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-7、髓样造血细胞抑制因子-1、骨质素、P53复合体蛋白PARC、血小板生长因子Rb、催乳素、蛋白C、转化生长因子-b RIII、肿瘤坏死因子受体-1、肿瘤坏死因子-a、血管黏附蛋白、血管内皮生长因子受体2和血管内皮生长因子受体3；其中，所述一个或多个生物标志物的表达不同即可作出治疗效果的诊断或辅助诊断。在一个例子中，所述一个或多个生物标志物是从以下组中挑选出来的：催乳素，巨噬细胞迁移抑制因子，骨质素，胰岛素样生长因子-II，血管内皮细胞-白细胞黏附分子，瘦素，表皮生长因子，白细胞介素-17，髓样造血细胞抑制因子-1，白细胞介素2可溶受体a。在一个例子中，所述一个或多个生物标志物是从以下组中挑选出来的：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
在一个例子中，上述监测癌症治疗效果的方法包括将两个或以上生物标志物的表达进行比较。在一个例子中，所述两个或以上生物标志物是从以下组中挑选出来的：催乳素，巨噬细胞迁移抑制因子，骨质素，胰岛素样生长因子-II，血管内皮细胞-白细胞黏附分子，瘦素，表皮生长因子，白细胞介素-17，髓样造血细胞抑制因子-1，白细胞介素2可溶受体a。在另一个例子中，所述两个或以上生物标志物是从以下组中挑选出来的：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
在一个例子中，上述监测癌症治疗效果的方法包括将三个或以上生物标志物的表达进行比较。在一个例子中，上述监测癌症治疗效果的方法包括将四个或以上生物标志物的表达进行比较。在一个例子中，上述监测癌症治疗效果的方法包括将四个或以上生物标志物的表达进行比较，其中所述四个或以上生物标志物包括：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。在另一个例子中，上述监测癌症治疗效果的方法包括将四个生物标志物的表达进行比较，其中所述四个生物标志物为：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
本发明还包括在癌症诊断或辅助诊断中使用的试剂盒和用于监测癌症的试剂盒。在一个例子中，所述试剂盒包括：(i)一个接收样本的容器；(ii)用于检测一个或多个生物标志物的一个或多个试剂，所述生物标志物从以下组中挑选出来：次级淋巴组织趋化因子、血管紧张素转换酶、脑源性神经营养因子、癌抗原CA125、血管内皮细胞-白细胞黏附分子、表皮生长因子、骨髓前体抑制因子、表皮生长因子受体1、卵泡调节因子、肝癌因子4、疱疹病毒入侵调节蛋白、胰岛素样生长因子-II、胰岛素样生长因子结合蛋白-I、白细胞介素-17、白细胞介素-1可溶性受体II、白细胞介素-2可溶受体a、瘦素、巨噬细胞集落刺激因子受体-R、巨噬细胞迁移抑制因子、巨噬细胞炎性蛋白1a、巨噬细胞炎性蛋白3b、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-7、髓样造血细胞抑制因子-1、骨质素、P53复合体蛋白PARC、血小板生长因子Rb、催乳素、蛋白C、转化生长因子-b RIII、肿瘤坏死因子受体-1、肿瘤坏死因子-a、血管黏附蛋白、血管内皮生长因子受体2和血管内皮生长因子受体3；以及(iii)一个参考样本。在一个例子中，所述试剂盒包括用于检测瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II的一个或多个试剂。
本发明还包括一种筛选对治疗癌症有用的候选化合物的方法。在一个例子中，本发明筛选对治疗癌症有用的候选化合物的方法包括：(i)确定一个控制至少一个生物标志物表达的候选化合物，所述生物标志物从以下组中挑选出来：次级淋巴组织趋化因子、血管紧张素转换酶、脑源性神经营养因子、癌抗原CA125、血管内皮细胞-白细胞黏附分子、表皮生长因子、骨髓前体抑制因子、表皮生长因子受体1、卵泡调节因子、肝癌因子4、疱疹病毒入侵调节蛋白、胰岛素样生长因子-II、胰岛素样生长因子结合蛋白-I、白细胞介素-17、白细胞介素-1可溶性受体II、白细胞介素-2可溶受体a、瘦素、巨噬细胞集落刺激因子受体-R、巨噬细胞迁移抑制因子、巨噬细胞炎性蛋白1a、巨噬细胞炎性蛋白3b、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-7、髓样造血细胞抑制因子-1、骨质素、P53复合体蛋白PARC、血小板生长因子Rb、催乳素、蛋白C、转化生长因子-b RIII、肿瘤坏死因子受体-1、肿瘤坏死因子-a、血管黏附蛋白、血管内皮生长因子受体2和血管内皮生长因子受体3；以及(ii)确定这样的候选化合物是否对治疗癌症有效。在一个例子中，所述方法包括确定一个控制至少一个生物标志物的表达的候选化合物，所述生物标志物从以下组中挑选出来：催乳素，巨噬细胞迁移抑制因子，骨质素，胰岛素样生长因子-II，血管内皮细胞-白细胞黏附分子，瘦素，表皮生长因子，白细胞介素-17，髓样造血细胞抑制因子-1，白细胞介素2可溶受体a。在一个例子中，所述方法包括确定一个控制至少一个生物标志物的表达的候选化合物，所述生物标志物从以下组中挑选出来：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
本发明还包括一种处理方法。在一个例子中，所述处理方法包括：(i)获取一个样本；(ii)检测样本中一个或多个生物标志物的表达，其中所述一个或多个生物标志物是从以下组中挑选出来的：次级淋巴组织趋化因子、血管紧张素转换酶、脑源性神经营养因子、癌抗原CA125、血管内皮细胞-白细胞黏附分子、表皮生长因子、骨髓前体抑制因子、表皮生长因子受体1、卵泡调节因子、肝癌因子4、疱疹病毒入侵调节蛋白、胰岛素样生长因子-II、胰岛素样生长因子结合蛋白-I、白细胞介素-17、白细胞介素-1可溶性受体II、白细胞介素-2可溶受体a、瘦素、巨噬细胞集落刺激因子受体-R、巨噬细胞迁移抑制因子、巨噬细胞炎性蛋白1a、巨噬细胞炎性蛋白3b、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-7、髓样造血细胞抑制因子-1、骨质素、P53复合体蛋白PARC、血小板生长因子Rb、催乳素、蛋白C、转化生长因子-b RIII、肿瘤坏死因子受体-1、肿瘤坏死因子-a、血管黏附蛋白、血管内皮生长因子受体2和血管内皮生长因子受体3；以及(iii)报告这个检测结果。在一个例子中，所述一个或多个生物标志物是从以下组中挑选出来的：催乳素，巨噬细胞迁移抑制因子，骨质素，胰岛素样生长因子-II，血管内皮细胞-白细胞黏附分子，瘦素，表皮生长因子，白细胞介素-17，髓样造血细胞抑制因子-1，白细胞介素2可溶受体a。在另一个例子中，所述一个或多个生物标志物是从以下组中挑选出的：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
在一个例子中，本发明的处理方法包括：(i)获取一个样本；(ii)检测样本中四个生物标志物的表达，其中所述四个生物标志物为：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II；以及(iii)报告这个检测结果。
本发明还包括一种筛选候选癌症生物标志物的方法。在一个例子中，本发明的筛选候选癌症生物标志物的方法包括：(i)确定一组与癌症有潜在联系的生物标志物；(ii)比较在步骤(i)中所确定的生物标志物在首批癌症病例和健康人中的表达水平；(iii)选择在首批癌症病例中其表达显示出明显区别的生物标志物；(iv)在第二批癌症病例和健康人中比较在步骤(iii)中确定的生物标志物的表达水平；以及(v)选择在第二批癌症病例中其表达显示出明显区别的生物标志物；其中步骤(v)中确定的生物标志物就是候选癌症生物标志物。在一个例子中，所述首批癌症病例为新诊断的癌症，所述第二批癌症病例为复发的癌症。在一个例子中，所述首批癌症病例为复发的癌症而所述第二批癌症病例为新诊断的癌症。在另一个例子中，所述首批癌症病例为晚期癌症而第二批癌症病例为早期癌症。在另一个例子中，所述首批癌症病例为早期癌症而第二批癌症病例为晚期癌症。在另一个例子中，所述方法进一步包括如下步骤：(vi)在第三批癌症病例和健康人中比较在步骤(v)中确定的生物标志物的表达水平，其中所述生物标志物的表达使用一种不同的化验模式进行检测；以及(vii)选择在第三批癌症病例中其表达显示出明显区别的生物标志物；其中在步骤(vii)中确定的生物标志物为候选癌症生物标志物。在另一个例子中，所述方法进一步包括：确定在步骤(v)或(vii)中确定的生物标志物在盲检中能否区分癌症病例和健康人。
本发明的筛选候选癌症生物标志物的方法还包括：(i)确定一个癌症生物标志物；(ii)选择能控制在步骤(i)中确定的生物标志物或者由该生物标志物控制的多肽；以及(iii)在癌症病例和健康人中，测量在步骤(ii)中所确定的多肽的表达，其中在癌症病例和健康人中表现不同的多肽为候选癌症生物标志物。
附图说明
图1是用于鉴定能区分癌症患者和健康人的生物标志物的筛选过程示意图。
图2是16子排样本的蛋白芯片示意图，芯片上有16孔，每孔点上了抗体，每个芯片只包含一种类型的排列。
图3显示了在卵巢癌病例和健康人中，四种蛋白(瘦素，催乳素，骨质素，胰岛素样生长因子-II)表达的不同点，使用两种不同的化验：RCA微阵列免疫分析法(RCAmicroarray immunoassay)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。
图4使用适于传统的二进制数据分析的最小方形显示了在206例病例中，四种蛋白(瘦素(定义为1)，催乳素(定义为2)，骨质素(定义为3)，胰岛素样生长因子-II(定义为4))表达数据的分析结果，健康人的蛋白水平用黑色显示(左)，而那些卵巢癌病例的蛋白水平用灰色显示(右)。
图5使用成对结构显示了在206例病例中，四种蛋白(瘦素(定义为1)，催乳素(定义为2)，骨质素(定义为3)，胰岛素样生长因子-II(定义为4))表达数据的分析结果，来自健康人的数据点是黑色的，来自卵巢癌病例的数据点是灰色的。
图6显示了在所述的基于分值的分类系统的基础上分配给206例病例的分数，206例病例包括106例健康人和100例卵巢癌患者，分数大于或等于2的病例可以被诊断为卵巢癌，而分数小于或等于1的病例可以被诊断为没有卵巢癌。来自健康人的数据点是淡灰色，而来自卵巢癌的数据点是深灰色。
具体实施方式
I概述
这里所描述的一种方法可以用来区分癌症病例(包括早期(I-II期)诊断的病例)和健康人。该方法建立在特别适合区分癌症病例和健康人的生物标志物的鉴定基础上。这些生物标志物是使用这里所描述的一种独特、新颖的筛选法来确定的，包括几种不同的筛选步骤，在每个步骤中使用来自不同病例的样本，并用不同的技术进行确认。这里所揭示的生物标志物可以用于诊断，预测和监视癌症。
在一个特殊例中，本发明揭示了基于四个生物标志物：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II的新的测试，可区分癌症病例和健康人，特别是可区分卵巢癌病例和健康人。在一个例子中，这四个生物标志物可以用在血液测试中，用来诊断、预测和监视卵巢癌。
这时所确定的生物标志物可以与另外的已知生物标志物组合。例如，卵巢癌已知的一个生物标志物是癌抗原CA125。癌抗原CA125与这里所确定的生物标志物的结合使用展示了一种新颖的卵巢癌早期监测的方法，可以很大的提高我们准确检测到癌变前的变化或由于卵巢癌早期没有症状而处于不断增加的危险中的妇女的能力。进一步的，本申请中所确定的生物标志物可以与其它诊断技术相结合，例如，对于卵巢癌的诊断，本申请中所确定的生物标志物可以与阴道检查、超声或MRI相结合来诊断卵巢癌。
所述冠词“a”，”an”，”the”在这里指一个或不止一个(至少一个)。
所述词组“包括”在这里表示“包括但不限于”并可与之交换使用。
所述词组“或者”在这里表示“和/或者”并可与之交换使用，除非文中明确指出不同。
所述词组“例如”在这里表示“例如但不限于”并可与之交换使用。
