CN102465146A - 融合表达重组制备t4核酸内切酶v - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在大肠杆菌中利用融合可溶性表达重组制备T4核酸内切酶V(T4N5)的方法，其中包含融合表达的重组质粒和专一性蛋白酶酶切位点，以及重组制备中无需复性的纯化工艺。经本发明制备的重组T4核酸内切酶V纯度高，对因紫外照射造成损伤的DNA有强修复功能。

Description

融合表达重组制备T4核酸内切酶V

技术领域

本发明涉及DNA重组技术和药物领域，涉及通过融合表达的重组T4N5，含编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用于基因工程制备该蛋白的方法，以及该蛋白在治疗疾病领域的应用。

背景技术

长期暴露于紫外线是皮肤癌(非黑色素性)的重要发病原因，实验表明：皮肤角朊细胞DNA的嘧啶碱基可吸收紫外线产生环丁烷嘧啶二聚体(5，6-Cyclobutyl dipycimidines，CPD)，造成DNA损伤。DNA损伤后细胞发生有丝分裂增殖时经常发生突变，从而导致细胞衰老、癌变。因此防止紫外线辐射引起皮肤病变，对DNA的防护和修复就显得尤为重要。

T4核酸内切酶V(T4endonuclease V，简称T4N5)是噬菌体T4感染宿主E.coli后由基因DenV表达的一种修复酶，分子量约16000道尔顿。它能特异性地识别CPD，并在该损失部位切断磷酸二酯键，从而启动体内的DNA切除修复途径。T4N5通过两种酶活的作用方式完成对CPD位点的切割：第一步是通过PD-DNA糖苷酶活力切割PD中的5’嘧啶与其脱氧核糖间的N-糖苷键形成一个脱嘧啶(AP)位点；第二步由AP内切酶活力在所产生AP位点的3’端切断磷酸二酯键，形成具有5-P，3’-OH末端的单链缺刻。T4N5作用范围不限于噬菌体和E.coli的DNA，在细胞内外它也能作用于各种DNA，且特异性强，只针对被紫外损伤的DNA有修复作用，对正常DNA无任何切割作用。近年来，国际上已有大公司将T4N5开发成护肤品成分和药品。美国TPSG公司将T4N5包埋于脂质体中，作为护肤产品的主要成分；美国AGI公司开发的T4N5脂质体药品已在皮肤癌的预防和治疗中进入III期临床试验。

国内外均有报道T4N5的基因工程制备，其工艺主要包括：1、用基因克隆方法，将T4N5基因构建到重组质粒，再将该重组质粒转入表达菌株；2、筛选高表达工程菌株，诱导表达；3、收集菌体破菌，离心去除沉淀，上清分别经过离子柱、疏水柱、DNA亲合柱等层析，获得纯品。

Yusaku Nakabeppu等(THE JOURNAOLF BIOLOGICALC HEMISTRY，Vol.257，No.5，Issueof March 10，Pages 2556-2562，1982)经过抽提、萃取、CM Sephadex层析、Bio-Gel-P-10层析、Phosphocellulose层析、单链DNA亲合柱层析，获得的T4N5工艺复杂且酶比活性低。K.M.Higgins等(Mutation Research/DNA Repair Reports，Volume 183，Issue 2，March1987，Pages 117-121)通过破菌、单链DNA亲合柱层析、Pharmacia PBE94层析、CM Sephadex层析虽可获得较高纯度的T4N5，但回收率低，工艺无法放大。两者采用分泌型可溶性表达T4N5，但表达量仅为1％左右。Carol ina Alvarez Roger等(Journal of Dermatological Science(2005)39，81-88)经过破菌、复性、DEAE层析、单链DNA亲合柱层析，可获得一定量的T4N5。但由于T4N5为包涵体表达，工艺中需要变性、复性步骤，而复性的T4N5存在一定量的非活性形式，并难以有效控制变性过程。已报道的T4N5纯化工艺中均采用了单链DNA亲和柱层析，该方法成本高，限制了T4N5的规模化制备。

