CN101058805B

CN101058805B - 突变羧肽酶原b及突变羧肽酶b的生产方法

Info

Publication number: CN101058805B
Application number: CN2007100646343A
Authority: CN
Inventors: 李素霞; 王福清; 袁勤生
Original assignee: Beijing Guanhong Science & Technology Co Ltd; East China University of Science and Technology
Current assignee: Beijing Guanhong Technology Group Co., Ltd.
Priority date: 2007-03-21
Filing date: 2007-03-21
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2027-03-21
Also published as: CN101058805A

Abstract

公开了一种突变的羧肽酶B或相应的羧肽酶原B，其在对应于天然羧肽酶原B氨基酸序列第288位的半胱氨酸被除半胱氨酸之外的天然氨基酸所取代，并且所述的羧肽酶B基本上保留天然羧肽酶B的活性。还公开了编码它的多核苷酸、表达载体、宿主细胞，以及生产重组羧肽酶B或羧肽酶原B的方法，还公开了该突变羧肽酶B或羧肽酶原B用作从胰岛素原制备胰岛素的工具酶，或用于蛋白测序、制备诊断胰腺炎的试剂或试剂盒的用途。

Description

突变羧肽酶原B及突变羧肽酶B的生产方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，主要是通过定点突变使得基因表达产物的性能改善的方法。具体的说，是通过选择使得特定的半胱氨酸位点或其它影响二硫键形成的基因位点，使得突变羧肽酶B表达产物的活性提高的方法。

背景技术

胰腺羧肽酶B(carboxypeptidase B，CPB，EC 3.4.17.2)发现于1958年(参见Folk JE，Gladner JA，Carboxypeptidase B J Biol Chem 1958；231：379-391)。它是一种消化酶，其水平在正常的血清中几乎检测不到。只有发生胰腺炎期间，血清中才可发现活性CPB，其血浆半衰期为几分钟，这可能是由于没有糖基化。

羧肽酶B是一种含锌的胰外肽酶，其中，锌离子作为酶活性所必需的一种辅因子存在。羧肽酶B可特异性水解肽链C端的碱性氨基酸——精氨酸，赖氨酸或鸟氨酸。CPB含307个氨基酸，分子质量35ku。天然存在的CPB是由前羧肽酶原B(preprocarboxypeptidase B)产生的，其N-末端包含108个氨基酸(其中13个氨基酸为信号肽序列，95个氨基酸组成活性肽部分)的片段与C端的CPB相连，前羧肽酶原B在转运到内质网的过程中，信号肽被切掉，得到不具酶活性羧肽酶原B(procarboxypeptiedase B，pCPB)从细胞中分泌出来，然后在小肠中经胰蛋白酶酶解为具酶活性的CPB和活性肽部分。

由于羧肽酶B特异性水解肽链C端的碱性氨基酸(精氨酸，赖氨酸或鸟氨酸)，所以羧肽酶B可应用于蛋白质和多肽的序列分析，特别是用来确定羧基端氨基酸。

目前，羧肽酶B最重要的用途是作为工业用酶，特别是应用于胰岛素的工业生产中，欧洲专利申请EP-A 0489780中描述了胰岛素的制备，在这个申请中，羧肽酶B被用于将胰蛋白酶打开的胰岛素原转变为胰岛素的一个必需步骤中。

从猪胰腺中纯化的商业化的羧肽酶B有可能没有完全去除其他蛋白水解酶的活性。此外，如同大多数动物来源的产物的情况，猪胰腺来源的羧肽酶B可能含有感染物质，如病毒、朊病毒、或其他具有损害人体健康潜能的生物活性组分。如果这种酶应用于大规模工业生产，例如工业生产胰岛素，另一个不利的因素是获得和储存冷藏胰腺的高后勤成本。

除了从胰腺组织中提取羧肽酶B，用生物技术方法生产羧肽酶B是另一替代方法。这一方法中有一些已知的路线，例如表达羧肽酶B前体，即羧肽酶原B，它包括羧肽酶B的氨基酸序列和活性肽序列。大肠杆菌(E.coli)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等均可作为表达菌株，但表达所得羧肽酶原需经胰蛋白酶激活后获得活性羧肽酶B，然后再纯化去除胰蛋白酶和活性肽部分等。这一方法的另一替代方法是在细菌或酵母中以融合蛋白形式，如β-半乳糖苷酶-羧肽酶B融合蛋白形式表达，但需体外去除融合蛋白才可获得活性羧肽酶B。