II诊断方法
在一个例子中，本发明是指对病例进行癌症诊断或辅助诊断的方法。在一个例子中，所述方法包括将一个病例样本中的、从表2所鉴定的组中挑选出来的一个或多个生物标志物的表达与所述一个或多个生物标志物的预定标准一一进行比较，当所述样本中的所述一个或多个生物标志物的表达与其预定标准比较有明显区别时即可作出癌症的诊断或辅助诊断。在一个例子中，所述一个或多个生物标志物是从表3所鉴定的生物标志物组中挑选出来的。在另一个例子中，所述一个或多个生物标志物是从瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II中挑选出来的。
当这个生物标志物是催乳素和/或骨质素时，所述生物标志物的表达与预定标准相比有所增长即可作出癌症的诊断或辅助诊断。当所述生物标志物是瘦素和/或胰岛素样生长因子-II时，所述生物标志物的表达与预定标准相比有所减少即可作出癌症的诊断或辅助诊断。这里所说的表达的增长或减少指基因表达产物的水平事实上是高了还是低了，或者基因表达产物的活跃性是提高了还是降低了。
上述方法可以用于任何一种癌症或肿瘤的诊断。在一个例子中，所述癌症是卵巢癌。在另一个例子中，所述癌症是乳癌。在另一个例子中，所述癌症是结肠癌。在另一个例子中，所述癌症是前列腺癌。在另一个例子中，所述癌症是宫颈癌。
这里所述的“生物标志物”是指一个或多个的多肽，可用于：单独或结合成复合多肽用于癌症的诊断、辅助诊断或预测；监视癌症的发展；和/或监视癌症治疗的效果。这里所述的“多肽”指氨基酸的聚合体，没有明确的长度。因而，肽、低聚肽和蛋白质都包括在多肽的定义中。
这里所述的“瘦素”包括所有同源体，自然发生的同源异构体，等位体和瘦素的前体。瘦素也称作HGNC：6553，OB，OBS，肥大(obesity)，或者鼠类肥大同源体(murine obesityhomolog)。在一个例子中，瘦素包含基因库保存编号为NP---000221的氨基酸序列。
这里所述的“催乳素”包括所有同源体，自然发生的同源异构体，等位体和和催乳素的前体。催乳素又称作PRL或HGNC：9445。在一个例子中，催乳素包含基因库保存编号为NP---000939的氨基酸序列。
这里所述的“骨质素”包括所有同源体，自然发生的同源异构体，等位体和骨质素的前体。骨质素又称作HGNC：11255，BNSP，BSPI，早期淋巴细胞激活蛋白-1，分泌的磷蛋白质-1，骨质素。在一个例子中，骨质素包含基因库保存编号为NP---000573的氨基酸序列。
这里所述的“胰岛素样生长因子-II”包括所有同源体，自然发生的同源异构体，等位体和胰岛素样生长因子-II的前体，胰岛素样生长因子-II也被称作HGNC：5466，似胰岛素生长因子2，似胰岛素生长因子-II或生长调节素A。在一个例子中，胰岛素样生长因子-II包含基因库保存编号为NP---000603的氨基酸序列。
这里所述的“病例”或“病人”包括所有热血动物。在一个例子中，所述病例是一个人。在一个例子中，所述病例是随癌症扩散而增加风险的个体。
在一个例子中，当所述方法涉及卵巢癌，所述病例是指怀疑患上或已知患有卵巢癌、或者具有卵巢癌高危发病风险的雌性(例如妇女)。例如，对于有家族卵巢癌病史的卵巢癌病例、被确认具有突变致癌基因的病例、以及具有至少50年的卵巢癌高危风险的病例。
这里所述的“样本”指从病例中获得的材料。所述样本可以源自任何生物体，包括所有体液(例如，全血、血浆、血清、唾液、目镜液、汗水、尿液、乳汁等等)，组织或其提取液，细胞等等。与卵巢相关的体液样本包括血液(举例来说，全血、血液血清、从血液中提取的血小板等等)，淋巴腺，腹水，妇产科医学液体(举例来说，卵巢的、输卵管的、子宫的分泌物、月经、阴道冲洗液、用于冲洗卵巢细胞样本的液体等等)膀胱液，尿液，收集冲洗腹膜的液体(举例来说，在腹腔镜检查中应用收集的液体或从人类患者中灌入或抽出的液体)。
这里所述的“表达”意思是多肽从DNA产生的过程。这个过程涉及将基因转录到信使核糖核酸上和这些信使核糖核酸翻译成多肽。视乎其在文中的使用，“表达”可以指RNA的产生，蛋白质的产生或两者兼有。
本发明生物标志物的表达可以由多种众所周知的、用于检测分子转录或其相应的蛋白质表达的方法中的任何一种来评定。这种对样本没有限制的方法包括检测分泌蛋白的免疫学方法、蛋白质纯化方法、蛋白功能或活性分析、核酸杂交方法、核酸逆转录方法、核酸扩增方法。在一个首选的例子中，标志物基因的表达的可使用抗体来评估(举例来说，放射性同位素示踪、发色基团示踪、荧光基团示踪、或者酶标抗体)、抗体衍生物(举例来说，一个结合了底物的抗体，或结合了配基的抗体{如生物素-亲和素}，或者一个抗体片段(如单链抗体))与标志物基因对应的蛋白质特异结合，例如，所述蛋白质通过开放可读框进行编码并与标志物基因或这样的蛋白质对应，所述标志物基因或蛋白质已经被全部或部分转译后的修饰。在另一个首选例子中，一个标志物基因的表达是通过以下步骤进行评定的：从病人样本的细胞中准备mRNA/cDNA，并用参考的多核苷酸链与mRNA/cDNA杂交，该多核苷酸链是包含标志物基因片段的多核苷酸互补链，其中cDNA在与参考多核苷酸链杂交之前可以随意地使用多种聚合酶连锁反应方法中的任何一种被放大；而该cDNA未被放大更好。
这里所述的生物标志物的“预定标准”指在健康人中所述生物标志物的表达水平或在同一个病例中非癌组织中的所述生物标志物的表达水平。对于一个特定生物标志物的所述预定标准的表达水平可以建立在预期的和/或过去的仅使用例行试验的统计研究的基础上。所述预定标准的表达水平可使用众所周知的方法由一个具有普通技术水平的人来确定。
“健康人”是指一个没有被诊断有癌症的病例或没有被诊断为所分析的癌症类型的人。因此，例如在诊断卵巢癌的方法中，“健康人”是指有癌症的病例或没有卵巢癌的病例。
这里所述的“明显区别”是在一个专业技术人员的知识范围内并且对每个特别的生物标志物凭经验的决定。例如，一个癌症病例中的一个生物标志物的表达与一个健康人相比有明显区别是指其表达具有统计上显著差异。
在一个例子中，所述方法包括将两个或以上生物标志物的表达进行比较并且癌症的诊断是基于分数的分类方法。在一个例子中，该基于分值的分类方法是以二进制数为基础的。在一个例子中，所述基于分值的分类方法包括确定m个不同生物标志物的表达；其中每一个生物标志物都被赋予0或1的分数，其中如果所述的生物标志物的表达与预定标准没有明显区别的话，该生物标志物所赋予的分数是0；如果所述的生物标志物的表达与预定标准有明显区别的话，该生物标志物所赋予的分数是1；其中，所述病例被赋予与m个生物标志物的分数总和相当的全部分数；其中一个给定的端值t用于癌症的诊断或辅助诊断。
在一个例子中，基于分值的分类方法包括将四个不同生物标志物的表达进行比较；其中，每个生物标志物被赋予分数0或1，其中如果所述的生物标志物的表达与预定标准相比没有明显区别的话，该生物标志物所赋予的分数是0；如果所述的生物标志物的表达与预定标准相比有明显区别的话，该生物标志物所赋予的分数是1；其中，所述病例被赋予与4个生物标志物的分数总和相当的全部分数；其中2或以上的分数即可作出癌症的诊断或辅助诊断。在一个例子中，所述四个生物标志物是瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
在一个例子中，所述方法包括对两个或以上生物标志物的表达进行比较，其中癌症的诊断是通过将两个或以上生物标志物的表达形式与所述生物标志物的预定标准形式进行比较而确定的，并且根据表达形式上的区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。这里所述的“表达形式”是指在一个给定样本中的一个或多个生物标志物表达水平的表现。
在一个例子中，预定的标准形式是使用机械阅读方法将在癌症病例中所述两个或以上生物标志物的表达与在健康人中所述两个或以上生物标志物的表达进行比较来决定的。在一个例子中，预定的标准形式是使用向量支持模式(support vector machines)、K值临近分类模式(K-nearest neighbor classifier)，或者树枝分类分析模式(Classificationtree analysis)将癌症病例中和健康人中的所述两个或以上生物标志物的表达进行比较来决定的。
在一个例子中，所述方法包括检测一个表2中未列出来的附加的已知生物标志物并将该附加的已知生物标志物的表达与其预先标准进行比较。癌症的附加生物标志物可以由本领域的普通技术人员参考已出版的文献来确定。在一个例子中，所述癌症是卵巢癌，卵巢癌的附加生物标志物是从以下组中挑选出来的：人类角质激肽释放酶，激肽释放酶4，激肽释放酶5，激肽释放酶6(蛋白酶M)，激肽释放酶8，激肽释放酶9，激肽释放酶10，癌抗原CA125，癌抗原15-3，癌抗原19-9，肿瘤抗原OVX1，溶血磷脂酸(LPA)，癌胚抗原(CEA)，巨噬细胞集落刺激因子，丝氨酸蛋白水解酶，癌抗原54-61，癌抗原72，肿瘤抗原HMFG2，白细胞介素-6，白细胞介素-10，脂质结合唾液酸，肿瘤抗原NB70K，碱性磷酸酶同工酶，结肠癌抗原，肿瘤坏死因子，组织纤维蛋白溶酶激活剂，肿瘤抗原UGTF，肿瘤抗原HE4，基质金属蛋白酶2，肿瘤抗原Tetranectin，抑制素，肿瘤抗原Mesothelyn，肿瘤抗原MUC1，表皮生长因子，肿瘤抗原CLDN3，肿瘤抗原NOTCH3，肿瘤抗原E2F3，肿瘤抗原RACGAP1，肿瘤抗原HN1，阿朴脂蛋白Al，层粘连蛋白，肿瘤抗原claudin 3，肿瘤抗原claudin 4，肿瘤相关钙信号传导子-1，肿瘤相关钙信号传导子-2，肿瘤抗原Ladininl，肿瘤抗原S100A2，肿瘤抗原PAI-2，肿瘤抗原CD24。肿瘤抗原Lipocalin 2，肿瘤抗原TADG-15，肿瘤抗原Stratifin，转移生长因子-β受体III，血小板生长受体α，肿瘤抗原SEMACAP3，肿瘤抗原ARHI，凝血蛋白2，肿瘤抗原Dab2/DOC2，结合珠球蛋白-α亚单位。在另一个例子中，卵巢癌的附加生物标志物是α-胰岛素抑制剂重链H4片段。在一个例子中，卵巢癌的附加生物标志物是癌抗原CA125。
在一个例子中，本发明指对一个病例进行癌症诊断或辅助诊断的方法，该方法包括将一个病例样本中的、从表2所鉴定的生物标志物组中挑选出来的两个或以上生物标志物的表达与每个所述生物标志物的预定标准进行比较，其中所述样本中的一个或多个生物标志物的表达与其预定标准有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。在一个例子中，所述两个或以上生物标志物是从表3所鉴定的生物标志物组中挑选出来的。在另一个例子中，所述两个或以上生物标志物是从以下组中挑选出的：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。在一个例子中，所述两个或以上生物标志物中至少有两个的表达有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
在一个例子中，本发明所包括的对一个病例进行癌症诊断或辅助诊断的方法包括将一个病例样本中的、从表2所鉴定的生物标志物组中挑选出来的三个或以上生物标志物的表达与每个所述生物标志物的预定标准进行比较，其中所述样本中的一个或多个生物标志物的表达与其预定标准有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。在一个例子中，所述三个或以上生物标志物是从表3所鉴定的生物标志物组中挑选出来的。在另一个例子中，所述三个或以上生物标志物是从以下组中挑选出的：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。在一个例子中，所述两个或以上生物标志物中至少有两个的表达有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
