KR20230131424A - Dsg2를 이용한 순환종양세포 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 DSG2에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 순환종양세포 검출용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 DSG2에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 순환종양세포 검출용 조성물은 기존의 순환종양세포 마커인 EpCAM에 음성을 나타내는 암세포/순환종양세포를 모두 검출할 수 있고, 다양한 암종에서 순환종양세포를 정확히 검출 및 분리할 수 있어, 암의 조기 진단, 원발성 암의 종류 및 단계의 분석이 가능하므로 개인 맞춤형 치료에 이용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 DSG2에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 순환종양세포 검출용 조성물에 관한 것이다.
우리나라 암 (악성신생물) 사망자 수는 2002년 우리나라 총 사망자 246,515명 (조사망률 인구 10만 명당 512명) 가운데 25.5% (남성 사망자의 29.6%, 여성 사망자의 20.5%)인 62,887명으로 암으로 인한 사망 (사망률 인구 10만명당 130.7명)이 사망원인 1위를 차지하고 있다. 암 사망순위는 폐암, 위암, 폐암, 대장암 및 췌장암 순으로, 이들 5대 암에 의한 사망이 전체 암 사망의 약 70%를 차지하고 있다. 또한 남성에 있어 주요 암 사망원인은 폐암, 위암, 폐암 및 대장암 등으로 이들 4대 암에 의한 사망자 수 (28,147명)가 전체 남성 암 사망자 수 (40,177명)의 70%를 차지하고 있으며, 여성에 있어 주요 암 사망원인은 위암, 폐암, 폐암, 대장암 및 췌장암 등으로 이들 5대 암에 의한 사망자 수 (13,630명)가 전체 여성 암 사망자 수 (22,710명)의 60%를 차지하고 있다. 이러한 암의 종류는 현재까지 밝혀진 것만 해도 수십 종에 이르며, 주로 발병 조직의 위치에 따라 구분된다. 암은 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이 (metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 암의 종류로는 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 식도암, 취암, 대장암, 폐암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 폐암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암등이 있다. 또한 이러한 암의 발병 기전 또는 형태에 따라 다른 분류 체계에 의해 구분되기도 한다.
암의 전이는 원발소의 암세포가 혈관이나 림프관을 통해 전신에 퍼져, 상기 세포의 일부가 타부위의 장기 등에 생착하여 증식함으로써 일어나며, 이는 혈액을 타고 도는 혈중순환 종양 세포(Circulating Tumor Cell, 이하 CTC)로 인해 발생한다. 혈액 중의 CTC 수는 암의 전이 및 예후와 상관있다는 것이 보고되어 있어, CTC 수의 측정은 전이성암, 예를 들면 전이성 유방암의 예후 및 치료 효과를 예측하는데 유용하다고 보고되어 CTC를 암 진단의 대표적인 마커로 이용하려는 다양한 연구가 최근 이뤄지고 있다. CTC를 검출하는 검사법은 액상 조직검사(Liquid biopsy)에 해당한다. 액상 조직검사는 기존 암 진단에 쓰는 조직검사(tissue biopsy)와는 다르게 혈액, 소변, 침 등의 생체 유체를 활용한다. 조직검사는 자주 시행할 수 없으며 환자에게 부담이 되는 단점이 있었다. 액상 조직검사는 비교적 간단한 방법으로 암을 조기에 진단할 수 있어 새로운 대안으로 주목받고 있다. 하지만 같은 양의 혈액 속에 수십억 개의 적혈구, 수백만 개의 백혈구와 대조적으로 CTC는 수십 개 미만으로 존재해 검출이 매우 어려워, 혈액내 적혈구 109개중에 한 개의 비율로, 극히 미량으로 존재하는 CTC를 세포 손실 없이 정확하게 찾아내서 분리하는 기술이 필요한 실정이다.
