CN104774822A - 幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法，具体是以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4扩增SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，然后将扩增产物经酶切后连入经同样酶切的pMAL-C质粒中，获得重组表达载体pMAL-C-SP，然后将重组表达载体pMAL-C-SP于大肠杆菌中诱导表达并用Ni2+亲和层析柱和强阴离子交换柱纯化，最后过SephadexG200分子筛，得幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶，利用该方法获得的幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶量大，损失小，具有丝氨酸蛋白酶活性，为研究该蛋白的晶体结构和功能奠定了坚实的基础，同时能作为一种前景广阔的胰酶替代物及药物研发的靶点。

Description

幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法。
背景技术
幽门螺旋杆菌是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌。在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形。幽门螺杆菌是微需氧菌，环境氧要求5～8％，在大气或绝对厌氧环境下不能生长。大量研究表明，超过90％的十二指肠溃疡和80％左右的胃溃疡，都是由幽门螺杆菌感染所导致的。长期的溃疡，会导致癌症，因此WHO宣布胃幽门杆菌为微生物型的致癌物质，也是第一个可致癌的原核生物。
最近研究发现幽门螺旋杆菌的丝氨酸蛋白酶(SP)是一种新型的分泌性细菌毒力因子，它的同源蛋白也广泛表达于原核生物和真核生物细胞，在蛋白质量控制中发挥重要作用。SP蛋白除了包含一个丝氨酸蛋白酶结构域，还包括了PDZ结构域，而PDZ与细胞内的信号传导有关，已有研究发现它与关节炎、癌症都有密切的关系。幽门螺旋杆菌感染后，SP蛋白被细菌分泌到黏膜表面，作用于细胞间粘连蛋白E-cadherin的胞外段，从而破坏细胞之间的连接，达到损伤胃黏膜的目的。而E-cadherin作为细胞连接和癌症抑制的重要蛋白，它的破坏对胃溃疡和胃癌的发生和发展起到重要作用。因此，SP蛋白的成功表达纯化对于研究其结构功能以及与胃癌相关疾病的发生发展具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法，制备方法简单，采用细菌体内TEV酶切技术，纯化过程中对酶量和酶活性损失小，能够获得有活性的幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法，包括如下步骤：以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为引物，SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为模板进行PCR扩增，然后将扩增产物经酶切后连入经同样酶切的pMAL-C质粒中，获得重组表达载体pMAL-C-SP，然后将重组表达载体pMAL-C-SP于大肠杆菌中诱导表达，接着收集菌体，破碎，离心取上清，用Ni2+亲和层析柱和强阴离子交换柱纯化，最后过G200分子筛，即得幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶。
优选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌JM109或含有TEV蛋白酶编码基因的大肠杆菌JM109。
优选的，所述诱导表达是在温度为16～37℃条件下用0.1～1mmol/L的IPTG诱导表达3小时；然后用0.5M脱水四环素诱导2小时。
优选的，所述诱导表达是在温度为37℃条件下用1mmol/L的IPTG诱导表达3小时。
优选的，所述收集菌体是将菌液在10000rpm条件下离心10分钟，弃上清，收集沉淀。
优选的，所述破碎为向收集的菌体中加入细菌裂解液和苯甲基磺酰氟至苯甲基磺酰氟的终浓度为1mmol/L，超声至溶液变清澈即可；所述细菌裂解液为pH8.0、Tris-HCl浓度为25mM，NaCl浓度为300mM的溶液。
优选的，所述离心为在18000rpm条件下离心15分钟。
优选的，所述Ni2+亲和层析柱纯化为取上清过Ni2+亲和层析柱，先用平衡缓冲液洗柱3次，再用上样缓冲液洗脱，收集洗脱液；所述平衡缓冲液为pH8.0、Tris-HCl浓度为25mM，NaCl浓度为300mM，咪唑浓度为20mM的溶液；所述上样缓冲液为pH8.0、Tris-HCl浓度为25mM，NaCl浓度为300mM，咪唑浓度为200mM的溶液。
本发明的有益效果在于：本发明采用细菌体内TEV酶切技术，通过在细菌内酶切目标蛋白标签，并采用Ni2+柱、离子交换和分子筛纯化SP蛋白，相对于传统标签酶切方式(MBP柱－酶切－Ni2+柱－离子交换－分子筛)，采用本发明的方法能够减少目的蛋白纯化过程的损失，同时减少纯化的技术流程；同时优化缓冲液，结果显示采用25mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH8.0的体系，当NaCl浓度低于300mM时，SP出现大量沉淀，无法顺利纯化出目的蛋白；此外，利用本发明的方法制备的丝氨酸蛋白酶具有较强的丝氨酸蛋白酶活性，能促使肽链分裂，有效降解细胞间粘附分子，与传统上消化细胞的胰酶相比，SP蛋白酶具有更强的活性，可用于替代商业化的胰酶。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶编码基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图(其中泳道1为DNA分子量标准，泳道2和3为PCR扩增产物)。
