CN101570575B

CN101570575B - Sncg的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN101570575B
Application number: CN 200810105770
Authority: CN
Inventors: 寿成超; 刘彩云; 吴建; 孟麟
Original assignee: Beijing Inst Of Tumor Prevention & Cure
Current assignee: Beijing Xiandai Gaoda Biotechnology Co ltd; Biochain Beijing Science and Technology Inc
Priority date: 2008-04-30
Filing date: 2008-04-30
Publication date: 2012-02-29
Anticipated expiration: 2028-04-30
Also published as: CN101570575A

Abstract

本发明涉及SNCG(synucleinγ)的单克隆抗体及其应用。本发明的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.2468或CGMCC No.2469的杂交瘤细胞系分泌。本发明的单克隆抗体具有较高的灵敏度和特异性，可识别内源性SNCG蛋白并可用于各种免疫学检测；可应用于临床组织标本中SNCG蛋白表达水平的检测，以预测肿瘤的转移趋势及患者的预后；可应用于疑似或肿瘤患者体液中SNCG蛋白的检测，以帮助肿瘤的诊断；与检测其它肿瘤标志物的试剂联合能提高肿瘤诊断的敏感性和特异性，也有助于动态观察肿瘤进程，为个体化的治疗方案提供参考依据；亦可用于SNCG的相关研究和药物开发。

Description

SNCG的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体地涉及针对SNCG(synucleinγ)的单克隆抗体或者来源于该抗体的能够特异性结合SNCG的生物活性片段，和分泌该抗体的杂交瘤细胞系。本发明还涉及包含该抗体或其生物活性片段的试剂盒、抗肿瘤药物和检测试剂；所述抗体或其生物活性片段在检测样品中SNCG蛋白水平的应用，以及所述抗体任选与检测其它肿瘤标志物的试剂的联合在用于辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和/或肿瘤患者预后判断中的应用。

背景技术

恶性肿瘤的发病率近年来在全球范围内继续呈上升之势。由于恶性肿瘤的发病大多较为隐匿，早期没有明显症状，患者就诊时往往已经到了晚期或已发生转移，这种转移在临床上难以察觉，从而影响对早期肿瘤的合理治疗。临床病理指标如TNM分期相近的患者，预后有较大的差异，说明肿瘤发生、发展的复杂性。目前尚缺乏能用于诊断或预后判断的理想肿瘤标志物。癌胚抗原CEA已普遍应用于消化道肿瘤(例如结直肠癌)的患者血清标志物的检测，但其灵敏度偏低。因此，寻找并检测与肿瘤发生、发展及转移相关的肿瘤标志物和/或肿瘤抗原，对肿瘤的临床诊断、监视病情发展及判断预后均有重要意义，以提高肿瘤的治疗水平、延长患者的生存期，同时对肿瘤发生的分子机制也有重要意义。

synucleinγ(突触核蛋白γ)，简称SNCG，属于synuclein家族成员，该家族是具有高度保守性的小分子神经蛋白家族。由于首先在乳腺癌中筛选出来的，又称乳腺癌特异基因(BCSG1)。目前已知该家族还包括synucleinα(SNCA)和synucleinβ(SNCB)。synucleinα主要与一些神经退行性疾病有关，例如阿尔茨海默氏病(AD)和帕金森氏病(PD)。有关SNCG的研究进展大多在乳腺癌或卵巢癌中。SNCG在正常乳腺组织或乳腺良性病变组织中不表达，而在乳腺癌组织表达而且呈现出明显的TNM分期特异性，即I/II期SNCG低水平表达，III/IV期高水平表达，提示SNCG的表达与乳腺癌的浸润和转移相关。近年来有不少研究提示，SNCG的高表达同肿瘤的侵袭、转移等恶性表现有关。但目前国内外关于SNCG的研究均是利用SNCG的多克隆抗体进行的，而多克隆抗体的特异性差，用于免疫组化时显色背景高，质量不易控制，难以在临床诊断中推广。而用PCR方法检测SNCG的基因表达又存在易被污染产生假阳性的缺点，同时不能准确反映蛋白质的实际水平，从而极大地限制了SNCG检测在临床中的应用。已有单抗(Jianping Guo等，Neuronal proteinsynuclein gamma predicts poor clinical outcome in breast cancer.《Int.J.Cancer》121(6)：1296-305，2007；以及中国专利申请号；200410078299.9中所公开的单抗4E9)不能用于免疫组化之外的其它免疫学方法而检测内源性SNCG蛋白水平，尤其不能用于体液中SNCG检测。因此，需要制备能够用于内源性SNCG，尤其是体液中SNCG检测的、特异性强和敏感性更高的SNCG单克隆抗体，以便能用于对肿瘤的诊断、监测肿瘤和预后判断。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种SNCG的单克隆抗体或者来源于该抗体的能够特异性结合SNCG的生物活性片段；

本发明的另一目的是提供分泌本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系；

本发明的另一目的是一种检测SNCG水平的试剂盒。

本发明的另一目的是提供本发明的单克隆抗体或其生物活性片段在制备用于检测样品中SNCG水平的试剂或试剂盒中的应用。

本发明的另一目的是提供本发明的单克隆抗体或其生物活性片段在制备用于辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和/或肿瘤患者预后判断的试剂或试剂盒中的应用。

本发明的另一目的是提供一种抗肿瘤药物。

本发明的另一目的是提供一种SNCG水平的检测试剂。

一方面，本发明提供一种SNCG的单克隆抗体或者来源于该抗体的能够特异性结合SNCG的生物活性片段，所述单克隆抗体由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCC No.2468或CGMCC No.2469的杂交瘤细胞分泌。由于SNCG与其家族中的其它两个成员SNCA，SNCB同源性很高，所以不易得到仅与SNCG反应，而不与SNCA、SNCB反应的特异性单克隆抗体。本发明人通过大量实验以及丰富技术经验获得了本发明的单克隆抗体(单抗)。经鉴定，本发明单克隆抗体αSNCG1的亚类是IgG2a。同时，另一种抗SNCG单抗αSNCG2可与αSNCG1单抗识别不同的抗原表位，其亚类是IgG1。

本发明的单克隆抗体与已有的SNCG蛋白单克隆抗体不同，并且具有意想不到的有益效果，例如，本发明的单克隆抗体具有较高的灵敏度和特异性，可识别内源性SNCG蛋白并可用于免疫组织化学(免疫组化)、免疫细胞化学、免疫沉淀、免疫印迹和酶联免疫吸附实验(ELISA)等免疫学检测，可应用于临床组织标本中SNCG蛋白表达水平的检测，以预测肿瘤的转移趋势及患者的预后；可应用于疑似或肿瘤(如结肠癌/乳腺癌/卵巢癌)患者体液(如血清、尿液)中SNCG蛋白的检测，以帮助肿瘤的诊断；与检测其它肿瘤标志物的试剂联合能提高肿瘤诊断的敏感性和特异性，也有助于动态观察肿瘤进程，为个体化的治疗方案提供参考依据；亦也可用于SNCG的相关研究和药物开发。