한편, 개인들을 특정 질병이나 특정 치료에 대한 반응에 관하여 각 환자의 개별적 특성에 맞춘 의료 치료를 제공하는 것을 맞춤의학이라고 한다. 근대의학에서는 같은 질병의 경우 개개인의 유전형질과 무관하게 같은 의약을 확립된 투여용량 범위 내에서 처방하는 획일적 치료를 해왔었다. 하지만 최근 각종 유전체 프로젝트를 통하여 인체의 질환을 유전자 수준에서 이해할 수 있는 기반이 조성되었으며, 이에 따라 유전적 환경이 다른 환자 개개인에 맞추어 보편적 치료가 아닌 개개인의 유전형질과 각각의 약물반응을 비교해보면서 개인 맞춤형 질병 진단, 치료, 예방하는 맞춤 의학의 시대가 도래하고 있다. 이때, 개별적인 차이를 파악하기 위해서는 개인의 유전형질을 알아야 할 필요가 있고, 이를 위하여 개인의 유전 형질에 대해 분석하기 위해서 먼저 개인의 신체조직을 수집할 필요가 있다. 다만, 종래에는 신체에 천공(구멍)을 내서 생체조직(특히 암 조직과 같은 질병 조직)을 수집하는 침생검병리조직검사(invasive tissue biopsy)를 이용하여 생체조직 수집할 수밖에 없었다. 이는 고가의 방법임은 물론, 환자 신체 내에 침습 기구가 침습해야 하는 점에서 환자가 채집 과정에서 고통스러움은 물론, 암세포의 경우에는 골수 내 암세포를 수집할 필요가 있어서 침습 과정이 환자에게 위험할 수도 있다는 단점이 있었다. 그러나 순환종양세포(circulating tumor cell, CTC)를 수집하는 경우에 단순히 환자의 혈액만 채취하면 되므로 침습 기구가 환자의 신체 내에 침습하지 않아 간편하고, 안전하다. 나아가, 혈액을 채취하는 것은 단시간 내에 가능하므로 시간도 절약되어 항암제 반응의 결과에 기초하여 개개인에게 맞는 항암제 선별하는 전체 과정의 시간이 단축되어 경제적인 측면 또한 존재한다.
본 발명의 목적은 순환종양세포 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 혈액 내에서 CD45 양성 세포로부터 순환종양세포를 분리하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 암세포 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 순환종양세포 검출 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 Epcam 음성 순환종양세포 검출 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 원발성 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 개인 맞춤형 항암제 선정 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 DSG2에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 순환종양세포 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 혈액 내에서 CD45 양성 세포 또는 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)로부터 순환종양세포를 분리하기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 암세포 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 순환종양세포 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 Epcam 음성 순환종양세포 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 원발성 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 개인 맞춤형 항암제 선정 방법을 제공한다.
본 발명의 DSG2에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 순환종양세포 검출용 조성물은 기존의 순환종양세포 마커인 EpCAM에 음성을 나타내는 암세포/순환종양세포를 모두 검출할 수 있고, 다양한 암종에서 순환종양세포를 정확히 검출 및 분리할 수 있어, 암의 조기 진단, 원발성 암의 종류 및 단계의 분석이 가능하므로 개인 맞춤형 치료에 이용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 Epcam 양성 및 음성 암세포를 웨스턴 블롯 분석으로 분류한 도이다.
도 2 및 3은 DSG2 항체의 EpCAM 음성(EpCAM(-)) 암세포 검출능을 확인한 도이다.
도 4는 DSG2 항체의 EpCAM 양성 암세포 검출능을 확인한 도이다.
도 5는 in vitro CTC 모방 모델에서 DSG2 항체의 CTC 검출능을 확인한 도이다.
도 2 및 3은 DSG2 항체의 EpCAM 음성(EpCAM(-)) 암세포 검출능을 확인한 도이다.
도 4는 DSG2 항체의 EpCAM 양성 암세포 검출능을 확인한 도이다.
도 5는 in vitro CTC 모방 모델에서 DSG2 항체의 CTC 검출능을 확인한 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
일 측면에서, 본 발명은 DSG2(desmoglein-2)에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 순환종양세포(circulating tumor cells, CTC) 검출용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 Epcam(Epithelial cell adhesion molecule) 음성 순환종양세포를 검출하기 위한 조성물일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 혈액 내에서 CD45 양성 세포를 검출하지 않을 수 있으며, 상기 CD45 양성 세포는 혈구세포일 수 있다.
일 구현예에서, 순환종양세포는 대장암, 난소암, 췌장암 또는 폐암 세포 유래일 수 있다.