在一个例子中，本发明指对一个病例进行癌症诊断或辅助诊断的方法，该方法包括将一个病例样本中的、从表2所鉴定的生物标志物组中挑选出来的四个或以上生物标志物的表达与每个所述生物标志物的预定标准进行比较，其中所述样本中的一个或多个生物标志物的表达与其预定标准有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。在一个例子中，所述四个或以上生物标志物是从表3所鉴定的生物标志物组中挑选出来的。在另一个例子中，所述四个或以上生物标志物是从以下组中挑选出的：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。在一个例子中，所述两个或以上生物标志物中至少有两个的表达有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
所述一个或多个生物标志物的表达可以使用本领域的普通技术人员所知道的任何一种方法进行检测。在一个例子中，所述一个或多个生物标志物的表达可以用该一个或多个生物标志物的试剂来检测。所述试剂可以是专门检测所述一个或多个生物标志物的任何一种试剂。所述试剂可以是：一种对该生物标志物特效的抗体(天然的或人工合成的)或片段、一种多肽、一种核酸、或其他任何可以专门检测一种生物标志物的试剂。在这里术语“抗体”包括生物合成或人工合成的抗体，如由重组或由人工平台产生。术语“抗体”包括抗体的模拟或抗体的人工合成模拟天然多肽。人工合成模拟天然多肽是基于或源于肽和蛋白的化合物。本发明的人工合成模拟天然多肽，典型的可以通过利用非天然氨基酸(unnatural amino acids)，结构重塑(conformational restraints)，等位替换(isostericreplacement)等方法在结构上修改已知肽的排序而获得。人工合成模拟天然多肽在肽与非肽人工合成结构之间构成了结构空间的连续体；因此，在描绘药效基团和连同母肽的活动帮助将肽转化为非肽化合物方面，人工合成模拟天然多肽也许有用。为了说明的目的，抗体的模拟肽可以通过使用，如，苯二氮(例，见弗雷的丁尔等在《肽：化学与生物》，G.R.马谢尔编著，埃斯康母(ESCOM)出版社，来登，荷兰，1988)(Freidinger et al.in Peptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshall ed.，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988))；替代伽马乳胺环(见加维等在：《肽：化学与生物》，G.R.马谢尔编著，埃斯康母(ESCOM)出版社，来登，荷兰，1988，p123)(substituted gamma lactam rings(Garvey et al.in Peptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshall ed.，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988，p123))；模拟C-7(哈伏曼等在：《肽：化学与生物》，G.R.马谢尔编著，ESCOM出版社，来登，荷兰，1988，p105)(C-7mimics(Huffinan et al.in Peptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshall ed.，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988，p.105))；亚甲基酮假肽(诶文森等(1986)J.医药化学29：295(keto-methylene pseudopeptides(Ewenson et al.(1986)JMed Chem 29：295)；和诶文森等在《肽：结构与功能》(第九届美国肽学大会的进程)皮尔司化学公司Rockland，11，1985)(Ewenson et al.in Peptides：Structure and Function(Proceedings of the 9h American Peptide Symposium)Pierce ChemicalCo.Rockland，IL，1985))；β-转缩二氨酸核心(那盖等(1985)Tetrahedron Lett 26：647和撒脱等(1986)J生物Soc Per kin Trans 1：1231)(13-turn dipeptide cores(Nagai etal.(1985)Tetrahedron Lett 26：647；and Sato et al.(1986)J Che7n Noc Perkin Trans 1：1231))；β-氨基醇二氨基酮(桥登等(1985)研究通讯126：419(B-aminoalcohols(Gordonet al.(1985)Biochem Biophys Res Comraun 126：419)；和丹等(1986)生物化学与生物物理研究通讯134：71)(Dann et al.(1986)Biochem Biophys Res Commun 134：71))；氨基酮类(那他拉真等(1984)生物化学和生物物理研究通讯124：141)(diaminoketones(Natarajan et al.(1984)Biochem Biophys Res Commun 124：141))；和亚甲氨基-更改(洛克等在《肽：化学与生物》，G.R.马谢尔编著，ESCOM出版社，来登，荷兰，1988，p134)(methyleneamino-modified(Roark et al.in Peptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshalled.，ESCOM Publsiher：Leiden，Netherlands，1988，p134))。同样，参见第三部分：分析与人工合成方法出自(《肽：化学与生物》，G.R.马谢尔编著，埃斯康母(ESCOM)出版社，来登，荷兰，1988)(Session III：Analytic and synthetic methods，in Peptides：Chemistry andBiology，G.R.Marshall ed.，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988))。
另一个实施例中，所述的试剂用可见物质直接或间接进行标记。此可见物质可以是，例如，选自，如放射性同位素组合，荧光化合物，酶和辅酶。给抗体标记是本领域中常用的方法。
这里所使用的术语“检测”，“被检测”或“检测的”包含测量，被测量和测量的。
上述方法可以用任何样品来实施。在一个实施例中，所述样品为体液样品。在一个实施例中，所述体液样品为血液或血清。
在另一个实施例中，所述的一个或多个生物标志物的表达通过质谱分析进行检测。
还有一个实施例为，所述的一个或多个生物标志物的表达是通过检测所述一个或多个生物标志物基因码的信使核糖核酸的转录水平来检测的。
还有一个实施例为，所述一个或多个生物标志物的表达可以通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、RCA微阵列免疫分析法(RCA immunoassay)、化学发光、薄膜生物传感器、质子共振技术、蛋白芯片、或任何一种本领域中已知的检测方法来检测。
在一个例子中，所述的一个或多个生物标志物的表达可以通过以下方法进行检测：(a)检测由所述的一个或多个生物标志物控制的一种多肽的表达；(b)检测控制所述生物标志物的一种多肽的表达；或(c)检测所述生物标志物的代谢物的表达。本领域的技术人员都能够通过普通的实验识别出控制一种生物标志物或被一种生物标志物控制的多肽和一种生物标志物的代谢物。
上述癌症的诊断或辅助诊断方法可以与其他方法结合使用来验证结果(例如，更加确凿的认定一个病例是否是癌症)。一个实施例中，所述癌症为卵巢癌，并且上述方法进一步包括：体检，超声波检查，X光检查，核磁共振检查，剖腹术和/或验血。对于结果表现出可能患有卵巢癌的病人的验血包括对卵巢癌的附加生物标志物的血清系数分析。
III.监测方法
一个实施例中，本发明包括一种监测一个病例中癌症发展进度的方法，其包括将从一个病例样品中的、从表2所鉴定的生物标志物组中选出的一个或多个生物标志物的表达与在后来的时间点中从该病例中获得的所述一个或多个生物标志物的表达进行比较，其中所述一个或多个生物标志物的表达的不同显示出病例中癌症的发展进度。在一个实施例中，所述一个或多个生物标志物的表达是从表3所鉴定的生物标志物组中选出的。在另一个实施例中，所述一个或多个生物标志物的表达是从瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II中选出的。
一个实施例中，所述方法包括比较两个或以上生物标志物的表达。另一个实施例中，所述方法包括比较三个或以上生物标志物的表达。还有一个实施例中，所述方法包括比较四个或以上生物标志物的表达，其中所述四个或以上生物标志物包括瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
一个实施例中，所述方法用来在监测一个病例接受癌症治疗后的癌症发展进度情况。
本发明还包括一种监测癌症治疗效果的方法，其包括将一个接受至少一部分治疗之前的病例样品的、从表3所鉴定的生物标志物组中选出的一个或多个生物标志物的表达与接受至少一部分治疗后的该病例样本的该一个或多个生物标志物的表达进行比较，其中所述一个或多个生物标志物表达的不同显示了治疗的效果。
一个实施例中，所述的一个或多个生物标志物是从表3所鉴定的生物标志物组中选出的。另一个实施例中，所述的一个或多个生物标志物是从瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II中选出的。
一个实施例中，所述方法包括比较两个或以上生物标志物的表达。另一个实施例中，所述方法包括比较三个或以上生物标志物的表达。还有一个实施例中，所述方法包括比较四个或以上生物标志物的表达。一个实施例中，所述方法包括比较四个或以上生物标志物的表达，其中，所述的四个或以上生物标志物包括：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。还有一个实施例中，所述方法包括比较四种生物标志物：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II的表达。
值得一提的是这里所使用的“治疗”可以是任何一种治疗卵巢癌的治疗方法，但不限于化学疗法、免疫疗法、基因疗法、放射疗法和外科手术摘除组织疗法。这里所使用的“一部分治疗”是指癌症治疗的任何部分，例如，一剂治疗癌症的化合药物或部分化疗。
上述监测癌症的方法可应用于任何癌症或肿瘤。一个实施例中，所述方法用于监测卵巢癌。一个实施例中，所述方法用于监测乳癌。一个实施例中，所述方法用于监测结肠癌。还有一个实施例中，所述方法用于监测宫颈癌。
IV.试剂盒
本发明还包括用于癌症的诊断或辅助诊断或癌症的监测的试剂盒。所述试剂盒可以用于诊断或监测任何癌症。一个实施例中，所述试剂盒用于诊断或监测卵巢癌。一个实施例中，所述试剂盒用于诊断或监测乳癌。一个实施例中，所述试剂盒用于诊断或监测结肠癌。一个实施例中，所述试剂盒用于诊断和监测宫颈癌。
一个实施例中，所述试剂盒包含：(i)一个用于接收样品的接收容器；(ii)一个或多个用于检测选自表2所鉴定的生物标志物组中的一个或多个生物标志物的试剂；以及(iii)一个参考样品。一个实施例中，所述试剂盒包含一个或多个用于检测选自表3所确定的生物标志物组中的一个或多个生物标志物的试剂。一个实施例中，所述试剂盒包含一个或多个用于检测瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II中的一个或多个生物标志物的试剂。
一个实施例中，所述试剂盒包含用于检测两个或以上生物标志物的试剂。一个实施例中，所述两个或以上生物标志物选自瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
另一个实施例中，所述试剂盒包含用于检测三个或以上生物标志物的试剂。
一个实施例中，所述试剂盒包含用于检测四个或以上生物标志物的试剂。一个实施例中，所述四个或以上生物标志物包括：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
