CN110079506B - 一种人血清纤维胶凝蛋白ficolin-2的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种人血清纤维胶凝蛋白ficolin-2的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人血清纤维胶凝蛋白ficolin‑2的单克隆抗体及其应用。本发明提供的杂交瘤细胞株，其保藏编号分别为CCTCC No:C201943。利用本发明提供的单克隆抗体5B3可制备用于检测人ficolin‑2蛋白的免疫检测工具。本发明的双抗夹心ELISA方法，检测2μg/ml的ficolin‑2蛋白仅需要1:409600稀释度的ficolin‑2单克隆抗体5B3即可。本发明获得的人ficolin‑2单克隆抗体5B3与Ficolin‑2蛋白的结合位点和商业化单抗（sc‑130297）与Ficolin‑2蛋白的结合位点不同，效价更高。因此本发明的单克隆抗体具有更广泛的应用空间。

Description

一种人血清纤维胶凝蛋白ficolin-2的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及抗人ficolin-2的单克隆抗体，产生该抗体的杂交瘤细胞株，以及该抗体的免疫检测用途。
背景技术
纤维胶凝蛋白(ficolin)属于补体凝集素，是重要的天然免疫分子。作为可溶性模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)，ficolin能识别病原微生物表面的病原相关模式分子(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)，并能与甘露糖结合凝集素(Mannose-binding lectin,MBL)相关丝氨酸蛋白酶(MBL-ssociated serineproteases,MASPs)结合而激活补体凝集素途径，还能作为调理素与吞噬细胞表面受体结合而介导调理吞噬作用。
ficolin-2(FCN-2))是纤维胶凝蛋白ficolin中的一种，也被称为P35、L-ficolin、EBP-37hucolin。FCN-2蛋白主要由肝细胞合成分泌。其与MBL具有类似的结构和功能，具有凝集素活性，能通过识别病原体表面的寡糖结构，继而通过lectin途径激活补体。
正常人血清中ficolin-2属于一种重要补体凝集素蛋白，在急性应急反应、炎症反应或感染时会发生浓度上升可以作为炎症性疾病等预警指标。疾病恢复正常后其浓度又回归正常，其与CRP也呈正相关性，因而可作为炎症等监控指标(Yang YF,et al.,FCN-A/2,acting as a new regulator of macrophage polarization,mediates theinflammatory response in experimental mouse colitis.Immunology.2017,151(4):433-450.)。另外，孕妇血浆ficolin-2水平低，可能发生妊娠子癇前症。因此，利用ficolin-2的单抗可以制备人血清纤维胶凝蛋白(ficolin-2)检测试剂盒。现有技术中抗人ficolin-2的单克隆抗体主要有sc-130297(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC.)，但它与ficolin-2的结合位点有限，研究不同抗人ficolin-2的单克隆抗体将有助于提高纤维胶凝蛋白检测的灵敏度和特异性。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能稳定分泌特异性识别人血清纤维胶凝蛋白(ficolin-2)的单克隆抗体5B3的杂交瘤细胞株以及该单克隆抗体在制备用于检测ficolin-2蛋白的免疫检测工具中的应用。本发明的单克隆抗体效价高、特异性强，因此具有更广泛的应用空间。
为实现上述目的本发明提供以下技术方案：
第一方面，提供一种分泌抗人ficolin-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株是保藏编号为CCTCC NO：C201943的小鼠抗人ficolin-2单克隆抗体杂交瘤细胞5B3。是纯化的重组ficolin-2-GST融合蛋白(ficolin-2基因编码序列(NM_004108.3))免疫小鼠后至尾血效价检测达1:10000左右或以上后，加强免疫后进行细胞融合，带His标签的ficolin-2重组蛋白(ficolin-2基因编码序列(NM_004108.3))筛选获得。