WO 0151624公开了在巴斯德毕赤酵母中猪前羧肽酶B的重组表达。通过胰蛋白酶酶切的方式活化酶原，随后加入胰蛋白酶抑制剂，疏水柱层析纯化得到羧肽酶B，Q-琼脂糖凝胶层析进一步纯化活化的酶。WO0151624的纯化方法涉及多个步骤并伴随着羧肽酶B产物的损失。此外，还需从产物中分离胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和羧肽酶B前肽。

DE 19915938公开了在甲基营养巴斯德毕赤酵母中组氨酸标记的人前羧肽酶B的重组表达。利用亲和层析凭借组氨酸标记的优点来纯化该产物。随后，利用胰蛋白酶活化前羧肽酶B并通过添加胰蛋白酶抑制剂来终止该活化反应。由于活化步骤施用于溶解的酶原，因此需要进一步将前肽和羧肽酶B纯化分开。

WO 9623064中公开了在E.coli中的鼠前羧肽酶B的重组表达。产生了非溶解性的前羧肽酶B的包涵体。该酶原被复性，针对溶解的酶原进行胰蛋白酶的活化步骤，并随后被进一步纯化，将前肽、胰蛋白酶与羧肽酶B分离。我们也对该方法进行了摸索(Su-Xia Li等，Protein and Peptide Letters2003，10(6)：1-10)。

目前本领域对于通过定点突变技术进行突变CPB的研究并无报道。因此，本领域对于通过突变技术来改变CPB表达，从而进行突变CPB的研究以揭示CPB的结构与功能的关系，从而进一步改善其生产方法具有迫切的需要。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种重组生产羧肽酶B的方法。

在本发明的一个方面，公开了一种突变的羧肽酶B或相应的羧肽酶原B，其在对应于天然羧肽酶原B氨基酸序列第288位的半胱氨酸被除半胱氨酸之外的天然氨基酸所取代，并且羧肽酶B基本上保留天然羧肽酶B的活性。

在该方面的一个优选例中，该羧肽酶原B具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，其中Cyt288被选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸的氨基酸替换。

在更优选的具体实施方式中，Cyt288被选自甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸、天冬酰胺和苯丙氨酸的氨基酸替换。

在本发明的另一个方面，提供了一种多核苷酸，它编码上述羧肽酶B或羧肽酶原B，优选编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列；更优选的，该多核苷酸是SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

在本发明的还有一个方面，公开了一种表达载体，它含有上述多核苷酸。

在本发明的另一个方面，公开了一种宿主细胞，它含有上述表达载体，或者在基因组中整合有上述多核苷酸。优选的，该宿主细胞是大肠杆菌。

在本发明的另一个方面，提供了一种生产重组羧肽酶B或羧肽酶原B的方法，包括步骤：

(a)培养宿主细胞，从而表达出上述突变的羧肽酶B或羧肽酶原B；

(b)从培养物中分离出步骤(a)中所表达的突变的羧肽酶B或羧肽酶原B。

优选宿主细胞为大肠杆菌，并且羧肽酶B或羧肽酶原B以包涵体形式表达，并且该方法还包括步骤：

(c)对分离的羧肽酶B或羧肽酶原B通过变性和复性而获得酶活性。

在另一优选例中，羧肽酶B以上清形式表达，纯化后得到活性羧肽酶B。

在另一优选例中，该方法还包括步骤：对分离的羧肽酶原B用胰蛋白酶消化，从而获得羧肽酶B。

在本发明的另一个方面，还提供了一种上述突变羧肽酶B或羧肽酶原B的用途，用作从胰岛素原制备胰岛素的工具酶，或用于蛋白测序、制备诊断胰腺炎的试剂或试剂盒等。

附图说明

图1描述了突变羧肽酶原B(mpCPB)的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。其中羧肽酶原B的氨基酸序列为(SEQ ID NO：1)，核苷酸序列为(SEQ ID NO：2)。该DNA序列来源于已构建的质粒pT7-pCPB，pCPB核苷酸序列来源于RT-PCR技术获得的大鼠胰腺pCPB RNA序列(Su-Xia Li等，Protein and PeptideLetters 2003，10(6)：1-10)。BLAST的结果表明，与Genbank登录号：P19223上收录的大鼠的pCPB基因相比有5个核苷酸不同，导致2个氨基酸的差异，其中Lys11变为Asn11，Arg139变为Glu139。图1还显示了突变的核苷酸和相应的氨基酸位点，C288→S288，以灰色框表示。

图2显示了PCR的电泳鉴定结果。以含有突变基因的质粒pET-mpCPB为模板，本文所述的为特异引物，进行PCR扩增后获得pCPB7和CPB7的特异扩增条带，这里的pCPB7和CPB7代表的是突变的基因。