所述试剂可以被标为一种能够检测与本发明基因标志相对应的一种多肽或一种将多肽编码的信使核糖核酸的化合物或测试剂和决定样品中多肽或信使核糖核酸的数量的装置。(例如，一种结合多肽的抗体或一种附着于DNA或将多肽编码的mRNA的低聚核甙酸探测剂。)与本发明基因标志相对应的多肽相结合的合适的试剂包含：抗体，抗体衍生物，抗体片段和诸如此类物质。与核酸(如一基因组的DNA，一种mRNA，一种接合的mRNA，一种cDNA或诸如此类)相结合的合适的试剂包含互补核酸。
一种抗体基础上的试剂盒，该试剂盒可包括，例如：(1)一种与本发明基因标志物相对应的多肽接合的第一抗体(如，附着在一固体支架上)；还可视情况需要(2)一种第二抗体，不同的抗体，其或与多肽接合或与第一抗体接合，并被标记了可检测标记物。
一种低聚核苷酸基础上的试剂盒，该试剂盒包括，例如：(1)一种低聚核苷酸，如，一种可检测的被标记的低聚核苷酸，与核酸序列杂交将一种多肽编码与本发明的基因标志相对应；或(2)一对引子，有助于扩大与本发明的基因标志相对应的核酸分子。
所述参考样品用于与被测试样品中获得的结果比较。
所述试剂盒还可包含其他成份如，缓冲剂，防腐剂，或蛋白稳定剂。该试剂盒还可以包含必要的用于检测可检测标记物的成份(例如，一种酶或一种酶作用物)。
所述试剂盒的每一种成份可以被包含在一个独立容器内，并且所有各种容器连同使用试剂盒的分析结果的指导说明书都可以装入单个包装内。
V.筛选方法
本发明还包括一种筛选有助于治疗癌症的候选化合物的方法。一个实施例中，本发明包含一种筛选有助于治疗癌症的候选化合物的方法，其包含：(i)确定一种控制表2所确定的生物标志物组中的一个或多个生物标志物的表达的候选化合物；和(ii)确定该候选化合物对于治疗癌症是否有效。一个实施例中，所述一个或多个生物标志物是从表3所鉴定的生物标志物组中选出的。另一个实施例中，所述一个或多个生物标志物是从瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II中选出的。
一个实施例中，本发明的筛选有助于治疗癌症的候选化合物的方法包括：(i)确定一种控制表2所确定的生物标志物组中的两个或以上生物标志物的表达的候选化合物；和(ii)确定这种候选化合物对于治疗癌症是否有效。一个实施例中，所述的两个或以上生物标志物是从表3所鉴定的生物标志物组中选出的。另一个实施例中，所述的两个或以上生物标志物是从瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II中选出的。
本发明还包括筛选有助于治疗癌症的候选化合物的方法。一个实施例中，本发明的筛选有助于治疗癌症的候选化合物的方法包括：(i)确定一种控制表2所鉴定的生物标志物组中的三个或以上生物标志物的表达的候选化合物；和(ii)确定这种候选化合物对于治疗癌症是否有效。一个实施例中，所述三个或以上生物标志物是从表3所鉴定的生物标志物组中选出的。另一个实施例中，所述三个或以上生物标志物是从瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II中选出的。
本发明还包含筛选有助于治疗癌症的候选化合物方法。一个实施例中，本发明的筛选有助于治疗癌症的候选化合物的方法包括：(i)确定一种控制表2所鉴定的生物标志物组中的四个或以上生物标志物的表达的候选化合物；和(ii)决定这种候选化合物对于治疗癌症是否有效。一个实施例中，所述四个或以上生物标志物是从表3所鉴定的生物标志物组中选出的。另一个实施例中，所述四个或以上生物标志物是从瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II中选出的。
这里所使用的术语“化合物”是指任何一种可以治疗或预防疾病、病症、状况、或身体功能紊乱的化学实体，药物，药品和诸如此类的物品。化合物包含已知和潜在的治疗化合物。一种化合物可以通过用本发明的筛选方法来筛选决定使用。试验例中的化合物包含但不限于：肽、多肽、人工合成有机分子和有关的化合物。
上述筛选方法可以用来筛选有助于治疗任何癌症的候选化合物。一个实施例中，所述方法为筛选有助于治疗卵巢癌的候选化合物的方法。另一个实施例中，所述方法为筛选有助于治疗乳癌的化合物的方法。另一个实施例中，所述方法为筛选有助于治疗结肠癌的化合物的方法。另一个实施例中，所述方法为筛选有助于治疗宫颈癌的化合物的方法。
VI.处理方法
本发明还包括一种处理方法，其包括：(i)获取一种样品；(ii)检测样品中至少一种生物标志物的表达，其中所述一个或多个生物标志物是从表2所鉴定的生物标志物组中选出的；和(iii)报告这种检测的结果。一个实施例中，所述的一个或多个生物标志物是从表3所鉴定的生物标志物组中选出的。一个实施例中，所述的一个或多个生物标志物是从瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II中选出的。
本发明还包括一种处理方法，其包括：(i)获取一种样品；(ii)检测瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II的表达；和(iii)报告此检测的结果。
VII.一般筛选方法
本发明还包含筛选候选癌症生物标志物的方法，其包含：(i)确定一组与癌症有潜在联系的生物标志物(如致癌基因，肿瘤抑制基因，生长因子基因，似蛋白酶基因和似激酶基因)；(ii)比较在步骤(i)中所确定的生物标志物在首批癌症病例和健康人中的表达水平；(iii)选择在首批癌症病例中其表达显示出明显区别的生物标志物；(iv)在第二批癌症病例和健康人中比较在步骤(ii)中确定的生物标志物的表达水平；以及(v)选择在第二批癌症病例中其表达显示出明显区别的生物标志物；其中步骤(v)中确定的生物标志物就是候选癌症生物标志物。第一批癌症病例和第二批癌症病例可以是任何的两个癌症群体只要这两个群体是不同的群体。一个实施例中，所述第一批癌症病例是由新诊断出的癌症病例组成，所述第二批癌症病例是由复发的癌症病例组成。另一个实施例中，所述的第一批癌症病例是由晚期癌症病例组成，所述的第二批癌症病例是由早期癌症病例组成；或者所述的第一批癌症病例是由早期癌症病例组成，所述的第二批癌症病例是由晚期癌症病例组成。
本领域中的专业技术人员都能够确定与癌症有潜在联系的生物标志物。此生物标志物可以从以下组中选出：致癌基因，肿瘤抑制基因，生长因子基因，蛋白酶样基因和激酶样基因。
一个实施例中，所述方法还包括：(vi)在第三批癌症病例和健康人中比较在步骤(v)中确定的生物标志物的表达水平，其中所述生物标志物的表达使用一种不同的化验模式进行检测；以及(vii)选择在第三批癌症病例中其表达显示出明显区别的生物标志物；其中在步骤(vii)中确定的生物标志物为候选癌症生物标志物。为此，例如，一个实施例中，所述的生物标志物的表达是首先通过高通量的分析方法来检测，再通过专门针对有问题的蛋白质的分析方法来检测。例如，一个实施例中，所述生物标志物的表达首先由RCA微阵列免疫分析法检测再通过ELISA化验法检测。第三批癌症病例可以与第一或第二批癌症病例相同或不同。
一个实施例中，所述方法还包括决定在第(v)步骤或第(vii)步骤所确定的生物标志物是否可以在盲检试验中区分癌症病例和健康人。盲检的结果可以使用已知的常用统计方法来分析。
所述生物标志物的表达可以用本领域中任何已知的方法来比较。一个实施例中，生物标志物的表达可以用蛋白质测定、质谱分析、凝胶电泳或免疫分析来检测。一个实施例中，生物标志物的表达可以通过RCA微阵列免疫分析法检测。另一个实施例中，生物标志物的表达通过ELISA测定。三种方法都是本领域中常用的方法。
本发明还包括一种筛选候选癌症生物标志物的方法，其包含：(i)确定一种癌症生物标志物；(ii)选择控制第(i)步骤所确定的生物标志物或被其控制的多肽；和(iii)在癌症病例和健康人中测定第(ii)步骤中确定的多肽的表达，其中，一种在癌症病例和健康人中的表达不同的多肽为候选癌症生物标志物。
上述筛选方法可以用于筛选任何癌症的候选生物标志物。一个实施例中，方法为筛选有助于治疗卵巢癌的候选化合物。另一个实施例中，所述方法用于筛选候选乳癌生物标志物。另一个实施例中，所述方法用于筛选候选结肠癌生物标志物。另一个实施例中，所述方法用于筛选候选宫颈癌生物标志物。
例证
例1.卵巢癌的生物标志物的识别
图1为用于识别卵巢癌的新颖的生物标志物筛选测定法的图解，该生物标志物可区分卵巢癌症病例和健康人。如图1所示，筛选方法阶段I中，169个蛋白质的表达水平在46个血清样品(18个样品来自带卵巢癌的病例而28个样品来自健康的年龄对照控制组)中通过RCA微阵列免疫分析法测定从而确定在卵巢癌病例中和在健康人中表达不同的蛋白质。
                                表1
 用于筛选卵巢癌生物标志物的蛋白质(分析物)。(这里使用的术语“分析物”是指一种分子或化合物，例如一种多肽或核酸，其存在会在样品中被识别出。)
 蛋白质(缩写)   蛋白质(全称)
1 ANG   阵列I分析物血管生成素
  2 BLC(BCA-1)3 EGF4 ENA-785 EOT6 EOT-27 Fas8 FGF-79 FGF-910 GDNF11 GM-CSF12 IL-1ra13 IL-2sRa14 IL-315 IL-416 IL-517 IL-618 IL-719 IL-820 IL-1321 IL-1522 MCP-223 MCP-324 MIP-1a25 MPIF26 OSM27 PIGF1 AR2 BDNF3 Flt-3Lig   B淋巴细胞趋化因子表皮生长因子上皮细胞源的嗜中性激活肽骨髓前体抑制因子骨髓前体抑制因子细胞死亡基因95成纤维细胞生长因子-7成纤维细胞生长因子-9胶质细胞源性神经营养因子粒巨噬细胞集落刺激因子白细胞介素1受体拮抗剂白细胞介素2可溶受体α白细胞介素3白细胞介素4白细胞介素5白细胞介素6白细胞介素7白细胞介素8白细胞介素13白细胞介素15单核细胞趋化蛋白2单核细胞趋化蛋白3巨噬细胞炎性蛋白1-α髓样造血抑制因子1致瘤素M胎盘生长因子阵列2分析物双向调节蛋白脑源性神经营养因子具内切酶酪氨酸激酶配体
  4 GCP-25 HCC4(NCC4)6 I-3097 IL-Iα8 IL-1β9 IL-210 IL-1711 MCP-112 M-CSF13 MIG14 MIP-1β15 MIP-1δ16 NT-317 NT-418 PARC19 RANTES20 SCF21 sgp13022 TARC23 TNF-RI24 TNF-α25 TNF-β26 VEGF1 BTC2 DR63 Fas Lig4 FGF acid(FGF-1)5 Fractalkine6 GRO-β   粒细胞趋化蛋白质2肝细胞生长因子4肿瘤抗原I-309白细胞介素Iα白细胞介素1β白细胞介素2白细胞介素17单核细胞趋化蛋白1巨噬细胞集落刺激因子干扰素-γ诱生单核因子巨噬细胞炎性蛋白1β巨噬细胞炎性蛋白1δ神经营养因子3神经营养因子4P53蛋白复合体趋化因子调节激活正常T细胞表达和分泌因子干细胞因子可溶糖蛋白130胸腺活化调节趋化因子肿瘤坏死因子受体I肿瘤坏死因子α肿瘤坏死因子β血管内皮生长因子列3分析物β细胞调节素死亡受体6Fas配体成纤维细胞生长因子-1肿瘤抗原Fractalkine生长相关癌基因β
  7 HCC-18 HGF9 HVEM10 ICAM-3(CD50)11 IGF BP-212 IL-2Rγ13 IL-5Rα(CD125)14 IL-915 Lepitn/OB16 L-Selectin(CD62L)17 MCP-418 MIP-3β19 MMP-7(total)20 MMP-921 PECAM-1(CD31)22 RANK23 SCF R24 TIMP-125 TRAIL R426 VEGF-R2(Flk-1/KDR)27 ST21 ALCAM2 β-NGF3 CD274 CTACK5 CD306 Eot-37 FGF-28 FGF-4   肝细胞生长因子1肝细胞生长因子疱疹病毒侵入调控因子细胞间粘连分子-3胰岛素样生长因子结合蛋白2白细胞介素2受体γ白细胞介素5受体α白细胞介素9瘦素白细胞选择素单核细胞趋化蛋白4巨噬细胞炎性蛋白3β基质金属蛋白酶-7基质金属蛋白酶9血小板内皮细胞附着分子1NF-kappa-B蛋白质的受体激活剂干细胞因子受体金属蛋白酶抑制因子-1肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体受体4血管内皮生长因子受体2白细胞介素1受体4列4分析物＿激活的白细胞黏附分子β神经生长因子细胞死亡因子CD27皮肤T细胞诱导趋化因子细胞死亡因子CD30嗜酸粒细胞趋化因子基因3成纤维细胞生长因子2成纤维细胞生长因子4