在本发明的第二方面，提供一种抗人ficolin-2单克隆抗体5B3，由上述的保藏编号为CCTCC NO：C201943的小鼠抗人ficolin-2单克隆抗体杂交瘤细胞5B3分泌。
在本发明第三方面，提供抗人ficolin-2单克隆抗体5B3在制备用于检测人ficolin-2蛋白的免疫检测工具中的应用。
优选地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
优选地，所述试剂盒为含抗人ficolin-2单克隆抗体5B3的免疫组化试剂盒。
优选地，所述的免疫组化试剂盒为采用可见光、荧光、化学发光或酶标任意一种进行标记。
优选地，所述试剂盒为定量检测人ficolin-2蛋白含量的双抗夹心酶联免疫(ELISA)试剂盒，优选地，人ficolin-2单克隆抗体5B3作为检测抗体。
优选地，所述试剂盒为定量检测人ficolin-2蛋白含量的双抗夹心荧光免疫(ELISA)试剂盒，优选地，人ficolin-2单克隆抗体5B3作为检测抗体。
优选地，所述试剂盒为定量检测人ficolin-2蛋白含量的化学发光试剂盒，优选地，人ficolin-2单克隆抗体5B3作为检测抗体。
本发明的有益效果：
(1)本发明以ficolin-2基因编码序列(NM_004108.3)和ficolin-1基因编码序列(NM_002003.5)为模板，扩增ficolin-2和ficolin-1编码序列全长，ficolin-2和ficolin-1蛋白同时进行免疫印迹鉴定，确保所产生ficolin-2单克隆抗体特异识别ficolin-2，以确保所产生单克隆抗体的特异性。
(2)本发明获得的人ficolin-2单克隆抗体5B3与Ficolin-2蛋白的结合位点与商业化单抗(sc-130297)结合Ficolin-2蛋白的结合位点不同。为制备用于检测ficolin-2蛋白的免疫检测工具提供了多种选择。
(3)在间接ELISA实验中，本发明提供的人ficolin-2单克隆抗体5B3抗体的效价具有效价高的特点，5B3单抗细胞株制备的腹水抗体效价可以达到检测2μg/ml的ficolin-2蛋白仅需要1:409600稀释度的ficolin-2单克隆抗体5B3即可。
(4)本发明提供了抗人ficolin-2单克隆抗体5B3在ficolin-2检测中的应用，为炎症等检测和监控提供新的工具。
保藏信息
用于保藏的杂交瘤细胞株的科学描述为:
保藏单位全称:中国典型培养物保藏中心；
保藏单位简称：CCTCC；
藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；
保藏日期：2019年03月15日
培养物名称(分类命名)：小鼠抗人ficolin-2单克隆抗体杂交瘤细胞5B3，
保藏编号：CCTCC NO：C201943。
附图说明
图1.酶联免疫吸附实验(ELISA)进行抗人ficolin-2单克隆抗体亚型鉴定。
图2.Western Blot检测抗人ficolin-2单克隆抗体5B3对ficolin-2的特异性识
别结果。
图3.酶联免疫吸附实验(ELISA)进行抗人ficolin-2单克隆抗体效价鉴定。
图4.Ficolin-2蛋白的不同截断体构建示意图。
图5.比较抗人ficolin-2单克隆抗体5B3和商业化单抗(sc-130297)与Ficolin-2蛋白的不同截断体的结合结果。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。如无特殊说明，以下实施例中所使用的实际均来源于市售，操作方法均为现有常规操作方法。
【实施例1】ficolin-2蛋白抗原的制备
首先以构建ficolin-2重组蛋白作为单克隆抗体制备所需的抗原。
1.ficolin-2重组质粒的构建：依据ficolin-2基因编码序列(NM_004108.3)和ficolin-1基因编码序列(NM_002003.5)，扩增ficolin-2和ficolin-1编码序列全长，克隆到pET28a、pGEX、pcDNA3.1载体上，分别构成重组ficolin-1和ficolin-2质粒(重组ficolin-1质粒：pcDNA3.1-FCN-1；重组ficolin-2质粒：pcDNA3.1-FCN-2)。
2.使用pGEX-FCN1和pGEX-FCN2分别转化BL21大肠杆菌，IPTG诱导表达FCN-1-GST融合蛋白和FCN-2-GST融合蛋白。高压均质仪破碎，Ni柱亲和纯化FCN-1-GST融合蛋白和FCN-2-GST融合蛋白。SDS-PAGE电泳鉴定纯化融合蛋白纯度，作为小鼠免疫原。