经实验证明，本发明的单克隆抗体不仅可成功用于需要较高抗体效价的石蜡切片免疫组化实验中(实施例9)，而且可成功用于血清、尿液等需要高敏感性和特异性的免疫学检测中(实施例8)。采用血清、尿液等样品进行检测，简便易行，创伤小、费用低，适用于临床大批量检测。此外，由于本发明的单克隆抗体具有较高的效价，所以其不仅与原核表达蛋白或外源性蛋白反应，更可与内源性SNCG蛋白反应。而中国专利申请号：200410078299.9中所公开的单抗4E9则不能有效用于上述检测中。

另一方面，本发明提供一种分泌本发明所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其已于2008年4月29日以保藏号CGMCC No.2468或CGMCCNo.2469被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)。本发明的杂交瘤细胞系具有较强的分泌单克隆抗体的能力(例如，抗SNCG单抗的细胞培养上清可进行1∶000倍稀释后进行ELISA试验其滴度未明显下降)，能稳定、大量分泌本发明的单克隆抗体。

从杂交瘤细胞收集本发明的单克隆抗体时，可以从杂交瘤细胞体外培养上清液中获得抗体，或者将杂交瘤细胞注入适宜的哺乳动物并从动物腹水中获取抗体。前一种方法适于获得高纯度的抗体，后一种方法适于大量获取抗体。通过上述方法获得的抗体，可以用常规方法纯化，例如盐析、凝胶过滤、亲合色谱层析等方法。

本领域普通技术人员已知，可以直接采用SNCG蛋白作为抗原，获得本发明的单克隆抗体。也可以将本发明SNCG蛋白与已知的标签形成重组蛋白作为抗原，获得对SNCG有反应性、对标签没有反应性的本发明的单克隆抗体。所述的标签选自，但不限于，组氨酸标签(His标签)、谷胱苷肽巯基转移酶标签(GST标签)、HA标签、HSV标签、Myc标签或VSV-G-标签等。在本发明的一个实施方式中，本发明通过原核表达获得纯化的GST-SNCG融合蛋白，并通过杂交瘤技术获得SNCG蛋白的单克隆抗体。

因此，本发明还提供本发明单克隆抗体的制备方法，该方法包括：用融合蛋白谷胱苷肽巯基转移酶-SNCG(GST-SNCG)免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对SNCG有反应性、对谷胱苷肽巯基转移酶没有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤上清液中或从注射杂交瘤细胞后的动物腹水中获取单克隆抗体。上述方法仅是示例性的，例如可以用同样的方法免疫其他哺乳动物，大鼠、兔子、豚鼠或仓鼠等。

在本发明的一个实施方式中，以SNCG基因(Genbank登记号：GeneID 6623)的cDNA为模板，用PCR方法扩增SNCG基因的cDNA片段。将PCR扩增产物克隆到原核表达载体pGEX4T-1上，构建原核重组质粒pGEX4T-1-SNCG，并在大肠杆菌中表达。挑选单克隆阳性菌，大量诱导表达GST-SNCG蛋白并纯化。参照Kohler和Milstein建立的B淋巴细胞杂交瘤技术(Kohler G，Milstein C，Continuous cultures of fused cellssecreting antibody of predefined specificity.Nature.1975 Aug 7；256(5517)：495-7)，本发明用纯化的GST-SNCG蛋白免疫BALB/c小鼠。将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，制备杂交瘤细胞。用ELISA方法筛选阳性细胞克隆。本发明人经过多次试验，获得了多株阳性细胞克隆。对这些阳性克隆所分泌的单克隆抗体进行分析鉴定，发现两株分泌单克隆抗体αSNCG1和αSNCG2的杂交瘤细胞株，其分泌的SNCG单克隆抗体αSNCG1和αSNCG2具有较高的灵敏度和特异性，可识别内源性SNCG蛋白并可用于免疫组化、免疫细胞化学、免疫沉淀、免疫印迹和酶联免疫吸附实验(ELISA)等免疫学检测；可应用于临床组织标本中SNCG蛋白表达水平的检测；亦可应用于疑似或早期肿瘤患者血清SNCG蛋白表达的检测，同时可动态检测肿瘤进展过程中SNCG蛋白水平的变化。所述杂交瘤细胞株已于2008年4月29日以保藏号为CGMCC No.2468或CGMCC No.2469被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)。

另一方面，本发明提供一种检测SNCG水平的试剂盒，其含有本发明的单克隆抗体或其活性片段；优选所述的试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物，以及缓冲液；优选优选所述第二抗体为本发明所述的单克隆抗体或抗本发明所述单克隆抗体的抗抗体(例如本领域常用的羊抗鼠IgG)或按本领域已知技术制备的抗SNCG的多抗。

作为检测信号的荧光和/或放射标记可以是放射性同位素、荧光化合物、生物素和酶等。所述酶包括，但不限于，辣根过氧化物酶(horseradishPeroxidase，HRP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatease，AP)、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等，优选辣根过氧化物酶和/或碱性磷酸酶。本领域普通技术人员已知，针对不同的酶，可使用不同的底物。HRP作用的底物包括，但不限于，邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS、二氨基联苯胺(diamino benzidine，DAB)等。碱性磷酸酶的底物一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)、碱性磷酸酶红(alkalinephosphatase-red，AP-Red，又称Fast Red，快红)，AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮)。本发明的试剂盒可用于检测结直肠癌、乳腺癌或卵巢癌等肿瘤及多种癌症细胞系及血清中的SNCG表达水平，进而用于对上述多种癌症的辅助诊断和相关的实验研究以及指导临床治疗。

发明人进一步应用本发明的单抗建立了简单特异、灵敏度高、可大批量检测临床血清SNCG蛋白水平的双抗夹心ELISA法。在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供了一种检测流体样品中SNCG水平的双抗夹心ELISA试剂盒，其包括用本发明所述单克隆抗体或其活性片段包被的ELISA酶标板(优选为本发明SNCG单抗αSNCG1包被的ELISA酶标板)，SNCG标准品，辣根过氧化物酶标记的抗SNCG第二单抗(优选为本发明单抗αSNCG2)，相应显色底物四甲基联苯胺(TMB)、H₂O₂及缓冲液。

在本发明的另一具体实施方式中，所述试剂盒用于检测组织细胞中SNCG的表达水平，特别是对结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤组织中SNCG的检测，其包括本发明所述单克隆抗体或其活性片段，还包括用于检测本发明所述单克隆抗体或活性片段的抗抗体及酶或荧光标记物和相应的缓冲液；在本发明的优选实施方式中，所述组织细胞为来自肿瘤组织的活检细胞或培养细胞或为已建系培养细胞。