T4N5的体外活性检测采用DNA缺刻法，其原理是利用被紫外线照射的质粒DNA的三种不同构型在琼脂糖凝胶电泳中迁移率不同达到测活的目的。T4N5在I型DNA的CPD位点造成一个缺口后，I型DNA即转变成迁移率更低的II型质粒DNA，如果在互补双链上相距很近的CPD位点均造成缺口，II型DNA转变成迁移率更低的III型DNA，通过观察电泳结果中三种DNA的分布，即可获得酶活力的定性结果，计算I型DNA减少的量，可获得酶活力的定量结果。1个国际活性单位定义为20μl反应体系中，37℃条件下，30分钟内使大于95％的1ng经紫外线照射的超螺旋PBR322DNA变成切刻型质粒的酶量。

发明内容

目前T4N5以包涵体的形式表达，工艺中需要先变性再复性，制备工艺复杂，在工业生产中难以控制，且比活性偏低。另外有用非包涵体表达(分泌和可溶性表达)T4N5的工艺，但表达量和回收率很低，表达水平在1-2％(Expression of the bacteriophage T4denV structural genein Escherichia coli.，J Bacteriol.1986November；168(2)：1014-1018)。

本发明以硫氧还原蛋白(TRX)作为融合表达蛋白，将T4N5以TRX-Linker-T4N5融合表达的方式，实现了可溶性形式表达，表达量达到30％左右。通过在TRX与T4N5之间设计不同蛋白酶酶切位点，能高效专一的切除并分离融合蛋白TRX，经进一步无需单链DNA亲和柱纯化，制备到重组T4N5，产率和回收率高。为了有利于表达的融合蛋白的纯化，在连接肽Linker中引入6×His标签。工程菌经发酵罐扩大培养后，加入IPTG诱导，然后收集菌体。在特定的破菌缓冲液中破菌后离心收集上清，上清通过Ni柱层析获得融合蛋白，经特定的蛋白酶酶切后通过反相层析、离子交换层析，制备的重组T4N5纯度大于98％，酶比活性大于2.5×10⁶IU/mg。每100克湿菌体可获100mg以上的T4N5，具有高表达、高回收率和工艺简单的优势。

本发明的内容在于提供一种以融合方式表达的重组T4N5蛋白并进行重组制备。还提供了编码所述融合表达的T4N5蛋白的DNA分子、含该DNA序列的载体以及含该载体的宿主细胞。

本发明的另一目的提供一种无需复性即可的获得生物比活性更高的重组T4N5的制备工艺。

本发明的另一目的是提供一种可预防器官移植(主要是肾移植)后因长期服用免疫抑制剂的皮肤癌的发生，和治疗着色性干皮病(XP)、毛细血管扩张性共济失调(AT)、Fanconi贫血(FA)、Bloom综合症(BS)等疾病和化妆品中用于修复紫外损伤DNA的重组T4N5。

本发明的优点

1、本发明T4N5为天然野生型结构，由138个氨基酸组成，同时提供了其N端第一或二位氨基酸替代衍生物；

2、TRX-Linker-T4N5是可溶性表达，无需复性即有生物活性，酶切后获得的T4N5生物活比酶切前提高10倍，达到2.5×10⁶IU/mg；

3、Linker含有6×His标签，此标签由4-10个组氨酸串联起来。该标签有利于破菌后目的蛋白纯化和酶切后含标签的TRX和T4N5分离。制备工艺通过Ni螯合层析、蛋白酶切、反相层析和离子柱层析，重组T4N5蛋白纯度达到98％，回收率大于60％。本工艺简单高效，成本低，适用于规模化生产。

发明概述

在本发明的第一方面，提供了一种融合表达重组T4N5蛋白的上游构建体系，它包括：通过与TRX融合表达重组T4N5。更具体的，该融合蛋白中包含不同的连接肽(Linker)，在Linker中设计酶切位点和组氨酸标签。特定的蛋白酶酶切位点是肠激酶酶切位点Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DDDDK)，或凝血酶酶切位点Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(LVPRGS)，或烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切位点Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly(ENLYFQG)。还提供了所述T4N5的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，以及N端第一位或二位氨基酸被替代的衍生物序列，包含Met替代成Gly、MetThr替代成Gly Ser。

