CN102869682B - 单克隆抗体及其诊断用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及针对黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)和滑膜肉瘤X断裂点2(SSX‑2)抗原的抗体，其使用方法和诊断试剂盒。在示例性实施方案中，本公开涉及针对PRAME和SSX‑2抗原的特异性表位的单克隆抗体及使用这种抗体的方法。

Description

单克隆抗体及其诊断用途
发明领域
本公开涉及黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)和滑膜肉瘤X断裂点2(SSX-2)抗原的抗体，其使用方法和诊断试剂盒。尤其，本公开涉及针对PRAME和SSX-2抗原的特异性表位的单克隆抗体及使用这种抗体的方法。
背景
美国癌症协会估计今年将诊断出几乎150万例新发癌症。这包括膀胱的原位癌而不包括其他位点的癌如基底细胞和扁平细胞皮肤癌。大约每两名美国男性中的一个以及每三名美国女性中的一个在其一生中的某个点将患有某种类型的癌症。
定位癌症的一种手段是通过早期筛查和检测以及在疾病早期阶段的诊断，这允许对更晚期疾病的治疗和预防。许多癌症当在早期被检测、筛查或诊断出时，可以被更成功的治疗。尽管存在许多治疗方法，但仍需要其他工具从而用适当的治疗方法更好的帮助预防、筛查、诊断和定位癌症。这样的工具，例如，包括癌症睾丸家族的肿瘤相关抗原，对其的体液和细胞免疫应答已经在患有不同类型癌症的患者中观察到。
使用肿瘤相关抗原特异性疫苗的临床试验在进行中，并显示有希望的初步结果。对于被用于治疗表达靶向的肿瘤相关抗原的肿瘤的疫苗，其可以用于确定患者的肿瘤表达的是哪种TAA。检测肿瘤组织中特异性TAA的表达水平为获得患者肿瘤中TAA的表达谱提供了方便的方法。因此，可以辅助这样的癌症疗法的诊断工具是有价值的。
本公开概述
本公开的一些实施方案涉及特异性结合PRAME肿瘤相关抗原的表位的抗体。本公开的一些实施方案涉及特异性结合SSX-2肿瘤相关抗原的表位的分离的抗体。
一些实施方案涉及抗PRAME抗体，或其一种或多种其抗原结合片段，其特异性结合包含PRAME抗原的氨基酸残基123-132(SEQ ID NO：1)的表位。一些实施方案涉及抗PRAME抗体，或其一种或多种其抗原结合片段，其特异性结合包含PRAME抗原的氨基酸残基276至286(SEQ ID NO：2)的表位。
一些实施方案涉及抗SSX-2抗体，或其一种或多种其抗原结合片段，其特异性结合包含SSX-2抗原的氨基酸残基41-49(SEQ ID NO：3)的表位。一些实施方案涉及抗SSX-2抗体，或其一种或多种其抗原结合片段，其特异性结合包含SSX-2抗原的氨基酸残基120至128(SEQ ID NO：4)的表位。
在一些实施方案中，本文公开的抗体或包含其抗原结合部分的多肽是单克隆抗体。在一些实施方案中，本文公开的抗体是鼠抗体。在一些实施方案中，本文公开的抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，本文公开的抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，本文公开的抗体是人抗体。
在一些实施方案中，抗PRAME抗体或包含其抗原结合部分的多肽特异性结合SEQID NO：1。在一些实施方案中，抗PRAME抗体或包含其抗原结合部分的多肽特异性结合SEQID NO：2。在一些实施方案中，抗PRAME抗体是鼠单克隆抗体。在一些实施方案中，抗PRAME抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗PRAME抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗PRAME抗体是人抗体。
在一些实施方案中，抗SSX-2抗体，或包含其抗原结合部分的多肽特异性结合SEQID NO：3。在一些实施方案中，抗SSX-2抗体，或包含其抗原结合部分的多肽，特异性结合SEQID NO：4。在一些实施方案中，抗SSX-2抗体是鼠单克隆抗体。在一些实施方案中，抗SSX-2抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗SSX-2抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗SSX-2抗体是人抗体。
在一些实施方案中，本文公开的抗体与标记相连。在一些实施方案中的一个实施方案中，该标记是可检测标记物或可检测的试剂。在一些实施方案中，该标记可以结合作为可检测标记物的另一个分子/或被作为可检测标记物的另一个分子结合。在一些实施方案中，该标记可以包括与可检测标记物缀合或连接的分子。
在一些实施方案中，所述方法是用于检测肿瘤相关抗原PRAME表达的方法。在一些实施方案中，所述方法是用于检测肿瘤相关抗原SSX-2表达的方法。在一些实施方案中，所述方法是用于检测肿瘤相关抗原PRAME和SSX-2表达的方法。因此，一些实施方案涉及检测受试者中肿瘤相关抗原PRAME、SSX-2或两者表达的方法。一些实施方案涉及检测生物样品中肿瘤相关抗原PRAME、SSX-2或两者表达的方法。该方法包括用本文所述抗体接触生物样品(例如在样品中获得的细胞或组织中、)并检测与样品中包含的抗原结合的抗体，由此检测肿瘤相关抗原的表达。在一些实施方案中，该方法包括从受试者获得生物样品，例如从哺乳动物，如从人。
在一些实施方案中，该受试者患有癌症。在一些实施方案中，癌症可以是但不限于：黑色素瘤(melanoma)、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肝癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、眼黑色素瘤、激素敏感性(hormone sensitive)和激素不应性(hormone refractory)前列腺癌、肾细胞癌(renal cell carcinoma)、食道癌、子宫内膜癌(endometrial cancer)、子宫癌(uterine cancer)、淋巴瘤(lymphoma)、软组织肉瘤(soft tissue sarcoma)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、胆囊癌(gallbladder cancer)、甲状腺癌、间皮瘤等。在一些实施方案中，生物样品可以是但不限于：活检样品，组织(如肿瘤组织)，细胞(如癌症或肿瘤细胞)，血液，腹水，胸膜液，可溶蛋白质等。在一些实施方案中，PRAME、SSX-2或两者的表达由免疫荧光显微术、免疫细胞化学、免疫沉淀法、免疫组织化学、ELISA(酶联免疫吸附测定)、FACS(荧光激活细胞分类器)分析等检测。
一些实施方案涉及生产如本文所公开的单克隆抗体的杂交瘤。因此，一些实施方案涉及生产特异性结合具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的序列的肽的单克隆抗体的杂交瘤。
本公开的一些实施方案涉及包含本文所公开的抗体的诊断试剂盒。例如，一些实施方案涉及这样的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含特异性结合包含PRAME抗原的氨基酸残基123-132(SEQ ID NO：1)的表位的抗PRAME抗体或其一种或多种其抗原结合片段。一些实施方案涉及这样的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含特异性结合包含PRAME抗原的氨基酸残基276至286(SEQ ID NO：2)的表位的抗PRAME抗体或其一种或多种其抗原结合片段。本公开的一些实施方案涉及这样的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含特异性结合包含SSX-2抗原的氨基酸残基41-49(SEQ ID NO：3)的表位的抗SSX-2抗体或其一种或多种其抗原结合片段。一些实施方案涉及这样的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含特异性结合包含SSX-2抗原的氨基酸残基120至128(SEQ ID NO：4)的表位的抗SSX-2抗体或其一种或多种其抗原结合片段。
本公开的一些实施方案涉及可操作地编码本文所公开的抗体或其抗原结合片段的核酸工具或分子。该核酸工具或分子可以包括质粒。在一些实施方案中，抗PRAME抗体或其一种或多种其抗原结合片段，特异性结合包含PRAME抗原的氨基酸残基123-132(SEQ IDNO：1)的表位，或该表位的部分。在一些实施方案中，抗PRAME抗体或一种或多种其抗原结合片段，特异性结合包含PRAME抗原的氨基酸残基276至286(SEQ ID NO：2)的表位，或该表位的部分。
本公开的一些实施方案涉及可操作地编码本文所公开的抗体或其抗原结合片段的核酸工具或分子。该核酸工具或分子可以包括质粒。在一些实施方案中，抗SSX-2抗体或其一种或多种其抗原结合片段，特异性结合包含SSX-2抗原的氨基酸残基41-49(SEQ IDNO：3)的表位，或该表位的部分。在一些实施方案中，抗SSX-2抗体或其一种或多种其抗原结合片段，特异性结合包含SSX-2抗原的氨基酸残基120至128(SEQ ID NO：4)的表位，或该表位的部分。
附图简述
图1.描绘PRAME276-286表位的最小表位作图。对于每种类型肽或没有肽或阴性对照，分析连续稀释液：1∶50(第一列)，1∶100(第二列)，1∶500(第三列)以及1∶1000(第四列)。
图2.在用对PRAME276-286表位特异的抗体检验的黑色素瘤样品中的免疫组织化学染色。
图3.描绘SSX241-49的最小表位作图。对于每种类型肽或没有肽或阴性对照，分析连续稀释液：1∶500(第一列)，1∶1000(第二列)，1∶5000(第三列)以及1∶25000(第四列)。
图4.描绘SSX-241-49单克隆抗体不与其他SSX家族成员交叉反应。对于另一个SSX家族成员的每种类型肽或没有肽，分析连续稀释液：1∶1(第一列)，1∶10(第二列)，1∶50(第三列)以及1∶200(第四列)。
