JP4256265B2

JP4256265B2 - 循環腫瘍細胞の検出および／または定量方法、およびその方法の早期診断、予後診断、および再発診断への使用、ならびにその方法の治療的処置の選択および評価への使用

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Publication number: JP4256265B2
Application number: JP2003575115A
Authority: JP
Inventors: ジャン−ピエール・ヴァンドレル; カトリーヌ・パナビエール; ジェナヴィエーブ・ショケ−カスティレフスキー; ミシェル・ジョリヴェ
Original assignee: ベーイーオー・メリュー; サントル・オスピタリエ・ウニヴェルシテール・ドゥ・モンペリエ・ラボラトワール・ドゥ・ヴィロロギー・ドゥ・ロピタル・ラペイロニ
Priority date: 2002-03-13
Filing date: 2003-03-13
Publication date: 2009-04-22
Anticipated expiration: 2023-03-13
Also published as: WO2003076942A2; ATE331958T1; DE60306517D1; WO2003076942A3; AU2003242815A8; JP2005527793A; DE60306517T2; EP1506407A2; EP1506407B1; AU2003242815A1; ES2268387T3; US20050079557A1

Description

本発明は、癌腫学における生物学的診断の分野に関する。より詳細には、本発明は、1種または複数の腫瘍マーカーを、in vitroで放出または分泌することができる循環腫瘍細胞の検出および/または定量方法に関し、またこの方法を、固形癌に関する病態早期診断および予後診断、治療的処置の選択および有効性の評価、および再発診断に使用することに関する。

現在の癌の診断は、乳癌の場合、乳房触診などの臨床的診断、および/または乳房撮影またはスキャンなどの臨床的基礎検査からなり、確認を生検または外科的介入などの組織学的分析によって行っている。

癌の早期の臨床的診断または臨床的基礎診断は、特に癌領域に解剖学的に到達できないため難しい。その結果、多くの腫瘍が末期になって初めて検出されるのが一般的である。

領域が解剖学的にアクセス可能である場合にも、同様の問題に直面する。たとえば、乳癌の場合、乳房撮影の際に腫瘍が検出されても、多くは平均で8年間無症状で進行している。

現時点では、独自に癌の診断ができる生物学的診断方法は皆無であるか、あっても少数である。

現在開発されている生物学的診断方法では、たとえば、ある種の癌マーカーを分析することによって、既に診断された癌の進行をモニターすることが可能かまたは、再発についてスクリーニングが可能である。したがって、血清マーカーまたは尿中のマーカーが当業者に既知の技法で分析されている。

一方、循環腫瘍細胞を直接検出しようとする探索研究は、比較的わずかしか行われておらず、常用のテストは存在しない。

循環腫瘍細胞を検出する可能性については、主に2つの診断法、すなわち、フローサイトメトリーおよび逆転写反応を伴うポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCT)により研究されてきた(Racila E.、Euhus D.、Weiss A.、Rao C.、McConnell J.、Terstappen L.、Uhr J.、「Detection and characterization of carcinoma cells in the blood」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:4589-4594(1998)、Ghossein R.、Bhattacharya S.、Rosai J.「Molecular detection of micrometastase and circulating tumor cells in solid tumors.」Clin.Cancer 5、1950-1960(1999)およびMoss,T.J.、1991、N.Engl.J.Med.、324、219-226。これら2つの方法によって、乳癌および前立腺癌に罹患している患者において、血液または骨髄の細胞中で循環腫瘍細胞を検出することが可能となってきた。

しかし、これら2つの方法には欠点がある。すなわち、これらの方法はどちらも、固形腫瘍由来の希少な循環細胞を定量できない。加えて、この技法はPCRで偽陽性となる可能性があり、感度と特異性を欠く。その結果、腫瘍細胞の存在を確認するためには、通常は腫瘍組織が必要となる。

E.Racilaら(1998、上記)が、血液中の乳癌および前立腺癌細胞の検出および特性決定する方法を記載しており、本方法では、上皮細胞の免疫磁気濃縮法とフローサイトメトリーを併用し、反応が陽性の場合に、免疫化学分析を行う。この免疫化学分析は、腫瘍マーカー(抗サイトケラチン5、6、8および18抗体)と結合した酵素の発色の検出をベースとしている。このテストは、癌マーカーに特異的な一次抗体、ウサギの二次イムノグロブリン、抗アルカリホスファターゼマウスイムノグロブリン、アルカリホスファターゼおよびその対応基質を必要とする。

上記方法は下記欠点を有する。
- 特定の高価な設備を必要とし（特に、フローサイトメトリー分析のために）、
- 2種の分析、すなわちフローサイトメトリー分析と、その後の免疫細胞化学分析を必要とし、
- 感度を欠く。

さらに、上記記載の方法はどれも、循環細胞の生存性およびその生存可能性を決定できない。

F.Cordoba et al.(2000、British Journal of Haematology、108、549-558)が、骨髄腫細胞がイムノグロブリンを分泌するというその既知の性質を利用して、多発性骨髄腫に罹患している患者由来の骨髄腫細胞を検出する方法を記載している。この骨髄腫細胞は、通常血液中に存在し、イムノグロブリンを分泌するBリンパ球に由来する。
Racila E.、Euhus D.、Weiss A.、Rao C.、McConnell J.、Terstappen L.、Uhr J.、「Detection and characterization of carcinoma cells in the blood」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:4589-4594(1998) Ghossein R.、Bhattacharya S.、Rosai J.「Molecular detection of micrometastase and circulating tumor cells in solid tumors.」Clin.Cancer 5、1950-1960(1999) Moss,T.J.、1991、N.Engl.J.Med.、324、219-226 F.Cordoba et al.、2000、British Journal of Haematology、108、549-558 フランス特許出願第98/10084号国際公開A-95/0800 J.Histochem.Cytochem.45:481-491、1997年 Garcia,M.、Capony,F.、Derocq,D.、Simon,D.、Pau,B.& Rochefort,H.、「Characterization of monoclonal antibodies to the estrogen-regulated Mr 52,000 glycoprotein and their use in MCF7 cells」、Cancer Research 45、709-716(1985) Schonberger J.、Bauer J.、Spruss T、Weber G、Chahoud I、Eilles C、Grimm D.、「Establishment and characterization of the follicular thyroid carcinoma cell line ML-1,and characterization of the follicular thyroid carcinoma cell line ML-1.」、J.M01.Med 2000;78(2):102-10)