图3显示了PCR产物胶回收后进行基因电泳鉴定测定的结果。

图4显示了PCR胶回收产物双酶切及表达载体双酶切电泳图，直接用NcoI/Hind III进行基因片段和表达载体pET-22a的双酶切，酶切后鉴定。

图5显示了重组表达质粒pET-PCPB，pET-CPB的双酶切鉴定。将图4所示的双酶切片段进行割胶回收，连接，转化，扩增，抽质粒，同样双酶切鉴定。可得相应条带。

图6显示了SDS-PAGE进行重组突变pCPB克隆的IPTG诱导(37℃)后筛选。泳道1，3为诱导前样品。泳道2、4为用0.5mM IPTG诱导后的样品。它们都呈阳性。分别与诱导前相对照，含有重组质粒的经IPTG诱导后有相应蛋白条带(43KD)表达。结果显示：菌株2和3为阳性克隆，菌株1为阴性克隆。

图7显示了SDS-PAGE电泳分析37℃条件下IPTG诱导后重组突变CPB克隆的筛选。泳道1、3和5是诱导前样品。泳道2、4和6是0.5mM IPTG诱导后的样品。分别与诱导前相对照，含有重组质粒的经IPTG诱导后有相应蛋白条带(35KD)表达。结果显示：菌株1(泳道1、2)和3(泳道5、6)为阳性克隆，菌株2(泳道3、4)为阴性克隆。

图8显示了SDS-PAGE分析比较突变mPCPB和mCPB与原始菌株(未突变菌株)PCPB在37℃和12℃表达量的差异。

泳道1～3，12℃诱导表达，泳道1，pCPB；泳道2，mpCPB；泳道3，mCPB；

泳道4～6，37℃诱导表达，泳道4，pCPB；泳道5，mpCPB；泳道6，mCPB；

其中，1和4为原始菌株，2和5为突变后mPCPB，3和6为突变后mCPB。

图9A显示了SDS-PAGE分析突变mPCPB在37℃条件下，IPTG诱导表达情况(培养基中加入0.01mM Zn²⁺)。泳道1，0.5mM IPTG诱导后菌体沉淀；泳道2，菌体超声破碎离心后上清；泳道3，菌体超声破碎离心后上清(SDS-PAGE上样液中不含β-巯基乙醇)(和附图中所述正好颠倒)；泳道4，菌体超声破碎离心后包涵体经洗涤后溶解在10M尿素中(SDS-PAGE上样液中不含β-巯基乙醇)，泳道5，菌体超声破碎离心后沉淀包涵体经洗涤后溶解在10M尿素中。

图9B显示了SDS-PAGE分析突变mPCPB在37℃条件下，IPTG诱导表达情况(培养基中没有加Zn²⁺)。泳道1，菌体超声破碎离心后包涵体经洗涤后溶解在10M尿素中，泳道2，菌体超声破碎离心后沉淀包涵体经洗涤后溶解在10M尿素(SDS-PAGE上样液中不含β-巯基乙醇)。

图10A显示了SDS-PAGE电泳分析突变mPCPB在12℃条件下，IPTG诱导表达情况(培养基中加入0.01mM Zn²⁺)。其中泳道1为0.5mM IPTG诱导后菌体沉淀；泳道2，菌体超声破碎离心后上清(SDS-PAGE上样液中不含β-巯基乙醇)；泳道3，菌体超声破碎离心后上清；泳道4，菌体超声破碎离心后包涵体经洗涤后溶解在10M尿素中(SDS-PAGE上样液中不含β-巯基乙醇)，泳道5，菌体超声破碎离心后沉淀包涵体经洗涤后溶解在10M尿素。

图10B显示了SDS-PAGE分析突变mPCPB在12℃条件下，IPTG诱导表达情况(培养基中没有加Zn²⁺)。泳道1，0.5mM IPTG诱导后菌体沉淀；泳道2，0.5mM IPTG诱导后，菌体超声破碎离心后上清；泳道3，菌体超声破碎离心后上清；泳道4，菌体超声破碎离心后上清(SDS-PAGE上样液中不含β-巯基乙醇)；泳道5，菌体超声破碎离心后包涵体经洗涤后溶解在10M尿素中，泳道6，菌体超声破碎离心后沉淀包涵体经洗涤后溶解在10M尿素(SDS-PAGE上样液中不含β-巯基乙醇)。