图5.描绘SSX2120-128的最小表位作图。对于每种类型肽或没有肽，分析连续稀释液：1∶100(第一列)，1∶200(第二列)，1∶400(第三列)以及1∶500(第四列)。
图6.描绘SSX-2120-128单克隆抗体与其他SSX家族成员的交叉反应性。对于另一个SSX家族成员的每种类型肽或没有肽，分析连续稀释液：1∶1(第一列)，1∶10(第二列)，1∶50(第三列)以及1∶200(第四列)。
详述
定义
除非明显不同于本文中使用术语的语境，以下列出的术语通常应当具有就本说明书所指定的含义。
术语“抗体”或“抗体”当用于本文时是领域公认术语并被理解为是指结合抗原的分子或分子的活性片段，尤其是免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特异性结合抗原的结合位点的分子。在一些实施方案中，该定义包括抗血清或免疫血清。
术语“单克隆抗体”是本领域中所公知的术语并且是指来自单克隆的抗体。单克隆抗体通常通过将正常的短命的抗体生产B细胞与快速生长的细胞如癌细胞(有时称作“永生”细胞)融合来制备。所得的杂交细胞或杂交瘤繁殖迅速，产生生产大量抗体的克隆。
当用于本文时，当用作本文所述的组分(例如，抗体、抗原结合部分、编码其的核酸、细胞、载体等)的修饰语时，术语“分离的”是指该组分由人手工制备或分离自其天然存在的体内环境。术语“分离的”是指基本或基本上不含当于其天然状态发现时通常伴随其的组分的物质(例如，生物分子)。
术语“杂交瘤”是领域公认的并被本领域普通技术人员理解为是指通过将抗体生产细胞与永生细胞(例如，多发性骨髓瘤细胞)融合而产生的细胞。此杂交细胞能够产生抗体的连续供应。
术语“表位”是指在抗原上为抗体或抗原受体所识别的位点。
术语“特异性结合”当用于本文时是指抗体结合相应表位的行为并且意欲排除可能在随机蛋白之间发生的低水平、非特异性结合。“特异性结合”当用于本文时不是指且不意味着抗体将不结合除本文所公开的表位以外的任何表位。
术语“检测(detecting)”或“检测(detected)”当用于本文时是指将已知技术用于检测生物分子如免疫化学或组织学方法并且是指定量或定性确定所研究生物分子的存在、流行或浓度。
当用于本文时，术语“标记”或“标记的”是指将另一种分子结合到抗体中。在一些实施方案中的一个实施方案中，所结合的分子(即标记)是可检测标记物或可检测的试剂。在一些实施方案中的一个实施方案中，所结合的分子是可检测标记物，例如，结合放射性标记的氨基酸或连接到具有可以被标记的抗生物素蛋白(例如，包含可以被光学或比色方法检测的荧光标记物或酶活性的链霉抗生物素)检测的生物素酰基部分的多肽。在一些实施方案中，所结合的分子(即标记)可以结合作为可检测标记物的另一种分子/或可以被作为可检测标记物的另一种分子结合或与可检测标记物缀合或连接。在另一个实施方案中，所结合的分子可以是治疗性的，例如，药物缀合物或毒素。标记多肽和糖蛋白的多种方法是本领域中已知的并可以被使用。多肽标记的实例包括但不限于以下：反射性同位素或放射性核素(例如，3H，14C，15N，35S，90Y，99Tc，111In，125I，131I)，荧光标记(例如，FITC，罗丹明，镧系元素荧光体)，酶标记(例如，辣根过氧化酶，β-半乳糖苷酶，荧光素酶，碱性磷酸酶)，化学发光标记物，生物素酰基基团，为第二报告分子所识别的预定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列，第二抗体的结合位点，金属结合结构域，表位标签)，磁性试剂如钆螯合物(gadolinium chelates)，毒素如百日咳毒素(pertussis toxin)、紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、鬼臼噻吩苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、dihydroxy anthracin dione、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放射菌素D(actinomycin D)、1-去氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质激素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)及其类似物或同系物。在一些实施方案中，标记通过具有不同长度的间隔臂连接以减小潜在的空间位阻。
当用于本文时，术语“可操作地编码”是指当存在于宿主细胞如细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞时，具有可以被转录为mRNA并翻译为蛋白或蛋白片段的顺反子的质粒。
本公开涉及特别针对肿瘤相关抗原的抗体的产生。这种抗体允许检测多种癌症中的这些抗原。在一些实施方案中，这种抗体可以被用于为患有特定癌症的患者评估、施用、实施或确定合适的免疫治疗性疗法。
在一些实施方案中，本公开涉及针对PRAME抗原的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段结合包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列的或基本由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的表位。在一些实施方案中，本公开涉及针对SSX-2抗原的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段结合包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列的或基本由SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4的氨基酸序列组成的表位。在一些实施方案中，“其抗原结合片段”作为完整的多肽存在，而在其他实施方案中其被结合到更长的多肽分子中。
在一些实施方案中，本公开提供检测在患有癌症的受试者中肿瘤相关抗原PRAME、SSX-2、或两者表达的方法，所述方法包括用如本文所述的针对SSX-2或PRAME抗原的抗体接触来自受试者的生物样品；并检测结合到该样品的抗体；由此检测肿瘤相关抗原的表达。
在本文所公开的实施方案中，公开的PRAME单克隆抗体对PRAME蛋白具有特异性。在一些实施方案中，PRAME276-286和PRAME123-132单克隆抗体各自仅对PRAME蛋白具有特异性，其中它们各自与PRAME上的唯一肽结合(如由本文所述的免疫组织化学分析所示)。在示例性实施方案中，将BLAST蛋白检索(用于比较不同蛋白质的氨基酸序列的算法，即将PRAME蛋白质的276-286(SEQ ID NO：2)或123-132(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基与氨基酸序列的文库或数据库进行比较)用于评估针对特定表位的抗体的特异性。这样的算法及其用途在本领域中是已知的。
如在实施例中所示，PRAME276-286单克隆抗体对PRAME蛋白质的特异性通过确定为该单克隆抗体所识别的PRAME276-286表位的最小区域来评估。分析来自PRAME276-286(SEQ IDNO：2)的重叠区段的短肽序列与PRAME276-286免疫原的竞争性结合。在一些实施方案中，为PRAME276-286单克隆抗体所识别的PRAME276-286的最小区域是280-285。如通过BLAST蛋白检索分析的PRAME276-286和PRAME123-132单克隆抗体的特异性表明，没有其他已知的人蛋白与276-286(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列，和/或对应于氨基酸序列280-285的最小区域，或PRAME蛋白质的123-132(SEQ ID NO：1)具有交叉反应性。在一些实施方案中，PRAME276-286和PRAME123-132单克隆抗体的特异性进一步通过在肽竞争性测定中对多种肿瘤组织的IHC染色而得到指示(见实施例7)。在过量PRAME肽的存在下，(如至少2倍，或至少4倍，或至少6倍，或至少8倍，或至少10倍，但不限于此)，PRAME276-286和PRAME123-132单克隆抗体展示竞争性结合。数据支持所公开的PRAME抗体有利的特异性，其中其不存在与非目标抗原的交叉反应性。
确认了PRAME276-285抗体在组织的免疫组织化学分析中的用途。抗体显示良好的灵敏性和特异性，因此确认抗体可用于，例如，免疫组织化学测定，如目标在于诊断癌症或分析癌细胞中的蛋白表达的测定(见实施例6)。抗体的特异性不仅与免疫组织化学分析有关，而且还与其中抗体被用于检测样品中的抗原的众多其他分析技术有关。例如，如果抗体被用于分析特定细胞或组织(如癌细胞或肿瘤)中的蛋白表达，则抗体的高特异性将使假阳性结果的数目最小化，因此导致更可靠的分析。在本文中的实施方案中，识别PRAME276-286表位或PRAME123-132表位的本公开的PRAME单克隆抗体可用作诊断工具，其中它们各自可以补助以PRAME肿瘤相关抗原为目标的癌症治疗。在一些实施方案中，本公开的PRAME单克隆抗体可以用于标准测定如ELISA，FACS分析，免疫组织化学，免疫细胞学和免疫组织学测定，免疫沉淀法和蛋白质印迹以检测PRAME抗原在肿瘤组织或癌细胞中的表达。
在一些实施方案中，SSX-241-49和SSX-2120-128单克隆抗体仅对其中各自结合SSX-2上的唯一肽的SSX-2蛋白具有特异性(如由本文所述的免疫组织化学分析所示)。针对特定SSX-2表位的抗体的特异性同样通过BLAST蛋白检索来评估。如在实施例中所述，SSX-241-49和SSX-2120-128单克隆抗体对SSX-2蛋白的特异性通过确定为各自的单克隆抗体所识别的SSX-241-49表位和SSX-2120-128表位的最小区域而得到评估。分析来自SSX-2蛋白的41-49(SEQID NO：3)或120-128(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列的重叠区段的短肽序列分别与SSX-241-49和SSX-2120-128免疫原的竞争性结合。在一些实施方案中，为SSX-241-49单克隆抗体所识别的SSX-241-49表位的最小区域是45-48。在一些实施方案中，为SSX-2120-128单克隆抗体所识别的SSX-2120-128表位的最小区域是123-128。BLAST蛋白检索揭示没有其他人蛋白分享SSX-241-49表位或SSX-2120-128表位的最小氨基酸序列。