일 구현예에서, 표지를 추가로 포함할 수 있으며, 표지는 형광 물질, 프로브 또는 택(tag)일 수 있다. 상기 표지 물질은 본 기술 분야에서 알려진 어떠한 방법에 의해 검출될 수 있는 어떠한 화학적 모이어티라도 될 수 있다. 검출가능한 표지의 예는 분광(spectroscopy), 광화학(photochemistry)에 의해 또는 생화학적(biochemical), 면역학적(immunochemical) 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 어떠한 모이어티라도 포함될 수 있다. 핵산 프로브에 표지하는 적절한 방법은 상기 표지의 종류 및 상기 표지의 위치 및 프로브에 따라 선택될 수 있다. 표지의 예는 효소, 효소 기질, 동위원소물질, 형광 다이, 발색단(chromophores), 화학발광 표지(chemiluminescent label), 전기화학적 발광 표지(electrochemical luminescent label), 특이적인 결합 파트너를 갖는 리간드, 및 서로 반응하여 검출 신호의 강도를 증가, 변형 또는 감소시킬 수 있는 기타 표지를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광 물질일 수 있으며, 형광 물질은 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP) 또는 변형된 적색 형광 단백질(modified red fluorescent protein; mRFP)일 수 있다.
일 구현예에서, DSG2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 서열번호 2의 핵산으로 코딩될 수 있다.
일 구현예에서, 순환종양세포는 혈중 순환종양세포일 수 있다.
본 발명에서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어, "순환종양세포 검출용"은 "순환종양세포 분리용" 및 "순환종양세포 동정용"과 서로 교차 또는 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "검출하다", "검출하는" 또는 "검출"은 검출가능하게 표지된 조성물의 발견 또는 식별 또는 특이적 관찰의 일반적 실시를 기재하는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 면역학적 활성을 가진 단편은 Fab, Fd, Fab', dAb, F(ab'), F(ab')2, scFv(single chain fragment variable), Fv, 단일쇄 항체, Fv 이량체, 상보성 결정 영역 단편, 인간화 항체, 키메라 항체 및 디아바디(diabody)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 항체는 전체(whole) 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합(disulfide bond)으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변영역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변영역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) WO94/13804) 등을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 동물 유래 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 및 이들의 면역학적 활성을 가진 단편으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 항체는 재조합적 또는 합성적으로 생산된 것일 수 있다.
본 발명에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서, 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 자연적 또는 비자연적(예컨대, 합성적 또는 재조합적)으로 얻어질 수 있다. 항체는 생체 외뿐 아니라 생체 내에서도 매우 안정하고 반감기가 길기 때문에 대량 발현 및 생산에 유리하다. 또한, 항체는 본질적으로 다이머(dimer) 구조를 가지므로 접착능(avidity)이 매우 높다. 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
일 측면에서, 본 발명은 DSG2에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는, 혈액 내에서 CD45 양성 세포로부터 순환종양세포를 분리하기 위한 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 순환종양세포는 Epcam 음성 순환종양세포일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 DSG2에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는, 암세포 검출용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 암세포는 Epcam 양성 암세포 또는 Epcam 음성 암세포일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 순환종양세포 검출용 조성물을 포함하는 순환종양세포 검출용 키트에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 개체로부터 분리된 시료에 DSG2에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 처리하는 단계를 포함하는 순환종양세포 검출 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 양수, 타액, 복수, 골수, 누액, 담즙, 폐세척액, 뇌척수액, 흉수, 활액, 림프, 정액, 뇨, 또는 조직 생검 또는 세포로부터 단백질을 추출한 용액일 수 있으며, 혈액인 것이 가장 바람직하다.
일 구현예에서, 상기 순환종양세포는 대장암, 난소암, 췌장암 또는 폐암 세포 유래 순환종양세포일 수 있다.
일 구현예에서, CD45 양성 세포로부터 순환종양세포를 검출할 수 있으며, 상기 CD45 양성 세포는 혈구세포일 수 있다.
