ES2268387T3 - Procedimiento de deteccion y de cuantificacion de celulas tumorales circulantes, procedentes de canceres solidos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de detección y / o cuantificación de células tumorales neoplásicas, no hematopoyéticas, circulantes, de una muestra biológica, de un paciente afectado de cáncer sólido, las cuales son capaces de liberar o secretar, in vitro, uno varios marcadores tumorales, que comprende las etapas consistentes en: (i) depositar la citada muestra, en donde se han enumerado las células, en el fondo de una superficie de cultivo, sobre la cual se fija por lo menos un compañero de enlace, específico, o no, del citado o de los citados marcador(es) tumoral(es), (ii) cultivar las citadas células, en condiciones tales que, las citadas células tumorales neoplásicas, no hemotopoyéticas, liberen o secreten los citados marcadores tumorales que son inmunocapturados en el fondo de la superficie de cultivo, (iii) eliminar las células, mediante lavado, (iv) añadir por lo menos un conjugado marcado específico de los citados marcadores tumorales y (v) visualizar el marcaje de esta forma obtenido.
Description
Procedimiento de detección y de cuantificación
de células tumorales circulantes, procedentes de cánceres
sólidos.
La presente invención, se refiere al sector del
diagnóstico biológico, en cancerología. De una forma más particular,
la presente invención, tiene por objeto un procedimiento para la
detección y/o cuantificación de células tumorales circulantes,
capaces de secretar in vitro, uno o varios marcadores
tumorales, así como a la utilización de este procedimiento, en el
diagnóstico precoz y el pronóstico de la patología, en la selección
de tratamientos terapéuticos y la evaluación de su eficacia, así
como en el diagnóstico de las recaídas, en el ámbito de los cánceres
sólidos.
El diagnóstico actual de los cánceres, consiste
en un diagnóstico clínico, tal como la palpación mamaria, en el caso
del cáncer de mama, y/o en un examen paraclínico, tal como la
mamografía, la exploración mediante "scanner", efectuándose, la
confirmación, mediante un análisis histológico, tal como la biopsia
o la intervención quirúrgica.
El diagnóstico clínico o paraclínico precoz del
cáncer, es difícil, especialmente, debido al hecho de la falta de
accesibilidad de las zonas cancerosas. Como consecuencia de ello,
numerosos tumores, no se ponen en evidencia, de una forma general,
más que de una forma tardía.
Se encuentra el mismo problema, cuando las zonas
son anatómicamente accesibles. Así, por ejemplo, en el caso del
cáncer de mama, cuando un tumor se detecta, durante el transcurso de
una mamografía, éste tiene a menudo una evolución infraclínica de 8
años, como media.
En el momento actual, no existen procedimientos,
o sólo existen pocos, de diagnóstico biológico, que permitan, ellos
solos, el diagnóstico del cáncer.
Los procedimientos de diagnóstico biológico
actualmente desarrollados, permiten seguir la evolución de un cáncer
ya diagnosticado o de diagnosticar precozmente una recidiva, por
ejemplo, mediante dosificación de ciertos marcadores tumorales. Así,
de este modo, se dosifican marcadores séricos u orinarios, mediante
técnicas bien conocidas por parte de la persona experta en el arte
especializado de la técnica.
Como contrapartida, la detección de las células
tumorales circundantes, se encuentra poco explorada, y no existe un
test de ensayo de rutina.
La posibilidad de detectar células tumorales
circulantes, ha sido ya estudiada, principalmente, mediante dos
procedimientos de diagnóstico, los cuales son la citometría de flujo
y la reacción del polimerización en cadena (PCR), acoplada a la
retrotranscriptasa-PCR
(RT-PCR)(Racila E., Euhus D., Weiss A., Rao C.,
McConnell J., Terstappen L., Uhr J. Detection and characterization
of carcinoma cells in the blood, -Detección y caracterización de
células de carcinomas en la sangre-. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:
4589-4594 (1998), Ghossein R., Bhattacharya S.,
Rosai J. Molecular detection of micrometastase and circulatig tumor
cells in solid tumors, -Detección molecular de micrometástasis y
células tumorales circulantes en tumores sólidos-. Clin. Cancer 5,
1950-1960 (1999) y Moss, T. J., 1991, N. Engl. J.
Med. 324, 219-226). Estos dos procedimientos, han
permitido detectar, en los pacientes afectados de cáncer de mama y
de próstata, células circulantes tumorales, en las células de la
sangre o de la médula ósea.
No obstante, estos dos procedimientos, presentan
algunos inconvenientes. De una forma particular, ninguno de estos
procedimientos, permite cuantificar las células raras circulantes,
procedentes de un tumor sólido. Además, es posible obtener falsos
positivos, con la PCR, de tal forma que, a esta técnica, le falta
sensibilidad y especificidad. Como consecuencia de ello, se tiene
necesidad, habitualmente, de tejido tumoral, para confirmar la
presencia de células tumorales.
Racila E. et al. 1998 (véase
anteriormente, más arriba), han descrito un procedimiento de
detección y de caracterización de células de cánceres de mama y de
próstata, en la sangre, el cual combina un enriquecimiento
inmunomagnético de células epiteliales, con un análisis en
citometría en flujo y, a continuación, en caso de respuesta
positiva, un análisis inmonocitoquímico. El análisis
inmunocitoquímico, se base en la detección colorimétrica de una
enzima acoplada a un marcador tumoral (anticuerpos anticitolceratina
5, 6, 8 y 18). Este test de ensayo, necesita un anticuerpo primario
específico de marcador de cáncer, una inmunoglobulina secundaria de
conejo, una inmunoglobulina de ratón anti-fosfatasa
alcalina, la fosfatasa alcalina y el substrato correspondiente.
El procedimiento anterior, de arriba, presenta
los inconvenientes siguientes:
- -
- éste necesita un equipo específico, costoso, especialmente, para el análisis en citometría en flujo,
- -
- son necesarios dos análisis, es decir, un análisis en citometría en flujo, seguido de un análisis inmunocitoquímico, y
- -
- a éste, le falta sensibilidad.
Además, ninguno de los procedimientos
precedentes, arriba mencionados, permiten asegurar la viabilidad de
la células circulantes, y su potencial de supervivencia.
Córdoba F., et al. (2000, British Journal
of Haemalology, 108, 549-558), han descrito un
procedimiento de detección de células mielomatosas, de pacientes
afectados de un mieloma múltiple, utilizando la propiedad conocida
de las células, de secretar la inmunoglobulina. Las células
mielomatosas, proceden de linfocitos B, normalmente presentes en la
sangre, y normalmente, secretores de inmunoglobulinas.
Zhou Zegi et al. han descrito, en la
patente estadounidense US 6 107 049, un kn de diagnóstico, que
comprende una superficie de cultivo, previamente revestida por uno o
por varios compañeros de enlace, de marcadores tumorales específicos
del cáncer prostático.
Estos marcadores, anticuerpos
Anti-PSA, permiten una lectura del antígeno (CPSA)
específica de la próstata, y una alta sensibilidad de este test de
ensayo de diagnóstico, el cual permite la limitación de recursos y
de biopsias.
El solicitante, ha encontrado, ahora, de una
forma sorprendente, el hecho de que, las células tumorales
circulantes procedentes de cánceres sólidos, son capaces de liberar
o de secretar ciertos marcadores tumorales, y que es posible el
detectar dicha secreción.