此外，已知存在具有对应于SSX-2蛋白的氨基酸41-49和120-128的相似肽序列的8个SSX蛋白家族的其他成员，分析这些SSX家族蛋白的对应肽以确定与为所公开的SSX-2单克隆抗体所识别的SSX-2表位的交叉反应性。未显示SSX-241-49表位与对应于其他SSX家族蛋白的肽的交叉反应性。这清楚地表明非常高程度的特异性。然而，注意到SSX-2120-128表位与对应于其他SSX家族蛋白的肽的部分交叉反应性，并且此部分交叉反应性涉及SSX-3。
在一些实施方案中，SSX-241-49和SSX-2120-128单克隆抗体的特异性进一步通过在肽竞争性测定中对多种肿瘤组织的IHC染色而得到分析，如本文所述。在过量SSX-2肽的存在下，(如至少2倍，或至少4倍，或至少6倍，或至少8倍，或至少10倍，但不限于此)，SSX-241-49和SSX-2120-128单克隆抗体展示竞争性结合。注意到尽管本公开的抗体可能与其他蛋白发生交叉反应(例如，部分地)，但这种蛋白可以不在特定组织或细胞中表达或在特定组织或细胞中仅仅最小化地表达，并且因此不影响竞争性结合。
SSX-2抗体的特异性不仅与免疫组织化学分析有关，而且还与其中这些抗体可以被用于检测样品中的SSX-2抗原的众多其他分析技术有关。例如，如果抗体被用于分析特定细胞或组织(如癌细胞或肿瘤)中的蛋白表达，则抗体的高特异性将使假阳性结果的数目最小化，因此导致更可靠的分析。在本文中的实施方案中，本公开的SSX-2单克隆抗体，SSX-241-49或SSX-2120-128可用作诊断工具，其中它们各自可以补助以SSX-2肿瘤相关抗原为目标的癌症治疗。在一些实施方案中，本公开的SSX-2单克隆抗体可以用于标准测定如ELISA，FACS分析，免疫组织化学，免疫细胞学和免疫组织学测定，免疫沉淀法和蛋白质印迹以检测SSX-2抗原在肿瘤组织或癌细胞中的表达。
为了获得目的肿瘤的表达谱，检测肿瘤组织中特异性肿瘤相关抗原表达水平的方法得到开发。确定TAA在肿瘤组织中的相对量需要具有高特异性和灵敏性的测定。因此，具有高度特异性并可用作测定中的抗体的单克隆抗体(例如，测定中的第一抗体)得到开发。除了具有高度特异性，当检测组织中的抗原时，相对于多克隆抗体，本文公开的单克隆抗体给出显著少的背景染色。如此，使用本文所述的单克隆抗体，可以作出关于表达目的抗原的细胞的类型的更好的评估，并且相对于全部的组织，阳性表达细胞的百分比不会被低估。
在一些实施方案中，本文公开的单克隆抗体用肽免疫原产生。在一些情况中，肽免疫原相对完整蛋白的优势在于所产生的抗体可以靶向唯一序列区域。当研究属于高序列同源性的家族的蛋白时，这尤其有用。因此，本公开的实施方案利用长度为8-15个氨基酸的肽免疫原，如长度为8个氨基酸的的免疫原，或长度为9个氨基酸的免疫原，或长度为10个氨基酸的免疫原，或长度为11个氨基酸的免疫原，或长度为12个氨基酸的免疫原，或长度为13个氨基酸的免疫原，或长度为14个氨基酸的免疫原，或长度为15个氨基酸的免疫原。这种肽可以是较大抗原的表位。因此，在一些实施方案中，本公开提供靶向特定表位的单克隆抗体，其中使用结合有所述表位的序列的肽免疫原来产生抗体。
在一些实施方案中，本公开提供针对PRAME或SSX-2抗原的单克隆抗体，其分别结合具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列的表位。
因此，在一些实施方案中，本公开提供针对PRAME抗原的单克隆抗体，其结合包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列的表位。在一些实施方案中，抗体对PRAME123-132表位特异。在一些实施方案中抗体对PRAME276-286表位特异。
PRAME(黑色素瘤优先表达抗原)，也被称为MAPE、DAGE和OIP4，原本作为黑色素瘤抗原被观察到。随后，其作为CT抗原被认识，但是与许多CT抗原(例如，MAGE、GAGE和BAGE)不同，它表达在急性骨髓性白血病中。PRAME是MAPE家族的成员，该家族大部分由假想蛋白组成，PRAME与所述假想蛋白共享有限的序列相似性。PRAME还是重要的视黄酸信号传递的调质(Epping等，Cell(细胞)122(6)：835-847，2005)。PRAME已经显示出是检测微小残留病(minimal residual disease)的有用工具(Proto-Siqueira等，Leukaemia Res.(白血病研究)27(5)：393-396，2003；Matsushita等，Methods Mol.Med.(分子医学方法)97：267-275，2004；以及Matsushita等，Br.J Haematol(不列颠血液学杂志).112(4)：916-926，2001)。PRAME作为TuAA的有效性在题为“ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES CODING FOR TUMORREJECTION ANTIGEN PRECURSOR DAGE AND USES THEREOF(编码肿瘤排斥抗原前体DAGE的分离的核酸分子及其用途)”的美国专利号5,830,753中被讲授，该专利通过引用完整地结合于此。题为“METHODS FOR SELECTING AND PRODUCING T CELL PEPTIDE EPITOPES ANDVACCINES INCORPORATING SAID SELECTED EPITOPES(用于选择和产生T细胞肽表位的方法及结合所选表位的疫苗)”的美国专利申请号10/181,499(公布号US 2003-0186355A1)(其通过引用完整地结合于此)使用利用免疫蛋白酶体的体外消化鉴别了包括PRAME 276-286在内的多种潜在表位。题为“METHOD OF EPITOPE DISCOVERY(表位发现方法)”的美国专利号6,861,234；以及公开了PRAME表位的题为“PRAME PEPTIDE ANALOGUES(PRAME肽类似物)”的美国专利号7,511,119各自通过引用完整地结合于此。
在细胞核中注意到PRAME表达。除了在急性骨髓性白血病中表达，也已知PRAME表达在实体、软组织、血液和转移瘤中。PRAME还高表达于众多病症和/或疾病中如，但不限于，乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌和结肠直肠癌。PRAME还高表达于淋巴瘤中，所述淋巴瘤包括Hodgkin淋巴瘤、外周T/NK细胞淋巴瘤、间变性(anaplastic)大细胞淋巴瘤和外周B细胞淋巴瘤，但是不表达于非Hodgkin淋巴瘤中。已经在滑膜肉瘤中注意到PRAME的高表达。PRAME还高表达于结肠癌及来自结肠直肠癌的肝转移中并且可以是转移性结肠直肠癌以及其他癌症中的转移疾病的可行靶标。
在一些实施方案中，本公开提供针对SSX-2抗原的单克隆抗体，其结合包含SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列的或基本上由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的表位。在一些实施方案中，抗体对SSX-241-49表位特异。在一些实施方案中，抗体对SSX-2120-128表位特异。
SSX-2，也被称为Hom-Mel-40，是高度保守的癌症-睾丸抗原家族的成员(Gure，A.O.等Int.J.Cancer(国际癌症杂志)72：965-971，1997，其通过引用完整地结合于此)。其作为TuAA抗原的证实在标题为“ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES THAT ENCODE AMELANOMA SPECIFIC ANTIGEN AND USES THEREOF(编码黑色素瘤特异性抗原的分离的核酸分子及其用途)”的美国专利6,025,191中得到讲授，所述专利通过引用完整地结合于此。注意到，癌症-睾丸抗原被发现于多种肿瘤中，但通常不存在于除睾丸外的正常成体组织中。SSX家族的九个成员中的六个(SSX-1、2、3、4、5和7)显示转录于睾丸中；其中，仅SSX-1、2和4显示在癌症中的显著表达。SSX-5仅有很少表达(在约1％的所检查到的肿瘤中)，而SSX-3表达仅显示与肉瘤中。SSX癌症睾丸抗原在大多数多发性骨髓瘤患者中有表达。在癌症所涉及的SSX分子中，SSX-2显示与降低的存活最强的相关性(Taylor等，J.Immunotherapy(免疫治疗杂志)2005，其通过引用完整地结合于此)。
SSX-2表达在许多不同类型的肿瘤中，所述肿瘤包括滑膜肉瘤、黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、胆囊癌、子宫癌/宫颈癌、恶性淋巴瘤和黑色素瘤、肾癌、甲状腺癌、结肠癌和卵巢癌，但不限于此。除了在多种癌症中的广泛表达，它在患有晚期疾病的患者中还具有免疫原性。此外，存在在转移性肿瘤患者中指向此抗原的自发性体液和细胞免疫应答证据(Ayyoub M等，Cancer Res.(癌症研究)63(17)：5601-6，2003；Ayyoub M等，JImmunol.(免疫学杂志)168(4)：1717-22，2002)，所述文献中的每个通过引用完整地结合于此。目前使用反转T-细胞免疫学已经鉴别出两种HLA-A2限制的T细胞表位，即SSX-241-49(Ayyoub M等J Immunol.(免疫学杂志)168(4)：1717-22，2002；标题为“ISOLATED PEPTIDESCONSISTING OF AMINO ACID SEQUENCES FOUND IN SSX OR NY-ESO-1MOLECULES，THATBIND TO HLA MOLECULE(由在SSX或NY-ESO-1分子中发现的氨基酸序列组成的分离的肽，其结合HLA分子)”的美国专利号6,548,064；标题为“EPITOPE SEQUENCES(表位序列)”的美国专利申请号10/117,937(公布号US 2003-0220239A1))和SSX-2103-111(Wagner C等，CancerImmunity(癌症免疫)3：18，2003)，其各自通过引用完整地结合于此。公开了SSX-2表位的标题为“SSX-2肽ANALOGS”的美国专利申请序号11/156,253(公布号2006-0063913)通过引用完整地结合于此。