图2为重组质粒pMAL-C-SP酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图(其中泳道1为DNA分子量标准，泳道2和3为NcoI和XbaI双酶切产物)。
图3为pMAL-c-SP转化菌表达产物的SDS-PAGE电泳图(其中泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2为未经IPTG诱导的表达产物，泳道3为经IPTG诱导的表达产物，泳道4为沉淀，泳道5为Ni2+亲和层析结果)。
图4为Sephadex-G75分子筛后的蛋白电泳图(其中泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2和3为幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶)。
图5不同纯化方式获得的SP蛋白电泳图(其中泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2为未用含TEV蛋白酶菌株纯化的SP蛋白，泳道3为用含TEV蛋白酶菌株纯化的SP蛋白)。
图6为不同缓冲液纯化的SP蛋白(其中泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2为缓冲液NaCl高于300mM纯化结果，泳道3缓冲液NaCl低于300mM纯化结果)。
图7为SP酶活性鉴定(a为对照；b，为12小时；c为24小时)。
图8为SP酶与胰酶在相同浓度相同时间内的活性对比(a为对照；b为10μg/ml胰酶24小时内消化结果；c为10μg/ml SP酶24小时内消化结果)。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶表达质粒pMAL-c-SP的构建
根据UniProt数据库中公开的幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶(SP)氨基酸序列(UniProt:O25663，SEQ ID No.1)和大肠杆菌的密码子偏好优化编码SP的核苷酸序列，优化后的核苷酸序列如SEQ ID No.2，然后人工合成SEQ ID No.2所示核苷酸序列。根据人工合成的SEQ IDNo.2所示的序列设计扩增SP的引物，具体序列如下：
上游引物SP-F：5’-tcccatgg gaaaatcttgttttccaaggaatgtcccctc-3’(SEQ ID No.3)，下划线为TEV酶切序列；
下游引物SP-R：5’-gttctagatcacatcatcatcatcatcattttcaccaaaatg-3’(SEQ ID No.4)，下划线为6his序列。
设计的引物及人工序列委托上海生工生物工程技术服务公司进行合成。
以人工合成的SP序列为模板，采用引物SP-F和SP-R进行PCR扩增，扩增条件为：先94℃预变性2分钟，再94℃变性30秒、65℃退火30秒、72℃延伸1min，共33个循环，最后72℃延伸10分钟；扩增后将PCR扩增产物经琼脂糖电泳鉴定，结果如图1所示。结果显示，扩增获得约1329bp的条带，与预期片段大小一致。然后切胶回收目的DNA片段，将回收所得的目的DNA片段用NcoI和XbaI双酶切，再与经同样双酶切的质粒pMAL-c2x在T4DNA连接酶的作用下连接，获得重组质粒pMAL-c-SP。将重组质粒pMAL-c-SP经NcoI和XbaI双酶切鉴定，结果如图2所示。结果显示，所得的重组质粒pMAL-c-SP中含有目的DNA片段。
实施例2、幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶的制备
将重组质粒pMAL-c-SP转化含有TEV蛋白酶编码基因的大肠杆菌JM109感受态细胞(含有TEV蛋白酶编码基因的大肠杆菌JM109由以下方法构建：先把来源于pRK603质粒(购自Addgene公司)的TEV基因插入到pET-28a的Nco I和Xho I之间，得pET-28-TEV载体，然后将pET-28-TEV导入大肠杆菌JM109)，用含有100μg/mL氨苄青霉素和20μg/mL卡拉霉素的LB平板筛选阳性克隆。挑取一个阳性克隆即pMAL-c-SP转化菌，分别于温度为16℃、25℃、37℃条件下用IPTG诱导目的蛋白表达，诱导剂IPTG的终浓度分别为0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L，诱导时间为3小时，然后用0.5M脱水四环素诱导2小时，收集菌液，将菌液在10000rpm条件下离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入细菌裂解液(25mM Tris-HCl，300mM NaCl,pH8.0)10ml和终浓度为1mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)，超声至溶液变清澈，18000rpm离心15分钟，取上清进行SDS-PAGE。结果显示，在37℃用IPTG诱导剂终浓度为1mmol/L的条件下，pMAL-c-SP转化菌成功表达了幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶，且表达量最高。
利用表达产物6his标签进行亲和纯化：取冻存的pMAL-c-SP转化菌菌液100μL，加入新鲜培养基10mL，37℃培养过夜，再取新鲜菌液1mL，加入新鲜培养基100mL，37℃培养2.5小时，再加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃诱导培养3小时，用0.5M脱水四环素诱导2小时，再收集菌体，10000rpm离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入细菌裂解液(25mMTris-HCl，300mM NaCl,pH8.0)和终浓度为1mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)，超声至溶液变清澈，18000rpm离心15分钟，取上清过Ni2+亲和层析柱，先用平衡缓冲液(25mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0)洗柱3次，再用洗脱缓冲液(25mM Tris-HCl，300mM NaCl，200mM咪唑，pH8.0)洗脱，收集洗脱液，然后将琼脂糖凝胶电泳，同时以未经诱导表达的和未经纯化的菌液为对照进行SDS-PAGE，结果如图3所示。结果显示，经Ni2+亲和层析柱亲和层析后含有SP蛋白，但还含有部分杂蛋白，还需进一步纯化。