驚いたことに本出願人は、固形癌由来の循環腫瘍細胞が、ある種の腫瘍マーカーを放出または分泌し、この分泌を検出することが可能であることを今回見出した。

したがって、本出願人は、この腫瘍マーカーの放出または分泌という具体的な特徴を利用して、固形癌由来の循環腫瘍細胞を検出および/または定量する方法を開発した。本方法は、分析段階がただ1つであり、特殊な材料は何も必要としないという意味で実施が簡単であるということから、上記の欠点を克服している。加えて、この方法は、その感度が非常に高いため、稀少な循環細胞を検出することができ、またこの腫瘍細胞の生存可能性を決定することもできる。したがって、この方法は、残存疾病の診断および探索をする上でも、またこれら循環細胞の生存可能性、つまり攻撃性を評価する上でも、大変有用である。

したがって、本発明の主題は、生物サンプル中の、in vitroで1種または複数の腫瘍マーカーを放出または分泌することができる循環腫瘍細胞を検出および/または定量するための方法であって、
(i)腫瘍マーカーの少なくとも1つの特異的結合パートナーが付着している培養面(culuture surface)の底に、既知量の上記細胞を置く工程と、
(ii)前記細胞が、培養面の底で免疫捕捉される前記腫瘍マーカーを放出または分泌するような条件下で、前記細胞を培養する工程と
(iii)洗浄によって細胞を除去する工程と、
(iv)前記腫瘍マーカーに特異的な、少なくとも1種の標識された複合体を添加する工程と、
(v)このようにして得られた標識を可視化するする工程と
を含む方法である。

したがって、本発明の方法は、固形癌に罹患した患者由来の生物サンプルからの循環している非造血性悪性腫瘍細胞(non-hematopoietic neoplastic cells)の計数を可能にする。

固形癌は当業者には既知である。例としては、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、肝癌、精巣癌、卵巣癌、消化器癌、肺癌などが挙げられる。

循環腫瘍細胞を含んでいる可能性のある生物サンプルは、血液、骨髄、滲出液、ミルク、脳髄液、および尿などの任意の生物流体からなる。

好ましい実施の一形態によると、生物サンプルは、血液または骨髄からなる。

腫瘍マーカーは、ある種の培地条件下、in vivoまたはin vitroで腫瘍細胞が放出または分泌できる、固形癌に特異的なマーカーである。

「腫瘍細胞から放出されるマーカー」という表現は、切断された膜結合性マーカーを意味するものであり、「腫瘍細胞によって分泌されるマーカー」という表現は、この細胞によって直接分泌されるマーカーと、細胞質で切断されて、次いでこの腫瘍細胞によって排出されるマーカーの両方を意味する。

様々な抗原(タンパク質または非タンパク質)をマーカーとして挙げることができる。

好ましい実施形態によると、前記腫瘍マーカーは、培養面の底で切断されることで放出されうる膜結合型抗原か、または培養面の底で前記細胞によって分泌される細胞内抗原のいずれかである。

膜結合型抗原の例として、Muc-1タンパク質が挙げられ、これは、乳癌細胞表面タンパク質であって、CA15-3(carbohydrate 15-3)タンパク質の形に切断される。

分泌型抗原の例として、前立腺癌細胞が産生するPSA、全組織で発現するが、乳癌に関連する癌細胞で過剰発現するリソソームアスパルチルプロテアーゼであるカテプシンDタンパク質(Cath-D)、甲状腺癌に関連する癌細胞が産生するサイログロブリン(TG)、卵巣癌に関連する癌細胞が産生するCA125タンパク質、結腸直腸の癌に関連する癌細胞が産生するACEおよびCA19-9タンパク質、ならびに肝細胞癌に関連する肝細胞が産生するα-フェトプロテイン(AFP)が挙げられる。

本発明の好ましい一実施形態によると、腫瘍細胞は、腫瘍マーカーとしてCA15-3タンパク質を放出することができ、調べられた癌は乳癌である。

本発明の別の好ましい実施形態によると、腫瘍細胞は、腫瘍マーカーとしてTGタンパク質を分泌することができ、調べられた癌は甲状腺癌である。

本発明の別の好ましい実施形態によると、腫瘍細胞は、腫瘍マーカーとしてCA125タンパク質を再分泌することができ、調べられた癌は卵巣癌である。

本発明の別の好ましい実施形態によると、腫瘍細胞は、腫瘍マーカーとしてACEタンパク質およびCA19-9タンパク質を分泌することができ、調べられた癌は直腸結腸癌である。

本発明の別の好ましい実施形態によると、腫瘍細胞は、腫瘍マーカーとしてα-フェトプロテインを分泌することができ、調べられた癌は原発性肝癌である。

本発明の別の好ましい実施形態によると、腫瘍細胞は、腫瘍マーカーとしてPSAを分泌することができ、調べられた癌は前立腺癌である。

腫瘍マーカーの特異的結合パートナーは、腫瘍マーカーと結合できるパートナーであれば何でもよい。例としては抗体、抗体断片およびタンパク質が挙げられる。

結合パートナーである抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかである。

ポリクローナル抗体は、少なくとも1種の目的とする腫瘍抗原で動物を免疫し、続いて望む抗体を純粋な形で回収することによって得られる。純粋な形での回収は、その動物の血清を採取し、他の血清構成成分から、その抗体を分離することにより行う。具体的には、その抗体が特異的に認識する抗原（具体的には目的の腫瘍抗原）を結合したカラムを用いたアフィニティカラムクロマトグラフィーを行う。