可以使用多种技术来生产或制备抗体，所述技术如例如，细胞培养技术，或通过将抗体基因转染到合适的细菌、真菌(例如，酵母)、昆虫或哺乳动物细胞宿主中以便允许产生重组抗体。可以通过以下方法制备单克隆抗体：将B淋巴细胞与永生细胞培养物融合以制备能够生产许多拷贝的完全相同的抗体的杂交瘤。
本文公开的示例性单克隆抗体是针对肽抗原制备的，相对于针对全长蛋白制备的那些，其识别更特异的表位。在一些实施方案中，可以例如使用Kohler和Milstein的技术(Eur.J.Immunol.(欧洲免疫学杂志)6：511-519，1976，其通过引用完整地结合于此)(适当时对其进行改善)来制备对PRAME123-132、PRAME276-286、SSX-241-49或SSX-2120-128表位特异的单克隆抗体。简言之，这些方法涉及制备能够生产具有所需特异性(即与一种或多种对照分子例如具有重叠序列同源性的非特异的蛋白或肽相比时，与目的肽抗原的反应性)的抗体的永生细胞系。这样的细胞系可以例如由获得自动物(例如，小鼠、大鼠、兔子、绵羊或山羊，但不限于此)、根据结合有一次或多次加强免疫的预定时间表免疫的脾细胞，如在实施例中所述。然后该脾细胞通过例如与骨髓瘤细胞融合伴侣(例如，NSO细胞、Sp2细胞等)(在一些情况中其与所免疫的动物同源)的融合永生化。可以采用本领域中所熟知的多种融合技术。例如，可以将脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子去垢剂结合数分钟，然后以低的密度放置在支持杂交细胞生长但是不支持骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上。在一些实施方案中，可以使用作为本领域中所熟知的方法的选择技术如HAT(次黄嘌呤、氨蝶呤、胸腺嘧啶)培养基选择。在足够的时间后，通常为约1至2周，观察到杂交的克隆。选取单克隆并测试其培养物上清对PRAME或SSX-2肽抗原的结合活性。具有高反应性和特异性的杂交瘤是优选的。在一些实施方案中，本公开提供生产单克隆抗体的杂交瘤，所述单克隆抗体结合具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的序列的肽。关于制备符合本公开的杂交瘤的更多的细节在本文的实施例中得到讨论。
一旦产生杂交瘤，单克隆抗体可以从生长的杂交瘤克隆的上清分离；尽管在一些实施方案中，上清可以直接使用。此外，可以采用多种技术以增加产率，如将杂交瘤细胞系注射到合适脊椎动物宿主如小鼠的腹膜腔内。然后，单克隆抗体可以从腹水或血液中收获。污染物可以通过常规技术从抗体除去，所述常规技术如例如本领域技术人员所熟知的色谱、凝胶过滤、沉淀和萃取。
在一些实施方案中，本公开提供检测样品中PRAME和/或SSX-2抗原表达的方法，所述方法包括用对PRAME123-132表位，或PRAME276-286表位，或SSX-241-49表位，或SSX-2120-128表位中的一种或多种特异的抗体接触来自受试者的生物样品；并检测与样品结合的抗体，由此检测PRAME或SSX-2抗原的表达。在一些实施方案中，本公开涉及检测生物样品中癌细胞或组织或其部分，例如，组织学或细胞学样品、活检样品等的方法。此方法包括提供抗体，如本文公开的PRAME或SSX-2抗体，其可以与标记(即可检测标记物)相连，在PRAME或SSX-2抗体与细胞或组织中的抗原结合后所述标记允许细胞或组织(例如，与这种癌细胞相关的或由这种癌细胞表达的PRAME或SSX-2或其片段)的检测。生物样品可以在有效条件下与标记的PRAME或SSX-2抗体接触以允许PRAME或SSX-2抗体与样品中的任何细胞或组织的PRAME或SSX-2蛋白结合。
在一些实施方案中，如本文所公开的PRAME或SSX-2抗体可以与可检测标记物相连。可以用其标记本公开的PRAME或SSX-2抗体的有用的可检测标记物包括荧光化合物，多种酶，辅基，发光物质，生物发光物质，荧光释放物质等。荧光可检测标记物的实例包括荧光素，异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基氨基荧光素、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白、量子点(quantum dots)等。抗体也可以用可检测的酶标记，所述酶如碱性磷酸酶、辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶等。当抗体用可检测的酶标记时，它可以通过加入与酶反应以产生可检测反应产物(例如，有色的，荧光的或发光的)的额外试剂来检测。例如，当存在可检测的试剂辣根过氧化酶时，加入过氧化氢和/或二氨基联苯胺产生可检测的有色反应产物。抗体也可以用辅基(例如，链霉抗生物素蛋白/生物素对中的一个，抗生物素蛋白/生物素对中的一个等)标记。例如，抗体可以用生物素标记，并且通过测量结合的抗生物素蛋白或链霉抗生物素来检测，其中抗生物素蛋白或链霉抗生物素与可检测标记物(例如，荧光化合物，多种酶，辅基，发光物质，生物发光物质，荧光释放物质等)缀合。发光物质可以包括鲁米诺(luminol)；而生物发光物质的实例包括荧光素(luciferin)和水母发光蛋白(aequorin)。将可检测标记物与抗体连接的方法是本领域技术人员已知的并且可以是例如，通过化学偶联，基因融合，非共价结合等。
在一些实施方案中，在许多情境中可以在诊断上和/或实验上使用PRAME和SSX-2抗体，包括(i)通过标准技术如亲和层析或免疫沉淀法分离预定的抗原；(ii)检测预定的抗原(例如，在细胞裂解液或细胞上清中)以便评估蛋白表达的丰度和模式；(iii)作为临床试验程序的部分，监测组织中的蛋白水平，例如，以确定给出的治疗方法的效力。
本文公开的PRAME和SSX-2抗体可以应用的诊断或实验技术包括(不限于)免疫组织化学测定、ELISA测定、流式细胞术、蛋白印迹测定等。典型地，这样的测定涉及使用带有标记或标记产生部分的第二试剂。使用第二试剂的有利之处在于：相比直接标记，它可以提供信号放大，并且它仅需要产生可与多种第一试剂一起使用的单一可检测试剂。在一些实施方案中，第一试剂(抗体)可以被直接标记。这种实施方案减少了进行测定所需的步骤的数目并且还可以产生较低的背景。
例如，免疫组织化学染色允许通过连续施用以下各项来将抗原可视化：结合抗原的特异性抗体(第一抗体)；结合第一抗体的第二抗体或其他第二试剂，该第二试剂连接或缀合有酶复合物；以及发色物质；其间有洗涤步骤。色素原的酶活化在抗原位点产生可视反应产物。然后样品可以被复染并盖片。结果可以使用光学显微镜解释并帮助病生理过程的差异诊断，其可以(也可以不)与特定抗原相关。在一些实施方案中，对任何染色或没有染色的临床解释可以由形态学研究以及对合适对照的评估来辅助。在一些实施方案中，评估可以由技术人员(例如，有资格的病理学家)进行。在一些实施方案中，第二试剂可以与荧光分子相连。
在一些实施方案中，本文公开的PRAME或SSX-2抗体可以用于免疫荧光技术以检查人组织、细胞和体液样品。例如，可以将包含冷冻、不固定组织活检样品的恒冷箱切片的玻片或细胞涂片风干，福尔马林或丙酮固定，并在室温在加湿室(humidified chamber)中与本文公开的PRAME或SSX-2单克隆抗体孵育。然后可以洗涤玻片并进一步与针对PRAME或SSX-2单克隆抗体的第二抗体的制剂孵育。在一些实施方案中，所用单克隆抗体来源于小鼠脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞系的融合，而该第二抗体可以是抗小鼠免疫球蛋白。此第二抗体用在特定波长发出荧光的化合物(例如，标记有可检测标记物的)，例如罗丹明或异硫氰酸荧光素标记。然后通过荧光显微镜确定样品内的染色式样和强度并任选地摄影记录。
在一些实施方案中，使用本文公开的PRAME或SSX-2抗体，可以将流式细胞术用于检查组织样品或脱落的细胞，即来自肿瘤的针吸活检(aspiration biopsy)的单一细胞制剂。在一些实施方案中，通过计算机增强的荧光图像分析仪或利用流式细胞仪，本文公开的PRAME或SSX-2抗体可以用于定量活的肿瘤细胞，即来自肿瘤的针吸活检的单一细胞制剂。在一些实施方案中，本文公开的抗体可以用于将良性肿瘤与恶性肿瘤区别的测定，原因在于与良性肿瘤相比，由恶性肿瘤表达的与PRAME或SSX-2抗体结合的PRAME或SSX-2蛋白的量增加。百分比PRAME或SSX-2阳性细胞种群，单独地或连同对细胞其他属性的确定(例如，这些细胞的DNA倍数性)，可以为确定治疗或方式另外提供非常有用的信息。流式细胞术的方法是本领域中所熟知的。
可以通过蛋白质印迹分别进一步测定所公开的PRAME或SSX-2抗体与PRAME或SSX-2抗原的反应性。例如，可以制备细胞提取物并对其进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳后，可以将分离的抗原转移到硝化纤维素膜，用小鼠血清(例如，20％)封闭，并用本文所述的PRAME或SSX-2单克隆抗体探查。在一些实施方案中，抗体结合可以通过以下方式检测：使用例如与碱性磷酸酶相连的抗鼠或抗羊特异性第二抗体并用适当的底物显色。蛋白质印迹实验方法是本领域中所熟知的。