另一方面，本发明提供本发明的单克隆抗体或其生物活性片段在制备检测样品中SNCG水平的试剂或试剂盒中的应用。所用检测方法包括可以使用本发明抗体的所有免疫方法，例如ELISA、Western Blot、免疫沉淀、免疫组化、免疫荧光等。优选为免疫组化，更优选为石蜡切片免疫组化，也优选为双抗夹心ELISA。本发明的单克隆抗体可检测任何样品的SNCG的表达水平，优选所述样品为受试个体(如人体)体液样品、或细胞蛋白提取液；可为来自受试个体的生物流体(例如血清、尿液或组织液)和组织样品(例如结直肠癌组织、乳腺癌组织或卵巢癌组织)；更优选所述样品为血清；在一个优选实施方式中，所述受试个体优选为恶性肿瘤病人及相应的高危人群；所述恶性肿瘤优选为结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌。

在本发明的一个实施方式中，本发明提供了一种双抗夹心ELISA检测方法，该方法包括：用本发明的αSNCG1包被ELISA酶标板(捕获抗体)，加入待检标本及HRP-αSNCG2(检测抗体)反应后，加入底物溶液，根据颜色反应来判定待检标本中的抗原含量。优选所述待测样本可来自生物流体(例如血液、尿液、组织液)和组织样品(例如结直肠癌组织、乳腺癌组织或卵巢癌组织)；更优选所述待测样本为血清，从而可大批量检测临床血清SNCG蛋白水平。实验证实，αSNCG2单抗识别SNCG蛋白的氨基端抗原位点，αSNCG1和αSNCG2两种抗SNCG单抗识别SNCG蛋白分子上两个不同的抗原表位，由此可建立双抗夹心ELISA法检测可溶性SNCG蛋白。结果表明：αSNCG1单抗作为捕获抗体，αSNCG2作为检测抗体建立最佳双抗夹心ELISA法(双抗夹心ELISA法)即4μg/mlαSNCG1包被酶标板，0.3μg/ml αSNCG2-HRP检测抗体，建立了抗SNCG单抗αSNCG1-SNCG-αSNCG2-HRP检测系统以检测可溶性SNCG蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，提供了通过双抗夹心ELISA法检测临床血清的SNCG蛋白水平的方法，该方法简单特异、灵敏度高、可大批量检测临床血清SNCG蛋白水平，该方法包括：以抗SNCG纯化单抗αSNCG1包被96孔板。封闭后加入人血清及HRP-αSNCG2单抗，常规TMB显色，并测定OD450处的吸光度值。在本发明的一个具体实施例中，用本发明SNCG单克隆抗体如上所述进行夹心ELISA对肿瘤患者的血清SNCG进行检测，其特异性和敏感性分别达到38.4％和99.1％。申请人同时证明，中国专利申请号：200410078299.9中所公开的单抗4E9不能有效用于双抗夹心ELISA法中进行SNCG蛋白水平的检测，更不能有效用于临床血清的SNCG蛋白水平检测。

另一方面，本发明提供本发明的单克隆抗体或其生物活性片段在制备用于辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和/或肿瘤患者预后判断的试剂和/或试剂盒中的应用。本发明不但证明了SNCG为肿瘤标志物及独立的预后因子，而且还证明SNCG与其他已知肿瘤标志物(例如癌胚抗原CEA水平和CA19-9水平)的联合检测可提高对肿瘤诊断的敏感性和特异性。因此，可单独使用本发明抗SNCG单抗进行辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和/或肿瘤患者预后判断，也可以组合检测本领域已知的肿瘤标志物(例如癌胚抗原水平和CA19-9水平)的试剂，以进一步提高辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和/或肿瘤患者预后判断。

可利用本发明的单克隆抗体或其生物活性片段通过检测疑似或早期结直肠癌组织、或乳腺癌组织或卵巢癌组织等癌症组织来辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和/或肿瘤患者预后判断；此时优选采用免疫组化检测。也可利用本发明的单克隆抗体或其生物活性片段通过检测体液，尤其是血清来辅助诊断、监测癌症和/或肿瘤患者预后判断；此时可采用本领域已知的任意检测方法，优选采用双抗夹心ELISA法进行检测，然后比较正常人血清及癌症患者血清中SNCG蛋白水平。其检测的性能鉴定可应用灵敏度，特异性，受试者工作特征曲线ROC(Receiver Operating Characteristic)下面积(area under the ROC curve，AUCROC)来判断诊断试验的诊断效率。在本发明的一个优选实施方式中，本发明的单克隆抗体或其生物活性片段可用于通过监测SNCG水平的动态变化来监测肿瘤的进程。

另一方面，本发明提供一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物含有本发明所述的单克隆抗体或其生物活性片段。本发明的SNCG单克隆抗体能够与SNCG特异性、高效结合。因此，给予肿瘤患者本发明的单克隆抗体或该抗体的能够与SNCG蛋白特异性结合的生物活性片段，可能抑制肿瘤细胞内SNCG的活性，从而起到抑制肿瘤浸润、转移的作用。因此，本发明还提供一种治疗动物(包括人)肿瘤的方法，包括给予需要治疗的动物治疗有效量的本发明单克隆抗体或其生物活性片段。对此处所用“肿瘤”或“癌症”没有特别限制，只要与SNCG的过表达相关即可，优选为结直肠癌或乳腺癌或卵巢癌。

所述药物的制备方法可以是本领域技术人员熟知的任何方法，例如将本发明的单克隆抗体或其生物活性片段与适当的赋形剂混合。所述赋形剂是本领域常规用于抗体药物制备的赋形剂，如水、盐水、缓冲剂等。所述药物的给药途径可以是任何抗体药物的常规给药途径，例如，静脉内注射、皮下注射、肿瘤内注射等。

另一方面，本发明提供一种检测试剂，该检测试剂含有本发明所述的单克隆抗体或其生物活性片段。所述检测试剂的制备方法可以是本领域技术人员熟知的任何方法，例如将本发明的单克隆抗体或其生物活性片段与适当的载体混和，如水、盐水、缓冲剂等。本发明的检测试剂可应用于临床组织标本中SNCG蛋白表达水平的检测，预测早期肿瘤的转移趋势及患者的预后；亦可应用于早期肿瘤患者血清SNCG蛋白表达的检测，同时可动态检测肿瘤进展过程中SNCG蛋白水平的变化，给临床医生制定个体化的治疗方案提供参考依据。

附图说明

图1：12％SDS-PAGE电泳鉴定αSNCG1单抗的纯度及定量。其中第1，2，3道电泳为BSA(1μg，5μg，10μg)；4，5，6道为纯化单抗αSNCG1(1μl，5μl，10μl)。