El solicitante, ha puesto a punto, también, un
nuevo procedimiento de detección y/o cuantificación de células
tumorales circulantes, procedentes de cánceres sólidos, que utiliza
esta característica particular de liberación o de secreción de
marcadores tumorales, y que palia los inconvenientes anteriormente
mencionados, arriba, es decir, que es fácil de aplicar en este
sentido, que no comporta más que una sola etapa de análisis y que no
necesita de material específico. Además, este procedimiento, permite
detectar células circulantes raras, debido a su sensibilidad muy
elevada, y permite igualmente el asegurarse de la viabilidad de las
citadas células tumorales. Éste es por lo tanto muy útil, tanto en
el diagnóstico, como en la exploración de la enfermedad residual y
como en la evaluación del potencial de supervivencia, es decir, de
la agresividad, de las células circulantes.
Así, de esta forma, la presente invención, tiene
por objeto un procedimiento de detección y/o cuantificación de
células tumorales circulantes de una muestra biológica, las cuales
son capaces de liberar o secretar, in vitro, uno varios
marcadores tumorales, que comprende las etapas consistentes en:
- (i)
- depositar una cantidad conocida de las citadas células, en el fondo de una superficie de cultivo, sobre la cual se fija por lo menos un compañero de enlace, específico, o no, del citado o de los citados marcador(es) tumoral(es),
- (ii)
- cultivar las citadas células, en condiciones tales que éstas liberen o secreten los citados marcadores tumorales que son inmunocapturados en el fondo de la superficie de cultivo,
- (iii)
- eliminar las células, mediante lavado,
- (iv)
- añadir por lo menos un conjugado marcado específico de los citados marcadores tumorales y
- (v)
- visualizar el marcaje de esta forma obtenido.
El procedimiento de la invención, permite por lo
tanto de enumerar las células neoplásicas no hematopoyéticas
circulantes, procedentes de muestras biológicas de pacientes
afectados de un cáncer sólido.
Los cánceres sólidos, son bien conocidos por
parte de la persona experta en el arte especializado de la técnica.
A título de ejemplo, se pueden citar los cánceres de mama, de
próstata, de tiroides, de hígado, de testículos, de ovarios, del
sistema digestivo, del pulmón, etc.
Las muestras biológicas susceptibles de contener
células tumorales circulantes, comprenden todo fluido biológico tal
como la sangre, la médula ósea, los derrames, la leche, el líquido
cefalo-raquídeo y las orinas.
Según una forma de realización preferida, las
muestras biológicas, se encuentran constituidas por la sangre, o la
médula ósea.
Los marcadores tumorales, son marcadores
específicos de cánceres sólidos, los cuales son capaces de ser
liberados o secretados por parte de las células tumorales, in
vivo o in vitro, bajo ciertas condiciones de cultivo.
Por marcador tumoral liberado de una célula
tumoral, se entiende un marcador membranario, el cual se ha
segmentado, y por marcador secretado por una célula tumoral, se
entiende tanto un marcador secretado directamente por la citada
célula, como un marcador que ha sementado en el citoplasma, y, a
continuación, se ha excretado por la citada célula tumoral.
A título de marcador, se pueden citar diferentes
antígenos (proteicos o no proteicos).
Según una forma de realización preferida, los
citados marcadores tumorales son, bien ya sea antígenos membranarios
capaces de ser liberados por segmentación, al fondo de la superficie
de cultivo, o bien ya sea antígenos intracelulares que son
secretados por las citadas células, al fondo de la superficie de
cultivo.
A título de ejemplo de antígeno membranario, se
puede citar la proteína Muc-1, que es una proteína
de superficie de las células del cáncer de mama, y que se segmenta
en forma de proteína CA 15-3 (hidrato de carbono
15-3).
A título de ejemplo de antígeno secretado, se
puede citar el PSA, el cual se produce por las células del cáncer de
próstata, la proteína catepsina-D
(Cath-D) que una espartil-proteasa
del lisosoma, expresada en todos los tejidos, pero que es
superexpresada por las células cancerosas en el ámbito del cáncer de
mama, la tiroglobulina (TG) producida por las células cancerosas en
el ámbito del cáncer de tiroides, la proteína CA 125 producida por
las células cancerosas en el ámbito del cáncer de ovario, las
proteínas ACE y CA 19-9 producidas por las células
cancerosas en el ámbito del cáncer colorrectal, y la
alfa-foetoproteína (AFP), producida por las células
hepáticas en el ámbito de los hepatocarcinomas.
Según una forma de realización preferida de la
invención, las células tumorales, son capaces de liberar, como
marcador tumoral, la proteína CA 15-3, y el cáncer
buscado, es el cáncer de mama.
Según otra forma de realización preferida de la
invención, las células tumorales, son capaces de secretar, como
marcador tumoral, la proteína TG, y el cáncer buscado, es el cáncer
de tiroides.
Según otra forma de realización preferida de la
invención, las células tumorales, son capaces de
re-secretar, como marcador tumoral, la proteína CA
125, y el cáncer buscado, es el cáncer de ovario.
Según otra forma de realización preferida de la
invención, las células tumorales, son capaces de secretar, como
marcador tumoral, las proteínas ACE y CA 19-9, y el
cáncer buscado, es el cáncer colorrectal.
Según otra forma de realización preferida de la
invención, las células tumorales, son capaces de secretar, como
marcador tumoral, la alfa-foetoproteína, y el cáncer
buscado, es el cáncer primario de hígado.
Según otra forma de realización preferida de la
invención, las células tumorales, son capaces de secretar, como
marcador tumoral, el PSA, y el cáncer buscado, es el cáncer de
próstata.
Los compañeros de enlace específicos de los
marcadores tumorales, se encuentran constituidos por todo compañero
susceptible de enlazarse con los marcadores tumorales. A título de
ejemplo, se pueden citar los anticuerpos, las fracciones de
anticuerpos y las proteínas.
Los anticuerpos compañeros de enlace son, bien
ya sea anticuerpos policlonales, o bien ya anticuerpos
monoclonales.
Los anticuerpos policlonales, pueden obtenerse
por inmunización de un animal con por lo menos un antígeno tumoral
de interés, seguido de la recuperación de los anticuerpos obtenidos
en forma purificada, mediante extracción del suero del citado
animal, y separación de los citados anticuerpos de los otros
constituyentes del suero, especialmente, por cromatografía de
afinidad sobre una columna, sobre la cual se fija un antígeno
específicamente reconocido por los anticuerpos, especialmente, un
antígeno tumoral de interés.
Los anticuerpos monoclonales, pueden obtenerse
mediante la técnica de los hibridomas, cuyo principio general, se
recuerda a continuación.
En primer lugar, se procede a inmunizar un
animal, generalmente, un ratón, (o células en cultivo, en el ámbito
de la inmunización in vitro), con un antígeno tumoral de
interés, cuyos linfocitos B, son entonces capaces de producir
anticuerpos contra el citado antígeno. Estos linfocitos productores
de anticuerpos, se fusionan, a continuación, con células
mielomatosas "inmortales" (murinas, en el ejemplo), para dar
lugar a hibridomas. A partir de la mezcla heterogénea de las células
de esta forma obtenidas, se efectúa, entonces, una selección de las
células capaces de producir un anticuerpo particular y de
multiplicarse indefinidamente. Cada hibridoma, es multiplica en
forma de un clon, conduciendo, cada uno de ellos, a la producción de
un anticuerpo monoclonal, cuyas propiedades de reconocimiento, con
respecto al antígeno tumoral de interés, podrán someterse a test de
ensayo, por ejemplo en ELISA, mediante inmunotransferencia en una o
en dos dimensiones, en inmunofluorescencia, o con la ayuda de un
biocaptador. Los anticuerpos monoclonales de esta forma
seleccionados, se purifican, a continuación, especialmente, mediante
la técnica de cromatografía de afinidad descrita anteriormente, más
arriba.
Ejemplos de fracciones de anticuerpos compañeros
de enlace de los morcadores tumorales, comprenden los anticuerpos
anti-CA 15-5,
anti-PSA,
anti-alfa-foeto-proteína,
anti-tiroglobulina, anti-CA
19-9 y anti-CA 125.