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法(その一般原理は下記にもう一度述べる)で得ることができる。

はじめに、動物、一般的にはマウス(またはin vitro免疫に関しては培養細胞)に、目的の腫瘍抗原で免疫する。この抗原により、Bリンパ球がこの抗原に対して抗体を産生できる。次に、この抗体産生リンパ球を「不死」のメラノーマ細胞(この例ではマウス細胞)と融合して、ハイブリドーマを生じさせる。次に、このようにして得た細胞の異種混合体を使用して、特定の抗体を産生でき、無限に増殖ができる細胞を選択する。各々のハイブリドーマを、クローンの形で増殖させて、クローンそれぞれがモノクローナル抗体の産生をもたらす。その目的の腫瘍抗原を認識する特性は、たとえば、ELISA、一次元または二次元イムノブロット法、免疫蛍光法、またはバイオセンサーによってテストできる。次に、このように選択したモノクローナル抗体は、具体的には上記したアフィニティカラムクロマトグラフ法によって精製される。

腫瘍マーカーの結合パートナーである抗体断片の例には、抗CA15-3、抗PSA、抗α-フェトプロテイン、抗サイログロブリン、抗CA19-9および抗CA125抗体が含まれる。

細胞がCA15-3タンパク質を放出できる乳癌の場合、抗CA15-3抗体を結合パートナーとして使用できる。

細胞がPSAを分泌できる前立腺癌の場合、抗PSA抗体を結合パートナーとして使用できる。

細胞がTGを分泌できる甲状腺癌の場合、抗TG抗体を結合パートナーとして使用できる。

細胞がCA-125を分泌できる卵巣癌の場合、抗CA-125抗体を結合パートナーとして使用できる。

細胞がCA19-9またはACEを分泌できる直腸結腸癌の場合、抗CA19-9および抗ACE抗体を結合パートナーとして使用できる。

細胞がα-フェトプロテインを分泌できる肝細胞癌の場合、抗AFP抗体を結合パートナーとして使用できる。

培養面には、数種の結合パートナーが含まれていてもよい。好ましくは、培養面が最高4種までの異なる結合パートナーを含むことである。

好ましい一実施形態によると、培養面には、乳癌に特異的な抗原に対する2種の異なる抗体、好ましくは抗CA15-3抗体および抗Cath-D抗体が含まれる。

培養面は、腫瘍細胞を培養できるようになっている。例として、マイクロウェル、マイクロプレート、プラスチック面および膜が挙げられる。

マイクロウェルまたはマイクロプレート自体は、結合パートナーが直接マイクロウェルまたはマイクロプレートに付着するようなプラスチックからなっていてもよい。マイクロウェルおよびマイクロプレートは、本発明の結合パートナーを付着できる、当業者に通常既知である膜を含んでいてもよい。例としては、ニトロセルロース膜および、イモビロン-P膜(ミリポアコーポレーション)が挙げられる。

対象の患者から得られた生物サンプルは、培養面の底に直接置くか、または非造血細胞を濃縮してから底に置く。

血液サンプルの場合、たとえば、磁気ビース(Dynal Biotech ASA、ノルウェー)に結合した抗CD45抗体を利用した血液細胞の除去と組み合わせた、フィコールを用いた細胞分離方法によって、細胞を濃縮する。このような条件下で、全血のミリリットル当り数個の循環腫瘍細胞を計数することができる。

当業者に既知の他の濃縮方法も本発明の目的に適する。

マクロウェルの膜上に置いた細胞は、血球計数法(Thomas cell、Kovas slide)によって計数する。

腫瘍マーカーの放出または分泌のための培養条件は、37℃、加湿雰囲気、5%CO₂といった通常の条件である。

培養面の底に付着させた結合パートナーによって腫瘍マーカーを免疫補足した後、ウシアルブミン(1%)含有または非含有のPBS緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水)などの常用の洗浄緩衝液を使用して洗浄することにより、細胞を除去する。

細胞を除去した後に使用する複合体は、当業者に通常既知である複合体である。

複合体の例としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が挙げられる。好ましくは、この複合抗体は、培養面の底に結合した抗体と比べて異なるエピトープ特異性を有する。

「複合体に標識をつける」という表現は、直接または間接に検出可能なシグナルを発生することができる標識をつけることを意味するものである。これらの標識の非限定のリストには、
・発色法、蛍光または発光によって検出可能なシグナルを発生する、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、α-ガラクトースまたはグルコース‐6‐リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素、
・蛍光性、発光性または色素化合物などの発色団
・³²P、³⁵S、または¹²⁵Iなどの放射活性分子、および
・Alexaまたはフィコシアニンなどの蛍光分子
が挙げられる。

間接的なシステム、たとえば、抗リガンドと反応可能なリガンドもまた使用できる。リガンド/抗リガンド対は、当業者に既知で、たとえば、下記の対、すなわちビオチン/ストレプトアビジン、ハプテン/抗体、抗原/抗体、ペプチド/抗体、糖/レクチン、ポリヌクレオチド/このポリヌクレオチドに相補的な配列が、この場合である。この場合は、結合作用を保持するのはリガンドである。抗リガンドは、前述のパラグラフで記載した標識によって直接に検出可能であるかまたはリガンド/抗リガンドによってそれ自身検出可能であってよい。

これらの間接検出システムは、ある種の条件下で、シグナルを増幅することができる。このシグナル増幅技法は当分野技術者に既知である。本出願人による先行フランス特許出願第98/10084号または国際公開A-95/0800あるいは論文(J.Histochem.Cytochem.45:481-491、1997年)を参照してもよい。