图2：用包被GST-SNCG、GST-SNCA、GST-SNCB重组蛋白ELISA酶标板分析αSNCG1和αSNCG2的特异性。纵坐标为OD450处的吸光度平均值，横坐标为1μg/ml包被抗原抗体浓度。结果显示αSNCG1和αSNCG2仅与GST-SNCG特异反应，而与GST-SNCA、GST-SNCB几乎无交叉反应。

图3：αSNCG1单抗应用于Western-Blot方法检测结直肠癌细胞系中内源性SNCG蛋白表达。15％SDS-PAGE电泳，细胞裂解液总蛋白上样量50μg，一抗为αSNCG1，SNCG阳性细胞系T47D和阴性细胞系MCF-7分别作为阳性和阴性对照。从左到右分别为：T47D、MCF-7、HCT-116、RKO、SW480、LOVO、CL-187、HT-29。

图4：αSNCG1，αSNCG2单抗应用免疫沉淀(IP)法检测T47D细胞中SNCG蛋白表达。从左到右分别为：SNCG阳性对照；正常小鼠IgG对照；αSNCG1；αSNCG2。

图5：αSNCG1单抗应用于免疫细胞化学方法检测结直肠癌细胞系中内源性SNCG蛋白表达。其中，1～7分别代表：MCF7-SNCG、HCT-116、RKO、SW480、LOVO、CL-187、HT-29细胞系。

图6：αSNCG1和αSNCG2单抗应用于双抗夹心ELISA法检测结直肠癌细胞系中内源性SNCG蛋白表达。

图7：αSNCG1和αSNCG2单抗应用于双抗夹心ELISA法检测正常人群及结直肠癌患者(CRC患者)血清中SNCG蛋达水平。

图8：αSNCG1单抗应用于免疫组织化学法检测结直肠癌及癌旁组织中SNCG蛋白表达。结果显示结直肠癌癌旁正常组织不表达而结直肠癌组织明显表达SNCG蛋白。

图9：双抗夹心ELISA法的特异性(A)及检测细胞裂解液、细胞培养上清和结直肠癌患者血清SNCG水平与反应信号的线性关系(B)，其中，SNCG sup.：MCF7-SNCG细胞培养上清1∶10稀释起；HT-29：HT-29细胞裂解液1∶2000稀释起；血清：结直肠癌患者血清。

图10：双抗夹心ELISA法(A)和Western blot法(B)检测结直肠癌患者血清SNCG表达水平的相互验证。

图11：结直肠癌血清SNCG检测的性能鉴定。

图12：229例结肠癌组织标本SNCG表达的Kaplan-Meier曲线分析；其中A和B分别为无病生存累计比率和总生存累计比率。

图13：I/II期、III/IV结肠癌组织SNCG表达与术前血清CEA水平的Kaplan-Meier曲线分析比较。

图14：II/III期结肠癌患者组织SNCG表达、术前血清CEA水平及两者联合的Kaplan-Meier曲线分析比较。

用于专利程序的生物材料保藏信息：

分泌本发明单克隆抗体αSNCG1的杂交瘤细胞株

保藏日期：2008年4月29日

保藏单位全称及简称：

中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)

保藏编号：CGMCC No.2468

用于专利程序的生物材料保藏信息：

分泌本发明单克隆抗体αSNCG2的杂交瘤细胞株

保藏日期：2008年4月29日

保藏单位全称及简称：

中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)

保藏编号：CGMCC No.2469

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步阐明本发明，但本发明的范围并不受这些附图和实施例的限制。

实施例1抗人SNCG单克隆抗体的制备

1、SNCG抗原的制备

分别设计SNCG基因(Genbank登记号：Gene ID 6623)cDNA片段的5’端正义引物5’-GACGGATCCATGGATGTTTTCAAGAAGGC-3’(SEQID NO.1)和3’端反义引物5’-ATCCTCGAGCTAGTCTCCCCCACTCTG-3’(SEQ ID NO.2)(引物由上海生工生物工程公司合成)，并于引物两端分别引入BamH I和Xho I酶切位点。用标准PCR方法扩增SNCGcDNA片段，产物长度为393bp。

将PCR产物与pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)连接形成pGEM-T Easy-SNCG质粒。将pGEM-T Easy-SNCG质粒转化入大肠杆菌JM-109菌株(购自Amersham Biosciences公司)进行扩增。用BamH I和Xho I消化扩增的pGEM-T Easy-SNCG质粒，再用BamH I和Xho I消化原核表达载体pGEX4T-1，将上述消化获得的SNCG基因cDNA片段插入原核表达载体pGEX4T-1(购自Amersham Biosciences公司)中，形成pGEX4T-1-SNCG。原核表达载体pGEX4T-1的SD序列下游就是谷胱甘肽巯基转移酶(GST)基因，而克隆的外源SNCG基因则与GST基因相连。当基因表达时，表达产物为GST和SNCG基因产物的融合体GST-SNCG，以方便SNCG的纯化。

用pGEX4T-1-SNCG转化大肠杆菌BL21菌株，挑选阳性克隆的BL21菌株进行GST-SNCG重组蛋白的小量诱导表达。取小量诱导表达鉴定为阳性的菌株进行GST-SNCG重组蛋白的大量诱导表达。用能够吸附GST融合蛋白的谷胱甘肽Sepharose 4B(购自HiTrap公司)纯化GST-SNCG重组蛋白，并回收、鉴定。

2、SNCG单克隆抗体的制备

用纯化的GST-SNCG重组蛋白免疫6～8周龄的BALB/c小鼠，6周后强化免疫。将免疫好的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。用ELISA方法筛选分泌抗SNCG单克隆抗体的杂交瘤细胞。再用有限稀释法对阳性的杂交瘤细胞进行多次亚克隆。选取强阳性的克隆扩大培养、建株，将其所分泌的抗SNCG单克隆抗体命名为αSNCG1，αSNCG2，而该杂交瘤细胞株即为αSNCG1细胞株和αSNCG2细胞株。所述杂交瘤细胞株已于2008年4月29日以保藏号为CGMCC No.2468或CGMCC No.2469被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)。将αSNCG1和αSNCG2细胞分别接种于10周龄BALB/C小鼠的腹腔中，至腹水形成增多腹部特别膨隆时处死小鼠取腹水，其内含大量αSNCG1，αSNCG1单抗。

实施例2鉴定αSNCG1的纯度

用常规ELISA方法鉴定αSNCG1的亚类，证实其为IgG2a，用Pro.ASepharose-4B柱进行纯化，并用12％SDS-PAGE电泳鉴定其纯度及定量(以BSA蛋白为标准进行单抗定量)。结果见图1，显示抗体纯度高、无杂带。类似地，同样证明αSNCG2抗体纯度高、无杂带，属于亚类IgG1。