En el caso del cáncer de mama, en donde, las
células son capaces de liberar la proteína CA 15-3,
se podrán utilizar, como compañeros de enlace, anticuerpos
anti-CA 15-3.
En el caso del cáncer de próstata, en donde, las
células son capaces de secretar el PSA, se podrán utilizar, como
compañeros de enlace, anticuerpos anti-PSA.
En el caso del cáncer de tiroides, en donde, las
células son capaces de secretar la TG, se podrán utilizar, como
compañeros de enlace, anticuerpos anti-TG.
En el caso del cáncer de ovario, en donde, las
células son capaces de secretar CA 125, se podrán utilizar, como
compañeros de enlace, anticuerpos anti-CA 125.
En el caso del cáncer de colorrectal, en donde,
las células son capaces de secretar el CA 19-9 ó el
ACE, se podrán utilizar, como compañeros de enlace, anticuerpos
anti-CA 19-9 y
anti-ACE.
En el caso del hepatocarcinoma, en donde, las
células son capaces de secretar la
alfa-foetoproteína, se podrán utilizar, como
compañeros de enlace, anticuerpos anti-FPA.
La superficie de cultivo, puede contener varios
compañeros de enlace. De una forma preferente, la superficie de
cultivo, contiene hasta cuatro compañeros de enlace diferentes.
Según una forma de realización preferida, la
superficie de cultivo, contiene dos tipos de anticuerpos diferentes,
dirigidos contra antígenos específicos del cáncer de mama, de una
forma preferente, los anticuerpos anti-CA
15-3 y
anti-Cath-D.
La superficie de cultivo, es tal que, ésta,
permite el cultivo de células tumorales. A título de ejemplo, se
pueden citar los microhoyos, las microplacas, las superficies
plásticas y las membranas.
Los microhoyos o la microplaca, pueden estar
constituidas, en sí mismas, de plástico, de tal forma que, los
compañeros de enlace, se fijen directamente a los microhoyos o la
microplaca. Estos pueden igualmente contener una membrana
clásicamente conocida por parte de la persona experta en el arte
especializado de la técnica, la cual es susceptible de poder fijar
los compañeros de enlace. A título de ejemplo, se pueden citar las
membranas en nitrocelulosa y en Immobilon-P
(Millipore Corporation).
La muestra biológica de los pacientes de
interés, se deposita directamente en el fondo de la superficie de
cultivo, o bien, las células no hematopoyéticas, se enriquecen,
antes de la deposición sobre el citado fondo.
En el caso de las extracciones sanguíneas, las
células, se enriquecen, por ejemplo, gracias a una técnica de
separación celular sobre Ficoll, asociada a un depleción de las
células sanguíneas utilizando anticuerpos anti-CD45,
acoplados a bolitas magnéticas (Dynal Biotech ASA, Noruega). En
estas condiciones, pueden enumerarse algunas células circulantes
tumorales, por milímetro de sangre total.
Cualquier otro procedimiento que sea conocido
por parte de la persona experta en el arte especializado de la
técnica, es apropiado, para los fines de la invención.
La enumeración o recuento de células depositadas
sobre la membrana de los microhoyos, se efectúa por hemacitometría
(célula de Thomas, Kovas slide).
Las condiciones de cultivo que permiten la
liberación o la secreción de los marcadores tumorales, son
condiciones clásicas, tales como las correspondientes a 37°C, bajo
atmósfera húmeda, a un 5% de CO_{2}.
La eliminación de las células, después de la
inmunocaptura de los marcadores tumorales mediante los compañeros de
enlace, fijados sobre el fondo de la superficie de cultivo, se
efectúa mediante lavados, consistentes en utilizar tampones de
lavado clásicos, tales como el tampón PBS (Phosfate Buffered Saline
-suero salino tamponado con fosfato-), con albúmina bovina (1%), o
sin ella.
Los conjugados, utilizados después de la
eliminación de las células, son conjugados que con clásicamente
conocidos por parte de la persona experta en el arte especializado
de la técnica.
A título de ejemplo de conjugado, se pueden
citar los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos policlonales.
De una forma preferente, los anticuerpos conjugados, tienen una
especificidad epitópica, diferente de los anticuerpos fijados sobre
el fondo de la superficie de cultivo.
Por marcaje de los conjugados, se entiende la
fijación de un marcador capaz de generar directamente o
indirectamente una señal detectable. Una lista no limitativa de
estos marcadores, consiste en:
- -
- las enzimas que producen una señal detectable por colorimetría, fluorescencia, luminiscencia, como la peroxidasa del rábano silvestre, la fosfatasa alcalina, la \alpha-galactosidasa, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
- -
- los cromóforos, como los compuestos fluorescentes, luminiscentes, colorantes,
- -
- las moléculas radioactivas, como la ^{32}P, la ^{35}S ó la ^{125}I, y
- -
- las moléculas fluorescentes, tales como la alexa o las ficocianinas.
Pueden también utilizarse sistemas indirectos
como, por ejemplo, ligandos capaces de reaccionar con un
anti-ligando. Las parejas ligando/antiligando, son
bien conocidas por la persona experta en el arte especializado de la
técnica, lo cual es el caso, por ejemplo, de las parejas siguientes:
biotina/estreptavidina, haptano/anticuerpo, antígeno/anticuerpo,
péptido/anticuerpo, azúcar/lectina, polinucleótido/complementario de
polinucleótido. En este caso, es el ligando el que porta el agente
de enlace. El anti-ligando, puede detectarse
directamente mediante los marcadores descritos en el párrafo
precedente, o puede él mismo ser detectable por un
ligando/anti-ligando.
Estos sistemas de detección indirectos, pueden
conducir, en ciertas condiciones, a una amplificación de la señal.
Esta técnica de amplificación de la señal, es bien conocida por
parte de la persona experta en el arte especializado de la técnica,
y se podrá hacer referencia a las solicitudes de patente anteriores
FR 98/10 084, ó WO-A-95/08 000 del
solicitante, o al artículo de J. Histochem. Cytochem. 45:
481-491, 1997.
Según el tipo de marcaje del conjugado
utilizado, la persona experta en el arte especializado de la
técnica, añadirá reactivos pertenecientes a la visualización del
marcaje.
Así, por ejemplo, en el caso de las enzimas, es
necesario el proceder a añadir un substrato cromógeno, tal como el
NBT-BCPI, para la fosfatasa alcalina, o el AEC, para
la peroxidasa. La adición del substrato cromógeno, deja entonces
aparecer, en el lugar en donde se encuentra una célula diana, un
precipitado coloreado o inmuno-spot (azul con el
NBT-BCIP, y rojo con el AEC), huella proteica veraz,
dejada por la célula.
El conjunto de los inmuno-spots
presentes en el fondo de la superficie de cultivo, puede
visualizarse y enumerarse (contarse), con la lupa binocular, o
mejor, con la ayuda del equipo KS ELISPOT (Sociedad Carl Zeiss
Vision GmbH), equipado con un microscopio de altas prestaciones y
con una cámara numérica (digital), acoplados a un sistema
informático.
Para el marcaje en fluorescencia, el conjunto de
inmuno-spots, se visualiza, y se enumera (se
contabiliza) con el equipo KS ELISPOT, adaptado al estudio de la
fluorescencia.
Los criterios retenidos para el análisis de
estos "spots" (puntos), incluyen el diámetro, el color, la
forma, la saturación, el contraste y el gradiente de difusión. En
efecto, la densidad y la granulosidad de los spots, decrece desde el
centro hacia la periferia, según un gradiente de difusión muy
característico de un sistema proteico.