使用した複合体の標識のタイプに従って、当業者が、標識を可視化するための試薬を加えることも可能である。

したがって、たとえば、酵素の場合、アルカリホスファターゼにはNBT-BCPI、またはペルオキシターゼにはAECといった色素生成基質を加えることが必要である。色素生成基質を添加すると、目的細胞のあった部位に、細胞によって残された本物のタンパク質のフットプリントである呈色沈殿物または免疫スポット(NBT-BCIPは青、AECは赤)が現れる。

培養面の底に存在している免疫スポットはすべて可視化でき、両眼拡大レンズまたは、高性能顕微鏡およびコンピューターに連結したデジタルカメラが装着されたKS ELISPOT装置(Carl Zeiss Vision GmbH社)によって、さらに良好に計数できる。

蛍光標識については、すべての免疫スポットが可視化され、蛍光の研究に適合したKS ELISPOT装置で計数される。

これらのスポットの分析用に選択される基準には、直径、色、形、彩度、明度、および散乱勾配が含まれる。実際、タンパク質合成に非常に特徴的な散乱勾配によると、スポットの密度および粒度は中心から周囲に向けて低下する。

培養面に2つより多い結合パートナーが存在する場合、結合パートナー/腫瘍マーカー間の結合は、好ましくは蛍光色素で標識された二次抗体によって呈示される。

したがって、好ましい一実施形態によれば、本発明の工程(iv)および(v)は、次の
(iv')蛍光色素で標識された二次抗体を添加する工程、
(v')結合パートナーと腫瘍マーカーとの間に結合が生じた場合における蛍光を可視化する工程に置換される。

腫瘍細胞を本発明の方法によって計数することによって、固形癌における腫瘍細胞の転移能を測定することが可能となる。したがって、予後診断、投与した治療処置の有効性をモニターすること、固形癌の残存疾病の定量ならびに無症状の再発および生物学的再発の診断が、本発明の方法によって、すなわち本発明方法の非常に大きな感度と特異性によって可能となる。

加えて、腫瘍は、その形成のきわめて初期から循環腫瘍細胞を放出できるので、本発明の方法は、癌の早期診断が可能である。

その結果、本発明の他の主題は、本発明の方法を、固形癌に関しての病態の早期診断および予後診断に使用すること、治療的処置の有効性の選択および評価へ使用すること、およびの再発の診断に使用することからなる。

好ましい一実施形態によると、本発明の方法は、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、および肝癌の診断に使用される。

さらに、本発明の方法は、特異的検出方法と培養方法とが併合しており、したがって、検出される腫瘍細胞の生存性および機能的性質を確認することができる。この特性が、予後診断に関して重要である。

したがって、本発明の他の主題は、固形癌罹患患者由来の循環腫瘍細胞の生存可能性の評価に本発明の方法を使用することからなる。

すなわち、本発明の方法で得られた陽性結果により、こうした生存可能性が明らかになる。

本発明の方法は、調査を行う目的の癌に特異的な腫瘍マーカーの1種または複数の結合パートナーで予め被覆されてある培養面と、これに対応する、予め標識された複合体を含む診断キットにより実施できる。このキットにはまた、免疫捕捉の後、細胞を勢いよく洗うための溶液が含まれる。

もちろん、本発明の方法は、特異的な結合パートナーが存在する、腫瘍マーカーと同定された少なくとも1種のマーカーを放出または分泌することができる任意の循環腫瘍細胞の計数に使用できる。

したがって、たとえば、本発明の方法は、
- サイログロブリン(TG)またはカルシトニン(CT)を産生する甲状腺腫瘍細胞、
- α-フェトプロテイン(AFP)を産生する肝臓腫瘍細胞、
- AFPまたは絨毛性ゴナドトロピンホルモン(β-HCG)を産生する精巣腫瘍細胞、
- CA15-3、カテプシンD、PS2、Her2/neu、マンマグロビンBを産生する乳房腫瘍、
- CA-125を産生する卵巣腫瘍細胞、
- PSAを産生する前立腺腫瘍細胞、
- CA19-9、CA-125、CA19-9およびACEを産生する消化器系(結腸、直腸、胃腸および膵臓)の腫瘍細胞、ならびに
- S100タンパク質を産生するメラノーマ腫瘍細胞
を計数できる。

本発明は、非限定の例示によってのみ与えられる下記実施例および添付された図1〜図3によってより完全に理解されるであろう。

（実施例１）
MCF-7およびMDA-MB-231(乳癌)腫瘍細胞ライン起源の腫瘍細胞の計数
MCF-7ラインが、高濃度のCath-DおよびMUC1タンパク質を分泌する理由で使用された。MDA-MB-231ラインはCath-Dタンパク質のみを発現する理由で使用された。

MCF-7およびMDA-MB-231細胞ラインを、1%のグルタマックス(glutamax、Life Technologies、Paisley、スコットランド)、10%ウシ胎児血清(Life Technology)、500IU/mlのペニシリン、および500μg/mlのストレプトマイシン(Life Technology)を補給したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Biochrom KG、ベルリン、ドイツ)中に入れて、5%のCO₂を含む加湿インキュベーター中37℃で保持した。

イモビロン-P膜を固相(ミリポアコーポレーション、ベッドフォード、マサチューセッツ州、合衆国)として使用する96ウェルのマイクロタイタープレート(Nunc Poskilde、デンマーク)をD7E3抗カテプシンDモノクローナル抗体(Garcia,M.、Capony,F.、Derocq,D.、Simon,D.、Pau,B.& Rochefort,H.、「Characterization of monoclonal antibodies to the estrogen-regulated Mr 52,000 glycoprotein and their use in MCF7 cells」 Cancer Research 45、709-716(1985))および抗CA15-3モノクローナル抗体(Dakocytomation、フランス)で被覆し、+4℃で一晩放置した。膜と結合しなかった抗体を、PBSで3回洗浄して除去した。次に、非結合部位を5%のウシ血清アルブミン(シグマアルドリッチ、St Quentin Fallavier、フランス)により1時間大気温度でブロックした。