3.使用pET28a-FCN1和pET28a-FCN2分别转化BL21大肠杆菌，IPTG诱导表达带His标签的FCN-1和FCN-2重组蛋白。高压均质仪破碎，Ni柱亲和纯化带His标签的FCN-1和FCN-2重组蛋白。SDS-PAGE电泳鉴定纯化重组蛋白纯度，作为效价鉴定抗原。
4.Vero细胞生长于10％胎牛血清RPMI1640培养基，以重组ficolin-1和ficolin-2质粒(重组ficolin-1质粒：pcDNA3.1-FCN-1；重组ficolin-2质粒：pcDNA3.1-FCN-2)转染Vero细胞。以转染细胞裂解物作为杂交瘤细胞抗体特异性鉴定的抗原。
【实施例2】ficolin-2单抗的制备和鉴定
以获得的ficolin-2抗原免疫小鼠，以免疫后小鼠脾细胞制备杂交瘤细胞。以ficolin-2抗原鉴定筛选特异性的抗ficolin-2阳性杂交瘤细胞克隆。
一、小鼠的免疫和免疫效果鉴定(血清抗体效价)
1.首次免疫选取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠3只，将纯化的重组ficolin-2-GST融合蛋白(100μg/只，50μl)与弗氏完全佐剂按1:1的比例混合乳化后在小鼠背部皮下进行多点免疫。3天后进行第一次加强免疫，第一次加强免疫后2周后、4周后和6周后进行第二次、第三和第四次加强免疫免疫(50μg/只，重组ficolin-2融合蛋白与弗氏不完全佐剂，1:1的比例混合乳化)。7天后从小鼠的尾静脉采血，用ELISA法检测抗体效价。
2.间接ELISA法检测抗体效价：取浓度为5μg/ml的带His标签的FCN-1和FCN-2重组蛋白抗原包被聚苯乙烯微孔板，每孔100μl，4℃过夜。洗板后每孔加封闭液150μl，37℃放置2小时，洗板后加入1:200,1:400,1:800,1:1600,1:3200,1:6400,1:12800,1:25600,1:51200,1:102400倍比稀释的待测血清、空白对照和阴性对照，每孔100μl，37℃孵育1h，洗板。每孔加入1:10000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG 100μl，37℃孵育1h，洗板。每孔加入1×TMB 100μl，37℃避光显色20min。加入终止液。用酶标仪测定OD490nm，测定孔与阴性对照孔的比值(P/N)>2.1为确定效价的临界点(表1)。
表1.抗血清ELISA效价
免疫小鼠编号 抗血清效价
M0309-1 1:12800
M0309-2 1:12800
M0309-3 1:6400
二、杂交瘤细胞融合及阳性克隆筛选
1.制备骨髓瘤细胞(Sp2/0)：将生长状态良好的骨髓瘤细胞(Sp2/0or NS-1)收集，用RPMI-1640培养基洗涤1次，再用RPMI-1640培养基重悬成1×106个细胞/mL的细胞悬液，于小鼠背部皮下注射0.5mL。待10天左右实体瘤形成后，取瘤组织，制备细胞悬液。
(1)小鼠颈椎脱臼处死，75％酒精浸泡10min。
(2)无菌状态下将小鼠背部肿瘤组织取出到无菌匀浆器中，加5mL RPMI-1640培养基研磨5-10次后，室温静置5min，使大组织块沉底部，取上清细胞悬液2mL出来，再补加2mLRPMI-1640培养液到匀浆器中，再次研磨，重复上述操作。吹打后静置5min后，吸取上层细胞悬液于新的50mL无菌离心管中备用。将细胞悬液1200rpm离心8min后，弃上清，用6-8MlRPMI培养液重悬。
(3)在新的15mL离心管中加入4mL淋巴细胞分离液，将细胞悬液缓慢加到淋巴细胞分离液液面上，800g离心15min，用巴氏吸管吸取中间的白色云雾状细胞(Sp2/0骨髓瘤细胞)层到新的离心管中，用15mL RPMI-1640洗涤细胞1次，再重悬计数。
2.免疫小鼠脾脏制备
(1)将血清抗体效价最高的小鼠眼球取血并收集，留血清作为阳性血清。
(2)小鼠无菌剪开腹腔，取出脾脏，置于装有5mL RPMI培养液的匀浆器中充分研磨。
(3)静置5min，取匀浆液到新的15mL离心管中，并补加RPMI培养液到15mL，1200rpm离心10min。
(4)弃上清，用10mL RPMI-1640培养液将细胞洗涤一次后重悬计数。
3.细胞融合
(1)将Sp2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞以1:3-1:10的比例混合，加到50mL离心管吹打混匀，补加RPMI-1640培养液到40mL，1200rpm离心10min，尽量将上清弃干净。
(2)在1min内慢慢滴入预温至37℃的50％PEG4000融合剂(Sigma)900μL，边加边搅拌。加完后再搅拌30s，静置1min。