  9 Follistatin10 GRO-γ11 ICAM-112 IFN-γ13 IFN-ω14 IGF-1R15 IGF-BP-116 IGF-BP-317 IGF-BP-418 IGF-II19 IL-1sR120 IL-1sR II21 IL-10Rβ22 IL-1623 IL-2Rβ24 I-TAC25 Lptn26 LTβR27 M-CSF R28 MIP-3α29 MMP-1030 PDGF Rα31 PF432 Svap-133 TGF-α34 TIMP-235 TRAIL R136 VE-cadherin37 VEGF-D   卵泡调控素生长相关癌基因γ细胞间粘附分子-1γ干扰素ω干扰素胰岛素样生长因子1受体胰岛素样生长因子结合蛋白1胰岛素样生长因子结合蛋白3胰岛素样生长因子结合蛋白4胰岛素样生长因子II白细胞介素可溶受体I白细胞介素可溶受体II白细胞介素10受体β白细胞介素16白细胞介素2受体β干扰素γ诱导T细胞α趋化因子淋巴细胞趋化因子淋巴细胞趋化因子β受体巨噬细胞集落刺激因子受体巨噬细胞炎性蛋白3α基质金属蛋白10血小板源生长因子3α血小板因子4可溶性血管细胞黏附分子-1转化生长因子α金属蛋白酶抑制因子2肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体受体1血管内皮附着因子血管内皮细胞生长因子-D列5分析物
  1 4-1BB(CD137)2 ACE-23 AFP4 AgRP5 CD1416 CD 407 CNTF Rα8 CRP9 D-Dimer10 E-Selectin11 HCG12 IGF BP-613 IL-12(P40)14 IL-1815 LIF Rα(gp190)16 MIF17 MMP-8(全部)18 NAP-219 Neutrophil elastase20 PAI-II21 Prolactin22 ProteinC23 ProteinS24 P-Selectin25 TSH1.6CKine2 ACE3 CA 1254 CNTF   4-1BB血管紧张素转化酶-2甲胎蛋白Agouti相关蛋白细胞死亡因子CD141细胞死亡因子CD40纤毛神经营养因子受体αC-反应蛋白D-二聚体E-选择素人类绒毛膜促性腺激素胰岛素样生长因子结合蛋白6白细胞介素12(P40)白细胞介素18白血病抑制因子可溶性受体α巨噬细胞迁移抑制因子基质金属蛋白酶8嗜中性粒细胞激活肽嗜中性粒细胞弹性蛋白酶纤溶酶原激活物抑制剂II催乳素人类蛋白质C人类蛋白质SP选择素甲状腺促进素列6分析物次级淋巴组织趋化因子血管紧张素转化酶癌抗原CA125纤毛神经营养因子
  5 Endostatin6 Endostatin37 ErbB18 ErbB29 FGF R3(IIIc)10 FGF-611 FGF-R3(IIIb)12 G-CSF13 HB-EGF14 IFN-a15 LIF16 MMP-117 MMP-2180 steopontin19 PAI-I20 PDGF Rb21 PEDF22 sVCAM-123 TGF-b RIII24 Tie-225 uPA26 uPAR27 VEGF R3   内皮抑素因子内皮抑素因子3表皮生长因子接收器1表皮生长因子接收器2成纤维细胞生长因子受体3IIIc异构体成纤维细胞生长因子6成纤维细胞生长因子受体3IIIb异构体粒细胞集落刺激因子肝磷脂结合EGF样生长因子干扰素α白血病抑制因子基质金属蛋白酶1基质金属蛋白酶2骨质素纤溶酶原激活抑制剂I血小板源生长因子受体β色素上皮层衍生生长因子可溶VCAM-1转移生长因子β受体III带Ig和EGF同源结构域2的酪氨酸激酶尿激酶型纤溶酶原激活剂尿激酶型纤溶酶原激活剂受体血管内皮生长因子受体3
从这169个蛋白质组中，35个蛋白质被识别出在健康人和卵巢癌病例之间的表达有所不同(各种试验的基础上P值小于0.05(ANOVA))。此数据在表2中显示。
                           表2
  卵巢癌病例与健康人中表达有明显区别(p＜0.05)的蛋白质*健康人
  蛋白质   均数   标准差   数量   均数   标准差   数量   均数   标准差   有效尺寸   p值
  6CkineACEBDNFCA125E-SelectinEGFEot2ErbB1FollistatinHCC4HVEMIGF-IIIGFBP-1IL-17IL-lsrIIIL-2sRaLeptinM-CSF RMIFMIP-1aMIP3bMMP-8MMP7MPIF-1OPNPARCPDGFRbProlactinProteinC   9.1812.0913.77.0513.838.4113.1211.7910.2613.938.3313.5313.248.789.9613.1412.7712.9810.756.857.5513.9211.579.2712.6214.2110.7411.0113.59   0.520.430.920.420.621.631.110.390.630.590.670.461.580.560.60.671.620.350.750.690.731.030.480.60.790.20.970.510.31   2828282828282828282828282828282727282828282828282828282828   9.6711.6712.8211.313.410.1412.5511.3610.7614.178.7513.0413.978.249.4813.7710.8312.7811.826.457.9214.53129.913.8114.3810.1311.7513.24   0.690.611.212.450.761.571.20.551.020.450.70.531.340.550.690.572.780.370.750.730.80.820.580.70.690.231.131.120.38   5151515151515151515151515151515151515151515151515151505151   -0.490.420.88-4.250.44-1.730.570.44-0.49-0.25-0.420.49-0.730.530.48-0.631.940.19-1.070.4-0.37-0.61-0.43-0.63-1.2-0.170.61-0.740.35   0.640.561.121.990.711.591.170.50.90.50.690.511.430.550.660.62.440.370.750.710.770.90.550.670.730.221.080.950.36   -0.760.760.79-2.130.61-1.090.490.87-0.55-0.49-0.610.97-0.510.960.72-1.040.790.53-1.420.56-0.48-0.68-0.79-0.94-1.64-0.780.56-0.780.97   0.0018130.0017630.001293＜.0000010.0111760.0000150.042280.0003830.02250.041780.0117770.0000940.0330160.0001050.0029830.000040.001340.027136＜.0000010.0207570.0433030.0049560.0012620.000155＜.0000010.0013180.0197950.0014450.000089
  TGF-bRIIITNF-R1TNF-aVAP-1VEGF R2VEGF R3   10.4610.147.0614.068.8410   1.151.230.970.280.380.55   282828242828   11.4610.736.313.788.599.51   1.121.180.70.650.490.67   515051445151   -1-0.590.750.290.260.49   1.131.20.80.550.460.63   -0.88-0.50.940.520.560.78   0.0003440.0391970.0001520.0428880.01890.001388
表2中鉴定的蛋白质(或分析物)还有其他已知的名称，这可以参照表1中描述的蛋白质全称和已出版文献确定。一种确定表2中所鉴定的蛋白质的其他名称的方法是参考多种NCBI数据库，此数据库包括基因库。
这35种蛋白质被选出连同40个从复发卵巢癌病例中提取的血清样品一起作进一步的特性分析。从35种蛋白质组成中，10种生物标志物在复发卵巢癌病例和健康人中的表达表现出明显区别。这10种生物标志物在表3中列出。
                        表3
   在复发卵巢癌病例和健康人中的表达有明显区别的蛋白质
  *蛋白质   博弗朗尼(bonferroni)调整p值
  ProlactinMIFOPNIGF-IIE-SelectinLeptinEGFIL-17MPIF.1*IL.2sRa   3.96E-133.61E-060.000010.000090.001550.002490.003820.003130.008390.49340
这10种蛋白质中，有些蛋白质不仅在健康人和新诊断为卵巢癌的病例中表现出极其潜在的不同而且在健康人和复发病例中也表现出极其潜在的不同，这些蛋白质是采用酶联免疫吸附试验(ELISA)在50个病例(25例III/IV期卵巢癌，平均年龄有63.4岁和25例健康人，平均年龄57岁)中的一小群组中测定。在原来样品组的ELISA化验法基础上，EGF，TNFa和IL-17并没有在癌症和控制血清样品间表现出一致的不同。MIF-1有希望成为标志物，但用ELISA试剂盒继续测试却发现不够可靠。如图3所示，四种蛋白质在RCA微阵列免疫分析法与ELISA化验法之间表现出完全的相关。为这些样品所决定的该四种生物标志物的平均浓度如下表4所示：
                                     表4
  该四种生物标志物中每一种生物标志物的平均蛋白水平(专门为ELISA化验法测定)健康人与卵巢癌病例的血清中平均蛋白质水平比较
Leptin(ng/ml) prolactin(ng/ml) OPN(ng/ml)   10IGF-II(ng/ml)
  正常范围健康卵巢癌   [7-50]123   [0-25]140   [0-19]1149   [450-2500]716350
如以上通过ELISA分析决定的，瘦素预先确定的标准为7-50ng/ml；催乳素预先确定的标准为0-10pg/ml；骨质素的预先确定标准为0.5-19pg/ml；胰岛素样生长因子-II的预先确定标准为450-2500ng/ml；本领域中的技术人员应知道一种生物标志物的预先确定浓度标准会在一次次的试验中根据不同的因素而改变。
在由206个血清样品组成的盲检试验中最后一组的四种生物标志物(瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II)被选出作化验，这206个样品中包括106个健康人和100个I-IV期癌症病例.在盲检试验中使用的病例的特点如图5所描述。这四个生物标志物的表达通过ELISA分析法测定。
                表5
  参与盲检试验的病人病状和年龄
  隐蔽组(n＝206) 平均年龄
  健康女性
  健康高风险   6640   58.457.6
  患卵巢癌的女性
  I/II期   24   59.5
  III/IV期   76   63