在本发明的第二方面，提供了编码本发明上述的T4N5蛋白(氨基酸序列为SEQ IDNO：1)的cDNA序列(SEQ ID NO：2)。

在本发明的第三方面，提供了含有上述DNA分子的载体，以及构建该表达载体的方法。

在本发明的第四方面，提供了包含上述表达载体的宿主细胞以及可能的转化或转染的方法。

在本发明的第五方面，提供了一种重组产生本发明融合表达T4N5蛋白的方法，它包括以下步骤：在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，表达出所述的融合蛋白，分离纯化所述的融合蛋白的方法。

至此已对本发明进行了详细描述，参照以下实例能够对之有更清楚的理解，所述实例仅为说明目的而并不旨在对本发明进行限制。

附图说明

图1：重组质粒pET-32a-T4N5构建示意图

图2：pET32-T改造质粒的构建过程示意图

图3：重组质粒pET32-T-T4N5构建示意图

图4：重组质粒pET32-T和pET32-T-T4N5双酶切验证琼脂糖电泳分析图，其中，1：pET32a经XbaI和KpnI双酶切；2：TRX-6×His PCR片段；3：pET32-T经XbaI和KpnI双酶切；4：pET32-T-T4N5经XbaI和KpnI双酶切；5：pET32a-T-T4N5经KpnI和HindIII双酶切；M：DNA Marker，从下往上依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp

图5：TRX-EK-T4N5融合表达的SDS-PAGE电泳分析图，其中，1：诱导前；2：诱导后；M：蛋白分子量标准，从下往上依次为14.4KD、20KD、26KD、33KD、45KD、66.2KD、94KD

图6：TRX-T-T4N5融合蛋白Ni柱层析SDS-PAGE电泳分析图，其中，1：Ni柱上样；2：Ni柱穿透峰；3：20mM咪唑洗脱峰；4：200mM咪唑洗脱峰；M：蛋白分子量标准

图7：TRX-T-T4N5经凝血酶酶切后的C18反相HPLC分析图，其中，峰1为GS-T4N5；峰2为TRX-Linker

图8：融合蛋白和T4N5分别经过Ni柱和SP柱纯化后的SDS-PAGE电泳分析图，其中，1、M：蛋白分子量标准；2：TRX-T-T4N5；3：TRX-EK-T4N5；4：GS-T4N5；5：T4N5

具体实施方式：

实例1融合蛋白TRX-EK-T4N5重组表达质粒构建及制备方法

在本实施例中，所涉及的融合蛋白具有TRX-EK-T4N5结构，EK为含肠激酶酶切位点DDDDK的连接肽，T4N5氨基酸序列为SEQ ID NO：1。该序列的cDNA碱基序列(SEQ IDNO：2)采用全基因人工合成后，嵌入pMD-18质粒中经DNA测序分析合成序列与设计序列完全一致，用于以下重组质粒的构建，命名为pMD18-T4N5。

1.1pET-32a-T4N5重组质粒构建

根据附图1的构建示意图设计并合成1对引物P1、P2：

P1：5′-CGGGTACCGATGACGATGACAAGCGTATTAATCTGACCCTGGTG-3′(SEQ ID NO：3)

P2：5′-GCAAGCTTTCATTACGCATAAAT CGC TTT GCC-3′(SEQ ID NO：4)

注：P1中CG为引物保护碱基，GATGACGATGACAAG为肠激酶酶切识别位点DDDDK的序列，GGTACC为Kpn I酶切位点；P2中GC为引物保护碱基，AAGCTT为Hand III酶切位点，TCATTA为双终止密码子。