在一些实施方案中，捕获测定可以用于检测和定量所公开的抗体或由其识别的抗原，并用于评估由抗体识别的表位。此方法是本领域中所熟知的并且可以被改进以在竞争性免疫测定中评估抗体竞争性。通常，这些方法可以采用固定在允许抗体结合的固相(例如，微量滴定板)上的未标记的抗原。抗体可以被直接标记。抗体可以被标记的、特异性识别抗体的第二试剂检测。所检测的信号(例如通过测量吸光度)的强度是结合的抗体的量的指示。因此，可以通过竞争性免疫测定来测定样品中PRAME或SSX-2的存在。此测定为标记本文公开的PRAME或SSX-2抗体提供备选方案，利用标记有可检测物质的标准物(例如，合适的第二抗体)以及未标记的PRAME或SSX-2抗体。在此测定中，生物样品，标记的标准物和PRAME或SSX-2结合剂相结合，并且与未标记的抗体结合的标记的标准物的量得到确定。样品中的PRAME或SSX-2的量反比于与PRAME或SSX-2结合剂结合的标记的标准物的量。
在一些实施方案中，本公开提供试剂盒，其包含本文公开的PRAME和/或SSX-2抗体以及使用说明。该试剂盒还包含至少一种额外试剂，如所公开的一种或多种额外抗体或适合于特定诊断方案或测定的一种或多种试剂。
在一些实施方案中，可以制备包含本公开的抗体或其抗原结合片段的试剂盒以用于通过免疫组织学、免疫细胞学和其他上述这样的方法体外诊断癌症。该试剂盒的组分可以封装在含水介质中或是以冻干粉的形式。当PRAME和/或SSX-2抗体或其抗原结合片段以其中连接有标记部分如酶或放射性金属离子的缀合物的形式用于该试剂盒时，这种缀合物的组分可以以完全缀合的形式、以中间物的形式或作为将由使用者或试剂盒缀合的分开的部分被提供。
一些实施方案涉及包含载体的试剂盒，所述载体被划分以将一个或多个容器装置或系列容器装置(如试管、小瓶、烧瓶、瓶子、注射器等)严密封闭地容纳于其中。在一些实施方案中，所述容器装置或系列容器装置中的第一个可以容纳一种或多种PRAME和/或SSX-2抗体或其抗原结合片段或其他试剂。在一些实施方案中，第二容器装置或系列容器装置可以容纳标记或连接体-标记中间物。
连同组成和方法来描述和说明以下实施方案及其各个方面，其意欲为示例性的和说明性的，而非限制范围。
实施例
以下实施例被包括以说明本文公开的实施方案。为本领域技术人员所理解的是，在以下实施例中公开的方法和组成代表由本发明人发现的在本公开的实施中作用良好的方法，并且因此被认为构成其实施的特定模式。然而，根据本公开，本领域技术人员理解可以在所公开的具体实施方案中作出许多改变并仍然获得相似或类似的结果而不背离本公开的精神和范围。
实施例1
材料和方法
肽。PRAME123-132(SEQ ID NO：1)，PRAME276-286(SEQ ID NO：2)，SSX-241-49(SEQ IDNO：3)和SSX-2120-128(SEQ ID NO：4)。为了将包含肽PRAME276-286的半胱氨酸(Cys 286，ISPEKEEQYIC(SEQ ID NO：5))与马来酰亚胺活化的KLH(血蓝蛋白(Keyhole LimpetHemocyanin))偶联以用于免疫，最后一个氨基酸由半胱氨酸变为丙氨酸以使缀合更容易。
将肽与KLH缀合以用于在小鼠中免疫。将2.0微克马来酰亚胺活化的KLH(ma-KLH，Pierce-Rockford，IL，USA)重建于0.25毫升水中至8微克/毫升。将0.25ml 8微克/毫升的ma-KLH加入到1微摩尔的PRAME123-132、PRAME276-286、SSX-241-49或SSX-2120-128肽中，混合，如果肽在1分钟内未完全溶解则加入至0.25毫升的H2O。室温孵育2小时然后加入1.5毫升的0.1MNa-磷酸缓冲液(pH 8.0)，并混合。室温孵育2小时并加入12ml PBS(磷酸盐缓冲液；InvitrogenTM-Carlsbad，CA，USA)。在MilliporeUltra 15离心过滤器中浓缩(20分钟，4000g，在水平转子中)至0.5毫升并丢弃滤液。将12毫升PBS加入包含浓缩液的滤器的上部隔间。再次浓缩到少于0.5毫升。用PBS重建浓缩液(肽-KLH缀合物)至4毫升。通过本领域中所熟知的BCATM蛋白测定确定肽-KLH缀合物的浓度。以2周为间隔将缀合物和佐剂悬浮液注射到小鼠中直到获得可测量的效价。所注射的物质是与Ribi或Freund不完全佐剂(IFA)缀合的肽-KLH的1∶1混合物。选择使用该两种佐剂系统中的任一种的原因是，在几乎所有情况中，关于对具体抗原加上特定佐剂系统的抗体反应的信息在不同类型的佐剂之间可能不同。在初次免疫中，可以使用Freund完全佐剂(CFA)。当使用Freund完全佐剂时，它可以用于初次免疫而Freund不完全佐剂可以用于所有随后的免疫。对于皮下给药，总体积/动物不超过0.2毫升，而对于腹膜内给药则不超过0.5毫升。取决于蛋白的免疫原性，免疫原总量/动物/免疫可以在1至200微克的范围内如10至50微克之间，或20至60微克之间，或30至70微克之间，或40至80微克之间，或50至90微克之间，或60至100微克之间，或70至110微克之间，或80至120微克之间，或90至130微克之间，或100至140微克之间，或110至150微克之间，或120至160微克之间，或130至170微克之间，或140至180微克之间，或150至190微克之间，或160至200微克之间。
利用本文公开的第一抗体对石蜡组织切片进行免疫组织化学染色。本文公开的单克隆抗体的染色程序包括：1).在70℃使用EZ-ARTM通用溶液(Biogenex-San Ramon，CA，USA)在预热的溶液中进行10分钟的去石蜡化，之后用20分钟冷却至室温(RT)。2).然后使用Citra Plus抗原修复溶液(Biogenex)(在pH 5.5，2分钟)实现抗原解掩蔽；然后将样品放入Decloaking ChamberTM(BioCare-Concord，CA，USA)，120-125℃，10-15分钟，18psi；之后在室温在Sniper(NemesisTM；BioCare)溶液中孵育10分钟(1/2稀释液)。3).然后结合第一抗体，45分钟，在DAKOTM背景减少稀释剂中。4).之后第二抗体(NemesisTMProbe)结合15分钟，之后NemesisTMPolymer(结合的放大)30分钟。5).然后施用DAKOTM检测底物DAB(3’，3’-二氨基联苯胺)10分钟。6).然后用苏木精复染玻片(蘸5-10下)。7).之后用上蓝剂后复染1分钟，然后用水洗涤，之后是使用100％乙醇的脱水步骤(3X，每次1分钟)，然后是使用二甲苯的最终步骤(3X，1分钟)。8).然后使用Sakura自动化机器将玻片盖片。
单克隆抗体。已经优化了本文公开的单克隆抗体以用于使用NemesisTM检测试剂盒和自动化玻片染色机的免疫组织化学染色，但不限于此。染色方案中的各个步骤包括孵育精确的时间期间。在每次孵育步骤的结尾，通过NemesisTM自动化玻片染色机清洗切片以防止反应并除去将在随后的步骤中妨碍所需反应的未结合的物质。为使含水试剂从包含样品的玻片的蒸发最小化，在玻片染色机中施用盖玻片溶液。在与底物色素原孵育以及任选的复染后，染色完成。所公开的单克隆抗体在免疫组织化学程序中的工作浓度为200纳克/毫升的小鼠单克隆抗体(针对SSX-2)以及10微克/毫升的小鼠单克隆抗体(针对PRAME)。将抗体稀释在TBS(Tris缓冲盐溶液)缓冲液(Invitrogen)中，该缓冲液包含0.02％叠氮化钠作为防腐剂。
ELISA测定。为检测本文公开的针对PRAME或SSX-2肽抗原的抗体，使用ELISA方法。将蛋白浓度为0.5微克/孔的肽抗原放入96孔NUNC板(eBioscience，Inc.，SanDiego，CA，USA)中。将该板在室温静置1小时，以使肽结合到板上，之后4℃孵育过夜。用洗涤缓冲液(PBS，补充有0.050％TWEEN 20，5毫摩尔咪唑和500毫摩尔NaCl)洗涤该板并用封闭缓冲液(洗涤缓冲液，其补充以酪蛋白和山羊血清)封闭。将包含PRAME123-132或PRAME276-286，或SSX-241-49或SSX-2120-128抗体的样品加入孔中并使其反应30分钟，并洗涤该板。加入第二抗体(过氧化物酶标记的山羊抗大鼠IgG抗体，Sigma-St.Louis，MO，USA)并孵育30分钟，接下来洗涤该板。通过加入发色底物(TMB Microwell Peroxidase Substrate System(TMBMicrowell过氧化物酶底物系统)，(KPL-Gaithersburg，MD，USA))进行酶反应，然后用1摩尔磷酸终止该反应。在635nm测量吸光度。
用于通过ELISA筛选克降的板。将Maxisorp板(NUNC stripwells(8))包被以PRAME123-132(SEQ ID NO：1)，或PRAME276-286(SEQ ID NO：2)，或SSX-241-49(SEQ ID NO：3)或SSX-2120-128(SEQ ID NO：4)肽-卵清蛋白缀合物用以通过ELISA筛选克隆。将肽-卵清蛋白缀合物(100微升的10微克/毫升溶液)各自放入指定给抗原的每个孔中并且将cys-卵清蛋白缀合物(100微升的10微克/毫升溶液，在20毫摩尔Na2B4O7pH 9.5中)放入指定为空白或对照孔的每个孔中。将该板在室温孵育16-20小时；用H2O洗涤两次并用0.2毫升/孔的ELISA稀释剂(2％山羊血清，5微克/毫升酪蛋白，在TBS pH 8.0中的0.1％NaN3)封闭3小时。该板用H2O洗涤两次，干燥并在室温储存4至16小时(然后覆盖以箔)或储存在4℃以下。
检测与特异性PRAME或SSX-2表位结合的抗体。为了通过ELISA检测针对PRAME或SSX-2表位的抗体，将每种肽抗原溶解在碳酸盐缓冲液(0.15％Na2CO3和0.3％NaHCO3)中并以1或2微克/孔的肽浓度放入96孔板(Nunc)中。将该板在4℃静置过夜以使肽吸附在板上。该板用PBS洗涤并用PBS(补充有0.5％牛血清清蛋白)封闭。将分别包含针对特异性PRAME或SSX-2表位；PRAME123-132(SEQ ID NO：1)，或PRAME276-286(SEQ ID NO：2)，或SSX-241-49(SEQ ID NO：3)或SSX-2120-128(SEQ ID NO：4)的抗体的样品在稀释后加入孔中并允许其与肽反应1小时。然后该板用含0.05％TWEEN 20的PBS洗涤。将第二抗体加入到孔中并允许与其反应30分钟；之后用含0.05％TWEEN 20的PBS洗涤该板。如上那样进行发色反应和吸光度测量。