通过统计群组分析来区分卵巢癌和健康人。虽然使用传统的二进位数据组分析(图4)，该四个标志物中没有一个能够独立地区分正常的和癌症的群组，但该四个标志的成对比较显示能更好的将这些组的病例(图5)区分开。
该四种生物标志物的组合数据用四个不同的分类模式进行分析：向量支持模式(SVM)，K值临近分类模式(k-NN)，树枝分类分析模式，和基于分值的分类系统，从而可将健康人样品和卵巢癌病例样品进行分类。向量支持模式，K值临近分类模式，树枝分类分析模式为分等级的群组分析模式。
图6显示基于分值分析的结果。尤其是，图6显示出赋予206个参与筛选化验阶段的病例的分数。这些分数是按如下方法分配的：对每一个标志，找到能最大程度缩小被错误分类的病例数目的最佳分裂点。最佳分裂点将样品分为两个区间：一个是针对健康人的，另一个针对癌症病例。如果一个病例的相关观察落入正常区间，则被赋予0分值；否则，被赋予1分值。表6显示上述该四种生物标志物中每一个的分裂点。总得说来，单个个体被赋予的分值为四种不同的标志物所赋予分值的总和。这样，在此例中的分数范围应为[0，4]。图6说明那些分数值大于或等于2的病例很可能为癌症；分数值小于或等于1的病例很可能是健康人。
                          表6
  生物标志物的计分标准
  生物标志物   分裂点   左区间   右区间
  瘦素(1)催乳素(2)骨质素(3)胰岛素样生长因子-II(4)   2.5ng/ml10pg/ml21pg/ml491pg/ml   癌症(1)正常(0)正常(0)癌症(1)   正常(0)癌症(1)癌症(1)正常(0)
表7显示出所有基于四种考虑到的分类方法进行10倍交叉效性分类的结果。结果显示所有分类方法都可以很好的区别正常和癌症群组。所建议的基于分值的分类方法要优于界近分类和树枝分类分析方法。从分值方法中得出的结果可以和向量支持模式算出的结果相比。试验的灵敏度为96％，特异性为97％，阳性预测值(PPV)为97％和阴性预测值(NPV)为96％。此化验中的“灵敏度”指试验将在患卵巢癌的个体中产生肯定结果的概率。此化验中的“特异性”指试验将在没患卵巢癌的个人中产生否定结果的概率。化验中的“阳性预测值”(PPV)是真正的肯定结果(也就是对于患卵巢癌病人的肯定化验结果)相对于所有肯定结果(也就是，对于患有卵巢癌的病人的肯定化验结果+没患有卵巢癌的病人的肯定化验结果)的比例。
                 表7
  10倍交叉效性分类结果
  分类方法   错误的肯定   错误的否定
  SVMTREEk-NN数值   3/10610/1066/1066/106   4/1007/10010/1004/100
最后，对40个样品使用上述的基于分值的分类分析作一个额外的盲检试验确认。此方法能够准确的从40个病例中区分出38例患有或没患卵巢癌的病例。(一个样品被区分为错误的阳性而另一个样品被区分为错误的阴性)。
表8总结了I期和II期卵巢癌病例中这里所确定的四种生物标志物(瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II)和癌抗原CA125的水平，这些病例参与了上述(阶段IV和V)筛选化验并经所述ELISA分析法测定。(这些黑体或斜体字的病人参与了这里所述的阶段V的筛选试验)
                                表8
  I期和II期卵巢癌病例的生物标志物表达水平
  病人编号 样品描述 Leptin Prolactin OPN IGF-II CA125
1期
  C4C69C113C114C115C169   I期卵巢癌I期卵巢癌I期卵巢癌IA期卵巢癌IA期卵巢癌IA期卵巢癌   110.29201   45357024391   102332223938   547484475319555821   14ND6ND53.815
  II期
  C6C8C9C16C19C24C328C48C59C62C63C70C71C77C89C102C103C117C120C135C165   II期卵巢癌IIA期卵巢癌IIC期卵巢癌IIC期卵巢癌IIC期卵巢癌IIC期卵巢癌IIC期卵巢癌II期卵巢癌IIA/C期卵巢癌IIC期卵巢癌IIC期卵巢癌IIC期卵巢癌II期卵巢癌IIB期卵巢癌IIA期卵巢癌IIC期卵巢癌II期卵巢癌IIL期卵巢癌IIC期卵巢癌IIC期卵巢癌II期卵巢癌   113312011010.2310512990009   633081361037483712358184287716127119577850   38284010686211042162340212178113325148412927   638513553381193364302894421484553543303230431634371260124501576   51.257.39811512297712557.3ND981119ND99.240546.963499173273
例1中所用的材料和方法
微阵列芯片的生产：微阵列芯片根据Schweitzer等人的方法制备《Nat Biotech》(2002)20：359。简言之，清洁玻璃玻片后，进行趋化处理。玻片配备一个特富龙模具，它可以将玻片分成16个直径为0.65cm的孔或叫做子微阵的环状分析点(图2)。用珀金埃尔默点样仪器有限公司的点样机进行点样，在每一个分析点点上一滴抗体(～350pL)；浓度为0.5mg/ml。每一微阵列芯片上的排列组，进行16次的重复(见表1)。一组抗体在一个亚阵列中重复四组。点样后，用光学显微镜观察芯片。如果观察到失误点的百分比大于5％，那么这一批点样的芯片作废。用一组合格的试剂以两种方法对微阵列芯片进行校正。第一，用1-3种细胞因子制备强信号的混合液，加样至芯片的14个微孔中，另外两个微孔作为空白对照。该芯片试验产生的信号与某阵列的位置图作比较。第二，采用已知的样品阵列对某一种阵列的所有分析物作质控滴定。正常人的血清和肝素化血浆纯排列或呈带纯的重组体细胞活素的峰形代表阵列的所有分析物。再从一个玻片的子阵沿每个非峰形的控制样品的两列子阵向下滴定峰形混合物，直到从峰形细胞活素的9000pg/m变到37pg/ml。量化该数据，对每一个阵列的分析物产生一滴定曲线，由此检查浓度在检验强度行为中的功能。综合在一起，此数据被用于确定阵列特点和试剂组的活动。
RCA微阵列免疫分析法：在化验前，玻片在室温的储存室的密封容器中移出并在湿度控制室(45-55％)内打开。玻片用Seablock(皮尔思化学公司)封闭，在潮湿的室内用磷酸缓冲液以1∶1的比例在37摄氏度下稀释Seablock液约1小时。在移开封闭液后，在加样前用1xPBS/0.5％Brij35清洗两次。每个样品玻片包含四种控制物，其特性浓度与完全滴定曲线的四个固位凹点相对应。测试样品在剩下的12个子阵中进行化验。然后将20μL经处理的样品加到每个子阵中。前面已经描述RCA信号放大分析方法，并且我们使用标准操作程序。玻片用LS200扫描仪(TECAN)进行扫描。用专有的软件对扫描的图像进行分析。分析对每一个特性和样品的微阵列点的荧光强度，最终决定平均强度值。检测被选出的细胞因子的剂量-反应曲线，确保特性强度在基线以上，所展现的强度随分析物的浓度增大而增大。
RCA微阵列免疫分析测定法测定的病例数：从86个病例中获取的血清用于RCA微阵列免疫分析测定法的化验。86例中，有28例为健康人，其平均年龄为60.8岁，有58例为III/IV期的卵巢癌病例，其平均年龄为57.1。在这58例III/IV期的卵巢癌病人中，有18个为新诊断的病例，其余40例为复发病例。
盲检测定病例数：对于ELISA测定组，从100个卵巢癌症病例和106个健康/无病或高风险病例(作为耶鲁大学纽黑文医院早期检测项目(HIC10425)的一部分)中抽取血清样品。正常组由66个健康/无病病例(包括28个送去化验的健康人样品)和40个考虑为高风险的女性病例组成。100个卵巢癌病人中，24名女性被诊断为I/II期的，76名女性被诊断为III/IV期的上皮卵巢癌。该组包括18例新诊断的卵巢肿瘤样品。从健康/无病的病例组抽取的血清样品被作为肿瘤发生基准值或“正常范围”值。
血清收集：收集10ml的血，用1500转/分的转速离心分离10分钟，血清被储藏于摄氏-80度的妇产科组织库中备用。血样的收集，准备和储藏要根据NCI样品储备委员会设定的使用守则来做。经允许参与这次试验的人员都是合格的技术人员。在分析前，血清被解冻一次，分成8份(25-50ul)并储存于摄氏-80度，避免不必要的冰冻和解冻。
ELISA分析：瘦素，催乳素和胰岛素样生长因子-II试剂盒从“诊断系统实验室公司”(德克萨斯州，韦伯斯特)购买，骨质素(Osteopontin)从“分析设计公司”(美国，密歇根州，安阿伯市)购买。化验按照试剂说明进行，结果从“Spectra Max M2”微板阅读器读出，该阅读器调至405nM双波长并根据每个化验做适当校正。三种分类模式：向量支持模式，K值临近分类模式，树枝分类分析模式用于分析结果(从卵巢癌症病人中区别出健康人/患病者/无病者)。
统计分析：变量分析(ANOVA)用于测试通过RCA微阵列免疫分析测定法测定的蛋白质在健康人和卵巢癌病例中不同表达的差异程度，这是通过使用SAS的GLM步骤。报告的有效尺寸测出两组均值之间的差别，使两组之间的标准偏差常态化，其与样品大小无关：
有效尺寸＝(组1平均值-组2平均值)/组1和组2标准值
有效尺寸直接关系到对一个特定变量的预测能力。表9表明了有效尺寸(列1)到可能性(列2)的转变。表9所列的样品目的在于体现有效尺寸和预测能力的关系。例如，对于两组间观察出0.3的有效尺寸，正确识别该组的可能性为0.56。如果有效尺寸为1，可能性将增加到0.69。
                  表9
  作为测量预测能力的有效尺寸
  有效尺寸   基于蛋白质表达的正确配组的可能性
  00.10.20.30.40.50.60.70.8   0.50.520.540.560.580.60.620.640.66
  0.911.21.41.61.822.53   0.670.690.730.760.790.820.840.890.93
为了区别正常/高风险和卵巢癌病人，对从病人血清中获得的四种蛋白质标志物表达进行统计簇分析。三种常用的分类方法为：向量支持模式、K值临近分类模式、和树枝分类分析模式(海斯特等人，2001)。我们采用10倍交叉效性来评估分类准确性。
除了这三种分类方法外，我们还采用更多用于生物解析的基于分值的分类方法。基于分值的分类系统操作如下：(i)对于每一个标志，找出能最大程度减小错误分类的最佳分裂点。分裂点定义了两个区间：一个用于正常和其他癌症病例。如果一个病例的相关观察落入正常区间则赋予0分；否则赋予1分。(ii)总得来说，一个病例赋予的分值为m种不同标志分值的总和。因此，这样的分数范围在0-m之间。(iii)一个给定的端值t用于预测一个给定的病例的疾病状态，如，一个给定的病例其总分等于或小于t则预测为正常状态，而一个分数高于t的病例则诊断为有疾病。
与上述分数基础的分类系统有关的上述“分裂点”的确定如下：假设将n个样品分类为两组。对于每一个标志X，令x_1，x_2，……，x_n为所观察的尺寸。我们筛选(n-1)个分裂点y_1，y_2，……，y(n-1)，其中，y_k＝0.5*(x_k+x_(k+1))，其中k＝1，2，……，n-1。对于每个分裂点y_k，有a_1和a_2的观察尺寸分别小于第一组和第二组中的y_k；有b_1和b_2的观察尺寸分别大于第一组和第二组中的y_k。如果y_k的左右两边分别分配给第一组和第二组，那么a_2和b_1为错误分类样品。如果y_k的左右两边分别配给第二组和第一组，那么a_1和b_2为错误分类样品。我们选择能最大程度缩小错误分类样品数目的分配方案。
讨论
