CN103983784B - 一种dab2ip蛋白的elisa检测方法 - Google Patents

一种dab2ip蛋白的elisa检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种针对DAB2IP蛋白的ELISA检测方法，该方法采用双抗体夹心ABC法，同时具有高特异性和高灵敏度。所述检测方法具有以下特征：包被DAB2IP单克隆抗体（由保藏号为CCTCC？No.C2013148的细胞株分泌，保藏名称为DAB2IPMab1）于ELISA检测板上作为固相抗体，以生物素标记的DAB2IP多克隆抗体作为酶标抗体，使HRP通过与其偶联的Avidin与多克隆抗体上的生物素结合，经TMB显色，在450nm单波长处测定吸收值，可以实现DAB2IP蛋白的定量检测。本发明还提供DAB2IP蛋白检测方法的应用。该方法为DAB2IP蛋白的检测及检测产品的开发奠定了基础。

Description

一种DAB2IP蛋白的ELISA检测方法
技术领域
本发明属于免疫学检测技术领域，特别是涉及一种DAB2IP蛋白的检测方法及其应用。
背景技术
肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病，其死亡率仅次于心脑血管疾病。全球每年罹患恶性肿瘤人数约有1000万人，其中因肿瘤死亡的病例达700多万，而肿瘤的转移和复发是肿瘤死亡的主要因素。近年来，我国每年新增肿瘤病患160-170万人，呈明显上升趋势。肿瘤治疗康复的关键在于肿瘤的及时准确诊断和治疗。因此，肿瘤诊断对于降低肿瘤病死亡率意义重大。肿瘤的诊断主要依靠检测肿瘤标志物来实现。同时，肿瘤标志物也是肿瘤的病理诊断、治疗和预后判断的重要指标。这些标志物存在于病人的细胞、组织、血液或体液中，检测这些肿瘤标志物的表达水平，对相关恶性肿瘤的早期诊断、治疗效果和预后转归判断等有重要参考价值。
DAB2IP是一种新发现的抑癌蛋白，它与抑癌蛋白DAB2蛋白的N末端相结合，是DAB2下游的效应蛋白。DAB2IP最初发现与前列腺癌有关，其表达减少常在前列腺癌细胞中检测到，而在正常的前列腺细胞中则表达正常。另外，研究表明DAB2IP蛋白的表达与前列腺癌转移的分级和预后呈负相关，故监测低表达的DAB2IP对于前列腺癌的预测和诊治具有重要意义。Dote等发现DAB2IP的基因沉默对胃肠癌和乳腺癌的发生发展和侵袭转移起重要作用。Yano等认为DAB2IP可作为肺癌发生的一个生物标志物。而越来越多的研究表明DAB2IP作为重要的抑癌基因，在乳腺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肺癌等多种肿瘤发生发展和预后等方面都发挥了举足轻重的作用。
作为一种新发现的抑癌蛋白，关于DAB2IP的失活机制、抑癌机理及其与多种肿瘤的关系正在不断被深入研究。对DAB2IP的进一步研究，将为肿瘤诊断提供新途径，并有望成为治疗肿瘤的突破口之一。DAB2IP的去甲基化治疗，DAB2IP再表达和依据DAB2IP信号通路蛋白设计肿瘤抑制剂类药物，将为肿瘤治疗提供新的思路。
因此，针对DAB2IP蛋白的检测方法一方面为临床肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、观察疗效、监测复发以及预后评价提供一个新的参考指标和检测工具；另一方面为全面揭示DAB2IP蛋白的作用机制以及与临床肿瘤的关系的研究提供了一个新手段。蛋白检测方法相对于核酸检测法，避免了蛋白表达的时空调控导致的误差，具有更直接准确的优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人DAB2IP蛋白的检测方法。
在一方面，本发明提供了一种DAB2IP蛋白的检测方法，所述方法包括以包被于ELISA检测板上的DAB2IP单克隆抗体作为固相抗体和标记的DAB2IP多克隆抗体作为酶标抗体进行双抗体夹心法，以定量检测DAB2IP蛋白。优选地，所述DAB2IP单克隆抗体来自抗人肿瘤抑制因子DAB2IP单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCCNo.C2013148。
在一个具体的实施方案中，所述检测方法包括：以包被于ELISA检测板上的DAB2IP单克隆抗体作为固相抗体，以生物素标记的DAB2IP多克隆抗体作为酶标抗体，通过显色剂-Avidin与多克隆抗体上的生物素结合使显色剂通过与其偶联的Avidin与多克隆抗体上的生物素结合，经显色，以定量检测实现DAB2IP蛋白。