(3)慢慢加入RPMI-1640培养液至50mL，终止反应。1200rpm离心5min，去上清于37℃放置5min，用含5％HAT(H：次黄嘌呤，A：氨基蝶呤，T：胸腺嘧啶脱氧核苷)的RPMI-1640培养液悬浮。
(4)提前1天，将小鼠腹腔局势细胞加入96孔板中作为饲养细胞。
(5)将融合反应后得到的细胞悬液按10000个/100μL L/孔加入96孔板中，置于37℃、5％CO2的培养箱内培养。
(6)融合后3天即可以看到杂交瘤细胞，第7天换1/2HAT完全培养基，第8天换1/2HT培养基。融合后10天左右开始进行筛选检测。细胞融合结果：融合后用HAT选择性培养基培养，显微镜下观察，看到多个生长的杂交瘤细胞，证明融合操作成功。
(7)杂交瘤细胞上清的检测：将抗原(带His标签的ficolin-2重组蛋白，GST和BSA分别包被；5μg/mL，100μL/孔)包被在酶标板上4℃过夜，PBST洗涤3次后，封闭37℃1h，洗涤3次，再加入杂交瘤培养上清，于37℃孵育1h，PBST洗涤3次，加入1:4000稀释的HRP-羊抗鼠IgG(Proteintech，SA00001-1)，PBST洗涤3次后，加入50μL/孔TMB底物显色10min，用2M浓硫酸终止反应，检测OD450nm。同时设立小鼠阳性血清为阳性对照，设Sp2/0细胞培养上清为阴性对照，OD450nm>阴性对照2倍的样品为阳性。选取阳性/阴性比值高，生长旺盛的细胞待用，以备进行克隆化。
4.杂交瘤的克隆化(有限稀释法)、特异性和效价鉴定
(1)将杂交瘤细胞从培养孔中吹散吸出，计数细胞。
(2)将细胞用RPMI-1640培养液稀释到10个细胞/毫升，将细胞悬液按100μL/孔分别加入到96孔细胞培养板中。对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆。(因为第一次亚克隆得到的阳性孔细胞株尚不稳定，有可能包含多个杂交瘤细胞，普遍认为第二次亚克隆后杂交瘤细胞为单个细胞株，并确定为阳性)。第一次亚克隆有限稀释阳性孔中细胞，至多个孔中，加HT DMEM培养基培养，7天左右在显微镜下观察，间接ELISA检测有克隆生长的孔，取OD值高的孔为阳性孔；挑取阳性孔的细胞进行第二次亚克隆，检测出稳定阳性的杂交瘤细胞株，作为最终制备单抗的细胞，并扩大培养。
(3)单克隆抗体亚型鉴定：用美国Southern Biotech的单抗亚型鉴定试剂盒分别测各个上清的亚型。准备好包被有免疫原蛋白的板条，50ng/孔，每个克隆收集600μl上清，分别滴加到6个对应蛋白的酶标孔中，100μl/孔。37℃孵育1h，PBST洗三遍，将稀释好的分型二抗抗IgM，IgA，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3的抗体加入6个孔中，37℃孵育1h，PBST洗三遍，TMB显色。以有最强蓝色的孔对应的鉴定二抗亚型即为该抗体的亚型(表2和图1)。
表2.单克隆抗体亚型
Figure BDA0002040384690000071
Figure BDA0002040384690000081
(4)抗体特异性的检测：在克隆后第10天，细胞克隆长满培养孔1/2时检测抗体的特异性。以转染pcDNA3.1-FCN-1或pcDNA3.1-FCN-2的Vero细胞裂解物作为抗体特异性鉴定的抗原。Western Blot鉴定筛选阳性克隆抗体的特异性：以Vero细胞裂解物上样，进行Western Blot测定，以制备的ficolin-2单克隆抗体为一抗，HRP羊抗鼠IgG为二抗，用ECL溶液进行显影分析。选取条带单一而清晰，且特异识别ficolin-2(FCN-2)抗原的克隆5B3作为阳性克隆(图2)。
5.单克隆抗体大量制备
取12周龄BALB/c小鼠，腹腔内注射0.5ml灭菌的石蜡油，1周后接种2×106个细胞/mL生理盐水，观察腹水的产生情况。1-2周后收集腹水，离心收集上清，用辛酸硫酸铵+DEAE离子柱法纯化抗体，获得小鼠抗人ficolin-2单克隆抗体。
(1)辛酸硫酸铵+DEAE离子柱法纯化(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3亚型抗体):
(2)腹水离心，吸出淡黄色液体计算体积，用4倍体积的60mM醋酸缓冲液(pH4.0)1:3稀释，逐滴加入辛酸(终浓度为25μl/ml稀释腹水)，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
(3)10000r/min，4℃，20min，收集上清，加入1/10体积的10*PBS(0.1M pH7.4)。根据每ml上述混合液加0.277g固体硫酸铵(0℃条件下，45％饱和硫酸铵为0.291g/ml)，继续静置至少60min以上。