卵巢癌是一种“相对安静”的腹内疾病，因此非入侵式方法，如血清肿瘤标志分析是监测和早期检测卵巢癌的绝佳方法。我们需要一种简单、可靠、可重复、快速并有足够灵敏度的检测策略，来提高准确检测恶化前的卵巢变化或高风险人群中早期卵巢癌发生的能力。有人指出，为了能被接受，任何一种早期检测的筛选方法必须达到至少99.6％的准确率。为此，我们需要一种组合式的检测方案，因为任何单一癌症标志物的测试不可能达到那样的准确率。事实上，即使卵巢癌发生率不高，如果生物标志物筛选测试作为唯一的分类方法，那么即使很低的假阳性率也会导致大量的女性被错误分类成可能患有卵巢癌的病人。我们认为先进行多分析物的结合血清筛选，而后进行阴道超声波检测和乳房造影术或乳房成像术，就足以达到足够低的假阳性率，来确定个体是否需要应用腹腔镜手术来验证诊断化验的结果。许多研究结果也支持这种方法，例如，结合CA125和阴道超声波检测就能检测出显著比例的临床前卵巢癌。
我们确定血清标志物的方法是在筛选多种血清蛋白的策略基础上，应用高产量的微阵列分析法，确定潜在的能准确区别健康或高风险人群和癌症人群、并能灵敏检测出早期I/II阶段卵巢癌的生物标志物。在微阵列分析结果的基础上，用ELISA方法检测出潜在的生物标志物亚群做进一步分析。从微阵列数据基础上选出的其中四种生物标志物被证实可用于早期检测并且使用ELISA化验法检测具有高的敏感性和特征性。如果寻找到了高敏感性和特异性的生物标志物，对其初步的确认并不需要许多的分析。一旦确立了有关技术人员的ELISA分析的质量控制体系后，生物标志物就可在分析15-20例正常人和患者样品后进行排除。确定敏感性、特征性、分裂点和组合策略则要对大量的数据进行数理统计。在确定了生物标志物是否能够继续用于组合化验及其分裂点后，生物标志物的组合方式则通过统计确定。使用分裂点，每个生物标志物被赋予一个二进制结果(正常对非正常水平)。被归为非正常水平的生物标志物的数量用于确定某个体是否患有癌症；这种情况下，带三个或四个非正常水平生物标志物的个体被确定为患有卵巢癌而带两个或以下非正常水平生物标志物的病例被确定为未患卵巢癌。单个生物标志物作为分析物也许敏感性和特异性不够，诊断测试需要多个生物标志物的组合。
例2利用卵巢癌病人中确定的生物标志物诊断乳癌和结肠癌
对某些样品进行分析以确定上面确定的生物标志物(瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II)在其他类型的癌症中是否有不同的表达。其结果在表9中显示，显示上面确定的生物标志物可以被用来诊断其他类型的癌症，包括乳癌和结肠癌。
如表10所示，根据两个或以上生物标志物与预定标准比较所显示的不同表达可将与癌症病例对应的样品从健康人的样品中区分开来。表10中，在所述生物标志物预定标准以外的表达水平用斜体和黑体标出。
                                   表10
  乳癌和结肠癌的瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II的表达分析
  病人编码 样品描述   Leptin(ng/ml)   Prolactin(pg/ml)   OPN(pg/ml)   IGF-II(ng/ml) CA125
  乳癌
  C51C57C66C92C29   乳癌I期2000.2.08，42岁纤维囊性乳房块(无乳癌)间皮囊肿块/乳房癌(导管的)2001/Tamox法乳癌I期2000.2.08，42岁乳癌IV期   33051   15078119   2631233830   540770460780250   ND8.3NDNDND
  结肠癌
  C107C52   结肠癌IV期/OVCA结肠癌III期从/OV囊肿   06   1651   21636   440592   NDND
参考文献：所有这里引用的出版物都应以它们的整体合并参考来更全面的描述此技术，其中应用属于此技术。
相应技术：本领域中的专业人员只是使用常规试验就能认可或能够确定许多与本发明的实施例相当的技术。这些技术包含在下列请求项中。

Claims (58)

1、一种用于癌症诊断或辅助诊断的方法，该方法包括，将一个病例样品中的一个或多个生物标志物的表达与所述一个或多个生物标志物的预定标准一一进行比较；
其中，所述一个或多个生物标志物是从以下组中选出的：次级淋巴组织趋化因子、血管紧张素转换酶、脑源性神经营养因子、癌抗原CA125、血管内皮细胞-白细胞黏附分子、表皮生长因子、骨髓前体抑制因子、表皮生长因子受体1、卵泡调节因子、肝癌因子4、疱疹病毒入侵调节蛋白、胰岛素样生长因子-II、胰岛素样生长因子结合蛋白-I、白细胞介素-17、白细胞介素-1可溶性受体II、白细胞介素-2可溶受体a、瘦素、巨噬细胞集落刺激因子受体-R、巨噬细胞迁移抑制因子、巨噬细胞炎性蛋白1a、巨噬细胞炎性蛋白3b、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-7、髓样造血细胞抑制因子-1、骨质素、P53复合体蛋白PARC、血小板生长因子Rb、催乳素、蛋白C、转化生长因子-b RIII、肿瘤坏死因子受体-1、肿瘤坏死因子-a、血管黏附蛋白、血管内皮生长因子受体2和血管内皮生长因子受体3；并且当所述样品中所述的一个或多个生物标志物的表达与该一个或多个生物标志物的预定标准一一比较具有明显的区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
2、根据权利要求1所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述预定标准对应为：(a)所述生物标志物在健康人中的表达水平，或(b)所述生物标志物在同一病例的非癌组织中的表达水平。
3、根据权利要求1所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述方法包括，比较两个或以上生物标志物的表达，其中癌症的诊断是基于分值的分类方法。
4、根据权利要求3所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述方法包括，比较m种不同生物标志物的表达；其中，每个生物标志物被赋予0或1分，如果所述生物标志物的表达与其预定标准表达无明显区别，则给该生物标志物赋予0分；其中如果所述生物标志物的表达与其预定标准表达有明显区别，则给该生物标志物赋予1分；其中病例被赋予与m个不同生物标志物所赋予分数的总和相等的全部分数；其中一个给定的端值t用于癌症的诊断或辅助诊断。
5、根据权利要求1所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述方法包括将两个或以上生物标志物的表达进行比较，其中，癌症的诊断是通过将所述的两个或以上生物标志物的表达形式与所述生物标志物的预定标准形式进行比较而得出的，其中表达形式不同即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
6、根据权利要求5所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述预定标准的形式是通过使用机械阅读技术将所述两个或以上生物标志物在癌症患者与健康人中的表达进行比较而决定的。
7、根据权利要求4所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述预定标准的形式是通过使用向量支持模式、K值临近分类模式，或者树枝分类分析模式将所述两个或以上生物标志物在癌症患者与健康人中的表达进行比较而确定的。
8、根据权利要求1所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述癌症为卵巢癌。
9、根据权利要求8所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：还包括检测卵巢癌的附加生物标志物。
10、根据权利要求9所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述卵巢癌的附加生物标志物从以下组中选出：人类角质激肽释放酶，激肽释放酶4，激肽释放酶5，激肽释放酶6，激肽释放酶8，激肽释放酶9，激肽释放酶10，癌抗原CA125，癌抗原15-3，癌抗原19-9，肿瘤抗原OVX1，溶血磷脂酸，癌胚抗原，巨噬细胞集落刺激因子，丝氨酸蛋白水解酶，癌抗原54-61，癌抗原72，肿瘤抗原HMFG2，白细胞介素-6，白细胞介素-10，脂质结合唾液酸，肿瘤抗原NB70K，碱性磷酸酶同工酶，结肠癌抗原，肿瘤坏死因子，组织纤维蛋白溶酶激活剂，肿瘤抗原UGTF，肿瘤抗原HE4，基质金属蛋白酶2，肿瘤抗原Tetranectin，抑制素，肿瘤抗原Mesothelyn，肿瘤抗原MUC1，表皮生长因子，肿瘤抗原CLDN3，肿瘤抗原NOTCH3，肿瘤抗原E2F3，肿瘤抗原RACGAP1，肿瘤抗原HN1，阿朴脂蛋白A1，层粘连蛋白，肿瘤抗原claudin 3，肿瘤抗原claudin 4，肿瘤相关钙信号传导子-1，肿瘤相关钙信号传导子-2，肿瘤抗原Ladinin 1，肿瘤抗原S100A2，肿瘤抗原PAI-2，肿瘤抗原CD24。肿瘤抗原Lipocalin 2，肿瘤抗原TADG-15，肿瘤抗原Stratifin，转移生长因子-β受体III，血小板生长受体α，肿瘤抗原SEMACAP3，肿瘤抗原ARHI，凝血蛋白2，肿瘤抗原Dab2/DOC2，结合珠球蛋白-α亚单位。
11、根据权利要求10所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述卵巢癌的附加生物标志物为癌抗原CA125。
12、根据权利要求1所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述癌症为乳癌。
13、根据权利要求1所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述癌症为结肠癌。
14、根据权利要求1所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述一个或多个生物标志物为催乳素和/或骨质素，其中所述生物标志物的表达与预定标准比较有所增长即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
15、根据权利要求1所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述一个或多个生物标志物为瘦素和/或胰岛素样生长因子-II，其中所述生物标志物的表达与预定标准比较有所减少即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
16、根据权利要求1所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：比较两个或以上生物标志物的表达。
17、根据权利要求16所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述两个或以上的生物标志物从以下组中挑选出来：催乳素，巨噬细胞迁移抑制因子，骨质素，胰岛素样生长因子-II，血管内皮细胞-白细胞黏附分子，瘦素，表皮生长因子，白细胞介素-17，髓样造血细胞抑制因子-1，以及白细胞介素2可溶受体a。
18、根据权利要求16所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述两个或以上生物标志物是从瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II中选出。
19、根据权利要求16所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述两个或以上生物标志物中的至少两个在表达上具有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
20、根据权利要求1所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：比较三个或以上生物标志物的表达。
21、根据权利要求20所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述三个或以上生物标志物是从瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II中选出。