通过免疫组织化学的组织样品中染色强度的评分。由病理学家评估所有组织样品的组织学。根据病理学家的评估对如在所有样品中所注意到的PRAME或SSX-2的表达(基于染色强度)进行评分并分配表示强度水平的0至3+的级别。‘0’级表示无染色强度，或者没有观察到为抗体所识别的抗原的表达。级别‘1+’表示弱的染色强度或为抗体所识别的抗原的表达。级别‘2+’表示中等的染色强度或为抗体所识别的抗原的表达。级别‘3+’表示强的染色强度或为抗体所识别的抗原的表达。
定量实时聚合酶链反应(QRT-PCR)。将为本领域技术人员所熟知的定量RT-PCR用于确定PRAME和SSX-2在不同肿瘤和正常组织中的表达频率。简言之，将分离自肿瘤和正常组织的信使RNA反转录并使用实时PCR反应扩增cDNA。简言之，定量RT-PCR测定是利用Taqman技术开发的，该技术利用Taq聚合酶在PCR反应期间以其核酸外切酶活性切割探针的能力(见，例如，Bustin，S.A.，J.Mol.Endocrin.(分子内分泌学杂志)25：169-193；2000)。探针长度约为20-30碱基并且在5’端与荧光染料相连而猝灭染料(quencher dye)在3’端。当聚合进行时，聚合酶可以降解适当退火的探针，因此将荧光团与猝灭剂分离。增加的荧光正比于PCR产物扩增的增加，因此能够定量。实时PCR的数据分析是基于使用ΔCt或比较Ct方法的基因表达的相对定量，其中表达是相对于持家基因GAPDH(假设两种基因的效率是相似的)。
实施例2
针对PRAME和SSX-2表位的单克隆抗体(mAbs)的产生
将典型的杂交瘤方法(包括免疫、融合、克隆和杂交瘤稳定化期)用于生产用于诊断目的的针对PRAME和SSX-2抗原的单克隆抗体。这些单克隆抗体对PRAME123-132、PRAME276-286、SSX-241-49和SSX-2120-128表位具有特异性。简言之，制备单克隆抗体如下：用使用Freund完全佐剂(CFA)乳化的PRAME或SSX-2免疫原经腹腔(ip)免疫雌性Swiss小鼠。随后的注射遵从两周的间隔使用IFA(不完全Freund佐剂)，其中每次注射的十天后抽取样品。通过ELISA评估动物对免疫原的反应。
小鼠免疫阶段实验方案。在第0天，给雌性CFW小鼠预放血(～0.1m1血清/小鼠)，并经腹腔(ip)注射100微克含PRAME或SSX-2及Freund完全佐剂(CFA)的免疫原。之后以两周为间隔，小鼠接受50微克免疫原(与IFA)的加强IP。之后在每次免疫的十天后给小鼠放血(～0.1毫升血液/小鼠)并通过ELISA分析血清对免疫原的反应达若干循环，直到获得高的血清效价。
在免疫后，准备来自超免疫小鼠(用额外的10微克经腹腔给药的(ip)免疫原和5微克经静脉给药的(iv)免疫原加强的小鼠)的活化的脾细胞并使用聚乙二醇将其与NSO骨髓瘤细胞融合。然后将融合的细胞重悬在预温的完全NSO/丙酮酸盐培养基(NSO(-InvitrogenTM)，其补充有1％非必需氨基酸，2毫摩尔L-谷氨酰胺，100单位/毫升的青霉素以及100微克/毫升的链霉素)中，在5％CO2、相对湿度100％及37℃的条件下铺板并培养。监测细胞并在第1天用NSO/丙酮酸盐/2x次黄嘌呤氨蝶呤和胸腺嘧啶(HAT)培养基，之后在随后的几日用NSO/丙酮酸盐/1xHAT培养基处理。两周后，用NSO/丙酮酸盐/1X次黄嘌呤和胸腺嘧啶(HT)处理细胞并选择活的杂交瘤，收集上清并通过ELISA筛查抗原特异性抗体。生长在初始ELISA筛查中具有最高特异性的分泌抗体的杂交瘤并将其暂时冷冻。评估来自阳性杂交瘤的培养基。
将所选择的数百个阳性初级克隆进行扩增并进行亚克隆。通过ELISA筛查生长有细胞的孔的抗体分泌。通过本文中别处所述的功能性测定如免疫组织化学(IHC)测定评估包含抗体的杂交瘤培养上清。将具有最高特异性的数十个阳性亚克隆一式两份地冷冻在小瓶中。
选择克隆以进行亚克隆从而产生稳定的、第三代细胞系。通过ELISA筛查生长的细胞的抗原特异性抗体。来自多达十个阳性克隆的培养基样品得到评估并将克隆冷冻。选择一个细胞系进行最终的扩增以用于长期保存或通过体外方法的放大试验(scale up)。基于试验的贮藏条件，发现一旦经放大试验，存储于2-8℃而不冷冻时的抗体上清是最好的，并从上清纯化抗体，将抗体等分并存储于-20℃。
使用上述方法，获得并分析PRAME276-286(克隆3-2-1-21)、PRAME123-132(克隆3-15-14-2)、SSX-241-49(1-42-9)和SSX-2120-128(克隆4-7-12)的克隆。
分泌针对PRAME123-132、PRAME276-286、SSX-241-49和SSX-2120-128的抗体的杂交瘤已经按照并满足国际承认用于专利程序目的的微生物保存布达佩斯条约的要求保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，“A.T.C.C.”)(10801UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209)。小鼠抗人PRAME123-132单克隆抗体杂交瘤克隆(3-15-14-2)得到保藏，并得到A.T.C.C.指定编号PTA11099。小鼠抗人PRAME276-286单克隆抗体杂交瘤克隆(3-2-1-21)得到保藏，并得到A.T.C.C.指定编号PTA11101。小鼠抗人SSX-241-49单克隆抗体杂交瘤克隆(1-42-9-1)和小鼠抗人SSX-2120-128单克隆抗体杂交瘤克隆(4-7-12)各自得到保藏，并分别得到A.T.C.C.指定编号PTA11102和PTA11100。制备的保藏物仅为了方便本领域技术人员。
实施例3
PRAME的最小表位作图
为确定特异性以及产生的抗体是否识别PRAME上不同的或重叠的表位，利用简单ELISA捕获测定(利用肽竞争)进行最小表位作图。
简言之，用目的肽抗原预涂ELISA板(在微量滴定板的每个孔中)并在4℃静置过夜。该板的一行未获包被以作为之后步骤中非特异性结合的对照。该板用TBS(InvitrogenTM)洗涤两次。将包含抗体的杂交瘤上清加入预涂有抗原的板并评估PRAME276-286抗体与PRAME抗原的竞争性结合。将PRAME表位转移到ELISA板并与上清一起在室温孵育1小时然后丢弃，并用TBS清洗该板五次。在室温加入针对小鼠IgG的辣根过氧化酶缀合的山羊抗体，达1小时。再次洗涤该板并加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺二盐酸(TMB)底物(Pierce，Rockford，IL，USA)以用于利用ELISA读板器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)在635nm进行色度读取。
该结果显示在图1中。图1显示针对在PRAME蛋白的氨基酸276至286的区域内的不同PRAME肽的抗体的连续稀释液，分析其与PRAME276-286免疫原的竞争性结合。分析各自经1∶50(第一列)、1∶100(第二列)、1∶500(第三列)和1∶1000(第四列)连续稀释的对应于PRAME278-285、PRAME279-285、PRAME280-285、PRAME281-285、PRAME276-284、PRAME277-285的肽以确定由PRAME单克隆抗体所识别的PRAME276-286表位的最小区域，并且将该最小氨基酸序列与其他已知蛋白比较。数据显示PRAME280-285是由PRAME276-286单克隆抗体所识别的最小表位。BLAST蛋白检索显示没有其他已知人蛋白共享此氨基酸序列。这也表明示例PRAME276-286单克隆抗体对PRAME280-285肽的良好特异性。然而，本领域普通技术人员将理解由抗体所识别的最小表位就其他结合特性(例如，结合亲合力等)而言可能不是最优的。该数据因此表明PRAME276-286抗体仅对PRAME蛋白特异并且不与任何其他已知人蛋白具有交叉反应性。PRAME123-132也通过BLAST蛋白检索被分析，并且没有其他已知人蛋白共享此氨基酸序列。
实施例4
确定PRAME抗体的抗体同种型
使用与上述ELISA捕获测定类似的实验方案，用识别不同同种型如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM及其亚型的抗体包被ELISA板。除了PBS+1％BSA以外，将(1微克/毫升)针对PRAME276-286表位的抗体或针对PRAME123-132表位的抗体的等分试样(1微克/毫升)放入每个孔中并在室温孵育1小时。然后丢弃上清并用TBS清洗该板三次。将HRP-标记的大鼠抗小鼠IgmAb用作第二抗体。如上所述地进行色度测定以确定PRAME276-286和PRAME123-132抗体的同种型。基于获得的数据，发现PRAME276-286是IgG3抗体并发现PRAME123-132是IgG1抗体。
实施例5
检测组织和肿瘤细胞中的PRAME表达
将如上所述的对PRAME123-132和PRAME276-286表位特异的PRAME单克隆抗体用于通过免疫组织化学分析组织样品和不同类型癌症的肿瘤细胞(如在以上实施例1中所述)，并通过染色强度确定表达频率。
通过免疫组织化学染色，利用对PRAME276-286表位特异的抗体，评估PRAME肿瘤相关抗原在乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、皮肤癌(如黑色素瘤)、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、淋巴结肿瘤、胃癌、脑瘤(如成胶质细胞瘤)、滑膜肉瘤、肺癌如(非小细胞肺癌(NSCLC))、淋巴瘤、软组织肉瘤的原发肿瘤组织和转移组织中的表达。对于所分析的每种肿瘤组织，还将PRAME的表达与正常成体组织进行比较。将来自正常睾丸的组织(对癌症-睾丸抗原如PRAME呈阳性)，用作阳性对照。
如在表1中所示，通过并行地对mRNA表达和IHC染色两者进行QRT-PCR分析，在所有指示的肿瘤中，PRAME在超过50％的样品中表达，例外的是肾癌和卵巢癌，其中通过IHC分别有40％和45％的样品显示阳性表达。在所分析的卵巢癌中，如按照病理学家的评估，发现PRAME高表达于卵巢透明细胞癌(ovary clear cell carcinomas)和粘液性囊腺癌(mucinous cyst adenocarcinomas)，但不高表达于移行细胞癌(transitional cellcarcinomas)。