具体实施方式

术语解释

本文所用的术语，除非特别指出，“CPB”指羧肽酶B，“pCPB”(大小写不论)指羧肽酶原。

本文所用的“CPB”“PCPB”“mPCPB”“mCPB”表示通过重组DNA方法和其他方法制备的一种多肽，它具有与任何天然存在的哺乳动物羧肽酶B的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。“mPCPB”“mCPB”表示通过重组体DNA定点突变方法获得的一种多肽，除特定氨基酸突变外，它与任何天然存在的哺乳动物羧肽酶B的氨基酸序列相同或基本上相同。

本文所用的一种“具酶活性”的CPB或mCPB指具有天然存在的羧肽酶B的生物活性的CPB。为了此定义的目的，天然存在的羧肽酶B的生物活性即其特异性的去除C末端精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸的能力。

本发明提供了突变的羧肽酶原B，以及由其产生的突变羧肽酶B，以及用该突变的羧肽酶原B产生具有提高的生物活性的羧肽酶B的方法。该方法优选仅通过化学变性复性来得到活性的、具有正确生物构象的羧肽酶B。

本发明采用了定点突变方法来对CPB的氨基酸序列进行突变。定点突变技术是本领域已知的技术，主要分为三类：1)PCR反应介导的；2)非PCR反应介导的；3)体内定点突变技术。采用PCR反应介导可实现简单、快速、高效的基因定点突变，可分为重叠延伸法和快速定点突变法。

采用快速定点突变法是对特定双链DNA中的氨基酸直接以PCR方法引入突变，一步完成，不需要ssDNA，适合与任何载体和宿主菌，模板可大于9kb，有两种方法：①在待突变位点设计点突变引物，两引物5’端相邻，直接以双链DNA为模板，以突变引物进行PCR，DNA聚合酶可采用常规的DNA聚合物，例如高保真的Pyrobest DNA聚合酶，得到含平末端的PCR产物。产物纯化后对末端进行磷酸化处理(也可在合成引物时直接对其中一条磷酸化处理)，在DNA连接酶的作用下连接处理后的PCR产物，得到含目的片段的环状双链DNA，转化入相应的宿主菌，对转化子鉴定，得到目的DNA。②在相应位置设计突变引物(两引物完全互补)，同样，为了便于鉴定，可在引物中利用沉默突变引入或去除某一限制性酶切位点。以双链DNA为模板，突变引物、高保真DNA聚合酶PCR，得到带粘性末端的全长DNA，产物用限制性内切酶DpnI(识别序列为5’-Gm6ATC-3’)消化甲基化和半甲基化的模板DNA。因为大肠杆菌里含有甲基化酶，所以大部分从大肠杆菌分离到的DNA都是甲基化的，可以被DpnI消化，依此来选择突变DNA。消化后的PCR产物转化与XL1-Blue(或TG1)感受态，对转化子质粒进行酶切或者测序鉴定。

本发明人采用PCR快速突变法的第二种方法，实现了定点突变，并测序证实了突变体基因的正确性。

本发明人发现，对于游离的半胱氨酸288进行替换，可以减少其形成不必要的链内二硫键的几率，从而使得产物的活性大大增加。

可使得半胱氨酸突变为任何不能形成二硫键的氨基酸，包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。还可包含这些天然氨基酸的衍生形式。本领域技术人员可以轻易选择这些氨基酸，只要它们和半胱氨酸的性质不相同。这些知识可以从任何生物化学领域的教科书上找到。

在定点突变mpCPB以后，可用任何方法根据已知的pCPB的序列设计引物，PCR克隆出mCPB序列。克隆序列的技术可见分子克隆等常用实验手册。

表达载体可用任何本领域技术人员已知的原核和真核表达载体，视具体情况而定。优选的表达载体包括在宿主细胞内表达克隆的基因所必需的调节元件，包括启动子、终止子等，视需要不同可分为瞬时表达和组成型表达。调节元件可定位在编码突变CPB的核酸附近，以便影响其表达。

可使用任何原核或真核宿主，例如细菌、真菌、植物、哺乳动物等。优选的细菌寄主细胞为大肠杆菌细胞，一种合适的大肠杆菌的例子是菌株BL21(DE3)。

在用含有本发明的mCPB连接入载体，并感染宿主，在本领域技术人员常规所知的适合宿主的培养基或条件下，通过发酵等方法培养，可收集表达该mCPB的细胞进行收集。诱导mCPB变为活性mCPB有两种途径，一是通过低温诱导，从细胞中回收上清表达的突变CPB，经体外处理和纯化可得到活性突变CPB。或者从细胞中回收包涵体表达的突变CPB，在突变CPB可折叠的条件下经过变性和复性处理回收的CPB，使其具有酶活性。