En el caso, en donde se encuentran presentes más
de dos compañeros de enlace, en la superficie de cultivo, la
revelación del acoplamiento entre compañero de enlace - marcador
tumoral, se efectúa, de una forma preferente, con anticuerpos
secundarios marcados con fluorocromos.
Así, de este modo, según una forma de
realización preferido de la presente invención, las etapas (iv) a
(v) de la invención, se reemplazan por las etapas siguientes:
- (iv')
- adición de los anticuerpos secundarios marcados con los fluorocromos,
- (v')
- visualización de la fluorescencia, cuando hay acoplamiento entre compañero de enlace y el marcador tumoral.
La enumeración de las células tumorales,
mediante el procedimiento de la invención, permite medir su
capacidad de migración, en los cánceres sólidos. El pronóstico, el
seguimiento de la eficacia de los tratamientos terapéuticos
administrados, la cuantificación de la enfermedad residual y los
diagnósticos de las recaídas infraclínicas y biológicas, en los
cánceres sólidos, se convierten por lo tanto en posibles, gracias al
procedimiento de la invención, debido a su muy grande sensibilidad y
especificidad.
Además, los tumores, pueden liberar células
tumorales circulantes, desde el inicio de su formación, de forma
que, el procedimiento de la invención, permite un diagnóstico precoz
del cáncer.
Correspondiente en consecuencia, otro objeto de
la invención, consiste en la utilización del procedimiento de la
invención, en el diagnóstico precoz y el pronóstico de la patología,
en la elección de la evaluación de la eficacia de los tratamientos
terapéuticos y en el diagnóstico de las recaídas, en el ámbito de
los cánceres sólidos.
Según una forma preferida de presentación, el
procedimiento de la invención, se utiliza en el diagnóstico del
cáncer de mama, de la próstata, de las tiroides, del ovario, del
colon, del recto y del hígado.
Además, el procedimiento de la invención, acopla
un procedimiento de detección específica, con un procedimiento de
cultivo, y permite, por lo tanto, el asegurar un carácter viable y
funcional de las células tumorales detectadas, siendo esta propiedad
importante, en el ámbito del pronóstico.
Otro objeto de la invención, consiste, por lo
tanto, en la utilización de un procedimiento de la invención, para
evaluar el potencial de supervivencia de las células tumorales
circulantes, procedentes de pacientes afectados de cánceres
sólidos.
En efecto, un resultado positivo del
procedimiento, de la invención, evidencia un potencial de vida de
este tipo.
El procedimiento de la invención, puede
aplicarse gracias a un equipo transportable, a modo de "kit" de
diagnóstico, que comprende una superficie de cultivo previamente
revestida de uno o de varios compañeros de enlace de los marcadores
tumorales específicos del cáncer, del cual se quiere efectuar la
investigación, el conjugado o los conjugados correspondientes,
previamente marcados. El equipo transportable a modo de kit, puede
igualmente contener soluciones para el lavado drástico de las
células, después de la inmunocaptura.
En el bien entendido, el procedimiento de la
invención, puede también utilizarse como enumerador de toda célula
tumoral circundante, capaz de liberar o secretar por lo menos un
marcador identificado como marcador tumoral, para el cual existe un
compañero de enlace.
Así, por ejemplo, el procedimiento de la
invención, permite enumerar:
- -
- células tiroideas tumorales, productoras de tiroglobulina (TG) o de calcitonina (CT),
- -
- células hepáticas tumorales, productoras de alfa-foetoproteínas (AFP),
- -
- células testiculares, productoras de AFP o de la hormona crónica ganodotropina (beta-HCS),
- -
- células mamarias tumorales, productoras de CA 15-3, de catepsina D, de PS2, de Her2/neu, de mamaglobina B,
- -
- células ovarias tumorales, productoras de CA-125,
- -
- células prostáticas tumorales, productoras de PSA,
- -
- células tumorales del sistema digestivo (colon, recto, estómago y páncreas), productoras de CA 19-9, CA-125, de CA 19-9 y de ACE, y
- -
- células tumorales del melanoma, productoras de la proteína S 100.
La presente invención, se comprenderá mejor, con
la ayuda de los ejemplos que se facilitan a continuación,
proporcionados únicamente a título ilustrativo y no limitativo, así
como con la ayuda de las figuras 1 a 3 anexadas, en las cuales:
- la figura 1 (1A a 1F), muestra los
inmuno-spots obtenidos según el procedimiento de la
invención, a partir de células tumorales MDC-7,
- la figura 2, muestra los
inmuno-spots obtenidos según el procedimiento de la
invención, a partir de células
CD45(-) de sujetos testigo y de sujetos afectados de cáncer de mama metastásico,
CD45(-) de sujetos testigo y de sujetos afectados de cáncer de mama metastásico,
- la figura 3, muestra los
inmuno-spots obtenidos según el procedimiento de la
invención, en un sujeto, entre aquéllos afectados de cáncer de mama
metastásico.
Ejemplo
1
Se procedió a utilizar la línea
MCF-7, debido al hecho de que, ésta, secreta niveles
elevados de las proteínas Cath-D y MUC1, así como la
línea MDA-MB-231, debido al hecho de
que, ésta, no expresa más que la proteína
Cath-D.
Las líneas celulares MCF-7 y
MDA-MB-231, se mantuvieron en medio
de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, biochrom KG, Berlín,
Alemania), complementado con un 1% de glutamax (Lifes technologies,
Paisley, Escocia), un 10% de suero bovino fetal (Life Technologies),
500 Ul/ml de penicilina y 500 \mug/ml de estreptomicina (Life
Technologies) en un incubador humidificado, que contenía un
porcentaje del 5% de CO_{2}, a una temperatura de
37°C.
37°C.
Se utilizaron placas de microtitulación
(microti-trimetría) de 96 hoyos (Nunc, Roskilde,
Dinamarca), que utilizaban una membrana de
immobilon-P, como fase sólida (Millipore
Corporation, Bedford, MA, USA), las cuales se revistieron de
anticuerpos monoclonales anticatepsina D D7E3 (Garcia, M., Capony,
F. Derocq, D. Simon, D., Pau, B., & Rochefort, H.
Characterization of monoclonal antibodies to the
strogen-regulated Mr 52.000 glycoprotein and their
use in MCF7 cells, -Caracterización de anticuerpos monoclonales, a
la glicoproteína Mr 52.000 regulada con estrógeno, y su uso en
células MCF7-. Cancer Research 45, 709-716 (1985), y
anticuerpos monoclonales anti-CA
15-3 (Dacocytomitation, Francia), y se dejaron toda
la noche a una temperatura de +4°C. Los anticuerpos no enlazados a
la membrana, se eliminaron procediendo a lavar tres veces, con PBS.
Los sitios no ligados, se bloquearon, a continuación, con suero de
albúmina bovina 5% (Sigma-Aldrich, St. Quentin
Fallavier, Francia), durante un tiempo de una hora, a la temperatura
ambiente.
En caso necesario, las líneas celulares, se
trataron con 50 \mug/ml de cicloheximida, sobre un dispositivo que
permitía, a la vez, la inclinación y la rotación, a una temperatura
de 37°C, durante un transcurso de tiempo de una hora, antes de
efectuar las dosificaciones.
Las células viables procedentes de líneas
celulares, se contaron en un hematocitómetro, después de la
coloración por exclusión, al colorante azul tripan y, a
continuación, se diluyeron en serie, en los hoyos en doble, en un
medio de crecimiento, a diferentes concentraciones. Se procedió, a
continuación, a incubar las placas, a una temperatura de 37°C, en
CO_{2}, a un 5%, durante un transcurso de tiempo de 24 horas.