表达PRAME的不同细胞类型的肿瘤组织样品的百分比(如通过IHC确定的)显示在以下的表2中。显示在表2中的细胞类型表示如下：Norm-肿瘤样品中的正常细胞以及渗入肿瘤的其他细胞类型；EC-内皮细胞；SM-平滑肌；Fibro-成纤维细胞；基质；LC-淋巴细胞；和神经细胞。数据显示，在任何测验的癌症中，表示神经、基质或平滑肌的细胞类型没有通过本公开的PRAME抗体而染色。
表1
癌症 PRAME表达QRT-PCR PRAME表达IHC
卵巢癌 94.7％(38个样品) 45％(33个样品)
乳腺癌 50.0％(30个样品) 56％(25个样品)
前列腺癌 71.0％(31个样品) 70％(27个样品)
结肠癌 78.9％(38个样品) 50％(40个样品)
肾癌 88.9％(18个样品) 40％(25个样品)
胰腺癌 73.3％(15个样品) 57％(23个样品)
黑色素瘤 91.7％(12个样品) 89％(36个样品)
表2
利用对PRAME276-286表位特异的抗体进行的对非小细胞肺癌症组织样品(NSCLC)的免疫组织化学染色显示来自17/24NSCLC肿瘤的细胞对PRAME表达呈阳性。尽管表达非常低，但这些中的12个的阳性表达仅在炎症细胞和渗入肿瘤的软骨中。在认为是阳性的组织中，仅有五个具有PRAME在肿瘤细胞中的1+表达。这些中，四个是很高分化鳞状细胞癌(well-differentiated squamous cell carcinoma)组织，而第五个是腺癌。在试验的低分化鳞状细胞癌(poorly differentiated squamous cell carcinoma)组织中，没有一个PRAME是阳性的。数据显示：对于非小细胞肺癌，PRAME可以是高分化鳞状细胞癌和腺癌适应证的可行靶标。
还在成胶质细胞瘤组织样品中利用PRAME276-286表位特异性抗体来评估PRAME表达(中等2+染色强度40％阳性表达)。发现PRAME表达于所有分析的滑膜肉瘤组织样品中(数据未示)。根据病理学家的评估，PRAME还显示高表达于肝脏肝细胞癌以及胆管癌(cholangiocarcinomas)中，但是不高表达于肝复合癌(combined carcinomas)中。也对通过免疫组织化学使用PRAME276-286抗体分析的一系列淋巴瘤和软组织肉瘤进行阳性PRAME表达的观察。
数据的全面分析显示在所分析的正常组织中没有PRAME的显著表达。PRAME仅表达于渗入肿瘤的正常细胞中。此外，未显示在肝或肾肿瘤中的表达。
实施例6
抗人PRAME抗体验证/黑色素瘤组织中的灵敏性分析
验证所产生的PRAME抗体作为免疫组织化学测定中的诊断工具的用途。该结果是基于经专门训练的独立的病理学家对总的组织图像的评估。通过IHC在从组织库中随机选择的20个人黑色素瘤样品上评估小鼠抗人PRAME276-286抗体的灵敏性。将福尔马林固定、石蜡包埋的组织用于使用小鼠EnVision+TM检测系统(DakoCytomation，Carpinteria，CA，USA)的间接免疫组织化学试验。通过在所测试的20个黑色素瘤样品的19个中的抗体的阳性细胞核和/或胞质染色显示了充分的灵敏性(图2)。在65％(13/20)的人黑色素瘤样品中观察到强(3+)染色。中等(2+)染色作为在25％(5/20)的所测试组织中的最高染色强度被观察到。弱(1+)染色作为在5％(1/20)的所测试组织中的最高染色强度被观察到。在5％(1/20)的所测试组织中没有观察到染色。总的来说，该数据与之前的试验相关，原因在于观察到黑色素瘤中的阳性胞质和核染色。这进一步得到文献中观察的支持(Epping等，Cancer Res.(癌症研究)66(22)：10639-42，2006；Tajeddine等，Cancer Res.(癌症研究)65(16)：7348-55，2005；van Baren等，Br J Haematol(不列颠血液学杂志)102(5)：1376-9，1998)，其各自通过引用结合于此。该数据支持抗体用于免疫组织化学测定的用途。
实施例7
在肿瘤组织中使用PRAME抗体的肽竞争
为了确认所公开的PRAME抗体的特异性，采用肽竞争测定并且通过免疫组织化学分析多种肿瘤组织(如肾癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、黑色素瘤)，如本文中别处所述。
简言之，在过量的其所针对的肽的存在下各自预孵育PRAME276-286或PRAME123-132抗体。将抗体-肽混合物与单独的抗体并行地用于免疫组织化学测定。
数据显示当单独使用抗体时不同肿瘤组织中强的染色强度，但是在与PRAME肽抗原预孵育后没有观察到特异性染色，分别显示与PRAME276-286和PRAME123-132抗体的100％肽竞争)。该结果确认了PRAME276-286和PRAME123-132抗体的特异性。将正常睾丸(testes)组织用作阳性对照。使用任一种抗体，在正常组织中没有注意到PRAME抗原的表达。
实施例8
SSX-241-49的最小表位作图
为确定特异性以及本文所述的SSX-2抗体是否识别SSX-2上不同的或重叠的表位，利用简单ELISA捕获测定(利用肽竞争)进行最小表位作图，如在以上实施例3中所述。
简言之，使用被用作竞争剂的不同更短肽评估SSX-241-49或SSX-2120-128抗体与不同SSX-2肽的竞争性结合。将各个SSX-2单克隆抗体转移到预包被的ELISA板中并于室温孵育1小时，然后丢弃并用TBS清洗五次。在室温加入针对小鼠IgG的辣根过氧化酶缀合的山羊第二抗体，达1小时。洗涤该板并加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺二盐酸(TMB)底物(Pierce，Rockford，IL，USA)以用于利用ELISA读板器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)在635nm进行色度读取。
图3显示，分析针对SSX-2免疫原的氨基酸41-49的区域内的不同SSX-2肽的抗体的连续稀释液与SSX-241-49表位的竞争性结合。将对应于SSX-241-47、SSX-242-48、SSX-243-49、SSX-243-47、SSX-243-48、SSX-244-48和SSX-245-48的肽各自结合到ELISA板并用于与免疫原肽竞争。对抗体进行1∶500(第一列)、1∶1000(第二列)、1∶5000(第三列)和1∶25000(第四列)的连续稀释并通过ELISA分析以确定针对SSX-241-49表位的抗体是否识别SSX-2上不同的或重叠的表位。数据显示SSX-241-49单克隆抗体的最小表位识别是SSX-245-48。这还显示示例SSX-241-49单克隆抗体对SSX-245-48肽的好的特异性。然而，本领域普通技术人员将理解由抗体所识别的最小表位就其他结合特性(例如，结合亲合力等)而言可能不是最优的。BLAST蛋白检索显示没有其他已知人蛋白共享此氨基酸序列(SSX245-48)。该数据因此表明SSX-241-49抗体仅对SSX-2蛋白具有特异性。
测试SSX-2与其他SSX家族成员的交叉反应性，原因在于对应于抗原区域的肽序列相似于SSX家族的其他九个成员。针对SSX-241-49的单克隆抗体未显示针对其他SSX家族成员的交叉反应性(图4)。对应的序列显示在表3中。
表3.对应于SSX-241-49的SSX家族成员区域序列的总结
实施例9
SSX-2120-128的最小表位作图
为确定针对SSX-2120-128表位的抗体是否识别SSX-2上不同的或重叠的表位。如在以上实施例8中所述，将在氨基酸120至128的区域内的肽作为竞争剂测试。将对应于SSX-2124-128；SSX-2125-128；SSX-2122-128；SSX-2123-128的肽结合到板并将抗体连续稀释1∶100(第一列)、1∶200(第二列)、1∶400(第三列)和1∶500(第四列)并通过ELISA分析并将其用于与免疫原肽竞争以确定针对SSX-2120-128表位的抗体是否识别SSX-2上不同的或重叠的表位(图5)。数据显示SSX-2120-128单克隆抗体的最小表位识别是SSX-2123-128。这还显示示例SSX-2120-128单克隆抗体对SSX-2123-128肽的好的特异性。然而，本领域普通技术人员将理解由抗体所识别的最小表位就其他结合特性(例如，结合亲合力等)而言可能不是最优的。BLAST蛋白检索显示没有其他已知人蛋白共享此氨基酸序列(SSX2123-128)。该数据因此表明SSX-2120-128抗体仅对SSX-2蛋白具有特异性。此外，对应于不同SSX家族蛋白的其他肽：SSX-6120-128；SSX-1，8120-128；SSX-9120-128；SSX-5，7120-128；和SSX-3120-128被测试以确定与SSX-2120-128表位的交叉反应性。数据显示SSX-2120-128与对应于其他SSX家族成员如SSX-3的肽具有部分的交叉反应性(图6)。注意到，SSX-3仅表达在肉瘤或结缔组织或支持组织(这些类型的组织包括骨、软骨、脂肪、肌肉和血管)的癌症中，而不表达在目的癌细胞中。
表4.对应于SSX-2120-128的SSX家族成员区域序列的总结
实施例10
确定SSX-2抗体的抗体同种型
使用与以上在实施例3中所述的ELISA捕获测定类似的实验方案，用针对不同同种型如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM及其亚型的抗体包被ELISA板。在PBS+1％BSA将(1微克/毫升)针对SSX-241-49表位的抗体克隆或针对SSX-2120-128表位的抗体的等分试样(1微克/毫升)放入每个孔中并在室温孵育1小时。在丢弃上清并用TBS冲洗该板后，将HRP-标记的大鼠抗小鼠Ig mAb用作第二抗体。将色度测定用于确定SSX-241-49和SSX-2120-128抗体的同种型。基于获得的数据，发现针对SSX-241-49的抗体是IgG2b抗体并且发现针对SSX-2120-128的抗体是IgG1抗体。