在上清表达的低温诱导方案中，可在培养基中加入适量ZnCl₂，低温诱导使其上清表达，从重组细胞中回收突变CPB包括破坏重组体细胞的细胞壁或其片段以产生细胞裂解产物，离心分离细胞裂解产物中的上清物质，然后调节pH，加入适量ZnCl₂，纯化该上清液，即可得纯化的活性突变CPB。

在另一个优选方案中，可从重组细胞中回收突变PCPB包括破坏重组体细胞的细胞壁或其片段以产生细胞裂解产物，离心分离细胞裂解产物中的上清，然后在合适比例的胰蛋白酶激活可得具酶活性的突变CPB。

可选择合适的方法来对突变PCPB和突变CPB进行变性和复性

选择合适的变性条件：

要使包涵体成为有活性的蛋白，第一步就必须使包涵体溶解。有许多方法被用来溶解包涵体，但是，选择一种合适的溶解试剂，对于后续的复性过程极为重要。可以采用多种条件，包括变性剂(8M尿素、6M盐酸胍)、去污剂、极端酸碱、高温等条件对重组突变PCPB的包涵体进行变性溶解。发明人采用10M尿素实现了非常好的复性和变性效果。

合适的变性条件的前提为：

①选择尽量温和的变性条件(如尽可能低的变性剂浓度)，得到较好的包涵体的溶解性，不破坏氨基酸的结构，尽量保持蛋白表达初期部分形成的二级结构，因为高浓度的变性剂会严重破坏蛋白质的二级结构，这对于随后的复性效率的提高可能非常重要。

②采用还原变性的方法，即在变性剂中加入还原试剂如：DTT，β-巯基乙醇等用以打开因包涵体形成过程中重组蛋白内部、重组蛋白之间以及重组蛋白与菌体蛋白之间形成的二硫键，使重组蛋白充分打开呈松散的单体状态。

复性方法：

可采用不同的复性方法对变性溶解突变体蛋白进行复性，可采用的复性方法有：稀释复性法、柱复性法等，对于稀释复性，可通过优化复性液组成，达到提高复性率的目的。

另外，相对于8M尿素还原变性方法，可以选择下列两种方案：间歇加样复性实现复性液的高浓度和高复性率；优化稀释复性液直接稀释法可对突变PCPB、突变CPB进行。

相对于弱碱性低浓度变性剂的还原变性方法，采用pH分段复性法偶联疏水层析复性及对复性蛋白的纯化，先在PH11条件下，蛋白质的构像为松散结构，使二硫键正确配对，之后调整pH8条件下进一步复性，使二级结构、三级结构都复性接近天然态。决定氧化重折叠效率或复性率的关键是折叠后期肽链的构象。另外，含有二硫键的蛋白质，是否与强碱性条件有利于保持肽链的柔性构象有关。加入固体硫酸铵或者加入高浓度的硫酸铵，上疏水层析柱，梯度洗脱，或者分段洗脱，收集洗脱蛋白峰，测活，透析脱盐，或者脱盐柱脱盐后，电泳，测活。如有必要，DEAE-FF阴离子交换柱对流加上样的羧肽酶B的吸附、浓缩，洗脱，收集。

实施例

所用培养基及菌株、质粒：

LB培养液：1％蛋白胨(Difco)，0.5％酵母提取物(Difco)，1％NaCl，pH7.0；

LB平板：LB培养液，加琼脂粉至浓度为1.5-2.0％；

菌株：BL21(DE3)：F，ompT，HsdS_B，(r_B ^-，m_B ^-)，dcm，gal，λ(DE3)

DH5α：φ80dlacZΔM15，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17(r_k ^-，m_k ⁺)，supE44，relA1，deoR，Δ(lacZYA-argF)U169

质粒：pET-21a，pET-22a：来源于invitrogen

实施例1：mCPB/mPCPB表达质粒pET-mCPB/pET-mPCPB的构建

I.mPCPB基因来源于已构建好含有羧肽酶原B基因的质粒pET-21a-pCPB，该基因为通过RT-PCR的方法从Wistar大鼠的胰腺获得，经定点突变后获得。(如图1所示)。

PCR扩增mCPB/mPCPB基因，克隆中使用的三个引物的DNA核苷酸序列：分别为PCPB的5’端引物和3’端引物(引物1(SEQ ID NO：3)和引物3(SEQ IDNO：5))；CPB的5’端引物和3’端引物(引物2(SEQ ID NO：4)和引物3(SEQID NO：5))，并用另一个反义引物引入Hind III限制性位点后的终止密码子(SEQ ID NO：6)。分别引入Nco I/Hind III双酶切位点、和Nco I/Hind III双酶切位点以及终止密码子。