22、根据权利要求20所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述三个或以上生物标志物中的至少两个在表达上具有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
23、根据权利要求1所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述方法包括比较四个或以上生物标志物的表达。
24、根据权利要求23所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述四个或以上生物标志物包括瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子II。
25、根据权利要求23所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述四个或以上生物标志物中的至少两个在表达上具有明显区别即可作出癌症的诊断或辅助诊断。
26、根据权利要求1所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：用检测所述一个或多个生物标志物的试剂来检测该生物标志物的表达。
27、根据权利要求26所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述试剂是对所述一个或多个生物标志物特效的抗体或片段。
28、根据权利要求27所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述试剂使用一种可见物质直接或间接标记。
29、根据权利要求1所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述一个或多个生物标志物的表达是用质谱分析进行检测的。
30、根据权利要求1所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述一个或多个生物标志物的表达是通过测量对所述一个或多个生物标志物进行编码的信使RNA转录水平来检测的。
31、根据权利要求1所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述样品为体液样品。
32、根据权利要求31所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述体液样品为血液或血清。
33、根据权利要求1所述用于癌症诊断或辅助诊断的方法，其特征在于：所述一个或多个生物标志物是用如下方法来检测的：(a)检测由所述一个或多个生物标志物控制的多肽的表达；(b)检测控制所述生物标志物的多肽的表达；或(c)检测所述生物标志物的代谢物的表达。
34、一种监测病例的癌症发展进度的方法，该方法包括将一个病例样本中的一个或多个生物标志物的表达与在后来的时间点中从该病例中获得的样本的该一个或多个生物标志物的表达进行比较；
其中，所述一个或多个生物标志物是从以下组中挑选出来的：次级淋巴组织趋化因子、血管紧张素转换酶、脑源性神经营养因子、癌抗原CA125、血管内皮细胞-白细胞黏附分子、表皮生长因子、骨髓前体抑制因子、表皮生长因子受体1、卵泡调节因子、肝癌因子4、疱疹病毒入侵调节蛋白、胰岛素样生长因子-II、胰岛素样生长因子结合蛋白-I、白细胞介素-17、白细胞介素-1可溶性受体II、白细胞介素-2可溶受体a、瘦素、巨噬细胞集落刺激因子受体-R、巨噬细胞迁移抑制因子、巨噬细胞炎性蛋白1a、巨噬细胞炎性蛋白3b、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-7、髓样造血细胞抑制因子-1、骨质素、P53复合体蛋白PARC、血小板生长因子Rb、催乳素、蛋白C、转化生长因子-b RIII、肿瘤坏死因子受体-1、肿瘤坏死因子-a、血管黏附蛋白、血管内皮生长因子受体2和血管内皮生长因子受体3；
其中，所述一个或多个生物标志物的表达不同即可对病例的癌症发展进度作出诊断或辅助诊断。
35、根据权利要求34所述监测病例的癌症发展进度的方法，其特征在于：比较两个或以上生物标志物的表达。
36、根据权利要求35所述监测病例的癌症发展进度的方法，其特征在于：所述两个或以上生物标志物是从以下组中选出的：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
37、根据权利要求34所述监测病例的癌症发展进度的方法，其特征在于：比较三个或以上生物标志物的表达。
38、根据权利要求34所述监测病例的癌症发展进度的方法，其特征在于：比较四个或以上生物标志物的表达。
39、根据权利要求38所述监测病例的癌症发展进度的方法，其特征在于：所述四个或以上生物标志物包括瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
40、一种监测癌症治疗效果的方法，该方法包括：将接受至少一部分治疗之前的病例样本中的一个或多个生物标志物的表达与已经接受至少一部分治疗的该病例样本中的所述一个或多个生物标志物的表达进行比较；
其中所述的一个或多个生物标志物是从以下组中挑选出来的：次级淋巴组织趋化因子、血管紧张素转换酶、脑源性神经营养因子、癌抗原CA125、血管内皮细胞-白细胞黏附分子、表皮生长因子、骨髓前体抑制因子、表皮生长因子受体1、卵泡调节因子、肝癌因子4、疱疹病毒入侵调节蛋白、胰岛素样生长因子-II、胰岛素样生长因子结合蛋白-I、白细胞介素-17、白细胞介素-1可溶性受体II、白细胞介素-2可溶受体a、瘦素、巨噬细胞集落刺激因子受体-R、巨噬细胞迁移抑制因子、巨噬细胞炎性蛋白1a、巨噬细胞炎性蛋白3b、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-7、髓样造血细胞抑制因子-1、骨质素、P53复合体蛋白PARC、血小板生长因子Rb、催乳素、蛋白C、转化生长因子-b RIII、肿瘤坏死因子受体-1、肿瘤坏死因子-a、血管黏附蛋白、血管内皮生长因子受体2和血管内皮生长因子受体3；其中，所述一个或多个生物标志物的表达不同即可作出治疗效果的诊断或辅助诊断。
41、根据权利要求40所述的监测癌症治疗效果的方法，其特征在于：比较两个或以上生物标志物的表达。
42、根据权利要求41所述的监测癌症治疗效果的方法，其特征在于：所述两个或以上生物标志物是从以下组中选出的：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
43、根据权利要求40所述的监测癌症治疗效果的方法，其特征在于：比较三个或以上生物标志物的表达。
44、根据权利要求40所述的监测癌症治疗效果的方法，其特征在于：比较四个或以上生物标志物的表达。
45、根据权利要求44所述的监测癌症治疗效果的方法，其特征在于：所述四个或以上生物标志物包括：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
46、一种用于诊断癌症的试剂盒，该试剂盒包括：
(a)一个接收样本的容器；
(b)用于检测一个或多个生物标志物的一个或多个试剂，所述生物标志物从以下组中挑选出来：次级淋巴组织趋化因子、血管紧张素转换酶、脑源性神经营养因子、癌抗原CA125、血管内皮细胞-白细胞黏附分子、表皮生长因子、骨髓前体抑制因子、表皮生长因子受体1、卵泡调节因子、肝癌因子4、疱疹病毒入侵调节蛋白、胰岛素样生长因子-II、胰岛素样生长因子结合蛋白-I、白细胞介素-17、白细胞介素-1可溶性受体II、白细胞介素-2可溶受体a、瘦素、巨噬细胞集落刺激因子受体-R、巨噬细胞迁移抑制因子、巨噬细胞炎性蛋白1a、巨噬细胞炎性蛋白3b、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-7、髓样造血细胞抑制因子-1、骨质素、P53复合体蛋白PARC、血小板生长因子Rb、催乳素、蛋白C、转化生长因子-b RIII、肿瘤坏死因子受体-1、肿瘤坏死因子-a、血管黏附蛋白、血管内皮生长因子受体2和血管内皮生长因子受体3；
(c)一个参考样本。
47、根据权利要求46所述试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于检测瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II的一个或多个试剂。
48、根据权利要求46所述试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于检测两个或以上生物标志物的一个或多个试剂。
49、根据权利要求48所述试剂盒，其特征在于：所述两个或以上的生物标志物是从以下组中选出的：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
50、一种筛选对治疗癌症有用的候选化合物的方法，其包括：
(a)确定一个控制一个或以上生物标志物的表达的候选化合物，所述生物标志物从以下组中挑选出来：次级淋巴组织趋化因子、血管紧张素转换酶、脑源性神经营养因子、癌抗原CA125、血管内皮细胞-白细胞黏附分子、表皮生长因子、骨髓前体抑制因子、表皮生长因子受体1、卵泡调节因子、肝癌因子4、疱疹病毒入侵调节蛋白、胰岛素样生长因子-II、胰岛素样生长因子结合蛋白-I、白细胞介素-17、白细胞介素-1可溶性受体II、白细胞介素-2可溶受体a、瘦素、巨噬细胞集落刺激因子受体-R、巨噬细胞迁移抑制因子、巨噬细胞炎性蛋白1a、巨噬细胞炎性蛋白3b、基质金属蛋白酶-8、基质金属蛋白酶-7、髓样造血细胞抑制因子-1、骨质素、P53复合体蛋白PARC、血小板生长因子Rb、催乳素、蛋白C、转化生长因子-b RIII、肿瘤坏死因子受体-1、肿瘤坏死因子-a、血管黏附蛋白、血管内皮生长因子受体2和血管内皮生长因子受体3；以及
(b)确定这样的候选化合物是否对治疗癌症有效。
51、根据权利要求50所述的筛选对治疗癌症有用的候选化合物的方法，其特征在于：该方法包括确定一个控制两个或以上生物标志物表达的候选化合物。
52、根据权利要求51所述的筛选对治疗癌症有用的候选化合物的方法，其特征在于：所述两个或以上的生物标志物是从以下组中选出的：瘦素，催乳素，骨质素和胰岛素样生长因子-II。
53、一种筛选候选癌症生物标志物的方法，该方法包括：
(a)确定一组与癌症有潜在联系的生物标志物；
(b)比较在步骤(a)中所确定的生物标志物在首批癌症病例和健康人中的表达水平；
(c)选择在首批癌症病例中其表达显示出明显区别的生物标志物；
(d)在第二批癌症病例和健康人中比较在步骤(c)中确定的生物标志物的表达水平；以及
(e)选择在第二批癌症病例中其表达显示出明显区别的生物标志物；
其中步骤(e)中确定的生物标志物就是候选癌症生物标志物。
54、根据权利要求53所述的筛选候选癌症生物标志物的方法，其特征在于：所述首批癌症病例为新诊断的癌症，所述第二批癌症病例为复发的癌症。
55、根据权利要求53所述的筛选候选癌症生物标志物的方法，其特征在于：所述首批癌症病例为晚期癌症而第二批癌症病例为早期癌症；或者，所述首批癌症病例为早期癌症而第二批癌症病例为晚期癌症。
56、根据权利要求53所述的筛选候选癌症生物标志物的方法，其特征在于，该方法还包括：
(f)在第三批癌症病例和健康人中比较在步骤(e)中确定的生物标志物的表达水平，其中所述生物标志物的表达使用一种不同的化验模式进行检测；以及
(g)选择在第三批癌症病例中其表达显示出明显区别的生物标志物；
其中在步骤(g)中确定的生物标志物为候选癌症生物标志物。
57、根据权利要求53所述的筛选候选癌症生物标志物的方法，其特征在于，还包括：确定在步骤(e)中确定的生物标志物在盲检中能否区分癌症病例和健康人。
58、根据权利要求56所述的筛选候选癌症生物标志物的方法，其特征在于，还包括：确定在步骤(g)中确定的生物标志物在盲检中能否区分癌症病例和健康人。
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