Después del lavado con PBS, se procedió a
añadir, bien ya fuere anticuerpos monoclonales
anti-Cath-DM1G8 (García, M., Capony,
F., Derocq. D., Simon, D., Pau B., & Rochefort, véase
anteriormente, arriba), conjugados con la peroxidasa del rábano
salvaje, o bien ya fuere anticuerpos monoclonales
anti-CAT 15-3 DF3 (Dakocytomation)
conjugados con la fosfatasa alcalina (procedimiento de un color), o
bien ya fuere una mezcla de éstos (procedimiento de dos colores), y
las placas, se incuban a la temperatura ambiente.
Se procedió a añadir, en cada hoyo, el substrato
cromático apropiado, es decir, el juego, a modo de "kit" de
coloración, AEC, (Sigma-Aldrich), para la peroxidasa
del rábano salvaje y la sal de
X-fosfato/5-bromo-4-dicloro-3-indonil-fosfato
toluidina y cloruro de 4-Nitro azul tetrazolium
(BCIP/INTB, Sigma). Se pudieron obtener precipitados insolubles de
color rojo (peroxidasa/presencia de Cath-D), o azul
(fosfatasa alcalina/presencia de CA 15-3), en
5-10 minutos.
Se procedió, a continuación, a lavar las placas
con agua destilada, para parar la reacción.
Los inmuno-spots, se completaron
utilizando el equipo KS ELISPOT. Los hoyos sin células o sin
revestimiento de anticuerpos específicos, se incluyeron en calidad
de testigo.
La figura 1, muestra los resultados obtenidos.
Tal y como se muestra en la figura 1 A-B (1 A para
Cath-D; 1 B para CA 15-3), en donde
se utilizó el procedimiento de un color, permitiendo observar, la
utilización de una combinación de anticuerpos monoclonales
anti-Cath-D y el antígeno CA
15-3, aproximadamente un 15% de las células
MCF-7 que secretan las proteínas
Cath-D y/o CA15-3, después de 24
horas de cultivo en vitro. La adición de cicloheximida,
durante el cultivo, disminuye, a la vez, el tamaño y el número de
spots obtenidos, lo cual confirma una síntesis proteica de novo
(figura 1 C-D, para
Cath-D-CA 15-3,
respectivamente).
Se tomará debida nota, en cuanto al hecho de
que, las células de la línea
MDA-MB-231, no mostraron spots, más
que con los anticuerpos anti-Cath-D
(datos no representados).
Finalmente, la técnica de dos colores (figura 1
E-F), permiten observar el hecho de que, con las
líneas celulares MCF-7, aproximadamente un
porcentaje del 17% de los spots, no son más que spots
"Cath-D" (precipitado de color rojo), un
porcentaje del 82%, no son más que spots "CA 15-3
(MUC-1)" (precipitado de color azul) y un
porcentaje del 1%, son spots dobles "Cath-D" y
"CA 15-3 (MUC-1)"
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Con objeto de determinar el nivel de detección
mínima del procedimiento de la invención, se utilizaron diluciones
en serie de las células de la línea celular MCF-7,
de 100 000, 10 000, 1000, 100, 10 a 1 células por hoyo, y se
procedió la secreción de Cath-D, mediante el
procedimiento de la invención, según el modo operativo descrito en
el ejemplo 1, y mediante la técnica ELISA (CisBioInternational,
Saclay, France), en el sobrenadante de cultivo
correspondiente.
correspondiente.
\newpage
Los resultados, se indican el la tabla 1 que se
facilita a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Tal y como muestra la tabla anterior, con una
dilución de 100.000 a 10.000 células por hoyo, los spots, eran tan
numerosos que éstos no se podían contar, mientras que, la detección
de Cath-D, era posible, con la técnica ELISA. Con
una dilución de 1000 células por hoyo, se contaron aproximadamente
250 spots, correspondientes a células que secretaban
Cath-D (25%), con el procedimiento de la invención,
mientras que, con la técnica ELISA, no se detectó ninguna secreción
de Cath-D. Se observaron resultados idénticos, con
diluciones superiores.
Es conveniente el tomar debida nota en cuanto al
hecho de que, incluso con una sola célula por hoyo, se detectó un
spot, con el procedimiento de la invención, y que se obtuvieron
resultados similares, con la proteína MUC1.
Estos datos, muestran, por lo tanto, el hecho de
que, el procedimiento de la invención, tiene una sensibilidad 10.000
veces superior a la de la técnica ELISA, aplicada a la detección de
marcador tumoral, en el sobrenadante de la célula.
Ejemplo
3
Se procedió a aislar células epiteliales
circulantes, y células mononucleadas periféricas, mediante
centrifugación, por gradiente de densidad
Ficott-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Suecia), de
8-10 ml de muestras sanguíneas procedentes de 16
pacientes que presentaban un cáncer de mama metastásico, tratados en
el Centre de Reserche et de Lutte contre le Cancer, Val de Aurelle,
Montpellier, France.
Se procedió a someter a test de ensayo, la
eficacia del aislamiento de las células epiteliales, de la forma
siguiente: se procedió a diluir, en la sangre de sujetos normales,
células de la línea celular MCF-7 y, a diferentes
concentraciones (1000, 100 y 10 células por ml de sangre). Se
procedió, a continuación, a tratar estas cantidades alícuotas de
sangre, por gradiente de Ficoll-Hypaque, y se
eliminaron las células de origen hematológico, mediante
tri-magnético, procediendo a utilizar bolitas
recubiertas con anticuerpos monoclonales anti-CD45.
Se procedió a investigar las proteínas CA 15-3, en
las células restantes, con el procedimiento de la invención. La
eficacia de la enumeración, mediante el procedimiento de la
invención, fue de un 67%, lo cual evidencia el hecho de que, el
procedimiento de la presente invención, permite la recuperación de
células circulantes raras de origen tumoral.
Se procedió a enriquecer las células no
hematopoyéticas, por depleción de todas las células sanguíneas
CD-45(+), de línea hematopoyética, procedente de las
células mononucleadas periféricas, utilizando anticuerpos
anti-CDS45, con una marcaje magnético, y un
procedimiento de separación magnética, según las recomendaciones de
Dynal Biotech ASA.
Se aplicó el procedimiento de la invención,
sobre las células de esta forma enriquecidas, de pacientes afectados
de cáncer de mama metastásico, y pacientes testigos, según la forma
operativa descrita en el ejemplo 1.
\newpage
Los resultados obtenidos, se proporcionan el la
tabla 2 que se facilita a continuación:
Tal y como se ha indicado en tabla anterior, de
arriba, cuando se procedió a someter a tests de ensayo a los sujetos
testigos, no se detectó ninguna expresión de la proteína
Caht-D, para 5/5 de los sujetos controlados
sometidos a tests de ensayo.
Cuando se observaron los spots CA
15-3 (MUC-1) en 9 pacientes del
mismo grupo, se notaron numerosos spots, cuyo tamaño, era inferior a
1 000 \mum^{2}, para numerosos pacientes (véase la figura 2,
parte superior). Si se trataba de spots CA 15-3
(MUC) en los pacientes afectados de cáncer, se detectaban dos
poblaciones de spots, pequeños spots cuyo tamaño era inferior a 1
000 \mum^{2} y spots más grandes, de un tamaño comprendido entre
1 200 \mum^{2} y más de 7 000\mum^{2} (figura 2, parte
inferior), lo cual sugiere el hecho de que una sola crítica de 1 000
\mum^{2}, podría ser útil para definir una expresión anormal de
MUC1, vía CA 15-3 (figura 2, parte inferior).
Para los 6 pacientes afectados de un cáncer
avanzado, una mayoría de células, no expresaron más que un solo
antígeno tumoral, de 0,2 a 25,5 células por ml de sangre, para la
proteína Cath-D y de 0,5 a 170 células de sangre,
para la proteína CA 15-3, mientras que, sólo 2
pacientes, entre estos 16, expresaron las dos proteínas (figura
3).