必要であれば、細胞ラインを、揺動および回転可能な装置上で50μg/mlのシクロヘキシイミドにより、37℃、1時間で処理して、その後で分析を行った。

トリパンブルー色素による色素排除を行った後、この細胞ライン起源の生存細胞を血球計で計数し、ウェル中の増殖培地中で様々な濃度に連続希釈を二連で行った。次にプレートを37℃、5%CO₂で24時間インキュベートした。

PBSで洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合したM1G8抗-Cath-Dモノクローナル抗体(Garcia,M.、Capony,F.、Derocq,D.、Simon,D.、Pau,B.& Rochefort,H.上記記載)または、アルカリホスファターゼと結合したDF3抗CA15-3モノクローナル抗体(Dakocytomation)のどちらか(1色法)、あるいはこれら抗体の混合物(2色法)を添加し、プレートを大気温度でインキュベートした。

適切な着色基質、すなわちホースラディッシュペルオキシダーゼ用にAEC染色キット(シグマアルドリッチ)、X-リン酸塩/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸トルイジンの塩と4-ニトロブルーテトラゾリウムクロライドの塩の混合物(BCIP/NBT、シグマ)を各ウェルに添加した。赤色(ペルオキシターゼ/Cath-Dの存在)または青色(アルカリホスファターゼ/CA15-3の存在)の不溶性沈殿物を、5〜10分で得た。

次に、反応を停止させるためプレートを蒸留水で洗浄した。

免疫スポットをKS ELISPOT装置を使用して計数した。細胞が入っていないかまたは特異的な抗体で被覆されていないウェルを対照として含めた。

図1に得られた結果を示す。1色法を使用した図1A〜B(Cath-Dについて1A、CA15-3について1B)に示すように、抗Cath-Dおよび抗CA15-3モノクローナル抗体の組合せを使用することで、in vitroで24時間培養後に、約25%のMCF-7細胞が、Cath-Dタンパク質および/またはCA15-3タンパク質を分泌することが観測できた。培養中、シクロヘキシイミドを添加すると、得られたスポットのサイズおよび数が減少し、これによってde novoタンパク質合成が確認される(図1C、1DはそれぞれCath-D、CA15-3について示す)。

MDA-MB-231細胞ラインのみが、抗Cath-D抗体によるスポットを示していた(データ不表示)ことに留意すべきである。

最後に、2色法(図1、E〜F)によって、MCF-7細胞ラインでは、約17%のスポットが「Cath-D」スポット(赤色沈殿物)のみで、82%が「CA15-3(MUC1)」スポット(青色沈殿物)のみ、1%が「Cath-D」と「CA15-3(MUC1)」の二重スポット(茶色の沈殿物)」であることが観察できた。

（実施例２）
本発明の方法の検出感度
本発明の最低の検出レベルを決定するために、MCF-7細胞ラインの細胞の、1ウェル当り100000、10000、1000、100、10から1細胞の連続希釈物を使用し、Cath-Dの分泌を実施例1に記載の手順に従った本発明の方法によって、また対応する培養上澄み液中でELISA技法(CisBioInternational、Saclay、フランス)によって測定した。結果を下記表1に掲載する。

上記表中に示したように、1ウェル当り100000〜10000細胞の希釈物では、計数が不可能なほど多数のスポットがあり、一方、ELISA法でのCath-Dの検出も可能であった。1ウェル当り1000細胞の希釈物では、本発明の方法によってCath-Dを分泌する細胞に対応する約250スポット(25%)が計数されたが、ELISA法では、Cath-Dの分泌は検出されなかった。同一の結果が、これより希釈率のより高い希釈物で観測されている。

たとえ、1ウェル当り1つの細胞でも、本発明の方法でスポットが検出され、類似の結果がMUC1タンパク質で得られたことに留意すべきである。

したがって、これらのデータは、本発明の方法が、培養上澄み液中で腫瘍マーカー検出に適用されるELISA法より10000倍高い感度を有することを示す。

（実施例３）
循環細胞の検出
循環上皮細胞および末梢単核球を、Ficoll-Hypaque(ファーマシア、ウプサラ、スウェーデン)密度勾配遠心分離によって、the Centre de Recherche et de Lutte contre le Cancer [癌研究撲滅センター](Val d'Aurelle、Montpellier、フランス)で治療を受けている転移性乳癌を有する16患者の8〜10mlの血液サンプルから単離した。

上皮細胞の単離の効率を、下記方法によってテストした。MCF-7細胞ラインの細胞を健康な個人から得られた血液中に、様々な濃度(血液ml当り1000、100および10細胞)で希釈した。血液のアリコートしたその分量をFicoll-Hypaque勾配で処理し、血液学的起源の細胞を、抗CD45モノクローナル抗体で被覆したビースを用いた磁気選別によって除去した。残留細胞中のCA15-3タンパク質を本発明の方法によって求めた。本発明の方法による計数の有効性は67%であり、本発明の方法が、腫瘍起源の稀少な循環細胞の回収を可能にすることが実証された。

末梢単核球を起源とする造血細胞系のCD45(+)血液細胞のすべてを、磁気標識した抗CD45抗体とDynal Biotech ASA推奨の磁気分離法を使用して減少させて、非造血細胞を濃縮した。