实施例3测定αSNCG1和αSNCG2抗体的特异性

1μg/ml的GST-SNCG，GST-SNCA(SNCA的Genbank登记号：ID6622，GST-SNCA制备方法同GST-SNCG的制备方法)，GST-SNCB(SNCB的Genbank登记号：ID 113893，GST-SNCB制备方法同GST-SNCG制备方法)包被ELISA酶标板。加入αSNCG1和αSNCG2室温温育1小时；0.05％Tween-20/PBS洗涤反应孔3次，PBS洗涤反应孔2次。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的抗体，室温温育1小时。0.05％Tween-20/PBS洗涤反应孔3次，PBS洗涤反应孔2次。向反应孔中加入辣根过氧化物酶底物TMB，室温显色15分钟后，加入终止液(12.5％H₂SO₄)。用酶标仪测量OD450处的吸光度值。结果见图2，显示αSNCG1和αSNCG2仅与GST-SNCG特异反应，而与GST-SNCA，GST-SNCB无交叉反应。

实施例4 Western-Blot法检测结直肠癌细胞系中SNCG蛋白的表达

细胞(分别为T47D、MCF-7、HCT-116、RKO、SW480、LOVO、CL-187、HT-29)裂解液行15％的SDS-PAGE电泳，每孔蛋白上样量为50μg。转移到硝酸纤维素膜(N.C.)，5％牛奶室温封闭1h，αSNCG1杂交瘤细胞培养上清(1∶10稀释)室温反应1h，HRP-羊抗小鼠IgG(1∶4000)室温反应40min；化学发光。结果显示αSNCG1检测到人结肠癌细胞系中内源性SNCG蛋白表达(图3)。

实施例5免疫沉淀(IP)检测T47D细胞系中SNCG蛋白

取200μg细胞总蛋白与本发明αSNCG1和αSNCG2杂交瘤上清30μl4℃孵育2h，加入Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)，4℃孵育2h。Sepharose-免疫复合物用PBST洗涤3遍后，行常规12％的SDS-PAGE电泳。转膜封闭后，以单抗αSNCG1为一抗进行常规Western blot检测。结果见图4，αSNCG1和αSNCG2均可与T47D细胞系中天然构象的SNCG蛋白反应。

实施例6免疫细胞化学检测结直肠癌细胞系中SNCG的表达

常规方法制备HCT-116(ATCC编号CCL-247)、RKO(ATCC编号CRL-2577)、SW480(ATCC编号CCL-228)、LOVO(ATCC编号CCL-229)、CL-187(ATCC编号CL-187)、HT-29(ATCC编号HTB-38)的细胞爬片，冷丙酮/甲醇(体积比1∶1)固定。将爬片浸泡于3％H₂O₂(PBS稀释)内10分钟，以去除内源性过氧化物酶。PBS洗涤爬片2次。然后用1％BSA(PBS稀释)在37℃下封闭30分钟。滴加适宜浓度的αSNCG1，在37℃下反应1小时。PBS洗涤爬片2次，滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的抗体工作液(DAKO ENVISIONTM+System HRP Mouse)，在37℃下反应1小时。

用PBS洗涤爬片2次，在辣根过氧化物酶底物DAB的溶液中显色20分钟。用PBS终止显色，将爬片反盖在载玻片上，显微镜下观察，以细胞浆内出现棕黄色颗粒状为阳性。结果见图5，HCT-116，HT-29显示细胞浆为棕黄色的强阳性表达；SW480，CL-187显示弱阳性表达；RKO和LOVO为SNCG阴性表达。

实施例7双抗夹心ELISA法检测结肠癌细胞系中SNCG蛋白的表达

以抗SNCG纯化单抗αSNCG1(4μg/m1)包被96孔板，4℃包被过夜。封闭后加入细胞(分别为T47D、MCF-7、HCT-116、RKO、SW480、LOVO、CL-187、HT-29)裂解液50μg及HRP-αSNCG2单抗，室温反应3h。PBST洗涤5遍后，常规TMB显色，并测定OD450处的吸光度值。结果见图6，细胞系中SNCG蛋白表达与WESTERN BLOT结果一致，两者均说明了HT-29细胞SNCG强阳性表达；HCT-116细胞SNCG中等强度表达；SW480，CL-187细胞SNCG弱阳性表达；RKO，LOVO细胞检测不到SNCG水平表达。

实施例8双抗夹心ELISA法检测结肠癌患者与正常人血清中SNCG蛋白的表达

以抗SNCG纯化单抗αSNCG1(4μg/ml)包被96孔板，4℃包被过夜。封闭后加入1∶5倍稀释的人血清及HRP-αSNCG2单抗，室温反应3h。PBST洗涤5遍后，常规TMB显色，并测定OD450处的吸光度值。结果见图7。结直肠癌(CRC)患者(151例)血清SNCG蛋白水平OD450为O.102±0.093，而正常人(109例)血清SNCG蛋白水平OD450为0.029±0.017，两者之间具有显著性差异(P＝0.000)。特异性和敏感性分别为38.4％和99.1％。本发明所建立的双抗夹心ELISA法用于诊断的性能见表1和表2。

表1血清SNCG水平检测

表2血清SNCG水平检测的诊断性能鉴定

实施例9免疫组化检测结直肠癌中SNCG的表达

结直肠癌组织石蜡切片进行常规福尔马林固定、酒精脱水、石蜡包埋，切成4μm厚的切片。在60℃烘烤4小时，以使切片牢固地附着于载玻片上。

用二甲苯对切片进行脱蜡处理，梯度酒精使切片水化，用PBS洗涤切片2次。将切片浸泡于3％H₂O₂(PBS稀释)内10分钟，以去除内源性过氧化物酶。然后用PBS洗涤切片3次。将切片浸泡于pH6.0的0.1M枸橼酸钠缓冲液中，在92℃～100℃煮20分钟，进行抗原修复。待切片自然冷却至室温后，用去离子水洗涤切片2次，再用PBS洗涤切片2次。将5％山羊血清(PBS稀释)滴加于切片上，在37℃下温育30分钟，进行抗原封闭。在切片上滴加适宜浓度的αSNCG1，4℃下过夜。然后用PBS洗涤切片3次。在切片上滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的抗体工作液(DAKO ENVISIONTM+System HRP Mouse)，在37℃下温育1小时。

用PBS洗涤切片2次，将切片浸泡于在辣根过氧化物酶底物DAB的溶液中显色20分钟。用PBS终止显色，用苏木精对切片进行复染。用1％盐酸酒精分化切片，梯度酒精脱水，二甲苯透明，然后将盖玻片盖在组织切片上，显微镜下观察。结果见图8，显示癌旁正常组织不表达SNCG，而结直肠癌组织中SNCG高水平表达(图8)。