在一个实施方案中，所述显色剂是辣根过氧化物酶(HRP)，在这种情况下经四甲基联苯胺(TMB)显色，在400-700nm，优选450nm单波长测定吸收值，以定量检测实现DAB2IP蛋白。
本发明的方法为DAB2IP蛋白的检测及相关检测产品的开发奠定基础。
在一个实施方案中，本发明的生物素标记的DAB2IP多克隆抗体是按以下步骤得到的：
将DAB2IP多克隆抗体溶解在PBS缓冲液中(优选浓度2mg/ml)，加入生物素(优选生物素为抗体分子数的1-40倍，更优选5-30倍，还更优选10-20倍)，在冰上静置，经纯化得到纯的生物素化抗体。
本发明中的DAB2IP单克隆抗体可以参见本申请人于2014年1月9日提交的，申请号为201410009739.9、发明名称为“一种抗人DAB2IP的单克隆抗体及其细胞株”的发明专利申请，其全文引入本文作为参考。
在一个实施方案中，本发明的单克隆抗体是按以下步骤制备的：将DAB2IP基因(SEQIDNO.1)重组到改造过的pET32a载体上，该载体同时含有6Histag和TRXtag，并在6Histag和多克隆位点之间含有TEV酶切位点；将重组质粒在大肠杆菌BL21菌株中进行表达，所表达的蛋白为TRX-6His-DAB2IP(SEQIDNO.2)融合蛋白，经TEV(S219V)酶切及二次镍柱和分子筛纯化，得到纯化的DAB2IP蛋白；利用该纯化的DAB2IP蛋白免疫小鼠，经细胞融合及亚克隆化得到单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株分泌产生单克隆抗体。
在一个具体的实施方案中，利用纯化的DAB2IP蛋白免疫新西兰大白兔获得DAB2IP的多克隆抗体。
在一个实施方案中，本发明的DAB2IP的定量检测是按以下方法完成的：将DAB2IP标准蛋白进行梯度稀释，然后分别用此方法测定400-700nm，优选450nm单波长时的读数，制作一个标准曲线，再将要测定的样品用此法在相同波长所测得的读数带入标准曲线，即得其实际浓度。双抗体夹心法与传统的ELISA检测方法相比，固相抗体可以捕获并富集抗原，产生放大作用，同时通过两个单克隆抗体的特异性选择，提高了特异性，所以该方法具有更高的特异性和灵敏性。因此建立的一种利用双抗体夹心法检测DAB2IP蛋白的方法具有重大意义。
本发明包含以下有益效果：
(1)检测重复性好，特异性强，灵敏度高。
(2)可以实现DAB2IP蛋白的定量检测。
(3)为DAB2IP蛋白的检测及相关检测产品的开发奠定了基础。
附图说明
图1：本发明的DAB2IP蛋白的检测方法的工作原理图。plate，检测板；Ab1，DAB2IP单克隆抗体；Ab2，DAB2IP多克隆抗体；Ag，待检测样品；Biotin，生物素；Avidin，抗生物素蛋白；HRP，辣根过氧化物酶。
图2：双抗体夹心ABC法检测不同浓度DAB2IP蛋白的XY散点图。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式做进一步详细描述。以下实施例将有助于说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1.所述检测方法(附图1)是按以下步骤进行的：
1.1包被:将DAB2IP单克隆抗体用包被液(pH9.6的碳酸钠缓冲液)稀释至10μg/ml，每孔加入100μl，37℃孵育4h。
1.2洗涤：弃去孔中液体，用PBST洗4次，每次2分钟，甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。
1.3封闭：每孔加200μl含5％BSA的PBS封闭液封闭，37度孵育4h。
1.4洗涤：PBST洗2次，每次2分钟，甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。
1.5捕获抗原：抗原稀释至合适浓度，每孔100μl加入到对应孔中，阴性对照加100μlPBS，37度孵育1h，洗涤(同步骤1.2)。
1.6加入二抗：将生物素化的DAB2IP多克隆抗体稀释至2μg/ml，每孔各加100μl，37度孵育1h，洗涤(同步骤1.4)。
1.7酶标二抗：将购买的商业化HRP-Avidin稀释1.5万倍，每孔各加100μl，37度孵育50min，洗涤(同步骤1.2)。
1.8显色：每孔加100μlTMB，室温或37度反应5-30min，时间依据孔内变蓝程度而定。
1.9终止反应：显色完毕后，每孔立即加入100μl2MH2SO4终止反应，于20min内检测实验结果。