本発明の方法を、実施例1に記載の手順に従って、転移性乳癌の罹患患者と対照患者に由来する、上記のように濃縮した細胞で行った。

結果を、表2に掲載する。

上記表中に示されたように、対照の個人をテストした場合、テストした対照個人5人中5人についてCath-Dの発現が検出されなかった。

同グループの患者9例で、CA15-3(MUC1)スポットを調べたところ、1000μm²未満サイズの数多くのスポットが、多くの個人で確認された(図2参照、上段)。癌罹患患者中のCA15-3(MUC1)スポットに関しては、2つのスポット集団、すなわち1000μm²未満の小スポットおよび1200μm²と7000μm²以上との間の大スポットが、検出可能であった(図2、下段)。これによってCA15-3を通してMUC1の異常発現を規定するのに、1000μm²の臨界閾値が有用である可能性が示唆される(図2、下段)。

進行癌罹患患者16例では、大部分の細胞が単一の腫瘍抗原しか発現せず、Cath-Dタンパク質を発現するものが血液ml当り0.2から25.5細胞で、CA15-3タンパク質を発現するものが血液の0.5から170細胞であった。一方、これら患者16例中2例のみが2つのタンパク質を発現した(図3)。

第1回目の腫瘍(サイズ<2cm)診断時(すなわち、未治療)に調査を行った、センチネルリンパ節侵襲を有する患者では、外科的介入前に血液ml当り5.1スポット、4日後にml当り0個のスポットを計数した。

（実施例４）
MCF-7およびLNCAP(前立腺癌)腫瘍細胞ライン起源の腫瘍細胞の計数
LNCAPラインは高濃度のPSAタンパク質を分泌するという理由で使用され、MCF-7ラインはPSAタンパク質を発現しないという理由で使用された。

LNCAP細胞ラインを、450mlのQS、5mlのグルタミン(2mM)、50mlのウシ胎児血清(10%)、100IU/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、2.5mlのグルコース100(4.5g/1)および5mlの100mMピルビン酸ナトリウム(1mM)を補給したRPMI培地(Eurobio、Les Ullis、フランス)中で保持した。

実施例1に記載したMCF-7細胞ラインを対照として使用した。

イムノビロン-P膜を固相(ミリポアコーポレーション、ベッドフォード、マサチューセッツ州、合衆国)として使用している96ウェルのマイクロタイタープレート(Nunc、Roskilde、デンマーク)を、抗PSAモノクローナル抗体(bioMerieux、Marcy 1'Etoile、フランス)で被覆し、+4℃で一晩放置した。膜と結合しなかった抗体を、PBSで3回洗浄して除去した。次に、非結合部位を5%のウシ血清アルブミン(シグマアルドリッチ、St Quentin Fallavier、フランス)により1時間大気温度でブロックした。

必要であれば、細胞ラインを、揺動および回転可能な装置上で50μg/mlのシクロヘキシイミドにより、37℃、1時間で処理した後、分析を行った。

この細胞ライン起源の生存細胞を、トリパンブルー色素による色素排除を行った後、血球計で計数し、ウェル中の増殖培地中で様々な濃度に連続希釈を二連で行った。次にプレートを37℃、5%CO₂で24時間インキュベートした。

PBSで洗浄した後、アルカリホスファターゼと結合した抗PSAモノクローナル抗体(bioMerieux) (1色法)を添加し、プレートを大気温度でインキュベートした。

X-リン酸塩/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸トルイジンの塩と4-ニトロブルーテトラゾリウムクロライドの塩の混合物(BCIP/NBT、シグマ)を有する適切な着色基質を、各ウェルに添加した。青色の不溶性沈殿物を5〜10分で得た。

次に、反応を停止させるために、プレートを蒸留水で洗浄した。

上皮細胞の単離の効率を、実施例3に示したようにテストし、70%であったことに留意すべきである。

（実施例５）
PSAを分泌する循環細胞の検出
循環上皮細胞および末梢単核球をFicoll-Hypaque(ファーマシア、ウプサラ、スウェーデン)密度勾配遠心分離によって、「Beau Soleil」クリニックおよびフランスのモントペリエ(Montpellier)のCHU(University Teaching Hospital)で治療を受けている転移性前立腺癌患者10例の8〜10mlの血液サンプルから単離した。

本発明の方法を、実施例1に記載の手順に従って、転移性前立腺癌罹患患者と対照患者由来の、上記のように濃縮した細胞で行った。

対照患者をテストしたが、PSAタンパク質の発現はテストした6例中6例で検出されなかった。一方、骨に転移した患者10例については、PSAを分泌する循環細胞を計数した。

（実施例６）
ML-1（甲状腺癌)細胞ライン起源の腫瘍細胞の計数
ML-1ラインは、高濃度のTGタンパク質を分泌するという理由で、使用された。

ML-1細胞ラインは、D.Grimmのドイツのチーム(Schonberger J.、Bauer J.、Spruss T、Weber G、Chahoud I、Eilles C、Grimm D.、「Establishment and characterization of the follicular thyroid carcinoma cell line ML-1,and characterization of the follicular thyroid carcinoma cell line ML-1.」、J.M01.Med 2000;78(2):102-10)から快く提供された。

この細胞ラインを、20%のウシ胎児血清、グルタミン(2mM)およびピルビン酸ナトリウム(1mM)を補給したDMEM培地(4.5g/lグルコース)中で保持した。

イムノビロン-P膜を固相(ミリポアコーポレーション、ベッドフォード、マサチューセッツ州、合衆国)として使用している96ウェルのマイクロタイタープレート(Nunc、Roskilde、デンマーク)を、抗TGモノクローナル抗体(BioRad、Marnes La Coquette、フランス)で被覆し、+4℃で一晩放置した。膜と結合しなかった抗体を、PBSで3回洗浄して除去した。次に、非結合部位を5%のウシ血清アルブミン(シグマアルドリッチ、St Quentin Fallavier、フランス)により1時間大気温度でブロックした。