以pMD18-T4N5为模板P1和P2引物进行PCR反应，反应条件为：94℃1min，58℃1min，72℃1min，共30个循环，第一个循环94℃变性10min，最后一个循环72℃延伸10min，获得420bpT4N5用Kpn I和Hind III双酶切后，回收目的片段，用T4DNA连接酶与同样经KpnI和Hind III双酶切回收的质粒pET-32a(+)(购于Invitrogen)连接，转化大肠杆菌宿主菌Top10F′。阳性克隆经双酶切鉴定和cDNA测序分析正确后，其重组质粒命名为pET-32a-T4N5，该重组质粒转化大肠杆菌Origami DE3(Novagen)，经表达筛选高效表达TRX-EK-T4N5融合蛋白菌种，保存并命名为pET32a-T4N5/Origami DE3。

1.2TRX-EK-T4N5融合表达

将表达最佳表达菌株划线接种于LA琼脂平板，37℃培养过夜。从过夜培养的LA平板上挑取菌苔接种于含LB液体培养基试管中，30℃培养12小时，然后按1％的比例转接到含200mL LB培养液的1000mL三角瓶中，30℃培养过夜即成为上罐种子液。将上罐种子液按5％的比例接种于含YT培养液的30L发酵罐中，37℃培养，整过发酵过程中，通过调节转速、通空气量、通纯氧量来保持溶氧在30％以上，用28％的氨水调节pH并维持在7.0。至菌液OD600＝10～12时，加入终浓度为0.3mMol/L IPTG，同时下调温度为26℃，继续培养4小时后停止发酵，收集菌液，8000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体放入-20℃冰箱保存备用。

1.3重组T4N5的制备

从-20℃冰箱中取出菌体，放入细菌裂解液(50mMol/L Tris-HCl、2mMol/L EDTA、PH10.0)中溶解菌体，37℃下搅拌1小时后加入终浓度为5μg/ml的DNase I酶作用3小时至镜检完全破菌，12000rpm离心10分钟，弃沉淀，收集上清。

粗纯化：将收集的上清通过Ni亲合纯化回收融合蛋白TRX-EK-T4N5，平衡液条件为20mMol/L Tris、200mMol/L NaCl、PH9.50，洗脱液条件为20mMol/L Tris、200mMol/L咪唑、200mMol/L NaCl、PH9.50；洗脱的目的蛋白在透析液(20mMol/L Tris-HCl、PH9.0)中透析过夜。

融合蛋白(TRX-EK-T4N5)酶切：取透析后的融合蛋白，加入按质量比1∶200的肠激酶(EK，购于Novagen)，于4℃搅拌酶切12小时，酶切效率不低于90％。

精纯化：酶切后的样品经反相(Waters公司C₁₈柱)层析纯化，流动相A液条件为0.1％三氟乙酸和5％乙腈，流动相B液条件为0.1％三氟乙酸和95％乙腈，流速5ml/min、0-100％B线性洗脱，收集含T4N5的洗脱峰。该洗脱峰再进行阳离子交换(SP Sepharose FF)层析，平衡液条件为20mMol/L NaAC PH3.00，洗脱液20mMol/L Na₂HPO₄、PH9.50，获得重组T4N5蛋白，纯度大于98.0％。

实例2融合蛋白TRX-T-T4N5重组表达质粒构建和制备方法

在本实施例中，所涉及的融合蛋白具有TRX-T-T4N5结构。T为含凝血酶酶切位点LVPRGS的连接肽，T4N5为序列SEQ ID NO：1的N端的衍生物即Gly Ser T4N5(以下称GS-T4N5)。为实现此融合蛋白表达TRX-T-T4N5的表达，对pET-32a(+)质粒中从Thrombinrecognition site+S*Tag的序列用PCR方法切除后改造。

2.1pET-32a(+)质粒改造：

根据附图2构建示意图设计并合成一对引物P3、P4：

P3：5′-CTCTAGAAATAATTTTGTTTAA-3′(SEQ ID NO：5)

P4：5′-CGGTACCACCAGAAGAATGATG-3′(SEQ ID NO：6)