Para un paciente explorado en el momento del
primer diagnóstico (es decir, en tratamiento), de un tumor (tamaño
> 2 cm), y con un ganglio centinela invadido, se enumeraron 5,1
spots/ml de sangre, antes de la intervención quirúrgica, y de 0
spots/ml, cuatro días después.
Ejemplo
4
Se utilizó la línea LNCAP, puesto que, ésta
secreta unos niveles elevados de proteína PSA, así como la línea
MCF-7, puesto que, ésta, no expresa la proteína
PSA.
La línea celular LNCAP, se mantuvo en el medio
RPMI (Eurobio, Les Ullis, Francia), complementado QSP 400 ml con 5
ml de glutamina (2 mM), 50 ml de suero bovino fetal (10%), 100 Ul/ml
de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina 2,5 ml de glucosa 100
4,5 ml) y 5 ml de piruvato de sodio 100 mM (1 mM).
La línea celular MC-F, tal y
como se describe en el ejemplo1, se utilizó como testigo.
Las placas de microtitulación de 96 hoyos (Munc,
Roskilde, Dinamarca), las cuales utilizaban una membrana de
Inmobilon-P como fase sólida (Millipore Corporation,
Bedford, MA, USA) se revistieron de anticuerpos monoclonales
anti-PSA (bioMérieux, Marcy l'Etoile, France), y se
dejaron, durante el transcurso de toda la noche, a una temperatura
de +4°C. Los anticuerpos no enlazados a la membrana, se pudieron
eliminar, procediendo a lavar, tres veces, con PBS. Los sitios no
enlazados, se bloquearon, a continuación, con sueroalbúmina bovina
al 5% (Sigma-Aldrich, St. Quentin, Fallavier,
Francia), durante una hora, a la temperatura ambiente.
En caso necesario, las líneas celulares, se
trataron con 50 \mug/ml de cicloheximida, sobre un dispositivo que
permitía, a la vez, la inclinación y la rotación, a una temperatura
de 37°C, durante un transcurso de tiempo de una hora, antes de
efectuar las dosificaciones.
Las células viables procedentes de las líneas
celulares, se contaron, en un hematocitómetro, después de la
coloración por exclusión al colorante azul tripan y, a continuación,
se diluyeron en serie, en los hoyos en doble, en un medio de
crecimiento adecuado, a diferentes concentraciones. Las placas, se
incubaron, a continuación, a una temperatura de 37°C, en CO_{2}, a
un 5%, durante un transcurso de tiempo de 24 horas.
Después del lavado con PBS, se procedió a añadir
anticuerpos monoclonales anti-PSA
(bio-Mérieux), conjugaos con la fosfatasa alcalina
(procedimiento de un color), y las placas, se incubaron a la
temperatura ambiente.
Se procedió a añadir, al interior de cada hoyo,
el substrato cromático apropiado, con la mezcla de sal de
X-fosfato /
5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato
toluidina y cloruro de 4-Nitro azul tetrazolium
(BCIP/NTB, Sigma). Se obtuvieron precipitados insolubles de color
azul, en un tiempo de 5 a 10 minutos.
Se procedió, a continuación, a lavar las placas,
con agua destilada, para parar la reacción.
Los inmuno-spots, se contaron
utilizando un equipo KS ELISPOT. Los hoyos sin células o sin
revestimiento de anticuerpos específicos, se incluyeron, en calidad
de testigo.
Deberá tomarse debida nota en cuanto al hecho de
que, la eficacia del aislamiento de las células epiteliales, se
sometió a test de ensayo, tal y como se indica en el ejemplo 3, la
cual fue de un 70%.
Ejemplo
5
Se procedió a aislar las células epiteliales
circulantes y las células mononucleadas periféricas, por
centrifugación, mediante gradiente de Ficoll-Hypaque
(Pharmacia, Uppsala, Suecia), de 8-10 ml de muestras
sanguíneas procedentes de 10 pacientes que presentaban un cáncer de
próstata metastásico, tratados en la clínica "Beau Soleil", en
la CHU de Montepellier, Francia.
Se procedió a enriquecer las células no
hematopoyéticas, mediante depleción de todas las células sanguíneas
CD45(+) de línea hematopoyética procedente de las células
mononucleadas periféricas y utilizando anticuerpos
anti-CD45, con un marcaje magnético y un
procedimiento de separación magnética, según las recomendaciones de
Dynal Biotech ASA.
Se procedió a aplicar el procedimiento de la
invención, sobre las células de esta forma enriquecidas, de
pacientes afectados del cáncer de próstata, metastásico, y de
pacientes testigos, según el modo operativo descrito en el
\hbox{ejemplo 1.}
Cuando se procedió a someter a test de ensayo a
los sujetos testigos, no se detectó ninguna expresión de la proteína
PSA, para 6/6 de los sujetos sometidos a test de ensayo. Por el
contrario, para 10 pacientes que tenían metástasis óseas, se
demostraron células circulantes secretantes de PSA.
Ejemplo
6
Se utilizó la línea ML-1, puesto
que, ésta, secreta unos niveles elevados de la proteína TG.
La línea celular ML-1, fue
suministrada, de forma gratuita, por el equipo alemán de D. Grimm
(Schonberger J., Bauer J., Spruss T., Weber G., Chahoud I., Billes
C, Grimm D. Establishment and characterization of de follicular
thyroid carcinma cell line ML-1, and
characterization of the follicular thyroid carcinoma cell line
ML-1, -Establecimiento y caracterización del la
línea celular ML-1, del carcinoma tiroideo
folicular, y caracterización de la línea celular del carcinoma
tiroideo folicular-. J. Mol Med 2000:
78(2):102-10).
Ésta se mantuvo en un medio DMEM (4,5 g/l de
glucosa), complementado con un 20% de suero bovino fetal, glutamina
(2 mM, y piruvato de sodio (1 mM).
Las placas de microtitulación de 96 hoyos (Munc,
Roskilde, Dinamarca), las cuales utilizaban una membrana de
Inmobilon-P como fase sólida (Millipore Corporation,
Bedford, MA, USA) se revistieron de anticuerpos monoclonales
anti-PSA (bioMerieux, Marcy l'Etoile, France), y se
dejaron, durante el transcurso de toda la noche, a una temperatura
de +4°C. Los anticuerpos no enlazados a la membrana, se pudieron
eliminar, procediendo a lavar, tres veces, con PBS. Los sitios no
enlazados, se bloquearon, a continuación, con sueroalbúmina bovina
al 5% (Sigma-Aldrich, St. Quentin, Fallavier,
Francia), durante una hora, a la temperatura ambiente.
Las células ML-1, se contaron,
en un hematocitómetro, después de la coloración por exclusión al
colorante azul tripan y, a continuación, se diluyeron en serie, en
los hoyos en doble, en un medio de crecimiento adecuado, a
diferentes concentraciones. Las placas, se incubaron, a
continuación, a una temperatura de 37°C, en CO_{2}, a un 5%,
durante un transcurso de tiempo de 24 horas.
Después del lavado con PBS, se procedió a añadir
anticuerpos monoclonales anti-TG (BioRad, Marnes la
Coquette, Francia), conjugados con la fosfatasa alcalina
(procedimiento de un color), y las placas, se incubaron a la
temperatura ambiente.
Se procedió a añadir, al interior de cada hoyo,
el substrato cromático apropiado (mezcla de sal de
X-fosfato/5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato
toluidina y de cloruro de 4-Nitro azul tetrazolium
(BCIP/NTB, Sigma). Se obtuvieron precipitados insolubles de color
azul, en un tiempo de 5 a 10 minutos.