ML-1細胞を、トリパンブルー色素による色素排除を行った後、血球計で計数し、ウェル中の適切な増殖培地中で様々な濃度に連続希釈を二連で行った。次にプレートを37℃、5%CO₂で24時間インキュベートした。

PBSで洗浄した後、アルカリホスファターゼと結合した抗TGモノクローナル抗体(BioRad、Marnes La Coquette、フランス) (1色法)を添加し、プレートを大気温度でインキュベートした。

適切な着色基質(X-リン酸塩/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸トルイジンの塩と4-ニトロブルーテトラゾリウムクロライドの塩(BCIP/NBT、シグマ)を、各ウェルに添加した。青色の不溶性沈殿物を5〜10分で得た。

上皮細胞の単離の有効性を、実施例3に示したようにテストし、70%であったことに留意すべきである。

（実施例７）
TGを分泌する循環細胞の検出
循環上皮細胞および末梢単核球をFicoll-Hypaque(ファーマシア、ウプサラ、スウェーデン)密度勾配遠心分離によって、フランスのモントペリエ(Montpellier)のCHU(University Teaching Hospital)にあるLapeyronie病院で治療を受けている転移性甲状腺癌患者15例からの8〜10mlの血液サンプルから単離した。

本発明の方法を、実施例1に記載の手順に従って、転移性甲状腺癌罹患患者と対照患者に由来する、上記のように濃縮した細胞で行った。

我々の研究には、陽性のTG血清レベルを有する患者のみを含めた。原発性腫瘍の治療からかなり時間が経過した患者15例を調査した。

転移性の進行を経験している患者6例のうち5例について、TGを分泌する循環細胞を計数したところ、3例について、サイロゲンによるin vivoで行った刺激の後、この細胞数に増加が見られた。2例については、臨床的合併症がなく、正常なTGレベルを有するスポットを計数した。

（実施例８）
BG-1およびSKOV3(卵巣癌)腫瘍細胞ライン起源の腫瘍細胞の計数
BG-1ラインは高濃度のCA125タンパク質を分泌するという理由で使用され、SKOV3ラインはCA125タンパク質を発現しないという理由で、使用された。

BG-1細胞ラインは、グルタミン(1.5mM)およびウシ胎児血清(10%)を含むMcCoy's 5a培地中で保持した。

SKOV3細胞ラインは、対照として使用した。これはBG-1ラインを保持したものと同一の培地で保持した。

イムノビロン-P膜を固相(ミリポアコーポレーション、ベッドフォード、マサチューセッツ州、合衆国)として使用している96ウェルのマイクロタイタープレート(Nunc、Roskilde、デンマーク)を、抗CA125モノクローナル抗体(Dakocytomation)で被覆し、+4℃で一晩放置した。膜と結合しなかった抗体を、PBSで3回洗浄して除去した。次に、非結合部位を5%のウシ血清アルブミン(シグマアルドリッチ、St Quentin Fallavier、フランス)により1時間大気温度でブロックした。

BG-1細胞を、トリパンブルー色素による色素排除を行った後、血球計で計数し、ウェル中の適切な増殖培地中で様々な濃度に連続希釈を二連で行った。次にプレートを37℃、5%CO₂で24時間インキュベートした。

PBSで洗浄した後、アルカリホスファターゼと結合した抗CA125モノクローナル抗体(Dakocytomation) (1色法)を添加し、プレートを大気温度でインキュベートした。

適切な着色基質(X-リン酸塩/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸トルイジンの塩と4-ニトロブルーテトラゾリウムクロライドの塩の混合物(BCIP/NBT、シグマ)を、各ウェルに添加した。青色の不溶性沈殿物を5〜10分で得た。

（実施例９）
CaCo2およびHT-29腫瘍細胞ライン(結腸直腸癌)起源の腫瘍細胞の計数
CaCo2ラインおよびHT-29ラインは、高濃度のCA19-9タンパク質およびACEタンパク質を分泌するという理由で使用された。この2つの細胞ラインを2つの腫瘍マーカーについてテストした。

CaCo2細胞ラインは、ウシ胎児血清(20%)、グルタミン(2mM)、ピルビン酸ナトリウム(1mM)、および重炭酸ナトリウム(1.5g/l)を補給したEarle's塩および非必須アミノ酸を有するMEM培地で保持した。

HT-29細胞ラインは、グルタミン(1.5mM)およびウシ胎児血清(10%)を含むMcCoy's 5a培地中で保持した。

イムノビロン-P膜を固相(ミリポアコーポレーション、ベッドフォード、マサチューセッツ州、合衆国)として使用している96ウェルのマイクロタイタープレート(Nunc、Roskilde、デンマーク)を、抗CA19-9モノクローナル抗体(Dakocytomation)または抗ACE(bioMerieux、Marcy 1'Etoile、フランス)モノクローナル抗体で被覆し、+4℃で一晩放置した。膜と結合しなかった抗体を、PBSで3回洗浄して除去した。次に、非結合部位を5%のウシ血清アルブミン(シグマアルドリッチ、St Quentin Fallavier、フランス)により1時間大気温度でブロックした。

CaCo-2およびHT-29細胞を、トリパンブルー色素による色素排除を行った後、血球計で計数し、ウェル中の適切な増殖培地中で様々な濃度に連続希釈を二連で行った。次にプレートを37℃、5%CO₂で24時間インキュベートした。

PBSで洗浄した後、アルカリホスファターゼと結合した抗CA19-9モノクローナル抗体、またはペルオキシダーゼと結合した抗ACEモノクローナル抗体(bioMerieux、Marcy 1'Etoile、フランス) (1色法)を添加し、プレートを大気温度でインキュベートした。