일 구현예에서, 순환종양세포는 Epcam 음성 암세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 순환종양세포 검출 방법은 개체의 혈액 내에 존재하는 순환종양세포를 검출 및 분리 동정하는 방법을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 개체로부터 분리된 시료에 DSG2에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 처리하는 단계를 포함하는 Epcam 음성 순환종양세포를 검출하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 방법은 혈액 내에서 CD45 양성 세포를 검출하지 않을 수 있으며, 상기 CD45 양성 세포는 혈구세포일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 시료에 본 발명의 순환종양세포 검출용 조성물을 처리하는 단계; 2) 시료 내 DSG2 양성 세포를 분리하는 단계; 3) 분리한 세포를 배양하는 단계; 및 4) 원발성 암을 판단하는 단계를 포함하는, 원발성 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 원발성 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계(central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 다형성교모세포종 및 뇌하수체선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 시료에 본 발명의 순환종양세포 검출용 조성물을 처리하는 단계; 2) 시료 내 DSG2 양성 세포를 분리하는 단계; 및 3) 분리한 세포의 게놈 시퀀싱을 수행하여 유전적 변이를 검출 및 분석하는 단계를 포함하는, 개인 맞춤형 치료를 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 게놈 시퀀싱은 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing: NGS)으로 수행될 수 있으며, 전체 게놈 시퀀싱(whole genome sequencing, WGS)으로 수행되는 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 개인 맞춤형 치료를 위한 정보는 암 진단, 암 예후 예측, 암 경과 모니터링, 약물 반응성, 치료 효과 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개체" 또는 "개인"이란, 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다.
일 측면에서, 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 시료에 본 발명의 순환종양세포 검출용 조성물을 처리하는 단계; 2) 시료 내 DSG2 양성 세포를 분리하는 단계; 및 3) 분리한 세포를 배양하는 단계; 4) 배양된 세포에 후보 항암제를 반응시키는 단계; 5) 후보 항암제 반응을 분석하는 단계; 및 6) 분석된 후보 항암제 반응 정보를 활용하여 개인 맞춤형 항암제를 선별하는 단계를 포함하는, 개인 맞춤형 항암제 선정 방법에 관한 것이다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. Epcam 양성 및 음성 암세포 분류
종래의 CTC 검출 마커인 Epcam을 양성/음성 암세포들을 분류하기 위해, HCT116 (대장암 세포), DLD-1 (대장암 세포), HT29 (대장암 세포), SW480 (대장암 세포), A2780 (난소암 세포), A549 (폐암 세포) 및 H460 (폐암 세포)의 암세포와 음성 대조군으로서 Raw 264.7 (mouse macrophage) 및 Jurkat (human T cell) 세포를 이용하였다. 구체적으로, PBMC 및 각 암세포주들을 차가운 PBS로 두 번 세척하고 RIPA 버퍼 (R0902;CURENBIO)를 사용해 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 얼음 위에서 10분 동안 인큐베이션하고 Ep 튜브로 옮긴 후 15,000g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 이 후 상등액을 새로운 Ep 튜브로 옮기고 Protein assay dye reagent concentrate (Bio-Rad)를 사용하여 세포 용해물의 단백질 농도를 맞췄다. 동일한 양의 단백질을 10% 폴리아크릴아마이드 젤에 넣고 전기영동으로 단백질을 크기별로 분리한 후 분리된 단백질을 wet-transfer을 사용하여 젤에서 PVDF 멤브레인(membrane) (Merck Millipore)으로 이동시켰다. 멤브레인을 실온에서 30분 동안 5% (wt/vol)의 무지방 분유로 블로킹하고 TBS-Tween 20 (0.05% vol/vol)으로 세척한 뒤, 멤브레인을 EpCAM (mouse monoclonal, sc-25308; Santa Cruz Biotechnology. 1:1000 희석), Vimentin (mouse monoclonal, 550513; BD Pharmingen™. 1:2000 희석) 및 actin (goat polyclonal, sc-1616; Santa Cruz Biotechnology. 1:1000 희석)에 특이적인 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이 후, 멤브레인을 5분씩 3회 세척하고, 2차 항체 (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, CSB-PA644737; CUSABIO ,1:10000 희석 또는 Rabbit anti-Goat IgG, ab6741; Abcam, Cambridge, UK. 1:10000 희석)와 반응시켰다. 멤브레인을 5분간 3회 세척한 후 Luminol reagent (sc-2048; Santa Cruz Biotechnology)을 사용해 단백질 밴드를 검출하였다.
그 결과, HT-29, SW480, DLD-1 및 HCT-116는 EpCAM을 고발현하는 EpCAM 양성 (EpCAM(+)) 암세포로 나타났으며, A549, H460, SN12C-Pm6 및 A2780은 EpCAM을 거의 발현하지 않는 EpCAM 음성 (EpCAM(-)) 암세포로 나타났다 (도 1).