引物1：pCPB：有义引物，5’-GCG GGA TCC CAT GCT TCC GAGGAG CAC TTT GAT GGC---3’(SEQ ID NO：3)EcoR I限制位点；

引物2：CPB：

有义引物，5’-GCG CAT ATG GCA ACG GGA CAC AGC TAC ACCAAG TAC-3’(SEQ ID NO：4)，编码Nde I限制性位点后的CPB N末端的开始9个氨基酸；

反义引物，3’-TTA ATA CAG GCT CTT CTA GAT ATA ATC ACT TTCAAG GGC-5’(SEQ ID NO：5)，

引物3：反义引物，5’-CGC AAG CTT TCA CTA ATA TAG ATG TTCTCG GAC ATA ATT 3’，Hind III限制性位点后的终止密码子(SEQ IDNO：6)。

PCR扩增条件如下：

1.3’端引物 1μg

2.5’端引物 1μg

3.模板pT7-473-pCPB(稀释后) 5μl

4.10×缓冲液 5μl

5.10mM dNTPs 1μl

6.50mM MgSO₄ 2μl

7.Taq聚合酶I 1.5u

8.灭菌双蒸水ddH₂O 加至50μl

94℃×2min；92℃×1.5min，53℃×1.5min，72℃×1.5min，40循环；72℃×15min，反应完成后，4℃保存。结果如图2所示。

PCR产物用1％低熔点琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收940bp/1200bp处的条带，双酶切后，连接入同样酶切的表达载体pET-22a，转化感受态细胞DH5α，质粒小量抽提，双酶切鉴定，(结果如图3，图4，图5所示)。测序，测序结果用BLAST程序与Genbank上的大鼠胰脏来源的pCPB对照证实(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)。BLAST的结果表明，与Genbank登录号：P19223上收录的大鼠的pCPB基因相比有5个核苷酸不同，导致2个氨基酸的差异，其中Lys11变为Asn11，Arg139变为Glu139。图1还显示了突变的核苷酸和相应的氨基酸位点，C288→S288，以灰色框表示。

实施例2：诱导表达突变体SDS-PAGE进行重组突变mPCPB克隆的筛选

I.培养基

经转化后，带有重组质粒pET-mPCPB的大肠杆菌BL21(DE3)可在含氨苄青霉素(100μg/ml)的固体LB培养基上生长。

II.接种物

挑取单菌落于5ml LB(含100μg/ml氨苄青霉素)液体培养基中，37℃，摇菌过夜；过夜菌按1％接种于含250ml LB氨苄青霉素抗性培养液中，37℃，摇菌至600nm下OD为0.3～0.5，0.5mM IPTG诱导，调节温度至相应温度，诱导后3～5小时，离心收集菌体。

III.表达情况分析

将诱导前及诱导后的菌体离心，弃上清，沉淀菌体中加入电泳上样缓冲液，煮沸10min，离心，上清进行变性聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。分别与诱导前相对照，含有重组质粒的经IPTG诱导后又相应蛋白条带(43KD)表达，结果显示：菌株2和3为阳性克隆，菌株1为阴性克隆。结果如附图6所示。

实施例3：诱导表达突变体SDS-PAGE进行重组突变mCPB克隆的筛选

筛选方法与实施例2相同。结果如附图7所示。

分别与诱导前相对照，含有重组质粒的经0.5mM IPTG诱导后又相应蛋白条带(35KD)表达，结果显示：菌株1和3为阳性克隆，菌株2为阴性克隆。

实施例4：SDS-PAGE分析比较重组突变mPCPB和mCPB与原始菌株(未突变菌株)PCPB的在37℃和12℃表达量的差异。

诱导表达条件如实施例2所述，唯一不同是诱导后的培养温度为37℃和12℃，目的是观察不同温度下的表达量的不同。

由附图8所示的电泳结果可知，C288-S288的氨基酸突变不但没有使表达量降低，反而使目的蛋白在重组菌中的相对表达量升高，这可能与游离半胱氨酸的突变降低了菌体细胞内的还原环境对与外源蛋白表达的限制作用。同时也说明了突变技术应用的可行性。

实施例5：培养基中的Zn²⁺加入对于突变mPCPB在37℃条件下表达的影响

培养及诱导表达条件如实施例2所述。将诱导诱导后的菌体离心，加入pH8的Tris-HCl缓冲液将菌体重新悬浮，超声破碎后，离心，对离心后的上清和沉淀中分别加入电泳上样缓冲液，煮沸10分钟，离心，上清进行变性聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析或者非还原的SDS-PAGE分析(加入的电泳上样缓冲液不含有β-巯基乙醇)。结果如附图9A和附图9B所示。