实施例10 SNCG表达与多种肿瘤临床病理特征的相关分析

本发明人利用本发明的单抗αSNCG1对223例结肠癌临床标本进行石蜡切片免疫组化分析。结果表明，223例结肠癌组织中有74例SNCG阳性(32.3％)；190例癌旁正常组织中有4例SNCG阳性(2.1％)；而42例良性病变(肠炎组织)中，均无SNCG表达(0％)。经Pearson X2检验，SNCG在结肠良性病变和结肠癌组织中的表达具有显著性差异(P＜0.001)(表3)。结果提示SNCG为一个新的结肠癌肿瘤标志物。

利用上述同样方法，检测了多种肿瘤，同样提示其为多种肿瘤标志物。

表3免疫组化检测SNCG在结直肠癌组织中的表达

a显示1与2之间的差异，b显示2与3之间的差异

实施例11利用双抗夹心ELISA法检测细胞裂解液、细胞培养上清和结直肠癌患者血清SNCG水平

利用本发明的双抗夹心ELISA检测细胞裂解液、细胞培养上清和结直肠癌患者血清水平，结果显示MCF7-SNCG细胞(SNCG转染的乳腺癌细胞系MCF-7)裂解液有强信号产生，MCF-7细胞裂解液无反应；HT-29细胞裂解液和MCF7-SNCG细胞培养上清的反应信号与SNCG蛋白的量(OD450)均显示很好的线性相关性(r2＝0.895，0.970，图9)。应用检测HT-29细胞裂解液或MCF7-SNCG细胞培养上清中SNCG水平的3次批内、批间的变异系数分别为6.23％、9.36％。图9也显示了一位代表性的结直肠癌患者血清中SNCG蛋白水平，由于人血液本身具有粘稠的特性，当血清的稀释度低于1∶4时，SNCG蛋白水平信号出现了所谓的倒钩现象，当血清经过1∶4以后的进一步稀释时，血清中SNCG蛋白水平(或血清稀释度)与反应信号呈现的线性关系类似于HT-29细胞裂解液。血清中高丰度人血浆白蛋白、IgG等掩盖了低丰度目标蛋白的检测。将HT-29细胞裂解液加入到8例正常人血清和8例结直肠癌患者血清中，再检测其SNCG蛋白水平，所得到的回收率为83.59％～116.60％；证明此双抗夹心ELISA法可应用于细胞裂解液、细胞培养上清、人类血液样品中SNCG蛋白的检测。

实施例12双抗夹心ELISA法与免疫印迹法(western blot)检测血液中SNCG蛋白水平

随机取2例正常人血清和8例结直肠癌患者血清在双抗夹心ELISA法中OD450值较低或较高者，各100μl，经αSNCG1-Sepharose富集浓缩后再进行免疫印迹实验，结果如图10，双抗夹心ELISA法中OD450值较低者，western blot结果中也未显示出信号，OD450值较高者在westernblot结果中也明显显示出清晰的蛋白信号，即两种方法得到的结果基本一致。由此也可以说明双抗夹心ELISA法具有简单、特异、能大批量检测血清中靶抗原的一种方法。

实施例13血清SNCG蛋白作为诊断指标的性能鉴定

根据本发明建立的双抗夹心ELISA法检测109例正常人血清和151例结肠癌患者血清SNCG的OD450值，以灵敏度为纵轴、误判率(1-特异度)为横轴，连接各点绘制曲线，制作的ROC曲线如图11，ROC曲线下的面积(AUCROC)为0.911±0.018(95％可信区间，0.876-0.945，P＝0.000)，即为结直肠癌组观察值大于正常组观察值的概率，面积越大，判断价值越高。在此曲线上通过判断点(cutoff point/cutoff value)的移动，可获得多对灵敏度(sensitivity)和误判率(1-Specificity(特异度))。ROC曲线反映了灵敏度与特异度间的平衡，即增加灵敏度将降低特异度；增加特异度将降低灵敏度。151例结肠癌患者血清SNCG水平检测的灵敏度为38.4％，特异性为99.1％。

实施例14血清SNCG蛋白与其它抗原的相关性

1、血清SNCG蛋白与癌胚抗原(CEA)、糖抗原CA19-9水平

应用本发明建立的双抗夹心ELISA法检测测得151例结直肠癌患者术前血清SNCG水平的阳性率为38.4(58/151)，当SNCG与CEA(用法国CIS公司放免试剂盒采用标准方法检测)两者或与CA19-9(用法国CIS公司放免试剂盒采用标准方法检测)三者联合检测时，阳性率明显提高，SNCG和CEA阳性为62.9(95/151)，SNCG、CEA和CA19-9为67.6(102/151)；三种肿瘤标志物在TNM各分期的检测率列于表4中。

表4 151例结直肠癌患者血清SNCG、CEA、CA19-9水平

二联，SNCG/CEA；三联，SNCG/CEA/CA19-9

2、血清SNCG水平与CEA、CA19-9水平之间的关系

从表5可以看出，血清SNCG水平与血清CEA水平(P＝0.987)、与CA19-9水平(P＝0.994)无相关性；即血清SNCG水平独立于血清CEA水平、CA19-9水平之外；而血清CEA水平与CA19-9水平高度相关(P＝0.000，r＝0.356，Spearman相关系数)，两者之间的血清水平具有显著的统计学意义的相关性。

表5 151例结直肠癌患者血清SNCG、CEA、CA19-9之间的关系

3、血清SNCG水平、CEA、CA19-9水平与TNM分期之间的关系

表6 151例结直肠癌患者血清SNCG、CEA、CA19-9水平与TNM分期的相关性

表6结果表明，血清SNCG水平与TNM分期无相关性(I/II期对III/IV期，P＝0.261)，CEA、CA19-9水平与TNM分期均具有统计学意义的相关性(P值分别为0.043和0.021)，相关系数分别为0.180和0.206，当将SNCG与CEA联合检测时，I/II期的阳性率由34.6％(SNCG)或26.9％(CEA)提高到48.1％，而III/IV期阳性率由44.6％(SNCG)或44.6％(CEA)提高到71.6％，而且，SNCG与CEA联合检测与TNM分期的相关性更加具有统计学意义(P值分别由0.261或0.043提高到0.007)，相关系数也相应的提高{不相关(SNCG)或0.180(CEA)提高到0.239，Spearman相关系数}。当将SNCG、CEA和CA19-9三个肿瘤标志物联合检测时，检测的阳性率和与TNM分期的相关性均更加进一步提高。