(4)10000r/min，4℃，20min，弃上清，将沉淀溶解于少量PBS中。对PBS透析，4℃透析过夜。
(5)检测浓度纯度后，调整浓度至2mg/ml。
(6)单克隆抗体特异性鉴定：取浓度为2μg/ml的带His标签的FCN-1和FCN-2重组蛋白抗原包被聚苯乙烯微孔板，每孔100μl，4℃过夜。洗板后每孔加封闭液150μl，37℃放置2小时，洗板后加入待测单克隆抗体，每孔100μl，37℃孵育30min，洗板。每孔加入羊抗鼠IgG亚型抗体100μl，37℃孵育30min，洗板。每孔加入1×TMB 100μl，37℃避光显色20min。加入终止液。据此鉴定待测单克隆抗体的亚型，5B3单克隆抗体为IgG2亚型。
(7)间接ELISA法检测效价，测定孔与阴性对照孔的比值(P/N)>2.1为确定效价的临界点。5B3单抗细胞株制备的腹水抗体效价可以达到1:409600稀释度(图3)。
【实施例3】比较抗人ficolin-2单克隆抗体5B3和商业化单抗(sc-130297)与Ficolin-2蛋白的不同截断体的结合
商业化的Ficolin2单抗来源：购买于SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC.L-ficolin(FCN219)：sc-130297(来源:L-ficolin(FCN219)是用人的重组L-ficolin免疫小鼠获得的单克隆抗体)。
构建Ficolin-2(又称L-ficolin)蛋白的不同截断体的真核表达质粒，Ficolin-2蛋白的不同截断体构建示意图见图4。将Ficolin 2的真核表达质粒及截短质粒分别转染到vero细胞中，转染48小时。48小时后弃去上清，收获细胞，用抗人ficolin-2单克隆抗体5B3以及商品化Ficolin2单抗(sc-130297)分别用免疫印迹Western blot(WB)检测。
图5结果显示本申请的单抗与商品化单抗是不同的，下图5A中显示抗人ficolin-2单克隆抗体5B3专一结合在ficolin-2的N端(26aa-111aa)。通过免疫印迹(WB)显示，构建的ficolin-2的三个截断蛋白中，仅仅ficolin-2的D3或全长ficolin-2与单抗5B3结合，而图5B显示商品化单抗(sc-130297)仅仅与全长ficolin-2，不与ficolin-2的三个截断蛋白结合。而且同样稀释度做的结果，本申请的单抗显示出更强(显色更强)的结合能力，说明本申请的ficolin-2单克隆抗体5B3比商业化单抗效价更高。
结果说明本申请制备的抗人ficolin-2单克隆抗体5B3与Ficolin-2蛋白的结合位点和商业化单抗(sc-130297)与Ficolin-2蛋白的结合位点不同。
【实施例4】血清ficolin-2的酶联夹心ELISA法检测
以获得的单克隆抗体为核心，建立酶联夹心ELISA法检测人血清ficolin-2的检测方法。
在96孔ELISA板上包被100μL兔抗ficolin-2多克隆抗体。在室温(RT)下孵育1小时后，弃去溶液，用含0.2％吐温-20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤ELISA板3次后，加入100μL新鲜血清(采集后6小时内)或100μL不同浓度的重组ficolin-2蛋白，在37℃下孵育2小时。洗净三次，用5％牛血清白蛋白(BSA)封闭过夜。然后加入小鼠抗人ficolin-2(1:1000稀释)单克隆抗体，在37℃下孵育1小时。将ELISA板洗涤3次，加入100μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG(1:1000稀释液)孵育。将ELISA板洗涤3次，通过添加100μL/孔四甲基联苯胺(TMB)显色底物(Sigma)实现显色。加入100μL的0.5M H2SO4，停止反应，用酶标仪测定OD450nm。使用由不同浓度的ficolin-2重组蛋白制成的ficolin-2标准曲线测定ficolin-2不同浓度。
【实施例5】血清ficolin-2的荧光夹心ELISA法检测
以获得的单克隆抗体为核心，建立荧光夹心ELISA法检测人血清ficolin-2的检测方法。