由电泳图分析可得如下结果：说明Zn²⁺加入有利于突变mPCPB正确构象的形成。培养基中的Zn²⁺加入有利于降低突变mPCPB聚集体的形成。

实施例6：培养基中的Zn²⁺加入对于突变mPCPB在12℃条件下表达的影响

培养及诱导表达条件如实施例2所述，唯一不同是诱导后的培养温度为12℃，而不是37℃，目的是为了获得降低温度后的可溶性表达。

将诱导诱导后的菌体离心，加入pH8的Tris-HCl缓冲液将菌体重新悬浮，超声破碎后，离心，对离心后的上清和沉淀中分别加入电泳上样缓冲液，煮沸10min，离心，上清进行变性聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析或者非还原的SDS-PAGE分析(加入的电泳上样缓冲液不含有β-巯基乙醇)。结果如附图10A和附图10B所示。

由电泳图分析可得如下结果：

I.降低诱导后培养温度可获得突变mPCPB的可溶性表达。

II.培养基中的Zn²⁺加入有利于突变mPCPB的可溶性表达，与不加Zn²⁺的培养条件相比，可溶性的表达量上升了1倍多。培养基中加入Zn²⁺基本都是可溶性的上清表达形式。而不加Zn²⁺的培养条件，仅可得到不到1/2的重组蛋白的可溶性表达。说明Zn²⁺加入有利于突变mPCPB正确构象的形成。

III.培养基中的Zn²⁺加入有利于降低突变mPCPB聚集体的形成。

实施例7：.上清表达的突变CPB活性

直接测定12℃上清中表达的突变CPB的活性，并加入不同浓度Zn²⁺进行体外活化，得到如表1所示的结果。可帮助折叠成活性状态。

表1.不同浓度ZnCl₂对上清中突变CPB活性的作用

ZnCl₂(mM)	CPB活性(u/ml)
		0	0.15
0.1	0.2
		0.01	1.3
0.001	1.2

实施例8：上清表达的突变pCPB的活化及活性测定

对于12℃上清中表达的突变pCPB，加入不同质量比例的胰蛋白酶进行体外活化，测定激活后的上清中的活性，得到如表2所示的结果。

表2.不同质量比例的胰蛋白酶对PCPB进行体外活化作用

等效例

本领域中熟练技术人员使用常规实验方法将会认识，或能够确定，本文所述的本发明具体实施例的许多等效例。这些等效例应包括在权利要求书所规定的本发明的范围中。

序列表

<110>华东理工大学

<120>突变羧肽酶原B及突变羧肽酶B的生产方法

<130>071196

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>402

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

His Ala Ser Glu Glu His Phe Asp Gly Asn Arg Val Tyr Arg Val Ser

1 5 10 15

Val His Gly Glu Asp His Val Asn Leu Ile Gln Glu Leu Ala Asn Thr

20 25 30

Lys Glu Ile Asp Phe Trp Lys Pro Asp Ser Ala Thr Gln Val Lys Pro

35 40 45

Leu Thr Thr Val Asp Phe His Val Lys Ala Glu Asp Val Ala Asp Val

50 55 60

Glu Asn Phe Leu Glu Glu Asn Glu Val His Tyr Glu Val Leu Ile Ser

65 70 75 80

Asn Val Arg Asn Ala Leu Glu Ser Gln Phe Asp Ser His Thr Arg Ala

85 90 95

Ser Gly His Ser Tyr Thr Lys Tyr Asn Asn Trp Glu Thr Ile Glu Ala

100 105 110

Trp Ile Gln Gln Val Ala Thr Asp Asn Pro Asp Leu Val Thr Gln Ser

115 120 125

Val Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg Asn Met Tyr Val Leu Lys Ile

130 135 140

Gly Lys Thr Arg Pro Asn Lys Pro Ala Ile Phe Ile Asp Cys Gly Phe

145 150 155 160

His Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala Phe Cys Gln Trp Phe Val Arg

165 170 175

Glu Ala Val Arg Thr Tyr Asn Gln Glu Ile His Met Lys Gln Leu Leu

180 185 190

Asp Glu Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro Val Val Asn Ile Asp Gly Tyr