실시예 2. DSG2 항체의 암세포 검출능 확인
2-1. EpCAM 음성 암세포 검출능 확인
DSG2 항체가 기존의 마커인 EpCAM의 발현이 거의 없는 암세포를 검출할 수 있는지 확인하기 위해, EpCAM 음성 암세포주인 MIA Paca 2 (췌장암 세포), SKOV3 (난소암 세포) 및 A549를 이용하여 면역형광분석을 수행하였다. 구체적으로, 각 세포주들을 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드 (pH 7.4)로 고정시키고, 고정된 세포를 1xPBS로 두 번 세척한 후 1xPBS로 희석한 3% BSA(bovine serum albumin)으로 30분 동안 실온에서 블로킹하였다. PBS로 2번 세척한 후 1% BSA로 희석한 1차 항체인 항-EpCAM 항체 (mouse monoclonal, sc-25308; Biotechnology. 1:400 희석) 및 항-DSG2 항체 (mouse monoclonal, sc-80663; Santa Cruz Biotechnology. 1:400 희석)와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하여 반응시켰다. 1차 항체와 반응시킨 뒤 세포를 PBS로 두 번 세척하고 적절한 농도로 희석한 2차 항체인 goat anti-mouse Alexa Fluor 488 (A32723 ;Termo Fisher Scientifc, Inc. 1:400희석)와 어두운 곳에서 1시간 동안 반응시켰다. DAPI 염색을 위해 세포에 1xPBS로 재현탁된 세포에 Hoechst 33342594 (Termo Fisher Scientifc, Inc. #62249)를 첨가해주었다. 슬라이드 유리 위에 적정양의 세포 현탁액을 분주하고 커버 글라스로 덮어 200X 대물렌즈가 장착된 형광 현미경을 사용하여 관찰 및 이미지를 촬영하였다.
그 결과, EpCAM 음성인 암세포주 MIA Paca 2, SKOV3 및 A549를 DSG2 항체로 검출이 가능한 것으로 나타났다 (도 2 및 3).
2-2. EpCAM 양성 암세포 검출능 확인
DSG2 항체가 EpCAM 양성 암세포를 검출할 수 있는지 확인하기 위해, EpCAM 양성 암세포주인 DLD-1 및 HT-29를 이용하여 상기 실시예 2-1과 같은 방법으로 면역형광분석을 수행하였다. 이 때, 혈구세포도 DSG2를 발현하는지 검증하기 위해 1차 항체 CD45(mouse monoclonal, sc-1178; Santa Cruz Biotechnology. 1:500 희석)를 사용하였다.
그 결과, 혈구세포는 DSG2를 발현하지 않는 것으로 나타났으며, DSG2 항체가 EpCAM 양성 암세포주인 DLD-1 및 HT-29도 검출 가능한 것을 확인하였다 (도 4).
이를 통해, DSG2 항체가 혈구세포는 검출하지 않으면서, EpCAM 양성 암세포주를 검출할 수 있고, 특히, 기존의 마커인 EpCAM를 거의 발현하지 않는 음성 암세포주까지 검출할 수 있는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 3. DSG2 항체의 EpCAM 음성 CTC 검출능 확인
EDTA 튜브에 수집된 혈액 10ml를 준비하여 두 개의 50ml 코니칼 튜브 각각에 혈액을 5ml씩 분주한 뒤, RBC 용해 버퍼 (NH4CL 8024mg/L, KHCO3 1001mg/L, EDTA·NA2·2H2O 37.72mg/L in DW) 45ml을 각 튜브에 첨가하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 불투명한 혼합물이 투명하고 진한 빨간색으로 변하면 300xg로 5분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고, 세포 펠렛을 각각 차가운 1 x PBS 10 ml로 2회 세척하여 PBMC를 분리하였다. EpCAM 음성 인간 대장암 세포주인 RKO를 1xPBS로 세척하고 스크래퍼(scraper)로 긁어 세포 배양 플레이트에서 세포를 떼어내어 300xg로 5분 동안 원심분리하였다. 상기 혈액에서 준비한 PBMC와 RKO를 적절한 부피의 차가운 1xPBS으로 각각 재현탁하고 트라이판 블루(Trypan blue) (Termo Fisher Scientifc, Inc. #15250061)를 사용해 PBMC 및 암세포의 세포수를 계산하였다. 그 후, PBMC 및 암세포를 10:1의 세포수 비율로 혼합하여 in vitro CTC 모방 모델을 준비하였다. 그 뒤, 항-EpCAM 항체 (Red) 및 항-DSG2 항체 (Green)를 이용하여 CTC를 검출하였다.