アルカリホスファターゼの適切な着色基質(X-リン酸/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸トルイジンの塩と4-ニトロブルーテトラゾリウムクロライドの塩の混合物(BCIP/NBT、シグマ)を、各ウェルに添加した。青色の不溶性沈殿物を5〜10分で得た。ペルオキシダーゼの適切な着色基質、すなわちAEC染色キット(シグマ-アルドリッチ)を、各ウェルに添加した。赤色の不溶性沈殿物を10分で得た。

（実施例１０）
肝癌細胞ライン(原発性肝癌)起源の腫瘍細胞の計数
肝癌細胞ラインは、高濃度のαタンパク質を分泌するという理由で、使用された。

この細胞ラインを、グルタミン(1.5mM)およびウシ胎児血清(20%)を含むRPMI培地中で保持した。

この細胞を、トリパンブルー色素による色素排除を行った後、血球計で計数し、ウェル中の適切な増殖培地中で様々な濃度に連続希釈を二連で行った。次にプレートを37℃、5%CO₂で24時間インキュベートした。

PBSで洗浄した後、ペルオキシダーゼと結合した抗AFPモノクローナル抗体(bioMerieux、Marcy 1'Etoile、フランス) (1色法)を添加し、プレートを大気温度でインキュベートした。

ペルオキシダーゼの適切な着色基質、すなわちAEC染色キット(シグマ-アルドリッチ)を、各ウェルに添加した。赤色の不溶性沈殿物を10分で得た。

本発明の方法によってMCF-7腫瘍細胞から得られた免疫スポットを示す図である。本発明の方法によってMCF-7腫瘍細胞から得られた免疫スポットを示す図である。本発明の方法によってMCF-7腫瘍細胞から得られた免疫スポットを示す図である。本発明の方法によってMCF-7腫瘍細胞から得られた免疫スポットを示す図である。本発明の方法によってMCF-7腫瘍細胞から得られた免疫スポットを示す図である。本発明の方法によってMCF-7腫瘍細胞から得られた免疫スポットを示す図である。対照の個人および転移性乳癌の罹患患者由来のCD45(-)細胞から、本発明の方法によって得られた免疫スポットを示す図である。転移性乳癌の罹患患者のうちの一個人で本発明の方法によって得られた免疫スポットを示す図である。

Claims

固形癌罹患患者由来の生物サンプル中の、in vitroで1種または複数の腫瘍マーカーを放出または分泌することができる循環非造血性悪性腫瘍細胞を検出および/または定量するための方法であって、
(i)前記腫瘍マーカーの少なくとも1つの特異的結合パートナーが付着している培養面の底に、細胞を計数した前記サンプルを置く工程と、
(ii)前記非造血性悪性腫瘍細胞が、培養面の底で免疫捕捉される前記腫瘍マーカーを放出または分泌するような条件下で、前記細胞を培養する工程と
(iii)洗浄によって前記細胞を除去する工程と、
(iv)前記腫瘍マーカーに特異的な、少なくとも1種の標識された複合体を添加する工程と、
(v)このようにして得られた標識を可視化する工程と
を含む方法。
前記生物学的サンプルが、血液または骨髄からなることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
前記腫瘍マーカーが、培養面の底で切断によって放出され得る膜結合型抗原であるか、または、培養面の底で細胞によって分泌される細胞内抗原のいずれかであることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
4種以下の異なる結合パートナー、好ましくは2種以下のパートナーが、培養面の底に付着していることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
前記腫瘍細胞が、腫瘍マーカーとしてPSA抗原を分泌することができ、前記結合パートナーが、抗PSA抗体であることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
前記腫瘍細胞が、腫瘍マーカーとしてCA15-3タンパク質抗原を分泌することができ、前記結合パートナーが、抗CA15-3抗体であることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
前記腫瘍細胞が、腫瘍マーカーとしてTGタンパク質抗原を分泌することができ、前記結合パートナーが、抗TG抗体であることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
前記腫瘍細胞が、腫瘍マーカーとしてCA125タンパク質抗原を分泌することができ、前記結合パートナーが、抗CA125抗体であることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
前記腫瘍細胞が、腫瘍マーカーとしてACEタンパク質抗原および/またはCA19-9タンパク質抗原を分泌することができ、前記結合パートナーが、抗ACE抗体および抗CA19-9抗体であることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
前記腫瘍細胞が、腫瘍マーカーとしてα-フェトプロテインタンパク質抗原を分泌することができ、前記結合パートナーが、抗AFP抗体であることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
2つの結合パートナーが存在し、これらの結合パートナーが、好ましくは抗CA15-3抗体および抗Cath-D抗体であることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
前記工程(iv)および(v)が、次の
(iv')蛍光色素で標識された二次抗体を添加する工程、
(v')結合パートナーと腫瘍マーカーとの間に結合が存在するときに蛍光が可視化される工程
に置換されることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
固形癌に関連した、治療処置の有効性の選択および評価における、請求項1から12のいずれかの一項に記載の方法の使用。
前記癌が乳癌であることを特徴とする、請求項13に記載の使用。
前記癌が前立腺癌であることを特徴とする、請求項13に記載の使用。
前記癌が甲状腺癌であることを特徴とする、請求項13に記載の使用。
前記癌が卵巣癌であることを特徴とする、請求項13に記載の使用。
前記癌が結腸直腸癌であることを特徴とする、請求項13に記載の使用。
前記癌が原発性肝癌であることを特徴とする、請求項13に記載の使用。
固形癌罹患患者に由来する循環腫瘍細胞の生存可能性を評価するための請求項1から12のいずれか一項に記載の方法の使用。
調査の実施が望まれる癌に特異的な腫瘍マーカーの1種または複数の結合パートナーで予め被覆した培養面、および、対応する予め標識した複合体を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載した、固形癌罹患患者に由来する生物サンプル中の、循環する非造血性悪性腫瘍細胞の検出および／または定量のための方法を行うための診断キット。