注：P3中C为引物保护碱基，TCTAGA为Xba I酶切位点；P4中C为引物保护碱基，GGTACC为Kpn I酶切位点。

具体实验方法：pET-32a(+)质粒经Xba I和Kpn I双酶切后分别回收小片段TRX-6×His-thrombin-S·Tag和质粒大片段。以小片段为模板，用引物P3和P4通过PCR扩增无Thrombin-s.Tag序列的TRX-6×His片段。PCR反应条件为：94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30个循环，第一个循环94℃变性10min，最后一个循环72℃延伸10min。获得的400bp TRX-6×His的DNA片段产物，用Xba I和Kpn I双酶切并用低熔点琼脂糖回收此片段后，用T4DNA连接酶与同样经Xba I和Kpn I双酶切pET-32a(+)回收大片段5400bp连接，转化大肠杆菌宿主菌Top10F′。阳性克隆经双酶切鉴定，改造后质粒命名为pET32-T。

2.2Trx-T-T4N5重组质粒构建

用实例1中pMD-T4N5质粒做模板，根据附图3构建示意图设计并合成以下一对引物P5和P6。

P5：5′-CGGGTACCCTGGTGCCACGCGGTTCTCGTATTAATCTGACCCTGGTG-3′(SEQID NO：7)

P6：5′-CG AAGCTTTCATTACGCATAAATCGCTTTGCC-3′(SEQ ID NO：8)

注：P5中CG为引物保护碱基，CTG GTG CCA CGC GGT TCT为凝血酶酶切识别位点LVPRGS的序列，GGTACC为Kpn I酶切位点，CGT ATT为编码GlySer的碱基序列；P6中GC为引物保护碱基，AAGCTT为Hand III酶切位点，TCATAA为双终止密码子

PCR反应条件为：94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30个循环，第一个循环94℃变性10min，最后一个循环72℃延伸10min。获得含GS-T4N5和凝血酶酶切位点的DNA片段，大小为420bp。经Kpn I和Hind III双酶切和低熔点琼脂糖回收此片段，用T4DNA连接酶与经Kpn I和Hind III双酶切回收的改造质粒pET32a-T连接，转化大肠杆菌克隆宿主菌Top10F′。阳性克隆用双酶切验证和DNA测序分析正确后，命名为pET32-T-T4N5。转化大肠杆菌表达宿主菌Origami DE3(Novagen)，表达筛选高表达Trx-T-T4N5含目的蛋白的菌种，将重组表达质粒保存并命名为pET32-T-T4N5/Origami DE3。

2.3TRX-T-T4N5融合表达

将pET32-T-T4N5/Origami DE3菌株划线接种于LA琼脂平板，37℃培养过夜。从过夜培养的LA平板上挑取菌苔接种于含LB液体培养基试管中，30℃培养12小时，然后按1％的比例转接到含200mL LB培养液的1000mL三角瓶中，30℃培养过夜即成为上罐种子液。将上罐种子液按5％的比例接种于含YT培养液的30L发酵罐中，37℃培养，整过发酵过程中，通过调节转速、通空气量、通纯氧量来保持溶氧在30％以上，用28％的氨水调节pH并维持在7.0。至菌液OD600＝10～12时，加入终浓度为0.3mMol/L IPTG，同时下调温度为26℃，继续培养4小时后停止发酵，收集菌液，8000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体放入-20℃冰箱保存备用。

2.4重组GS-T4N5的制备

从-20℃冰箱中取出菌体，放入细菌裂解液(50mMol/LTris-HCl、2mMol/LEDTA、PH10.0)中溶解菌体，37℃下搅拌1小时后加入终浓度为5μg/ml的DNase I酶作用3小时，镜检完全破菌后12000rpm离心10分钟，弃沉淀，收集上清。

粗纯化：将收集的上清通过Ni螯合层析获得融合蛋白TRX-thrombin-T4N5，平衡液条件为20mMol/L Tris、200mMol/L NaCl、PH9.50，洗脱液条件为20mMol/L Tris、200mMol/L咪唑、200mMol/L NaCl、PH9.50；洗脱的目的蛋白在透析液(20mMol/L Tris-HCl、PH9.0)中透析过夜。