然后将Ni2+亲和层析柱的洗脱液过HiTrapSP离子交换柱(购自GE公司，编号为17-1152-01)，再过Sephadex-G200分子筛，收集通过峰，即得幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶，将收集峰进行SDS-PAGE，结果如图4所示。结果显示，获得的蛋白为单一条带，其纯度高。
然后比较不同菌株纯化的SP蛋白，取相同量进行SDS-PAGE，结果如图5所示。结果显示，使用含TEV蛋白酶编码基因的大肠杆菌JM109表达SP蛋白经纯化后蛋白浓度更高，表明采用的细菌体内TEV酶切技术，通过在细菌内酶切目标蛋白标签，能够减少目的蛋白在纯化过程中的损失。
使用不同浓度盐离子缓冲液纯化SP蛋白，如25mM Tris-HCl，300mM NaCl,，pH8.0和25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0，取相同量进行SDS-PAGE，结果如图6所示。结果显示，当整个纯化过程的缓冲液NaCl高于300mM，纯化获得的SP蛋白浓度更好，表明在NaCl高于300mM时纯化的目的蛋白损失减少。
实施例3、幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶活性验证
MKN-28细胞系接种于含10％胎牛血清的1640培养基中，培养48小时，待细胞完全贴壁并融合后，换为不含血清的1640培养基，并加入实施例2纯化的SP蛋白，加入后SP蛋白终浓度为10μg/mL，同时用等体积的1640培养基作对照，分别在12小时和24小时，去掉上清，0.01M PBS洗3次，用质量分数为4％的多聚甲醛固定20分钟，0.01M PBS洗3次，滴加稀释的荧光标记的E-cadherin抗体溶液，孵育30分钟，0.01M PBS洗3次，每次3分钟。DAPI染色2分钟，0.01M PBS洗2次，加一滴体积分数为40％的甘油，盖上盖玻片，激光共聚焦观察，结果如图7所示。结果显示，SP蛋白有效酶解细胞间连接蛋白E-cadherin，破坏细胞粘附。
为了比对商业化胰酶与该丝氨酸蛋白酶在消化贴壁细胞时消化能力的差异，我们分别使用10μg/mL的胰酶和实施例2纯化的等量丝氨酸蛋白酶消化细胞，在12个小时时利用免疫荧光观察其消化能力，结果如图8所示。结果显示，SP蛋白消化贴壁细胞的能力明显强于商业化胰酶。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为引物，SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为模板进行PCR扩增，然后将扩增产物经酶切后连入经同样酶切的pMAL-C质粒中，获得重组表达载体pMAL-C-SP，然后将重组表达载体pMAL-C-SP于大肠杆菌中诱导表达，接着收集菌体，破碎，离心取上清，用Ni2+亲和层析柱和强阴离子交换柱纯化，最后过G200分子筛，即得幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶。
2.根据权利要求1所述幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌JM109或含有TEV蛋白酶编码基因的大肠杆菌JM109。
3.根据权利要求1所述幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述诱导表达是在温度为16～37℃条件下用0.1～1mmol/L的IPTG诱导表达3小时，然后用0.5M脱水四环素诱导2小时。
4.根据权利要求3所述幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述诱导表达是在温度为37℃条件下用1mmol/L的IPTG诱导表达3小时。
5.根据权利要求1所述幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述收集菌体是将菌液在10000rpm条件下离心10分钟，弃上清，收集沉淀。
6.根据权利要求1所述幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述破碎为向收集的菌体中加入细菌裂解液和苯甲基磺酰氟至苯甲基磺酰氟的终浓度为1mmol/L，超声至溶液变清澈即可；所述细菌裂解液为pH8.0、Tris-HCl浓度为25mM，NaCl浓度为300mM的溶液。
7.根据权利要求1所述幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述离心为在18000rpm条件下离心15分钟。
8.根据权利要求1～7任一项所述幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述Ni2+亲和层析柱纯化为取上清过Ni2+亲和层析柱，先用平衡缓冲液洗柱3次，再用上样缓冲液洗脱，收集洗脱液；所述平衡缓冲液为pH8.0、Tris-HCl浓度为25mM，NaCl浓度为300mM，咪唑浓度为20mM的溶液；所述上样缓冲液为pH8.0、Tris-HCl浓度为25mM，NaCl浓度为300mM，咪唑浓度为200mM的溶液。
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