在96孔黑色酶标板上包被100μL兔抗ficolin-2多克隆抗体。在室温(RT)下孵育1小时后，弃去溶液，用含0.2％吐温-20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤ELISA板3次后，加入100μL新鲜血清(采集后6小时内)或100μL不同浓度的重组ficolin-2蛋白，在37℃下孵育2小时。洗净三次，用5％牛血清白蛋白(BSA)封闭过夜。然后加入小鼠抗人ficolin-2(1:1000稀释)单克隆抗体，在37℃下孵育1小时。将ELISA板洗涤3次，加入100μL FITC-标记的羊抗小鼠IgG(1:1000稀释液)孵育。将ELISA板洗涤3次，用荧光酶标仪测定荧光信号强度。使用由不同浓度的ficolin-2重组蛋白制成的ficolin-2标准曲线测定ficolin-2不同浓度。
【实施例6】血清ficolin-2的化学发光法检测
以获得的单克隆抗体为核心，建立化学发光法检测人血清ficolin-2的检测方法。
在96孔白色酶标板上包被100μL兔抗ficolin-2多克隆抗体。在室温(RT)下孵育1小时后，弃去溶液，用含0.2％吐温-20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤ELISA板3次后，加入100μL新鲜血清(采集后6小时内)或100μL不同浓度的重组ficolin-2蛋白，在37℃下孵育2小时。洗净三次，用5％牛血清白蛋白(BSA)封闭过夜。然后加入小鼠抗人ficolin-2(1:1000稀释)单克隆抗体，在37℃下孵育1小时。将ELISA板洗涤3次，加入100μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG(1:1000稀释液)孵育。将ELISA板洗涤3次，通过添加100μL/孔化学发光底物(
Figure BDA0002040384690000111
飞克特超敏ECL发光液，大连美仑)。或向Ep管中加入异鲁米诺(ABEI)标记的小鼠抗人ficolin-2(1:1000稀释)单克隆抗体、100μL新鲜血清(采集后6小时内)或100μL不同浓度的重组ficolin-2蛋白、FITC标记的兔抗ficolin-2多克隆抗体、抗FITC包被的磁珠，温育15min后，形成“夹心三明治”免疫复合物(ABEI-ficolin-2单克隆抗+ficolin-2抗原+FITC包被抗体+抗FITC包被的磁珠)，该免疫复合物可被磁珠捕获，经洗涤后，加入化学发光底物(
Figure BDA0002040384690000112
飞克特超敏ECL发光液，大连美仑)。用化学发光检测仪测定425nm发射光强度。使用由不同浓度的ficolin-2重组蛋白制成的ficolin-2标准曲线测定ficolin-2不同浓度。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种分泌抗人ficolin-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株是保藏编号为CCTCC NO：C201943的小鼠抗人ficolin-2单克隆抗体杂交瘤细胞5B3。
2.一种抗人ficolin-2单克隆抗体5B3，其特征在于，由权利要求1所述的保藏编号为CCTCC NO：C201943的小鼠抗人ficolin-2单克隆抗体杂交瘤细胞5B3分泌。
3.权利要求2所述的抗人ficolin-2单克隆抗体5B3在制备用于检测人ficolin-2蛋白的免疫检测工具中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为含权利要求2所述的抗人ficolin-2单克隆抗体5B3的免疫组化试剂盒。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的免疫组化试剂盒为采用可见光、荧光、化学发光或酶标任意一种进行标记。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为定量检测人ficolin-2蛋白含量的双抗夹心酶联免疫试剂盒，权利要求2所述的人ficolin-2单克隆抗体5B3作为检测抗体。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为定量检测人ficolin-2蛋白含量的双抗夹心荧光免疫（ELISA）试剂盒，权利要求2所述的人ficolin-2单克隆抗体5B3作为检测抗体。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为定量检测人ficolin-2蛋白含量的化学发光试剂盒，权利要求2所述的人ficolin-2单克隆抗体5B3作为检测抗体。
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