实施例11
检测肿瘤组织和细胞中的SSX-2表达
将如上所述的对SSX-241-49表位和SSX-2120-128表位特异的SSX-2单克隆抗体用于通过免疫组织化学(如在以上实施例1和3中所述)分析不同类型癌症(例如，乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和滑膜肉瘤)的组织样品，并确定SSX-2肿瘤相关抗原(TAA)在不同类型癌症中表达的表达频率。对于所分析的每种肿瘤组织，还将SSX-2的表达与正常成体组织进行比较。将来自正常睾丸的组织(对癌症-睾丸抗原呈阳性)，用作阳性对照。
通过免疫组织化学染色利用对SSX-241-49表位特异的抗体，评估在原发肿瘤中SSX-2肿瘤相关抗原的表达特征，如在表5中所示。通过并行地对mRNA表达和IHC染色两者进行QRT-PCR分析，在所有指示的肿瘤中，SSX-2在超过50％的样品中表达，例外的是肾癌，其中通过IHC，27％的样品显示阳性表达。
表达SSX-2的不同细胞类型的肿瘤组织样品的百分比显示在表6中。显示在表6中的细胞类型表示如下：Norm-肿瘤样品中的正常细胞以及渗入肿瘤的其他细胞类型；EC-内皮细胞；SM-平滑肌；Fibro-成纤维细胞；基质；LC-淋巴细胞；和神经细胞。数据显示，在任何测验的癌症中，表示神经、基质或平滑肌的细胞类型没有通过本公开的抗体而染色。
表5
癌症 SSX-2表达QRT-PCR SSX-2表达IHC
卵巢癌 18.4％(38个样品) 61％(33个样品)
乳腺癌 13.3％(30个样品) 57％(28个样品)
前列腺癌 6.5％(31个样品) 87％(30个样品)
结肠癌 7.9％(38个样品) 63％(43个样品)
肾癌 5.6％(18个样品) 27％(26个样品)
胰腺癌 6.7％(15个样品) 55％(22个样品)
黑色素瘤 25％(12个样品) 69％(35个样品)
表6
实施例12
在肿瘤组织中使用SSX-2抗体的肽竞争
为了确认所公开的SSX-2抗体的特异性，采用肽竞争测定并且通过免疫组织化学分析多种肿瘤组织(例如乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和滑膜肉瘤)，如本文中别处所述。
简言之，在过量的其所针对的肽的存在下对SSX-241-49或SSX-2120-128抗体各自进行预孵育。将抗体-肽混合物与单独的抗体并行地用于免疫组织化学测定。
数据显示当单独使用SSX-241-49 or SSX-2120-128抗体时不同肿瘤组织中强的染色强度。在与SSX-2肽抗原预孵育后没有观察到特异性染色。该结果确认了SSX-241-49和SSX-2120-128抗体的特异性。此外，该数据显示尽管SSX-2120-128与其他SSX家族成员(如在以上实施例9中所讨论的SSX-3)具有部分的交叉反应性；但是SSX-2120-128在所测试的肿瘤上显示100％肽竞争。这大概是由于SSX3最低限度的表达于这些肿瘤中。将正常睾丸组织用作阳性对照。
上述多种方法和技术为实施本公开提供了众多方式。当然，要理解，按照本文所述的任何特定实施方案不一定能够实现所述的所有目标或优势。因此，例如，本领域技术人员将认可，可以以实现或最优化如本文所教导的一个优势或一组优势的方式实施所述方法，而不一定实现如本文所教导或显示的其他目标或优势。本文中提及多种有利的和不利的备选方案。还要理解的是，一些优选实施方案具体地包括一种、另一种或若干有利特征，而其他优选实施方案具体地排除一种、另一种或若干不利特征，而仍有其他优选实施方案具体地通过包括一种、另一种或若干有利特征而减轻存在的不利特征。
此外，技术人员将认可来自不同实施方案的多种特征的可应用性。类似地，上述多种元素、特征和步骤以及这些元素、特征和步骤中每个的其他已知等同物可以由本领域普通技术人员混合并匹配从而按照本文所述的原理来实施方法。在多种元素、特征和步骤中，在多种实施方案中一些可以被具体地包括而其他可以被具体地排除。
尽管本发明已经公开于特定实施方案和实施例的语境中，但将被本领域技术人员理解的是，本公开超出具体公开的实施方案而扩大至其他备选实施方案和/或其用途和修改和等同物。
已经公开了本公开的很多变量和备选元素。对本领域技术人员来说，其他的变量和备选元素仍然将是明显的。在这些变量中(不受限制)，有筛选板中或由治疗产品所靶向的抗原的具体数目，抗原的类型，癌症的类型，以及指定的特定抗原。本公开的多种实施方案可以具体地包括或排除任何这些变量或元素。
在一些实施方案中，用于描述并要求本公开的特定实施方案的表示成分的量，性质如分子量、反应条件等的数目被理解为在一些情况中被术语“约”修饰。因此，在一些实施方案中，所书写的说明书和所附权利要求中所列出的数字参数是近似值，其可以取决于想要通过具体实施方案获得的所需特性而变化。在一些实施方案中，数字参数应当视为是根据所报告的有效数字的数目并且通过应用常规舍入技术。尽管列出本公开的一些实施方案的大范围的数字范围和参数是近似值，但在具体实施例中所列出的数值被尽可能精确的报告。出现在本公开的一些实施方案中的数值可以包括一定误差，所述误差当然地源自发现于其相应的试验测量值中的标准差。
在一些实施方案中，在描述本公开的特定实施方案的语境中(尤其在某些以下权利要求的语境中)使用的术语“一个(a)”和“一种(an)”和“所述(the)”以及类似指示物可以被视为涵盖单数和复数两者。本文中对值的范围的例举仅仅是为了作为单独地提及落入该范围内的各个分离值的简写方法。除非本文中另外指出，各个单独的值如同被在本文中单独地例举那样结合到本说明书中。除非本文中另外指出或明显与语境矛盾，本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序实施。就本文中的特定实施方案提供的任何及全部实施例或示例性语言(例如“如”)的使用仅仅意在更好地说明本公开而不是对另外要求的本公开的范围加以限制。不应当将本说明书中的任何语言理解为指示对于实施本公开必要的任何非要求的元素。
本公开的备选元素或实施方案的分组不被理解为限制。各组成员可以单独地或以与该组的其他成员或本文中发现的其他元素的任何组合被涉及并要求。预期，可以为了方便性和/或专利性的原因而将组的一个或多个成员包括在组中或从组中删除。当任何这种包括或删除发生时，本文中认为本说明书包括如所修改的组，因此完成用于所附权利要求中的所有马库什组的书写的说明书。
本文中描述了本公开的特定实施方案，包括在本公开的实施中发明人已知的最佳模式。在阅读了前述说明书时，在那些实施方案上的变化对于本领域普通技术人员将是明显的。预期，技术人员适当时可以采用这种变化，并且可以与本文所具体描述的不同地实施本公开。因此，如被适用的法律所允许的，本公开的许多实施方案包括在附于本文的权利要求中例举的主题的所有更改和等同物。此外，除非本文中另外指出或明显与语境矛盾，本公开涵盖在其所有可能变化中的上述元素的任何组合。
此外，贯穿本说明书，已经对专利和印刷的出版物作出了许多参考。以上所引用参考文献及印刷的出版物中的每个单独地通过引用完整地结合于此至其内容不与直接呈现在此处的本公开冲突的程度。
PRAME 123-132-DLRKNSHQDF(SEQ ID NO：1)
Prame 276-286-ISPEKEEQYIA(SEQ ID NO：2)
SSX 241-49-KASEKIFYV(SEQ ID NO：3)
SSX 2120-128-GNDSEEVPE(SEQ ID NO：4)

Claims (17)

1.针对PRAME抗原的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合PRAME123-132(SEQ ID NO:1)或PRAME276-286(SEQ ID NO:2)。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
3.权利要求2的抗体，其中所述抗体是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
4.权利要求1-3中任一项的抗体，所述抗体还与标记相连。
5.权利要求1的抗体在制备用于检测生物样品中肿瘤相关抗原PRAME的表达的检测剂中的用途，其中所述肿瘤相关抗原的表达通过检测与所述抗体接触的生物样品中的抗原结合的抗体进行检测。
6.权利要求5的用途，其中所述生物样品获自受试者。
7.权利要求6的用途，其中所述受试者是人。
8.权利要求1的抗体在制备用于检测患有癌症的受试者中肿瘤相关抗原PRAME的表达的检测剂中的用途，其中所述肿瘤相关抗原的表达通过检测与所述抗体接触的生物样品中的抗原结合的抗体进行检测。
9.权利要求5-8中任一项的用途，其中所述抗体对SEQ ID NO:1具有特异性。
10.权利要求5-8中任一项的用途，其中所述抗体对SEQ ID NO:2具有特异性。
11.权利要求8的用途，其中所述癌症是黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肝癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、成胶质细胞瘤、食道癌、子宫癌、淋巴瘤、软组织肉瘤、多发性骨髓瘤、胆囊癌、甲状腺癌或间皮瘤。
12.权利要求8的用途，其中所述癌症是眼黑色素瘤、激素敏感性前列腺癌、激素不应性前列腺癌或子宫内膜癌。
13.权利要求5-8和11中任一项的用途，其中所述生物样品包括活检样品，组织，细胞，血液，腹水，胸膜液或可溶蛋白质。
14.权利要求5-8和11中任一项的用途，其中PRAME的表达通过免疫荧光显微术、免疫细胞化学、免疫组织化学、ELISA、FACS分析或免疫沉淀法来检测。
15.质粒，其可操作地编码权利要求1的抗体或抗原结合片段。
16.产生单克隆抗体的杂交瘤，所述单克隆抗体特异性结合SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
17.诊断试剂盒，其包括权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
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