Se procedió, a continuación, a lavar las placas,
con agua destilada, para parar la reacción.
Los inmuno-spots, se contaron
utilizando un equipo KS ELISPOT. Los hoyos sin células o sin
revestimiento de anticuerpos específicos, se incluyeron, en calidad
de testigo.
Deberá tomarse debida nota en cuanto al hecho de
que, la eficacia del aislamiento de las células epiteliales, se
sometió a test de ensayo, tal y como se indica en el ejemplo 3, la
cual fue de un 70%.
Ejemplo
7
Se procedió a aislar las células epiteliales
circulantes y las células mononucleadas periféricas, por
centrifugación, mediante gradiente de Ficoll-Hypaque
(Pharmacia, Uppsala, Suecia), de 8-10 ml de muestras
sanguíneas procedentes de 15 pacientes que presentaban un cáncer de
tiroides metastásico, tratados en el hospital de Lapeyronie, en la
CHU de Montepellier, Francia.
Se procedió a enriquecer las células no
hematopoyéticas, mediante depleción de todas las células sanguíneas
CD45(+) de línea hematopoyética procedente de las células
mononucleadas periféricas y utilizando anticuerpos
anti-CD45, con un marcaje magnético y un
procedimiento de separación magnética, según las recomendaciones de
Dynal Biotech ASA.
Se procedió a aplicar el procedimiento de la
invención, sobre las células de esta forma enriquecidas, de
pacientes afectados del cáncer de tiroides, metastásico, y de
pacientes testigos, según el modo operativo descrito en el ejemplo
1.
Se incluyeron, en nuestro estudio, únicamente
pacientes que tenían tasas séricas de TG positivo. Se exploraron 15
pacientes, a distancia del tratamiento del tumor primario. Para 5/6
pacientes en evolución metastásica, procedimos a enumerar células
circulantes secretantes de TG; para 3 pacientes, este número de
células, había aumentado, después de la estimulación in vivo,
mediante tirógeno. Para dos pacientes, se enumeraron spots, sin
complicaciones clínicas y con tasas normales de TG.
Ejemplo
8
Se utilizó la línea BG-1, puesto
que, ésta, secreta unos niveles elevados de la proteína CA 125, así
como la línea SKOV3, puesto que, ésta, no expresa la proteína CA
125.
La línea celular BG-1, se
mantuvo en medio McCoy' 5a, que contenía glutamina (1,5 mM) y suero
bovino fetal (10%).
La línea celular SKOV3, se utilizó como testigo.
Ésta se mantuvo en un medio idéntico al citado para la línea
BG-1.
BG-1.
Las placas de microtitulación de 96 hoyos (Munc,
Roskilde, Dinamarca), las cuales utilizaban una membrana de
Inmobilon-P como fase sólida (Millipore Corporation,
Bedford, MA, USA) se revistieron de anticuerpos monoclonales
anti-CA 125 (Dakatomation), y se dejaron, durante el
transcurso de toda la noche, a una temperatura de +4°C. Los
anticuerpos no enlazados a la membrana, se eliminaron, procediendo a
lavar, tres veces, con PBS. Los sitios no enlazados, se bloquearon,
a continuación, con sueroalbúmina bovina al 5%
(Sigma-Aldrich, St. Quentin, Fallavier, Francia),
durante una hora, a la temperatura ambiente.
Las células BG-1, se contaron,
en un hematocitómetro, después de la coloración por exclusión al
colorante azul tripan y, a continuación, se diluyeron en serie, en
los hoyos en doble, en un medio de crecimiento adecuado, a
diferentes concentraciones. Las placas, se incubaron, a
continuación, a una temperatura de 37°C, en CO_{2}, a un 5%,
durante un transcurso de tiempo de 24 horas.
Después del lavado con PBS, se procedió a añadir
anticuerpos monoclonales anti-CA 125
(Dakacitomation), conjugados con la fosfatasa alcalina
(procedimiento de un color), y las placas, se incubaron a la
temperatura ambiente.
Se procedió a añadir, al interior de cada hoyo,
el substrato cromático apropiado (mezcla de sal de
X-fosfato/5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato
toluidina y de cloruro de 4-Nitro azul tetrazolium
(BCIP/NTB, Sigma). Se obtuvieron precipitados insolubles de color
azul, en un tiempo de 5 a 10 minutos.
Se procedió, a continuación, a lavar las placas,
con agua destilada, para parar la reacción.
Los inmuno-spots, se contaron
utilizando un equipo KS ELISPOT. Los hoyos sin células o sin
revestimiento de anticuerpos específicos, se incluyeron, en calidad
de testigo.
Deberá tomarse debida nota en cuanto al hecho de
que, la eficacia del aislamiento de las células epiteliales, se
sometió a test de ensayo, tal y como se indica en el ejemplo 3, la
cual fue de un 70%.
Ejemplo
9
Se utilizaron las líneas Caco2 y
HT-29, puesto que, éstas, secreta unos niveles
elevados de la proteína CA 19-9 y ACE.
Las dos líneas celulares, se sometieron a test
de ensayo, para los dos marcadores celulares.
La línea celular Caco2, se mantuvo en un medio
MEM, con sales de Earles y aminoácidos no esenciales, adicionado con
suero bovino fetal (20%), glutainina (2 mM), piruvato de sodio (1
mM) y bicarbonato sódico (1,5 g/l).
La línea celular HT-29, se
mantuvo en medio McCoy's 5a, que contenía glutamina (1,5 mM) y suero
bovino fetal (10%).
Las placas de microtitulación de 96 hoyos (Munc,
Roskilde, Dinamarca), las cuales utilizaban una membrana de
Inmobilon-P como fase sólida (Millipore Corporation,
Bedford, MA, USA) se revistieron de anticuerpos monoclonales
anti-CA-19-9
(Dalcocytomation) ó anti-ACE (bioMerieux, Marcy
l'Etoile, France), y se dejaron, durante el transcurso de toda la
noche, a una temperatura de +4°C. Los anticuerpos no enlazados a la
membrana, se eliminaron, procediendo a lavar, tres veces, con PBS.
Los sitios no ligados, se bloquearon, a continuación, con
sueroalbúmina bovina al 5% (Sigma-Aldrich, St.
Quentin, Fallavier, Francia), durante una hora, a la temperatura
ambiente.
Las células Caco-2 y
HT-29, se contaron, en un hematocitómetro, después
de la coloración por exclusión al colorante azul tripan y, a
continuación, se diluyeron en serie, en los hoyos en doble, en un
medio de crecimiento adecuado, a diferentes concentraciones. Las
placas, se incubaron, a continuación, a una temperatura de 37°C, en
CO_{2}, a un 5%, durante un transcurso de tiempo de 24 horas.
Después del lavado con PBS, se procedió a añadir
anticuerpos monoclonales anti-CA
19-9, conjugados con la fosfatasa alcalina o
anti-ACE, conjugados con la peroxidasa (bioMérieux,
Marcy, l'Etoile, Francia)(procedimiento de un color), y las placas,
se incubaron a la temperatura ambiente.
Se procedió a añadir, al interior de cada hoyo,
el substrato cromático apropiado (mezcla de sal de
X-fosfato/5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato
toluidina y de cloruro de 4-Nitro azul tetrazolium
(BCIP/NTB, Sigma). Se obtuvieron precipitados insolubles de color
azul, en un tiempo de 5 a 10 minutos. Se procedió, a continuación, a
añadir a cada hoyo, el substrato cromático apropiado para la
peroxidasa, es decir, el juego, a modo de kit de coloración
(Sigma-Aldrich). Se obtuvieron precipitados
insolubles, de color rojo en 10 minutos.
Se procedió, a continuación, a lavar las placas,
con agua destilada, para parar la reacción.