表7 69例结肠癌和82例直肠癌患者血清SNCG、CEA、CA19-9水平比较

从表7可以看出，三种肿瘤标志物在结肠癌中的阳性率均比直肠癌中的阳性率高。

实施例15 SNCG蛋白与结肠癌患者的预后相关

1、SNCG蛋白过表达与结肠癌患者的预后差相关

所有统计均使用SPSS13.0 for windows分析软件

Kaplan-Meier曲线(图12)表明SNCG蛋白阴性表达组与SNCG蛋白阳性表达组的无病生存与总生存期之间均具有显著的统计学意义差异(分别为P＝0.000，P＝0.000，Log rank分析)。SNCG蛋白阴性表达组在术后1、3、5年的无病生存率分别为81.7％±3.1％，66.3％±3.8％，58.0％±4.3％，在SNCG蛋白阳性表达组则为64.7％±5.6％，48.1％±5.9％，32.9％±6.2％；术后1、3、5年的总累计生存率在SNCG蛋白阴性表达组分别为87.1％±2.7％，69.3％±3.7％，58.7％±4.3％，在SNCG蛋白阳性表达组则为75.6％±5.0％，49.5％±5.8％，32.5％±6.2％。SNCG蛋白阴性表达组无病生存率和总生存率均明显高于SNCG蛋白阳性表达组，无病生存率和总生存率随术后时间的延长逐渐降低，然而，术后5年后两组的无病生存率和总生存率均保持稳定水平。

发明人也利用Pearson卡方检验分析了SNCG蛋白表达水平对肿瘤的术后复发和患者的生存状态的影响。在229例结肠癌病例中共有61位患者在随访中发生复发或远端转移，而癌组织SNCG阳性组患者中发生复发或转移占36.5％(27/74)，SNCG阴性组患者发生复发或转移占22.2％(34/155)，二者具有显著的差异性(P＝0.020)，肿瘤组织SNCG蛋白表达与结肠癌患者术后转移具有显著的相关性(r＝0.141，P＝0.020，Spearman相关系数)，SNCG蛋白表达对术后复发的风险系数为2.044(95％CI，1.114-3.752)。在229例结肠癌患者在随访中有106位患者死亡，而癌组织SNCG阳性组患者死亡占62.2％(46/74)，SNCG阴性组患者发生复发或转移占38.7％(60/155)，二者具有显著的差异性(P＝0.001)，即肿瘤组织SNCG蛋白的表达与结肠癌患者的生存状态具有显著的统计学意义的相关性(r＝0.221，P＝0.001，Spearman相关系数)，SNCG蛋白表达对患者术后生存状态的风险系数为2.601(95％CI，1.471-4.601)。因此，结肠癌原发肿瘤细胞SNCG蛋白过表达预示术后复发的发生和较短的无病生存和总生存。从表8中可以看出，SNCG阳性患者发生复发的危险率是SNCG阴性组的2.044倍；SNCG阳性患者发生死亡的危险率是SNCG阴性组的2.601倍。

表8结肠癌组织SNCG表达与术后复发和术后生存状态的关系

2.结肠癌细胞SNCG蛋白表达水平是一独立的预后因子

为了探讨结肠癌细胞SNCG蛋白表达水平对肿瘤患者的预后是否是独立预后因子，发明人用单变量和多变量Cox回归分析SNCG蛋白表达水平对无病生存和总生存的影响。如表9所示，单变量分析结果表明TNM分期(P＝0.000)、淋巴结转移(P＝0.000)、肿瘤浸润水平(P＝0.000)、脉管癌栓(P＝0.000)、肿瘤大小(P＝0.030)、肿瘤标志物CEA(P＝0.000)、CA19-9(P＝0.002)和SNCG(P＝0.000)均显著影响DFS和OS。将单因素分析中具有统计学意义的因素纳入Cox比例风险模型，采用倒退法进行多因素分析，结果显示仅有TNM分期(P＝0.008)、肿瘤浸润水平(P＝0.025)、SNCG水平(P＝0.039)和脉管癌栓(P＝0.049)对DFS仍然保持为独立的预后因子，而TNM分期(P＝0.006)、肿瘤浸润水平(P＝0.028)、CA19-9(P＝0.037)和SNCG水平(P＝0.048)对OS保持独立的预后因子作用，脉管癌栓对OS的影响仅在统计学意义的边缘(P＝0.050)。TNM分期、肿瘤浸润水平、脉管癌栓、SNCG蛋白表达水平对DFS和OS的风险系数分别为5.402、3.969、1.789和1.796(DFS)，5.778、3.857、1.788和1.763(OS)，结肠癌肿瘤细胞SNCG蛋白表达水平对结肠癌患者的DFS和OS的影响强度与脉管癌栓相当但弱于TNM分期和肿瘤浸润水平。多变量Cox回归分析CEA对DFS(P＝0.107)OS(P＝0.099)的影响无统计学意义，而CA19-9对OS(P＝0.037)有影响但对DFS(P＝0.057)的影响无统计学意义。基于以上结果表明：SNCG蛋白表达可作为结肠癌患者的无病生存和总生存的独立于后因素之一。

表9单变量和多变量分析临床病理参数和肿瘤标志物对结直肠癌患者的DFS和OS的影响

HR，风险系数；CI，可信区间

3.SNCG与癌胚抗原(CEA)对结肠癌预后提供互补的预后信息

发明人根据TNM分期进一步比较了结肠癌细胞SNCG蛋白表达水平与术前血清CEA水平对结肠癌患者的预后的影响。术前CEA水平升高的I/II期结肠癌患者发生术后复发或转移的可能性以及死亡的几率增加(危险率为11.238，95％ CI，2.207-57.218，P＝0.001和3.400，95％ CI，1.255-9.210，P＝0.013)，而原发结肠癌组织中SNCG过表达与患者的术后复发和患者的生存状态无明显相关；相反，结肠癌组织SNCG过表达的III/IV期结肠癌患者的发生术后复发或转移的可能性以及死亡的几率增加(危险率为2.841，95％CI，1.293-6.238，P＝0.008 and 3.111，95％CI，1.217-7.954，P＝0.015)，而术前血清CEA水平对III/IV期结肠癌患者的术后复发和术后生存状态无统计学意义的影响；结肠癌患者术前血清CA19-9水平仅增加III/IV期结肠癌患者的死亡率(危险率为3.563，95％CI，1.032-12.303，P＝0.038)而与患者的术后复发无关(表10)。这些结果提示结肠癌患者术前血清CEA水平和结肠癌组织SNCG表达水平在结肠癌的进展过程中可提供相互互补的预后信息。