195 200 205

Val Tyr Thr Trp Thr Lys Asp Arg Met Trp Arg Lys Thr Arg Ser Thr

210 215 220

Met Ala Gly Ser Ser Cys Leu Gly Val Asp Pro Asn Arg Asn Phe Asn

225 230 235 240

Ala Gly Trp Cys Glu Val Gly Ala Ser Arg Ser Pro Cys Ser Glu Thr

245 250 255

Tyr Cys Gly Pro Ala Pro Glu Ser Glu Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala

260 265 270

Asp Phe Ile Arg Asn Asn Leu Ser Thr Ile Lys Ala Tyr Leu Thr Ile

275 280 285

His Ser Tyr Ser Gln Met Met Leu Tyr Pro Tyr Ser Tyr Asp Tyr Lys

290 295 300

Leu Pro Glu Asn Tyr Glu Glu Leu Asn Ala Leu Val Lys Gly Ala Ala

305 310 315 320

Lys Glu Leu Ala Thr Leu His Gly Thr Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly

325 330 335

Ala Thr Thr Ile Tyr Pro Ala Ala Gly Gly Ser Asp Asp Trp Ser Tyr

340 345 350

Asp Gln Gly Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Phe Glu Leu Arg Asp Thr Gly

355 360 365

Phe Phe Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser Gln Ile Arg Gln Thr Ser Glu

370 375 380

Glu Thr Met Leu Ala Val Lys Tyr Ile Ala Asn Tyr Val Arg Glu His

385 390 395 400

Leu Tyr

<210>2

<211>1209

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

catgcttccg aggagcactt tgatggcaac cgggtgtacc gtgtcagtgt acatggtgaa 60

gatcacgtca acttaattca ggagctagcc aacaccaaag agattgattt ctggaaacca 120

gattctgcta cacaagtgaa gcctctcact acagttgact ttcatgttaa agcagaagat 180

gttgctgatg tggagaactt tctggaggag aatgaagttc actatgaggt actgataagc 240

aacgtgagaa atgctctgga atcccagttt gatagccaca cccgtgcaag tggacacagc 300

tacaccaagt acaacaactg ggaaacgatt gaggcgtgga ttcaacaagt tgccactgat 360

aatccagacc ttgtcactca gagcgtcatt ggaaccacat ttgaaggacg taacatgtat 420

gtcctcaaga ttggcaaaac tagaccgaat aagcctgcca tcttcatcga ttgtggtttc 480

catgcaagag agtggatttc tcctgcattc tgtcagtggt ttgtgagaga ggctgtccgt 540

acctataatc aagagatcca catgaaacag cttctagatg aactggattt ctatgttctg 600

cctgtggtca acattgatgg ctatgtctac acctggacta aggacagaat gtggagaaaa 660

acccgctcta ctatggctgg aagttcctgc ttgggtgtag accccaacag gaattttaat 720

gctggctggt gtgaagtggg agcttctcgg agtccctgct ctgaaactta ctgtggacca 780

gccccagagt ctgaaaaaga gacaaaggcc ctggcagatt tcatccgcaa caacctctcc 840

accatcaagg cctacctgac catccactca tactcacaga tgatgctcta cccttactcc 900

tatgactaca aactgcctga gaactatgag gaattgaatg ccctggtgaa aggtgcggca 960

aaggagcttg ccactctgca tggcaccaag tacacatatg gcccaggagc tacaacaatc 1020

tatcctgctg ctgggggatc tgacgactgg tcttatgatc agggaatcaa atattccttt 1080

acctttgaac tccgggatac aggcttcttt ggctttctcc ttcctgagtc tcagatccgc 1140

cagacctctg aggagacaat gcttgcagtc aagtacattg ccaattatgt ccgagaacat 1200

ctatattag

1209

<210>3

<211>36

<212>DNA

<213>引物

<400>3

gcgggatccc atgcttccga ggagcacttt gatggc

36

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>引物

<400>4

gcgcatatgg caacgggaca cagctacacc aagtac

36

<210>5

<211>39

<212>DNA

<213>引物

<400>5

ttaatacagg ctcttctaga tataatcact ttcaagggc

39

<210>6

<211>39

<212>DNA

<213>引物

<400>6

cgcaagcttt cactaatata gatgttctcg gacataatt

39

Claims

1.一种突变的羧肽酶原B，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。

2.编码权利要求1所述突变的羧肽酶原B的多核苷酸，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。

3.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求3所述的表达载体，或者在基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于是大肠杆菌。

6.如权利要求1所述突变的羧肽酶原B的制备方法，其特征在于，培养权利要求4或5所述的宿主细胞，表达并分离出权利要求1所述的突变的羧肽酶原B。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，突变羧肽酶原B以包涵体形式表达，并且该方法还包括对分离的突变羧肽酶原B通过变性和复性而获得酶活性。