Los inmuno-spots, se contaron
utilizando un equipo KS ELISPOT. Los hoyos sin células o sin
revestimiento de anticuerpos específicos, se incluyeron, en calidad
de testigo.
Deberá tomarse debida nota en cuanto al hecho de
que, la eficacia del aislamiento de las células epiteliales, se
sometió a test de ensayo, tal y como se indica en el ejemplo 3, la
cual fue de un 70%.
Ejemplo
10
Se utilizó la línea hepática, puesto que, ésta,
secreta unos niveles elevados de la alfaproteína.
La línea celular, se mantuvo en un medio, y se
mantuvo en medio RPMI, que contenía glutamina (1,5 mM) y suero
bovino fetal (20%).
Las placas de microtitulación de 96 hoyos (Munc,
Roskilde, Dinamarca), las cuales utilizaban una membrana de
Inmobilon-P como fase sólida (Millipore Corporation,
Bedford, MA, USA) se revistieron de anticuerpos monoclonales
anti-CA-125 (Dakocytomation), y se
dejaron, durante el transcurso de toda la noche, a una temperatura
de +4°C. Los anticuerpos no enlazados a la membrana, se eliminaron,
procediendo a lavar, tres veces, con PBS. Los sitios no ligados, se
bloquearon, a continuación, con sueroalbúmina bovina al 5%
(Sigma-Aldrich, St. Quentin, Fallavier, Francia),
durante una hora, a la temperatura ambiente.
Las células, se contaron en un hematocitómetro,
después de la coloración por exclusión al colorante azul tripan y, a
continuación, se diluyeron en serie, en los hoyos en doble, en un
medio de crecimiento adecuado, a diferentes concentraciones. Las
placas, se incubaron, a continuación, a una temperatura de 37°C, en
CO_{2}, a un 5%, durante un transcurso de tiempo de 24 horas.
Después del lavado con PBS, se procedió a añadir
anticuerpos monoclonales anti-AFP (BioMérieux,
Marcy, l'Etoile, Francia), conjugados con la fosfatasa alcalina
(procedimiento de un color), y las placas, se incubaron a la
temperatura ambiente.
Se procedió a añadir, al interior de cada hoyo,
el substrato cromático apropiado para la preoxidas, a saber, el
juego a modo de kit de coloración AEC
(Sigma-Aldrich). Se obtuvieron precipitados
insolubles de color rojo, en un tiempo de 10 minutos.
Se procedió, a continuación, a lavar las placas,
con agua destilada, para parar la reacción.
Los inmuno-spots, se contaron
utilizando un equipo KS ELISPOT. Los hoyos sin células o sin
revestimiento de anticuerpos específicos, se incluyeron, en calidad
de testigo.
Deberá tomarse debida nota en cuanto al hecho de
que, la eficacia del aislamiento de las células epiteliales, se
sometió a test de ensayo, tal y como se indica en el ejemplo 3, la
cual fue de un 70%.
Claims (21)
1. Procedimiento de detección y/o cuantificación
de células tumorales neoplásicas, no hematopoyéticas, circulantes,
de una muestra biológica, de un paciente afectado de cáncer sólido,
las cuales son capaces de liberar o secretar, in vitro, uno
varios marcadores tumorales, que comprende las etapas consistentes
en:
- (i)
- depositar la citada muestra, en donde se han enumerado las células, en el fondo de una superficie de cultivo, sobre la cual se fija por lo menos un compañero de enlace, específico, o no, del citado o de los citados marcador(es) tumoral(es),
- (ii)
- cultivar las citadas células, en condiciones tales que, las citadas células tumorales neoplásicas, no hemotopoyéticas, liberen o secreten los citados marcadores tumorales que son inmunocapturados en el fondo de la superficie de cultivo,
- (iii)
- eliminar las células, mediante lavado,
- (iv)
- añadir por lo menos un conjugado marcado específico de los citados marcadores tumorales y
- (v)
- visualizar el marcaje de esta forma obtenido.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que, las muestras biológicas,
están constituidas por la sangre o la médula ósea.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado por el hecho de que, los citados marcadores
tumorales, son, o bien ya sea antígenos membranarios capaces de ser
liberados por segmentación, en el fondo de superficie de cultivo, o
bien ya sea antígenos intracelulares que se secretan por las citadas
células, en el fondo de la superficie de cultivo.
4. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que,
como mucho dos cuatro compañeros de enlace diferentes, de una forma
preferente, como mucho dos compañeros, se fijan sobre el fondo de la
superficie de cultivo.
5. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que,
las células tumorales, son capaces de secretar, como marcador
tumoral, el antígeno proteico, PSA, y el compañero de enlace, es un
anticuerpo anti-PSA.
6. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que,
las células tumorales, son capaces de liberar, como marcador
tumoral, el antígeno proteico, CA 15-3, y el
compañero de enlace, es un anticuerpo anti-CA
15-3.
7. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que,
las células tumorales, son capaces de secretar, como marcador
tumoral, el antígeno proteico TG, y el compañero de enlace, es un
anticuerpo anti-TG.
8. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que,
las células tumorales, son capaces de secretar, como marcador
tumoral, el antígeno proteico CA 125, y el compañero de enlace, es
un anticuerpo anti-CA 125.
9. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que,
las células tumorales, son capaces de secretar, como marcador
tumoral, los antígenos proteicos ACE y/ó CA 19-9, y
los compañeros de enlace, son los anticuerpos
anti-ACE y anti-CA
19-9.
10. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que,
las células tumorales, son capaces de secretar, como marcador
tumoral, el antígeno proteico alfa foetoproteina, y el compañero de
enlace, es un anticuerpo anti-AFP.
11. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que,
los compañeros de enlace, son en número de dos, y son, de una forma
preferente, anticuerpos anti-CA 15-3
y anti-Cath-D.
12. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que,
las etapas (iv) a (v), se reemplazan por las etapas siguientes:
- (iv')
- adición de los anticuerpos secundarios marcados con los fluorocromos,
- (v')
- visualizacion de la fluorescencia, cuando hay acoplamiento entre compañero de enlace y marcador tumoral.
13. Utilización in vivo del procedimiento
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el
diagnóstico precoz y el pronóstico de la patología, en la elección
de la evaluación de la eficacia de los tratamientos terapéuticos y
en el diagnóstico de recaídas, en el ámbito de los cánceres
sólidos.
14. Utilización, según la reivindicación 13,
caracterizada por el hecho de que, el cáncer, es el cáncer de
mama.
15. Utilización, según la reivindicación 13,
caracterizada por el hecho de que, el cáncer, es el cáncer de
próstata.
16. Utilización, según la reivindicación 13,
caracterizada por el hecho de que, el cáncer, es el cáncer de
tiroides.
17. Utilización, según la reivindicación 13,
caracterizada por el hecho de que, el cáncer, es el cáncer de
ovario.
18. Utilización, según la reivindicación 13,
caracterizada por el hecho de que, el cáncer, es el cáncer
colorrectal.
19. Utilización, según la reivindicación 13,
caracterizada por el hecho de que, el cáncer, es el cáncer de
hígado.
20. Utilización, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, para evaluar el potencial de supervivencia
de las células tumorales circulantes, procedentes de pacientes
afectados de cánceres sólidos.
21. Utilización de un equipo, a modo de
"kit" de diagnóstico, que comprende una superficie de cultivo
previamente revestida de uno o de varios compañeros de enlace de los
marcadores tumorales específicos del cáncer sólido, del cual se
quiere efectuar la investigación, el conjugado o los conjugados
correspondientes, previamente marcados, para detectar y/o
cuantificar las células tumorales neoplásicas no hematopoyéticas
circulantes de una muestra biológica de un paciente afectado del
citado cáncer sólido.
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