表10肿瘤标志物对II/III、III/IV期结肠癌患者术后复发和生存状态的影响

发明人又将SNCG、CEA对I/II期和III/IV结肠癌患者的无病生存的影响进一步进行了探讨，对于I/II期结肠癌患者，SNCG阴性组和SNCG阳性组相比，5年生存率(78.9％±5.1％对63.0％±9.2％)和无病生存时间(91.780±4.040月对80.065±6.946月)均有明显的下降趋势，但两者之间的的差别无统计学意义(P＝0.101，图13A)；CEA阴性组和CEA阳性组相比，5年生存率(78.2％±6.5％对59.2％±9.1％)和无病生存时间(75.659±2.444月对51.734±5.362月)均明显下降，两组之间的差异具有显著的统计学意义(P＝0.003，图13B)。对于III/IV结肠癌患者，SNCG阴性组和SNCG阳性组相比，5年生存率(35.2％±6.0％对0；)和无病生存时间(54.780±6.018月对19.701±3.386月)两组之间的差异具有显著的统计学意义(P＝0.003，图13C)，很明显，SNCG阳性组患者5年生存率为0，即SNCG阳性组患者在术后的5年期间相继死亡。CEA阴性组和CEA阳性组相比，5年生存率(35.1％±9.3％对20.7％±6.4％)和无病生存时间(47.828±6.910对30.329±5.580月)，两组之间的差异具有显著的统计学意义(P＝0.039，图13D)；III/IV结肠癌患者术后5年期间，所有SNCG阳性患者和79.3％的CEA阳性患者相继死亡。因此，术前血清CEA水平可作为I/II期结肠癌患者生存的主要预后指标，结肠癌组织SNCG蛋白水平可作为III/IV期结肠癌患者生存的主要预后指标。

瘤标志物CEA和SNCG对无病生存(P＝0.021和P＝0.012)和总生存(P＝0.022和P＝0.010)的影响均具有显著的统计学意义；在多变量Cox风险模型分析中，淋巴结转移、SNCG和CEA对DFS、OS仍保持独立的预后因子(对DFS分别为P＝0.001，0.015，0.024；对OS分别为P＝0.001，0.018，0.030)；SNCG对II/III期结肠癌患者的DFS和OS的风险系数分别为2.143和2.114，高于CEA(2.000和1.951)、淋巴结转移(1.873和1.950)对这些患者的DFS和OS的风险系数。因此，SNCG和CEA水平可被认为是判断II/III期结肠癌患者术后生存的独立的预后因子。发明人进一步分析了SNCG和CEA的组合对II/III期结肠癌患者生存的影响。两种标志物组合后的检测率从37.2％(42/113，CEA)或31.0％(35/113，SNCG)提高到56.6％(64/113)。组合后对II/III期结肠癌患者的DFS和OS的风险系数分别为2.670和2.732高于SNCG(2.049和2.011)、CEA(2.039和2.022)(表11)。SNCG和CEA的组合比单独一个因子对II/III期结肠癌患者的预后具有更高的统计学意义。

表11单变量和多变量分析临床病理参数和肿瘤标志物对II/III结肠癌患者的DF8和OS的影响

如图14所示，SNCG阴性组和SNCG阳性组对II/III期结肠癌患者DFS曲线的差异具有显著的统计学意义，5年无病生存率分别为60.9％±6.8％和42.3％±10.5％，随访期间的平均生存时间为71.993±4.110月和44.811±5.147月(P＝0.017)；CEA阴性组和CEA阳性组对II/III期结肠癌患者DFS曲线的差异也具有显著的统计学意义，5年无病生存率分别为60.7％±7.3％和48.4％±7.9％，随访期间的平均生存时间为72.363±4.341月和46.700±4.506月(P＝0.017)。两者组合后的阴性组和阳性组对II/III期结肠癌患者DFS曲线的差异比单个因子更加具有统计学意义，5年无病生存率分别为67.6％±8.3％和46.7％±7.6％，随访期间的平均生存时间为78.625±4.569月和47.302±3.695月(P＝0.003)。两者组合后比单个因子对II/III期结肠癌患者DFS的影响更大。

序列表

<110>北京市肿瘤防治研究所

<120>SNCG的单克隆抗体及其应用

<130>GAI08CN0777C

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

gacggatcca tggatgtttt caagaaggc 29

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

atcctcgagc tagtctcccc cactctg 27

Claims

1.一种SNCG的单克隆抗体，所述单克隆抗体由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCC No.2468的杂交瘤细胞分泌。

2.分泌权利要求1所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏号为CGMCC No.2468。

3.一种检测SNCG水平的试剂盒，其含有权利要求1所述的单克隆抗体。

4.如权利要求3所述的试剂盒，该试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射标记物，以及缓冲液。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其中所述第二抗体为权利要求1所述的单克隆抗体或抗权利要求1所述单克隆抗体的抗抗体或抗SNCG的多抗。

6.如权利要求3所述的试剂盒，该试剂盒为检测流体样品中SNCG水平的双抗夹心ELISA试剂盒，其包括用权利要求1所述单克隆抗体包被的ELISA酶标板、SNCG标准品、辣根过氧化物酶标记的抗SNCG第二单抗、四甲基联苯胺、H₂O₂及相应的缓冲液。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述用权利要求1所述单克隆抗体包被的ELISA酶标板为用权利要求1所述的保藏号为CGMCC No.2468的单克隆抗体包被的ELISA酶标板；而所述第二单抗为由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCC No.2469的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

8.如权利要求3所述的试剂盒，该试剂盒用于检测组织细胞中SNCG的表达水平，其包括权利要求1所述单克隆抗体，还包括用于检测权利要求1所述单克隆抗体的抗抗体及酶或荧光标记物和相应的缓冲液；所述组织细胞为来自肿瘤组织的活检细胞或培养细胞或为已建系培养细胞。

9.权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测样品中SNCG水平的试剂或试剂盒中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其中，所述样品为受试个体的体液样品或细胞蛋白提取液；所述受试个体的体液样品为血清、尿液或组织液；所述受试个体为恶性肿瘤病人及相应的高危人群；所述恶性肿瘤为结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌；所述检测SNCG水平的试剂或试剂盒为用于双抗夹心ELISA进行检测的试剂或试剂盒。

11.权利要求1的单克隆抗体在制备用于辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和/或肿瘤患者预后判断的试剂或试剂盒中的应用，其中，所述的肿瘤为结直肠癌、或乳腺癌或卵巢癌。

12.如权利要求11所述的应用，其中，所述的试剂或试剂盒用于免疫组化检测中；所述试剂或试剂盒用于通过检测体液中SNCG的水平，来辅助对恶性肿瘤的诊断和监测肿瘤的进程。

13.如权利要求11所述的应用，其中，权利要求1所述的单克隆抗体和检测其它肿瘤标志物的试剂联合用于辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和/或肿瘤患者预后判断；所述的其它肿瘤标志物为CEA或CA19-9。

14.一种SNCG水平的检测试剂，其含有权利要求1所述的单克隆抗体。