1.10检测：在450nm单波长处测定吸收值。用此方法可以检测DAB2IP蛋白，为DAB2IP蛋白的定量检测及相关检测产品的开发奠定基础。
1.11实例验证：将DAB2IP蛋白按表1所示浓度梯度进行稀释，并设置阴性对照。按照上述方法进行检测，在450nm单波长处测定吸收值(表1)，结果表明该方法灵敏度可以达到0.1μg/ml，检测结果的XY散点图(附图2)表明在450nm单波长处测定吸收值与蛋白浓度有很好的线性关系，结果准确，可重复性好。
表1双抗体夹心ABC法检测不同浓度DAB2IP蛋白的A450读数
实施例2.所述DAB2IP抗体生物素化是按以下步骤进行的：
将抗体溶解在PBS缓冲液中，浓缩至2mg/ml，按1ml抗体加入0.15mg生物素(约为抗体分子数的20倍)的比例加入生物素，冰上静置2h，经ProteinA纯化后得到纯的生物素化抗体。
实施例3.生物素化效果检测是按以下步骤进行的：
3.1用标准曲线法测定生物素化抗体中生物素的浓度：
将生物素用PBS稀释为0μg/ml、1μg/ml，10μg/ml及100μg/ml四个浓度梯度，各取10ul与90μlHABA/亲和素溶液混合于孔中，在500nm处测定吸收值，即为标准曲线。同时将10μl生物素标记的抗体与90μlHABA/亲和素溶液混合，亦于500nm处测定吸收值，代入标准曲线，得到生物素的浓度。
所述试剂配制如下：
PBS(3.58gNa2HPO4.12H2O；0.27gKH2PO4；8gNaCl；定容至1L；pH7.4)；HABA/亲和素溶液：10mg亲和素、600μl10mMHABA于19.4ml的PBS中，溶液于4℃保存可稳定2周。
3.2用BCA法测定生物素化抗体中抗体的浓度
3.2.1配制工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂(50:1)配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
3.2.2稀释标准品：①取15μl1mg/mlBSA标准品+15μlPBS；②取15μl①+15μlPBS；③取15μl②+15μlPBS；④取15μl③+15μlPBS。
3.2.3取90μlBCA工作液加于干净96孔板酶标中，然后第一孔取10μl1mg/mlBSA标准品于孔中，使其终浓度为1mg/ml。第二孔取10μl步骤2中的①于相应孔中，以此类推，在A562nm处测定吸收值，得到标准曲线。
3.2.4取5μl蛋白样品加10μlPBS，从中取10μl加于相应孔中。所有样加完后，将酶标板放于37℃孵育15-30分钟，用酶标仪测定A562nm吸收值，代入标准曲线计算出蛋白浓度。
3.3计算Biotin/Protein摩尔质量比，摩尔质量比小于20时说明生物素标记成功。本实验测得的Biotin/Protein摩尔质量比为10.21，说明抗体生物素化成功。
所述摩尔质量比的计算方法如下
A＝生物素化的蛋白毫摩尔浓度＝蛋白浓度(mg/ml)/蛋白的分子量
B＝生物素的毫摩尔浓度＝Biotin浓度/生物素分子量
Biotin/Protein摩尔比＝B/A(B/A应小于20才能使用)
实施例4.本发明使用的单克隆抗体的制备
4.1DAB2IP表达载体的构建
4.1.1DAB2IP基因片段(SEQIDNO.1)的获得
为了获得SEQIDNO.1表示DAB2IP基因片段序列，根据已公布DAB2IPcDNA序列设计一对特异性引物：正义链:5’-CGGGATCCAGGTCCTCCGGGGTCCAGC-3’(SEQIDNO.3)；反义链：5’-ATTTGCGGCCGCTTACTGGGCATCAATGATCTTCTGTTT-3’(SEQIDNO.4)；其中正义链含有BamHI酶切位点(GGATCC)，反义链含有NotI酶切位点(GCGGCCGC)和终止密码子(TAA)。以DAB2IP全长cDNA为模板，用高保真酶(PrimerHSSTAR)DNA聚合酶(大连宝生物工程(TaKaRa)有限公司产品)进行PCR扩增，
反应体系是：
2×PrimeSTARGC缓冲液:25μl
dNTP(每种均2.5mM):4μl
正义引物(10μm):2μl
反义引物(10μm):2μl
模板(DAB2IPcDNA50ng/μl):2μl
ddH2O:14.5μl
PrimeHSSTAR:0.5μl
扩增条件是：
98℃变性10s，
55℃退火15s，
72℃延伸1m30s，
上述条件共循环33次。
取PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳(附图1)，将该PCR产物测序确认正确扩增了DAB2IP基因序列。
4.1.2pET32a-TRX-His-DAB2IP(SEQIDNO.1)载体的构建及大肠杆菌转化
将步骤4.1.1得到的PCR产物和pET32a载体(购自Novagen)同时进行BamHI(购自TAKARA)和NotI(购自TAKARA)双酶切，酶切产物回收后用T4DNA连接酶(购自TAKARA)进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α(本实验室保存)。随后用步骤4.1.1中的特异性引物SEQIDNO.3和SEQIDNO.4对用质粒提取试剂盒(OMEGA,PlasmidMiniKitI)从转化子中提取的质粒DNA(分光光度计测量浓度为500ng/μl,使用时稀释至50ng/μl)进行PCR(反应体系和扩增条件同上)以鉴定阳性转化子。提取阳性转化子的质粒进行BamHI和NotI双酶切，经1％琼脂糖凝胶检测可以得到与目标条带大小一致的序列，经测序确认序列正确。
将重组质粒按如下条件转化表达菌株大肠杆菌BL21(本实验室保存)，得到含有pET32a-TRX-6His-DAB2IP质粒的大肠杆菌BL21菌株：从-80℃冰箱中取100μl感受态细胞，置于冰上解冻。待完全解冻后，加入连接产物，轻轻吹打均匀，冰浴30min，随后42℃温浴90秒，迅速置于冰浴中冷却3-5分钟。加入800μlLB液体培养基，混匀后37℃，150rpm振荡培养1h，之后涂布于含AMP抗性的平板上，37℃培养12-16h。
4.1.3Pet32a-TRX-His-DAB2IP(SEQIDNO.1)融合蛋白的诱导表达及纯化
将含有pET32a-TRX-6His-DAB2IP(SEQIDNO.1)质粒的大肠杆菌BL21菌株在含0.1mM氨苄青霉素(100mg/ml)的LB培养基(1％W/VNaCl，1％W/VTryptone和0.5％W/Vyeastextact)中培养至OD值0.5-0.6之间，加入诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至终浓度0.3mmol/L，未加IPTG的菌液作为阴性对照。将上述菌液在16℃下培养12-14h，7000rpm离心5min收集菌体。将诱导的菌体和阴性对照菌体煮沸10分钟裂解，然后进行SDS-PAGE电泳分析。随后，选择阳性菌株按上述条件进行大量诱导，收集菌体后在裂解液(pH8.0Tris-Hcl，500mMNaCl，5％甘油)中进行超声破碎(功率380W，破碎30min)，通过镍离子亲和层析(GEHealthcare)纯化，再用TEV蛋白酶(由本实验室自行制备)切除标签后再通过镍离子亲和层析(同前)及分子筛(superdexS200，GEHealthcare)进行进一步纯化，用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度达到90％左右(图2)，用于后续单克隆抗体制备。
4.1.4抗人DAB2IP单克隆抗体的制备
4.1.4.1免疫小鼠
将步骤4.1.3中纯化的DAB2IP蛋白与完全弗氏佐剂(sigma)或不完全弗氏佐剂(sigma)按1∶1比例混合乳化。取5只4-6周龄的健康小鼠(BAlB/c小鼠)，用上述DAB2IP蛋白与完全弗氏佐剂的乳化物进行腹腔免疫，每只小鼠每次50μg蛋白。8天后，用DAB2IP蛋白与不完全弗氏佐剂的乳化物对小鼠再次进行腹腔免疫。随后每隔7-10天用不加佐剂的DAB2IP蛋白进行一次免疫。细胞融合前4天，用DAB2IP蛋白进行加强免疫，分离小鼠脾细胞。
4.1.4.2细胞融合
取SP2/O骨髓瘤细胞(本实验室保存)与步骤4.1.4.1中得到的小鼠脾细胞按常规方法进行细胞融合后(吴建祥等,1999)，加入HAT培养基(不完全培养基中含有15-20％V/V的FBS及2％V/V的HAT)，轻轻吹打使细胞悬浮，最后加入到已有饲养细胞层(小白鼠腹水巨噬细胞)的96孔培养板中，每孔100μl，然后置5％CO2、37℃孵箱培养进行融合。融合10天后，检测培养基上清中的特异性抗体(步骤见下文)。
4.1.4.3阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆
筛选过程是以DAB2IP蛋白作为抗原，取有杂交瘤细胞生长的培养孔的细胞培养上清液用间接ELISA方法检测。选择其中ELISA反应为阳性的杂交瘤细胞在HAT培养基中进行连续3次亚克隆培养，直至得到单克隆。所述DAB2IP单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNo.C2013148，保藏时间为2013年10月23日，保藏名称为DAB2IPMab1。经鉴定此抗体为IgG1亚类(中国典型培养物保藏中心地址：中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，邮编：430072)。
5.所述DAB2IP多克隆抗体是按以下步骤制备的：
利用上述单克隆抗体制备中所纯化的DAB2IP蛋白(SEQIDNO.2)免疫新西兰大白兔，获得多克隆抗体。具体步骤如下：直接耳缘静脉注射纯化好的DAB2IP蛋白，注射量为0.5mg，此后每隔10-14天，耳缘静脉注射0.5mg纯化好的DAB2IP蛋白，第三次免疫之后，免疫前都先抽血检测效价，至第5次效价达到10-6，可以用于制备多克隆抗体。放血前3天再注射一次，加强免疫。采用心脏采血法进行取血，取血后放于4℃冰箱，待凝固后离心分离血清，血清即多克隆抗体冻存于-80℃冰箱。

Claims (11)

1.一种非诊断目的的DAB2IP蛋白的检测方法，所述方法包括以包被于ELISA检测板上的DAB2IP单克隆抗体作为固相抗体和标记的DAB2IP多克隆抗体作为酶标抗体进行双抗体夹心法，以定量检测DAB2IP蛋白，所述DAB2IP单克隆抗体来自抗人肿瘤抑制因子DAB2IP单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCCNo.C2013148。
2.权利要求1的方法，包括以包被于ELISA检测板上的DAB2IP单克隆抗体作为固相抗体，以生物素标记的DAB2IP多克隆抗体作为酶标抗体，通过显色剂-Avidin与多克隆抗体上的生物素结合使显色剂通过与其偶联的Avidin与多克隆抗体上的生物素结合，经显色，以定量检测DAB2IP蛋白。
3.权利要求2的方法，所述显色剂是辣根过氧化物酶(HRP)，在这种情况下经四甲基联苯胺(TMB)显色，在450nm单波长测定吸收值，以实现定量检测DAB2IP蛋白。
4.权利要求2的方法，所述生物素标记的DAB2IP多克隆抗体是按以下步骤制备的：
将DAB2IP多克隆抗体溶解在PBS缓冲液中，加入生物素，在冰上静置，经纯化得到纯的生物素化抗体。
5.权利要求4的方法，所述将DAB2IP多克隆抗体溶解在PBS缓冲液中，浓缩至2mg/ml。
6.权利要求4或5的方法，所述生物素为抗体分子数的1-40倍。
7.权利要求6的方法，所述生物素为抗体分子数的5-30倍。
8.权利要求7的方法，所述生物素为抗体分子数的10-20倍。
9.权利要求1的方法，所述多克隆抗体是按以下步骤制备的：将DAB2IP基因重组到改造过的pET32a载体上，该载体同时含有6Histag和TRXtag，并在6Histag和多克隆位点之间含有TEV酶切位点；将重组质粒在大肠杆菌BL21菌株中进行表达，所表达的蛋白为TRX-6His-DAB2IP融合蛋白，经TEV酶切及二次镍柱和分子筛纯化，得到纯化的DAB2IP蛋白；利用该纯化的DAB2IP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。
10.权利要求1的方法，所述DAB2IP的定量检测是按以下方法完成的：将DAB2IP标准蛋白进行梯度稀释，然后分别用此方法测定400-700nm单波长时的读数，制作一个标准曲线，再将要测定的样品用此法在相同波长所测得的读数带入标准曲线，得到其实际浓度。
11.权利要求10的方法，所述DAB2IP的定量检测是按以下方法完成的：将DAB2IP标准蛋白进行梯度稀释，然后分别用此方法测定450nm单波长时的读数，制作一个标准曲线，再将要测定的样品用此法在相同波长所测得的读数带入标准曲线，得到其实际浓度。
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新型Ras‐GAP 蛋白DAB2IP 在前列腺癌中的研究进展;宁忠运 等;《现代泌尿外科杂志》;20130531;第18卷(第3期);307-311 *
胃癌患者血清p53蛋白抗原的检测及其临床意义;沈建根等;《实用肿瘤杂志》;20010225;第16卷(第01期);摘要、第17页左栏第1段，第1.1.1、1.2.1节 *

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