融合蛋白(TRX-T-T4N5)凝血酶(thrombin)酶切：取透析后的融合蛋白，调整蛋白浓度为4mg/ml，加入2单位/ml人凝血酶(购于中检所)于4℃搅拌酶切12小时，酶切效率不低于90％。

精纯化：酶切后的样品经反相(Waters公司C₁₈柱)层析纯化，流动相A液为0.1％三氟乙酸和5％乙腈，流动相B液为0.1％三氟乙酸和95％乙腈，流速5ml/min、0-100％B线性洗脱，收集含有GS-T4N5第一个洗脱峰。该洗脱峰再进行阳离子交换(SP Sepharose FF)层析，平衡液条件为20mMol/L NaAC PH3.00，洗脱液条件为20mMol/L Na₂HPO₄PH9.50，获得的重组GS-T4N5蛋白纯度大于98.0％。

实例3重组T4N5体外DNA修复活性测定

采用DNA缺刻法。取200ng的PBR322质粒于EP管中，254λUV照射5分钟后，每管加入不同量(8ng、4ng、2ng、1ng、0.5ng、0.25ng)的T4N5样品。反应体系为25mMol/LNa₂PO₄、100mMol/L NaCl、1mMol/L EDTA、1mMol/L DTT、100ug/ml BSA，反应总体积20ul，37度反应30分钟后进行琼脂糖电泳。电泳结束后凝胶成像定量分析I型DNA减少的总量，并计算出其T4N5的酶比活性。同时，用T4N5活性标准品(NEB公司)作对照。TRX-T-T4N5和TRX-EK-T4N5均表现出较强的DNA修复活性，说明本工艺中可溶性表达的含T4N5融合蛋白是活性形式。经重组制备的T4N5和N末端替代衍生物GS-T4N5具有相同的DNA修复活性，达2.0×10⁶以上，明显高于T4N5活性标准品的比活性。

表1DNA修复比活性结果(三次平均值)

Claims (9)

1.一种在大肠杆菌中可溶性融合表达和重组制备T4核酸内切酶V(T4N5)的方法，其特征在于：融合表达方式为TRX-Linker-T4N5，融合蛋白为硫氧还原蛋白(TRX)，TRX位于氨基端，T4N5位于羧基端，中间由连接肽Linker相连。

2.权利要求1中所述T4N5氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

3.权利要求1中所述的连接肽(Linker)中含有专一性的蛋白酶酶切位点。

4.权利要求3中所述蛋白酶酶切位点为肠激酶酶切位点DDDDK，或凝血酶酶切位点LVPRGS，或烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切位点ENLYFQG。

5.权利要求1、3中所述连接肽Linker中含有位于蛋白酶酶切位点前的组氨酸标签序列，该序列由4-10个组氨酸串联。

6.权利要求2中所述序列SEQ ID NO：1的N端第一位氨基酸Met可由Gly取代，其专一性蛋白酶酶切位点优选烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切位点。

7.权利要求2中所述序列SEQ ID NO：1的N端第一位和第二位氨基酸Met Thr可由Gly Ser取代，其专一性蛋白酶酶切位点优选用凝血酶酶切位点。

8.权利要求1中所述的重组制备T4N5的方法包括：

(1)构建含编码TRX-Linker-T4N5的cDNA序列的重组质粒；

(2)重组质粒转化大肠杆菌，获得可溶性表达TRX-Linker-T4N5的融合蛋白的菌株，优选大肠杆菌菌株Origami DE3；

(3)表达菌株经发酵培养和诱导，可溶性表达TRX-Linker-T4N5；

(4)表达菌体经破菌、Ni亲合层析、蛋白酶切、反相层析、离子层析等步骤，获得高纯度的重组T4N5蛋白。

9.权利要求8所述的重组制备的T4N5具有更高的DNA修复活性，可用于DNA修复的药物、工具酶和护肤品的光修复成分。

Images