그 결과, DSG2 항체가 EpCAM 음성 암세포주를 검출하고, 혈구세포는 검출하지 않아 (도 5), CTC만 선별적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
Claims (22)
- DSG2(desmoglein-2)에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 순환종양세포(circulating tumor cells, CTC) 검출용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 Epcam(Epithelial cell adhesion molecule) 음성 순환종양세포를 검출하기 위한, 순환종양세포 검출용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 혈액 내에서 CD45 양성 세포를 검출하지 않는 것인, 순환종양세포 검출용 조성물.
- 제 3항에 있어서, 상기 CD45 양성 세포는 혈구세포인, 순환종양세포 검출용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 순환종양세포는 대장암, 난소암, 췌장암 또는 폐암 세포 유래인, 순환종양세포 검출용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 표지를 추가로 포함하는, 순환종양세포 검출용 조성물.
- 제 6항에 있어서, 표지는 형광 물질, 프로브 또는 택(tag)인, 순환종양세포 검출용 조성물.
- DSG2에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는, 혈액 내에서 CD45 양성 세포로부터 순환종양세포를 분리하기 위한 조성물.
- 제 8항에 있어서, 상기 순환종양세포는 Epcam 음성 순환종양세포인, 혈액 내에서 CD45 양성 세포로부터 순환종양세포를 분리하기 위한 조성물.
- DSG2에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는, 암세포 검출용 조성물.
- 제 10항에 있어서, 암세포는 Epcam 양성 암세포 또는 Epcam 음성 암세포인, 암세포 검출용 조성물.
- 제 1항의 순환종양세포 검출용 조성물을 포함하는 순환종양세포 검출용 키트.
- 개체로부터 분리된 시료에 DSG2에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 처리하는 단계를 포함하는 순환종양세포 검출 방법.
- 제 13항에 있어서, 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 양수, 타액, 복수, 골수, 누액, 담즙, 폐세척액, 뇌척수액, 흉수, 활액, 림프, 정액, 뇨, 또는 조직 생검 또는 세포로부터 단백질을 추출한 용액인, 순환종양세포 검출 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 순환종양세포는 대장암, 난소암, 췌장암 또는 폐암 세포 유래인, 순환종양세포 검출 방법.
- 제 13항에 있어서, CD45 양성 세포로부터 순환종양세포를 검출하는, 순환종양세포 검출 방법.
- 제 13항에 있어서, 순환종양세포는 Epcam 음성 암세포를 포함하는, 순환종양세포 검출 방법.
- 개체로부터 분리된 시료에 DSG2에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 처리하는 단계를 포함하는 Epcam 음성 순환종양세포 검출 방법.
- 제 18항에 있어서, CD45 양성 세포를 검출하지 않는, Epcam 음성 순환종양세포 검출 방법.
- 1) 개체로부터 분리된 시료에 제 1항의 순환종양세포 검출용 조성물을 처리하는 단계;
2) 시료 내 DSG2 양성 세포를 분리하는 단계;
3) 분리한 세포를 배양하는 단계; 및
4) 원발성 암을 판단하는 단계를 포함하는, 원발성 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법. - 제 20항에 있어서, 원발성 암은 대장암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 뇌종양, 두경부암, 흑색종, 골수종, 백혈병, 림프종, 위암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골암, 피부암, 두부암, 경부암, 피부흑색종, 안구내흑색종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 중추신경계(central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수종양, 다형성교모세포종 및 뇌하수체선종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 원발성 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
- 1) 개체로부터 분리된 시료에 제 1항의 순환종양세포 검출용 조성물을 처리하는 단계;
2) 시료 내 DSG2 양성 세포를 분리하는 단계; 및
3) 분리한 세포를 배양하는 단계;
4) 배양된 세포에 후보 항암제를 반응시키는 단계;
5) 후보 항암제 반응을 분석하는 단계; 및
6) 분석된 후보 항암제 반응 정보를 활용하여 개인 맞춤형 항암제를 선별하는 단계를 포함하는, 개인 맞춤형 항암제 선정 방법.
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